茶树FPS基因及其应用转让专利
申请号 : CN201210239772.1
文献号 : CN102876689B
文献日 : 2014-06-18
发明人 : 陆建良 , 范方媛 , 徐燕 , 梁月荣 , 郑新强 , 李娜娜
申请人 : 浙江大学
摘要 :
本发明公开了一种茶树FPS基因，其具有SEQ？ID？No：1所示的核苷酸序列。本发明还同时公开了上述茶树FPS基因编码的蛋白质，其具有SEQ？ID？NO：2？所示的氨基酸序列。？本发明还同时公开了上述茶树FPS基因的用途：该基因表达与茶树抗病应激有关，诱导高表达能提高茶树抗病性。
权利要求 :
1.茶树FPS基因，其特征是：为SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的茶树FPS基因编码的蛋白质，其特征是：为SEQ ID NO：2 所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的茶树FPS基因的用途，其特征是：该基因与茶树炭疽病和云纹叶枯病抗病应激有关，并且诱导其高表达能提高茶树对茶树炭疽病的抗病性。
4.一种提高茶树对茶树炭疽病抗病性的方法，其特征是：包括用为SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的基因转化茶树细胞，再将转化后的茶树细胞培育成植株。
说明书 :
茶树FPS基因及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于茶树基因工程领域；具体地说，本发明涉及茶树法呢基焦磷酸合酶(famesyl diphosphate synthase, FPS)基因的分离和分析，还涉及利用调节该基因表达强度进行茶树病害预防。
背景技术
[0002] 茶树病害的发生和流行是茶树和病菌相互作用的结果，常导致茶叶产量和品质下降，严重时还会引起树势衰退。
[0003] 从病菌侵入到茶树出现病害症状的过程，一般可分为侵入期、潜育期和发病期3个阶段。侵入期是指从病菌接触茶树到与茶树建立营养或寄生关系的阶段；潜育期是指从病菌与茶树建立寄生关系到出现明显病害症状的过程；发病期是指染病茶树在外部形态上反映出病理变化和病菌产生繁殖体的阶段。侵入期是影响病害发生发展的重要阶段，在该阶段病菌在茶树组织表面萌发、产生附着器，并通过气孔或伤口入侵茶树组织间隙，茶树细胞对于病菌入侵产生一系列的应激反应，诸如诱导合成植保素抑制病菌附着和生长、通过多酚氧化酶产生邻醌物质毒杀病菌、形成胼胝质阻挡病菌深入、产生它感物质通知邻近植株等，该阶段病原菌和茶树的互作决定了病菌能否侵染茶树，或者说决定了茶树抗病性强弱。
[0004] 茶树病害发生和流行主要受到病菌种类、茶树品种、生长状况和发育阶段、以及环境因子等诸多因素的影响，其中病菌和茶树品种是主要的决定因子，环境则主要起诱发作用。茶树病害通常在病菌致病性强、茶树品种抗性差、环境条件适宜时，才会发生和流行。
[0005] 茶树病害防控主要有三种途径：即通过选育抗性茶树品种、农药控制病菌发生与蔓延、以及营造良好环境抑制病害发生。其中选育抗性品种是优选途径，但是该途径因为机理不明确，致使困难重重；农药控制具有投入少、见效快特点，但容易造成产品和环境污染、以及诱发病菌抗药性；通过农艺措施控制环境因素具有环境友好的优点，但见效慢。如何通过现代分子生物学手段，明确茶树对病害的反应机制，提出相应的病害控制措施是目前乃至今后一段时间内茶学领域的重要研究内容之一。
发明内容
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种茶树法呢基焦磷酸合酶(famesyl diphosphate synthase, FPS)的基因序列及其编码的蛋白质，通过诱导该基因表达可提高茶树抗病性。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种茶树FPS基因，其具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
[0008] 本发明还提供了上述FPS基因编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO：2 所示的氨基酸序列。
[0009] 本发明还提供了上述FPS基因用途：该基因表达与茶树抗病应激有关，诱导高表达可提高茶树抗病性。
[0010] 本发明还同时提供了一种提高茶树抗病性的方法，包括用具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的基因转化茶树细胞，再将转化后的茶树细胞培育成植株。
