氧化石墨烯定向固定化葡萄糖氧化酶的工艺方法

摘要

本发明为一种固定化葡萄糖氧化酶的工艺方法，其步骤是：1）将氧化石墨烯溶于蒸馏水中，超声混合得到浓度为1mg/mL的氧化石墨烯悬浊液；向该悬浊液中加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二胺，振摇后，洗涤，分离，得酯化氧化石墨烯；2）向均匀的酯化氧化石墨烯悬浊液中加入已活化的伴刀豆蛋白A，反应后离心，充分洗涤沉淀；然后加入葡萄糖氧化酶溶液，反应后充分洗涤，真空冷冻干燥24h即得定向固定化葡萄糖氧化酶。本发明制备固定化酶的方法，固定化效率高，避免了酶活性位点取向不一致或酶活性位点被掩盖等缺点，从而提高了固定化酶的活性；对酶活性损失小，酶活可达150～195U/mg。

权利要求

1.一种固定化葡萄糖氧化酶的工艺方法，其特征包括以下步骤：

1）氧化石墨烯的酯化：将氧化石墨烯溶于蒸馏水中，超声混合得到分散均匀的浓度为1 mg/mL的氧化石墨烯悬浊液；向该悬浊液中加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二胺，其配比为在每50 μL 1 mg/mL氧化石墨烯悬浊液中加入100 μg N-羟基硫代琥珀酰亚胺和44.1 μg 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二胺，然后用浓度为0.1 M、 pH值= 6.0的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液定容使1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二胺终浓度为20 mM，振摇30 min后，高速离心，弃去上清液，在沉淀中加入pH值= 6.0的0.05 M 2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液洗涤，离心分离，最后沉淀在真空干燥24 h即得酯化氧化石墨烯；

2）定向固定化酶的制备：取上步得到的酯化氧化石墨烯重新悬浮于蒸馏水中，超声分散得到分散均匀的1 mg/mL酯化氧化石墨烯悬浊液，在悬浊液中加入pH值= 7.0、已活化的伴刀豆蛋白A溶液，其配比为在50 μL酯化氧化石墨烯溶液中加入300~1500μL 0.1 mg/omL伴刀豆蛋白A，反应60 min后，4 C高速离心，弃去上清液，沉淀用0.05 M、 pH 值=6.0的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液充分洗涤；在沉淀中加入pH 4.5~8.0、浓度为0.5 mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液，其配比为质量比伴刀豆蛋白A：葡萄糖氧化酶＝1:5，反应30~120 min，o

4 C高速离心，弃去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲溶液(PBS)充分洗涤后，真空冷冻干燥24 h即得定向固定化葡萄糖氧化酶；

所述的伴刀豆蛋白A活化过程是将伴刀豆蛋白A溶于含0.1 mol/L KCl、1 mmol/L CaCl2和1 mmol/L MnCl2的0.1 mol/L 、pH= 7.0的PBS中配成0.1 mg/mL 的蛋白质溶液，o并于4 C冰箱中活化12 h。

2.如权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的工艺方法，其特征为所述的葡萄糖氧化酶溶液是按照配比为1 mg葡萄糖氧化酶溶解于2 mL、pH值为4.5~8.0的磷酸盐缓冲液中配制得到。

说明书

氧化石墨烯定向固定化葡萄糖氧化酶的工艺方法

技术领域

[0001] 本发明属于固定化酶领域，特别是一种氧化石墨烯定向固定化葡萄糖氧化酶的工艺方法。

背景技术

[0002] 与传统的化学催化相比，酶催化具有温和的转化条件、高的反应速率、优异的选择性等优点。在大力倡导流程工业绿色化、节能减排的新形势下，酶催化将在大宗化学品、精细化学品的工艺取代以及环境化学等方面发挥日益重要的作用。由于固定化酶具有稳定性好、可重复利用、易分离等优点，成为酶催化领域的研究热点和前沿。但由于以下方面的约束，限制了酶催化更广泛的应用：（1）脱离了细胞内的微环境，酶在细胞外对温度和pH耐受范围窄、适应性差、易失活等；（2）酶提取纯化的费用较高，而在应用过程中重复利用率低，造成酶催化成本较高；（3）对非天然底物的催化活性低；（4）操作稳定性差、重复利用率低、生产成本较高。因此，如何最大限度地提高酶在胞外环境中的活性和稳定性、使其更有效的适应非生理催化环境、实现高效催化是新一代工业生物催化技术发展的重要课题。其中采用新颖的固定化酶技术、改造和发展高效固定化酶催化剂是解决以上问题的重要途径。而作为无化学损伤的定向固定化方法是最具实用价值和应用前景的技术之一，已成为近年来固定化酶领域的研究热点之一。