[0011] 本发明主要针对目前病害发生过程茶树和病菌互作机理不明确等实际问题，通过对茶树病害发生叶片和健康叶片差异基因筛选和克隆，以及基因表达活性与抗病性相关性研究，明确本发明基因表达活性上调与茶树病害发生之间的关系。为通过调节该基因表达活性进行茶树病害控制创造了条件，同时也为通过基因工程手段进行高抗病茶树新材料的创制奠定了基础。
[0012] 本发明是采用了以下技术方案来实现：采用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）和RACE技术分离了与茶树病害响应相关的FPS基因，其具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；提供一种茶树FPS全长的蛋白质序列，其具有如SEQ ID No：2所示序列。
[0013] 本发明还提供了茶树FPS基因表达特性，证明本发明提高FPS基因表达活性可以提高茶树抗病性。
[0014] 实现本发明的具体技术步骤如下：
[0015] 一、茶树FPS基因分离和分析
[0016] 在茶树品种园中采集同品种的病菌侵染叶片和相同成熟度的健康叶片，分别置于液氮中充分研磨后，以TRIZOL（Invitrogen公司）提取总RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提纯化试剂盒（上海生工生物工程有限公司）处理，分别获得病、健叶片的mRNA样本。分别以病、健叶的2µg mRNA为起始物，采用PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit（Clontech Laboratories, Inc）进行双链cDNA合成、酶切、接头连接、消减杂交和扩增，具体操作参照该试剂盒使用说明，获得在病叶中上调表达的差异基因片段，插入TaKaRa pMD®18-T Vector（宝生物工程（大连）有限公司），并转化JM109（宝生物工程（大连）有限公司）感受态大肠杆菌，经蓝白斑筛选，挑取白斑扩增，以M13通用引物（序列如SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4所示）进行菌液PCR，将有插入片段的阳性克隆，委托上海英维捷基公司进行测序。经与美国国家生物信息中心NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的Blastn工具在线比对发现，其中有1条长244bp差异片段与杜仲（Eucommia ulmoides）和葡萄（Vitis vinifera）等植物FPS基因的中间序列高度同源。根据获得的244bp的片段序列，设计了
5’端RACE序列特异性引物SEQ ID No: 5和SEQ ID No:6（预计产物长度约530bp）、以及
3’端RACE序列特异性引物SEQ ID No:7和SEQ ID No:8（预计产物长度为880bp），以上述病菌为害叶片的mRNA为起始物，采用TaKaRa 5'-Full RACE Core Set、TaKaRa 3'-Full RACE Core Set和TaKaRa Taq ™（宝生物工程（大连）有限公司）进行FPS 5’端和3’端序列克隆（具体操作参照试剂盒使用说明），对获得5’RACE和3’RACE产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，以TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（宝生物工程（大连）有®
限公司）对目标条带进行割胶纯化，将纯化的目标条带插入TaKaRa pMD18-T Vector，并转化JM109感受态大肠杆菌，经蓝白斑筛选，挑取白斑扩增，以M13通用引物（SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4）进行菌液PCR，将有插入片段的阳性克隆，委托上海英维捷基公司进行测序，获得了5’端524bp（与中间片段重叠区长118）的RACE产物和3’端870bp（与中间片段的重叠区长101bp）的RACE产物，经与NCBI已知序列比对，上述序列与杜仲和甘草（Glycyrrhiza uralensis）等植物FPS基因的5’端和3’端高度同源。以DNAStar包中SeqMan软件（DNASTAR, Inc.）对获得茶树FPS基因5’端、中间序列和3’端序列进行拼接，得到了茶树FPS基因全长序列。该基因长1419bp，如SEQ ID No： 1所示（加下划线的为对th th
应SEQ ID No：2的序列，下划线最后三个碱基为终止密码子）；具有1029bp（84 -1112 ）的开放阅读框，编码342个氨基酸残基的蛋白质，如SEQ ID No. 2所示。经与NCBI数据库比对发现，茶树FPS氨基酸序列与甘草（Glycyrrhiza uralensis）、人参（Panax ginseng）FPS有86%的一致性和93%的相似性。证明在病叶中高表达的差异序列为茶树FPS基因。根据PredictProtein（http://www.predictprotein.org/）分析显示，茶树FPS定位于细胞质中，具有多聚异戊烯基合酶(polyprenyl synthase)签名序列[LIVMFY]Gx2[FYL]Q[LIVM]xDD[LIVMFY]x[DNG]（x为任意氨基酸残基），属于法尼基焦磷酸（FPP）/牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）合酶家族。研究显示，FPS是植物细胞质异戊二烯代谢途径中一个重要酶类，主要负责催化二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）与异戊烯基焦磷酸（IPP）首尾相接，生成含
10碳的牻牛儿基焦磷酸（GPP），进而再与IPP经首尾相接，合成含15碳的法尼烯基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP）。FPP不仅是许多重要代谢产物如甾体、多萜醇、泛醌等的合成前体；同时在倍半萜环化酶的作用下，生成包括植保素和挥发油成分在内的倍半萜衍生物，而植保素和挥发油成分在植物自身免疫和病虫防御反应中起重要作用。此外，FPS催化过程中的中间体GPP等还能进入叶绿体（质体）参与单萜、二萜、四萜化合物的合成。由此可见，“龙井43”茶树病叶中FPS基因表达上调可能是机体对病原菌侵染所起的一种防御性应激反应之一，以使机体产生更多的抑菌性物质限制病菌生长和进一步侵染。
5’端RACE序列特异性引物SEQ ID No: 5和SEQ ID No:6（预计产物长度约530bp）、以及
3’端RACE序列特异性引物SEQ ID No:7和SEQ ID No:8（预计产物长度为880bp），以上述病菌为害叶片的mRNA为起始物，采用TaKaRa 5'-Full RACE Core Set、TaKaRa 3'-Full RACE Core Set和TaKaRa Taq ™（宝生物工程（大连）有限公司）进行FPS 5’端和3’端序列克隆（具体操作参照试剂盒使用说明），对获得5’RACE和3’RACE产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，以TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（宝生物工程（大连）有®
限公司）对目标条带进行割胶纯化，将纯化的目标条带插入TaKaRa pMD18-T Vector，并转化JM109感受态大肠杆菌，经蓝白斑筛选，挑取白斑扩增，以M13通用引物（SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4）进行菌液PCR，将有插入片段的阳性克隆，委托上海英维捷基公司进行测序，获得了5’端524bp（与中间片段重叠区长118）的RACE产物和3’端870bp（与中间片段的重叠区长101bp）的RACE产物，经与NCBI已知序列比对，上述序列与杜仲和甘草（Glycyrrhiza uralensis）等植物FPS基因的5’端和3’端高度同源。以DNAStar包中SeqMan软件（DNASTAR, Inc.）对获得茶树FPS基因5’端、中间序列和3’端序列进行拼接，得到了茶树FPS基因全长序列。该基因长1419bp，如SEQ ID No： 1所示（加下划线的为对th th
应SEQ ID No：2的序列，下划线最后三个碱基为终止密码子）；具有1029bp（84 -1112 ）的开放阅读框，编码342个氨基酸残基的蛋白质，如SEQ ID No. 2所示。经与NCBI数据库比对发现，茶树FPS氨基酸序列与甘草（Glycyrrhiza uralensis）、人参（Panax ginseng）FPS有86%的一致性和93%的相似性。证明在病叶中高表达的差异序列为茶树FPS基因。根据PredictProtein（http://www.predictprotein.org/）分析显示，茶树FPS定位于细胞质中，具有多聚异戊烯基合酶(polyprenyl synthase)签名序列[LIVMFY]Gx2[FYL]Q[LIVM]xDD[LIVMFY]x[DNG]（x为任意氨基酸残基），属于法尼基焦磷酸（FPP）/牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）合酶家族。研究显示，FPS是植物细胞质异戊二烯代谢途径中一个重要酶类，主要负责催化二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）与异戊烯基焦磷酸（IPP）首尾相接，生成含