[0003] 目前定向固定化方式主要有：利用酶和它的相应抗体之间的亲和性；利用生物素-亲和素之间的特异亲和性；通过酶分子上的糖基部分固定化；酶分子上的特定氨基酸残基和金属离子形成复合物；用基因工程手段改造酶分子使酶定向固定化。其中通过酶分子上的糖基部分与凝集素结合实现定向固定化可以确保酶的空间取向一致，酶在载体表面呈一定的方向排列，不必需氨基酸残基参与共价结合，无化学损伤作用，且酶的活性位点面朝固体表面的外侧排列，有利于底物与酶的活性位点接触，能够显著提高固定化酶的活性。而伴刀豆球蛋白A是一种常用的植物凝集素蛋白，对含有甘露糖或葡萄搪的糖蛋白有特异的亲和力，本发明所使用的葡萄糖氧化酶是一种含糖酶。因此本发明使用伴刀豆球蛋白A作为凝集素，利用伴刀豆球蛋白与葡萄糖氧化酶糖链间的特异生物亲和力实现葡萄糖氧化酶的定向固定化。

[0004] 葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，E.C.1.1.3.4，简称GOD）是催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸的酶，属于需氧脱氢酶类，广泛存在于动植物及微生物体内。因GOD能够利用O2将葡萄糖氧化成葡萄糖酸而有效去除氧，因而被广泛用于食品、啤酒、饮料等包装的除氧，此外GOD在蛋品加工、葡萄糖的定量分析、金属防腐、葡萄糖酸、生物传感器以及医学上的快速检验等方面也有着广泛的应用。因游离GOD存在不稳定、不可重复使用和不易于分离等缺点而限制了大规模使用。通过GOD的固定化，不仅可提高酶的稳定性，还可以扩展其应用范围。目前固定化方法主要有吸附法、共价结合法、交联法、包埋法。如，Liu等人（J.Mater.Chem.,2012,22,15085～15091）以Fe3O4-纤维素-壳聚糖杂化凝胶微球为载体，戊二醛为交联剂，共价固定GOD，结果表明在4h时固定化酶催化葡萄糖的转化率达91.5%，并且重复使用15次后酶活力仍能保持84.2%。Huang等人(Biotechnol.Lett.,2010,32,817～821;Mat.Sci.Eng.C,2011,31,1374～1378)分别以Fe3O4/SiO2磁性纳米粒子和SiO2纳米粒子为载体共价固定化GOD。GOD被固定化后其热力学稳定性、储存稳定性和操作稳定性均得到了很大提高。如以SiO2纳米粒子为载体制备所得的固定化酶45℃下浸泡360min时酶活力仍然能保持85%，并且重复使用6次后酶活力仍能保持87%。Sohn等人(Biotechnol.Bioprocess Eng.,2008,13,716～723)制备Fe3O4磁性纳米粒子固定化GOD并应用与生物监测系统，获得了较好的效果。Ying等人（J.Membr.Sci.,2002,208:361～374）和Li等人（Biomaterials,1998,19:45～53）在聚偏氟乙烯修饰的微孔膜和聚苯胺膜上共价固定GOD，结果表明酶的稳定性得到了很大提高，4℃下储存30天后酶活仍然维持85%的活性。
蒋利伟(北京化工大学学报,2007,34(4):428～431)等人以管状空心SiO2为载体，对GOD进行固定，得到了较好的操作与稳定性；曾嘉等人(食品工业科技,2002,1(23):29～37)以戊二醛为交联剂，利用壳聚糖微球制备了固定化GOD，确定了固定GOD的最佳条件，并得到了较高的酶活回收率；周涛等人(生物工程学报,2012,28(4):476～487)以壳聚糖为载体，在不同有机相中对GOD进行固定化研究，结果表明在合适的有机相中固定GOD可以获得更优的性质。虽然以上这些固定化方法使酶的稳定性得到了不同程度的提高，但目前应用的这些固定化方法都是随机固定化方法。随机固定化葡萄糖氧化酶必然存在着一些不可消除的问题，如单体、交联剂、溶剂、引发剂等都会在不同程度上破坏酶的活性，因此，研究更温和的固定化酶技术具有重要意义，而定向固定化技术正好可以消除这些问题。故本发明采用定向固定化技术固定化葡萄糖氧化酶。另外在决定固定化酶系统的特性方面，固定化载体的特性是极其重要的。目前，纳米材料在生物催化、药物控制释放、生物传感器等领域展现出极大的应用潜力，纳米技术的迅速发展为提高酶的活性和稳定性带来了新的机遇，是当前研究的热点。2004年，Andre K.Geim等首次发现了石墨烯，作为继富勒烯和碳纳米管后又一里程碑式的纳米新材料，石墨烯的制备、性质和应用迅速成为研究热点。而作为氧化还原法制备石墨烯的前体，氧化石墨烯也引起了研究者的极大关注。它的结构与石墨烯大体相同，只是在一层碳原子构成的二维空间无限延伸的基面上连有羧基、羟基、羰基等官能团，故氧化石墨烯亦称功能化石墨烯。因其拥有大量的含氧基团，因此可以通过某些化学反应将一些有机小分子或大分子物质（如酶）组装到氧化石墨烯上，从而使氧化石墨烯具有一些特殊的性质。同时，氧化石墨烯的层间距较原始石墨的层间距大，有利于其他物质分子的插层。如Zhang等人（Langmuir,2010,26,6083～6085）以氧化石墨烯为载体，以辣根过氧化酶为模型酶构建的新型纳米固载酶体系对许多酚类化合物均有较好的去除效果。但到目前为止，文献中还未见以氧化石墨烯为载体对葡萄糖氧化酶进行定向固定化的相关报道。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种操作简单、对酶活损失小的固定化葡萄糖氧化酶的方法，它是以氧化石墨烯为固定化载体，利用酶分子上的糖基与伴刀豆蛋白A的特异性亲和力实现葡萄糖氧化酶的定向固定化，该方法固定化酶制备工艺简单，酶活损失小且固定化效率较高。