10碳的牻牛儿基焦磷酸（GPP），进而再与IPP经首尾相接，合成含15碳的法尼烯基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP）。FPP不仅是许多重要代谢产物如甾体、多萜醇、泛醌等的合成前体；同时在倍半萜环化酶的作用下，生成包括植保素和挥发油成分在内的倍半萜衍生物，而植保素和挥发油成分在植物自身免疫和病虫防御反应中起重要作用。此外，FPS催化过程中的中间体GPP等还能进入叶绿体（质体）参与单萜、二萜、四萜化合物的合成。由此可见，“龙井43”茶树病叶中FPS基因表达上调可能是机体对病原菌侵染所起的一种防御性应激反应之一，以使机体产生更多的抑菌性物质限制病菌生长和进一步侵染。
[0017] 二、FPS基因表达强度与病害关联分析
[0018] 根据上述获得的茶树FPS基因序列，采用DNAStar软件包（DNAStar Inc.）中PrimerSelect设计表达引物，序列如SEQ ID No： 9和SEQ ID No： 10所示（预计产物长度406bp），同时以茶树肌动蛋白(Actin, ACT)基因（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FJ355923）为参比基因，设计用于ACT基因表达的引物，序列如SEQ ID No：11和SEQ ID No：12所示（预计产物344bp）。
[0019] 在品种园中采集不同品种病害发生的叶片，同时采集相同品种同等成熟度的健康叶片为对照，分别提取这些品种的病、健叶总RNA，合成cDNA第一链，采用设计的引物对病、健样品进行RT-PCR，经过琼脂糖凝胶电泳和目的条带光密度分析，并以FPS基因目的条带光密度与参比ACT基因目的条带光密度之比作为FPS基因的相对表达强度，结果显示，不管不同品种罹患的是相同的病害还是不同的病害，这些品种病叶中FPS基因相对表达强度均显著高于同品种的健康叶片。说明FPS基因表达上调是茶树对于病菌入侵的一种普遍应激响应之一，两者之间存在密切的因果关联关系。
[0020] 进一步的，以茉莉酸甲酯（该化合物是已知的、重要的与损伤应激反应相关的植物激素或信号分子）处理茶树叶片，模拟病菌侵染损伤信号，并采用上述RT-PCR技术分析茉莉酸甲酯对FPS基因表达的影响，结果显示，茉莉酸甲酯处理后，茶树叶片FPS基因相对表达强度显著上调，同时后期病害调查显示，经茉莉酸甲酯处理的茶树病害发生程度显著下降。说明FPS基因表达可受病菌入侵等损伤信号诱导，通过外源信号诱导FPS基因高表达，可提高茶树抗病性。
[0021] 在此基础上，设计了用于克隆茶树FPS基因整个开放阅读框、并嵌入有NdeI和SacI酶切位点的引物对，其序列如SEQ ID No：13和SEQ ID No：14所示，提取茶树叶片®mRNA，并以RT-PCR方法获得茶树FPS基因开放阅读框序列，将其插入TaKaRa pMD18-T Vector，并转化JM109感受态大肠杆菌扩增，经测序验证后，以UNIQ-10柱式质粒小量抽提®
试剂盒（上海生工生物有限公司）提取含FPS基因开放阅读框序列的重组pMD18-T Vector，®
并将该质粒命名为pMD18-T-FPS。以组合酶NdeI和SacI （宝生物工程（大连）有限公司）®
对pMD18-T-FPS质粒进行双酶切获得FPS基因开放阅读框，并插入同样酶切的真核双元表达载体TaKaRa pRI 201-AN DNA（宝生物工程（大连）有限公司），转化TG1感受态大肠杆菌扩增后，以UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒提取重组有FPS基因开放阅读框序列的双元表达载体，并将其命名为pRI-201-AN-DNA-FPS。采用冻融交替法将pRI-201-AN-DNA-FPS导人野生发根农杆菌15834。采用农杆菌侵染法将CaMV35S强启动子驱动下的外源FPS基因“浙农25”无菌苗茎段。从产生的转FPS基因发根诱导愈伤组织，将该愈伤组织命名为FPS转基因愈伤。以类似的方法，以无外源FPS基因的野生发根农杆菌15834侵染“浙农25”无菌苗茎段诱导产生的发根和愈伤组织，将该愈伤组织命名为对照愈伤。采用针刺方法将茶树炭疽病菌（Gloeosporium theae-sinesis Miyake）接种于两种愈伤块上，于12h光照/12h黑暗、28℃条件下培养3-5d，观察病斑大小。同时采用引物SEQ ID No： 9和SEQ ID No： 10（FPS基因）和SEQ ID No：11和SEQ ID No： 12对两种愈伤接种病菌后的FPS基因相对表达强度进行分析。结果显示，转FPS基因愈伤块病斑显著小于对照愈伤块上的病斑，而且转FPS基因愈伤块中FPS基因表达强度也显著高于对照愈伤。显然，转FPS基因的愈伤中，在CaMV35S强启动子的驱动下，大量表达外源转入的FPS基因，并使愈伤块的抗炭疽病能力显著提高。