[0006] 本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：

[0007] 一种固定化葡萄糖氧化酶的工艺方法，其具体步骤是：

[0008] 1）氧化石墨烯的酯化：将氧化石墨烯溶于蒸馏水中，超声混合得到浓度为1mg/mL的氧化石墨烯悬浊液；向该悬浊液中加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二胺，其配比为在每50μL 1mg/mL氧化石墨烯悬浊液中加入100μg N-羟基硫代琥珀酰亚胺和44.1μg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二胺，然后用2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液(0.1M,pH 6.0)定容使1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二胺终浓度为20mM，振摇30mi n后，高速离心，弃去上清液，在沉淀中加入0.05M 2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液(pH6.0)洗涤，离心分离，最后沉淀在真空干燥24h即得酯化氧化石墨烯；

[0009] 2）定向固定化酶的制备：取上步得到的酯化氧化石墨烯重新悬浮于蒸馏水中，超声分散得到均匀的1mg/mL酯化氧化石墨烯悬浊液，在悬浊液中加入已活化的伴刀豆蛋白A溶液（pH7.0），其配比为在50μL酯化氧化石墨烯溶液中加入300～1500μL 0.1mg/mL伴刀豆蛋白A，反应60min后，4℃高速离心，弃去上清液，沉淀用0.05M 2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液(pH 6.0)充分洗涤；在沉淀中加入pH 4.5～8.0的葡萄糖氧化酶溶液（0.5mg/mL），其配比为质量比伴刀豆蛋白A：葡萄糖氧化酶＝1:5，反应30～120min，4℃高速离心，弃去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲溶液(PBS)充分洗涤后，真空冷冻干燥24h即得定向固定化葡萄糖氧化酶。

[0010] 所述的葡萄糖氧化酶溶液是按照配比为1mg葡萄糖氧化酶溶解于2mL、pH值为4.5～8.0的磷酸盐缓冲液中配制得到；

[0011] 所述的伴刀豆蛋白A活化过程是将伴刀豆蛋白A溶于含0.1mol/L KCl、1mmol/L CaCl2和1mmol/L MnCl2的0.1mol/L PBS（pH 7.0）中配成0.1mg/mL的蛋白质溶液，并于4℃冰箱中活化12h。

[0012] 本发明的有益效果是：1.本发明是一种制备固定化酶的方法，由于采用了伴刀豆蛋白A，实现了葡萄糖氧化酶的定向固定化，避免了随机固定化造成的酶活性位点取向不一致或酶活性位点被掩盖等缺点，提高了固定化效率和固定化酶的活性；2.本发明制备固定化酶的工艺简单，条件温和，对酶活性损失小，酶活可达150～195U/mg。

具体实施方式

[0013] 本发明所用的氧化石墨烯购自中科碳纳米科技有限公司。

[0014] 本发明所用的葡萄糖氧化酶、伴刀豆蛋白A、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺和2-（N-吗啉代）乙磺酸均购于sigma公司。