试剂盒（上海生工生物有限公司）提取含FPS基因开放阅读框序列的重组pMD18-T Vector，®
并将该质粒命名为pMD18-T-FPS。以组合酶NdeI和SacI （宝生物工程（大连）有限公司）®
对pMD18-T-FPS质粒进行双酶切获得FPS基因开放阅读框，并插入同样酶切的真核双元表达载体TaKaRa pRI 201-AN DNA（宝生物工程（大连）有限公司），转化TG1感受态大肠杆菌扩增后，以UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒提取重组有FPS基因开放阅读框序列的双元表达载体，并将其命名为pRI-201-AN-DNA-FPS。采用冻融交替法将pRI-201-AN-DNA-FPS导人野生发根农杆菌15834。采用农杆菌侵染法将CaMV35S强启动子驱动下的外源FPS基因“浙农25”无菌苗茎段。从产生的转FPS基因发根诱导愈伤组织，将该愈伤组织命名为FPS转基因愈伤。以类似的方法，以无外源FPS基因的野生发根农杆菌15834侵染“浙农25”无菌苗茎段诱导产生的发根和愈伤组织，将该愈伤组织命名为对照愈伤。采用针刺方法将茶树炭疽病菌（Gloeosporium theae-sinesis Miyake）接种于两种愈伤块上，于12h光照/12h黑暗、28℃条件下培养3-5d，观察病斑大小。同时采用引物SEQ ID No： 9和SEQ ID No： 10（FPS基因）和SEQ ID No：11和SEQ ID No： 12对两种愈伤接种病菌后的FPS基因相对表达强度进行分析。结果显示，转FPS基因愈伤块病斑显著小于对照愈伤块上的病斑，而且转FPS基因愈伤块中FPS基因表达强度也显著高于对照愈伤。显然，转FPS基因的愈伤中，在CaMV35S强启动子的驱动下，大量表达外源转入的FPS基因，并使愈伤块的抗炭疽病能力显著提高。
[0022] 由此可见，FPS基因上调是茶树对病菌入侵的一种防御性反应之一，提高FPS基因表达水平可提高茶树对病菌的抵御能力。
附图说明
[0023] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0024] 图1是“龙井43”茶树健康（左）和罹患炭疽病（右）的叶片对比图；
[0025] 图2是“浙农25”茶树健康（左）和罹患炭疽病（右）的叶片对比图；
[0026] 图3 是“鸠坑”茶树健康（左）和罹患云纹叶枯病（右）的叶片对比图；
[0027] 图4 是茶树病健叶片FPS基因表达情况对比图；
[0028] 图4中：ACT为茶树肌动蛋白参比基因，FPS为茶树法呢烯焦磷酸合酶基因；1为“龙井43”病菌侵害叶、2为“龙井43”健康叶，3为“浙农25”病菌侵害叶、4为“浙农25”健康叶，5为“鸠坑”病菌侵害叶、6为“鸠坑”健康叶；
[0029] 图5是“龙井43”茶树喷施茉莉酸甲酯后FPS基因表达情况对比图；
[0030] 图5中：ACT为茶树肌动蛋白参比基因，FPS为茶树法呢烯焦磷酸合酶基因；1为喷清水6h后叶片、2为喷茉莉酸甲酯6h后叶片，3为喷清水24h后叶片、4为喷茉莉酸甲酯24h后叶片。
[0031] 图6是转FPS基因茶树愈伤与非转FPS基因茶树愈伤炭疽病斑比较图；
[0032] 图6中：左边为转FPS基因茶树愈伤，右边为非转FPS基因茶树愈伤，箭头所指为炭疽病斑。
具体实施方式
[0033] 实施例1
[0034] 在茶树品种园中采摘“龙井43” 被炭疽病菌为害叶片和相同成熟度的健康叶片（图1），分别置于液氮中充分研磨后，以TRIZOL（Invitrogen公司）提取总RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提纯化试剂盒（上海生工生物工程有限公司）处理，分别获得病、健叶片的mRNA样本。分别以病、健叶的2µg mRNA为起始物，采用PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit（Clontech Laboratories, Inc）进行双链cDNA合成、酶切、接头连接、消减杂交和扩增，具体操作参照该试剂盒使用说明，获得在“龙井43”病叶中上调表达的差异基因片段，插入TaKaRa pMD®18-T Vector（宝生物工程（大连）有限公司），并转化JM109（宝生物工程（大连）有限公司）感受态大肠杆菌，具体实验操作参照载体和工程菌使用说明。经蓝白斑筛选，挑取白斑，转接于1ml液体LB培养基中，37℃振荡培养12h；取菌液100μl于新离心管中，6000rpm离心2min，弃上清后，加20μl 重蒸去离子水（ddH20）稀释，用做菌液PCR模板。以M13通用引物（序列如SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4所示）进行菌液PCR，PCR溶液配制和程序设置如表1所示。
[0035] 表1
[0036]
[0037] SEQ ID No: 3 (M13 上游引物) 5’-cgccagggttttcccagtcacgac[0038] SEQ ID No: 4 (M13下游引物) 5’-agcggataacaatttcacacagga
[0039] 将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，将有插入片段的阳性克隆，委托上海英维捷基公司进行测序。经与美国国家生物信息中心NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的Blastn工具在线比对发现，其中有1条长244bp的差异片段与杜仲（Eucommia ulmoides）和葡萄（Vitis vinifera）等植物FPS基因的中间序列高度同源。根据获得的244bp的片段序列，设计了5’端RACE序列特异性引物SEQ ID No: 5和SEQ ID No:6（预计产物长度约530bp）、以及3’端RACE序列特异性引物SEQ ID No:7和SEQ ID No:8（预计产物长度为880bp）。
[0040] SEQ ID No: 5 (FPS 5’RACE out) 5’-tcatctgtccacaagttgtctg[0041] SEQ ID No: 6 (FPS 5’RACE in) 5’-cagcagatccacataataagg
[0042] SEQ ID No:7 (FPS 3’RACE out) 5’-tgccaatgatggcgtaattctc[0043] SEQ ID No:8 (FPS 3’RACE in) 5’-agacaacttgtggacagatgatag 。
[0044] 以上述病菌为害叶片的mRNA为起始物，采用TaKaRa 5'-Full RACE Core Set、TaKaRa 3'-Full RACE Core Set和TaKaRa Taq ™（宝生物工程（大连）有限公司）进行茶树FPS基因5’端和3’端序列克隆（具体操作参照试剂盒使用说明），对获得的5’RACE和3’RACE产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，以TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（宝生物工程（大连）有限公司）对目标条带进行割胶纯化，将纯化的目标条带插入TaKaRa ®pMD18-T Vector，并转化JM109感受态大肠杆菌，具体操作参照纯化试剂盒、载体和工程菌使用说明。经蓝白斑筛选，挑取白斑，转接于LB细菌培养基中扩增，采用上述相同的方法以M13通用引物（SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4）进行菌液PCR，PCR反应溶液配置和程序设置如表1所示。将有插入片段的阳性克隆，委托上海英维捷基公司进行测序，获得了
5’端524bp（与中间片段重叠区长118bp）的RACE产物和3’端870bp（与中间片段的重叠区长101bp）的RACE产物，经与NCBI已知序列比对，上述序列与杜仲和甘草（Glycyrrhiza uralensis）等植物FPS基因的5’端和3’端高度同源。以DNAStar包中SeqMan软件（DNASTAR, Inc.）对获得茶树FPS基因5’端、中间序列和3’端序列进行拼接，得到了茶树th th
FPS基因全长序列。该基因长1419bp，如SEQ ID No：1所示，具有1029bp（84 -1112 ）的开放阅读框，编码342个氨基酸残基的蛋白质，如SEQ ID No. 2所示。经与NCBI数据库比对发现，茶树FPS氨基酸序列与甘草（Glycyrrhiza uralensis）、人参（Panax ginseng）FPS有86%的一致性和93%的相似性。证明在病叶中高表达的差异序列为茶树FPS基因。根据PredictProtein（http://www.predictprotein.org/）分析显示，茶树FPS定位于细胞质中，具有多聚异戊烯基合酶(polyprenyl synthase)签名序列[LIVMFY]Gx2[FYL]Q[LIVM]xDD[LIVMFY]x[DNG]（x为任意氨基酸残基），属于法尼基焦磷酸（FPP）/牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）合酶家族。研究显示，FPS是植物细胞质异戊二烯代谢途径中一个关键酶，主要负责催化二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）与异戊烯基焦磷酸（IPP）首尾相接，生成含