[0015] 本发明所述的磷酸盐缓冲溶液为Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，不同pH值的缓冲液按如下方法配制得到：称取Na2HPO4及NaH2PO4，分别配制成0.1M的溶液，用pH计标定二者混合液的pH至所需pH。

[0016] 本发明所用的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液按如下方法配制得到：称取1.952g2-（N-吗啉代）乙磺酸于烧杯中，加少量水溶解再转至100mL容量瓶中定容，并用NaOH调pH至6.0，即可配成pH 6.00.1mol/L的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液；称取0.976g
2-（N-吗啉代）乙磺酸于100mL容量瓶中，加少量水定容，并用NaOH调pH至6.0，即可配成pH 6.00.05mol/L的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液。

[0017] 实例1：

[0018] 将氧化石墨烯溶于蒸馏水中，超声混合60min后得到分散均匀的浓度为1mg/mL的氧化石墨烯悬浊液。取50μL 1mg/mL氧化石墨烯悬浮液，向其中加入100μg N-羟基硫代琥珀酰亚胺和44.1μg 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二胺，用2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液(0.1M,pH 6.0)定容使1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二胺终浓度为20mM，剧烈振摇30min后，在13000r/min下离心20min，弃去上清液，在沉淀中加入0.05M 2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液(pH 6.0)洗涤，离心，弃上清液，重复洗涤、离心分离步骤三次，最后沉淀在40℃下真空干燥24h即得酯化氧化石墨烯；

[0019] 将上面得到的酯化氧化石墨烯重新悬浮于蒸馏水中，超声10min得到50μL分散均匀的浓度为1mg/mL的酯化氧化石墨烯悬浊液，向其中加入300μL已活化的0.1mg/mL伴刀豆蛋白A溶液（pH 7.0）反应60min，4℃ 13000r/min下离心20min，用0.05M 2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液(pH 6.0)洗涤3次，得沉淀；在沉淀中加入300μL pH 4.5的0.5mg/mL葡萄糖氧化酶溶液反应30min，4℃ 13000r/min下离心20min，用PBS洗涤3次，沉淀真空冷冻干燥24h即得定向固定化葡萄糖氧化酶。采用比色法测定固定化酶活性，得到固定化酶的酶活为150U/mg。

[0020] 比色法测定酶活方法：取1.5mL溶液A（3.5mg辣根过氧化物酶和3.5mg4-氨基安替吡啉溶于20mL pH 7.0的PBS缓冲液中，再加入1mL 3%的苯酚溶液，即得A液）和1.5mL溶液B（13g葡萄糖中加入87g蒸馏水，即得B溶液）混合均匀后加入到固定化酶中，于25℃剧烈震荡30s，过滤，测其上清液在500nm处不同时间的吸光度值。

[0021] 实例2：

[0022] 氧化石墨烯的酯化方法同实例1；

[0023] 将酯化氧化石墨烯重新悬浮于蒸馏水中，超声10min得到50μL分散均匀的浓度为1mg/mL的酯化氧化石墨烯悬浊液，向其中加入700μL已活化的0.1mg/mL伴刀豆蛋白A（pH7.0）反应60min，13000r/min 4℃离心20min，用0.05M 2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液(pH 6.0)洗涤3次，得沉淀；在沉淀中加入700μL pH 5.5的0.5mg/mL葡萄糖氧化酶溶液反应60min，13000r/min 4℃离心20min，用PBS洗涤3次，沉淀真空冷冻干燥24h即得定向固定化葡萄糖氧化酶。采用比色法测定固定化酶活性，得到固定化酶的酶活为195U/mg。

[0024] 酶活测定方法同实例1。

[0025] 实例3：

[0026] 氧化石墨烯的酯化方法同实例1；

[0027] 将酯化氧化石墨烯重新悬浮于蒸馏水中，超声10mi n得到50μL分散均匀的浓度为1mg/mL的酯化氧化石墨烯悬浊液，向其中加入1000μL已活化的0.1mg/mL伴刀豆蛋白A（pH7.0）反应60min，13000r/min 4℃下离心20min，用0.05M 2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液(pH 6.0)洗涤3次，得沉淀；在沉淀中加入1000μL pH7.0的0.5mg/mL葡萄糖氧化酶溶液反应120min，13000r/min 4℃下离心20min，用PBS洗涤3次，沉淀真空冷冻干燥24h即得定向固定化葡萄糖氧化酶。采用比色法测定固定化酶活性，得到固定化酶的酶活为180U/mg。

[0028] 酶活测定方法同实例1。

[0029] 实例4：

[0030] 氧化石墨烯的酯化方法同实例1；