10碳的牻牛儿基焦磷酸（GPP），进而再与IPP经首尾相接，合成含15碳的法尼烯基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP）。FPP不仅是许多重要代谢产物如甾体、多萜醇、泛醌等的合成前体，同时在倍半萜环化酶的作用下，生成包括植保素和挥发油成分在内的倍半萜衍生物，而植保素和挥发油成分在植物自身免疫和病虫防御反应中起重要作用。此外FPS催化过程中的中间体GPP等还能进入叶绿体（质体）参与单萜、二萜、四萜化合物的合成。由此可见，“龙井43”茶树病叶中FPS基因表达上调可能是机体对病原菌侵染所起的一种防御性应激反应之一，以使机体产生更多的抑菌性物质限制病菌生长和进一步侵染。
5’端524bp（与中间片段重叠区长118bp）的RACE产物和3’端870bp（与中间片段的重叠区长101bp）的RACE产物，经与NCBI已知序列比对，上述序列与杜仲和甘草（Glycyrrhiza uralensis）等植物FPS基因的5’端和3’端高度同源。以DNAStar包中SeqMan软件（DNASTAR, Inc.）对获得茶树FPS基因5’端、中间序列和3’端序列进行拼接，得到了茶树th th
FPS基因全长序列。该基因长1419bp，如SEQ ID No：1所示，具有1029bp（84 -1112 ）的开放阅读框，编码342个氨基酸残基的蛋白质，如SEQ ID No. 2所示。经与NCBI数据库比对发现，茶树FPS氨基酸序列与甘草（Glycyrrhiza uralensis）、人参（Panax ginseng）FPS有86%的一致性和93%的相似性。证明在病叶中高表达的差异序列为茶树FPS基因。根据PredictProtein（http://www.predictprotein.org/）分析显示，茶树FPS定位于细胞质中，具有多聚异戊烯基合酶(polyprenyl synthase)签名序列[LIVMFY]Gx2[FYL]Q[LIVM]xDD[LIVMFY]x[DNG]（x为任意氨基酸残基），属于法尼基焦磷酸（FPP）/牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）合酶家族。研究显示，FPS是植物细胞质异戊二烯代谢途径中一个关键酶，主要负责催化二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）与异戊烯基焦磷酸（IPP）首尾相接，生成含
10碳的牻牛儿基焦磷酸（GPP），进而再与IPP经首尾相接，合成含15碳的法尼烯基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP）。FPP不仅是许多重要代谢产物如甾体、多萜醇、泛醌等的合成前体，同时在倍半萜环化酶的作用下，生成包括植保素和挥发油成分在内的倍半萜衍生物，而植保素和挥发油成分在植物自身免疫和病虫防御反应中起重要作用。此外FPS催化过程中的中间体GPP等还能进入叶绿体（质体）参与单萜、二萜、四萜化合物的合成。由此可见，“龙井43”茶树病叶中FPS基因表达上调可能是机体对病原菌侵染所起的一种防御性应激反应之一，以使机体产生更多的抑菌性物质限制病菌生长和进一步侵染。
[0045] 实施例2
[0046] 根据上述获得的茶树FPS基因序列，采用DNAStar软件包（DNAStar Inc.）中PrimerSelect设计表达引物，序列如SEQ ID No： 9和SEQ ID No：10所示（预计产物长度406bp），同时以茶树肌动蛋白(Actin, ACT)基因（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FJ355923）为参比基因，设计用于ACT基因表达的引物，序列如SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示（预计产物344bp）。
[0047] 在品种园中采集罹患炭疽病的“龙井43”（图1）和“浙农25”（图2）、以及罹患云纹叶枯病的“鸠坑”（图3）等品种的病害叶，同时采集相同品种同等成熟度的健康叶片为对照，各取约100mg，以TRIZOL试剂（Invitrogen公司）提取叶片总RNA，以电泳法检测RNA质量，并将各样本RNA浓度调节至500μg/ml，以MMLV第一链cDNA合成试剂盒（上海生工生物工程有限公司）合成cDNA第一链，具体操作参照试剂盒使用说明。以上述cDNA第一链为模板，分别以SEQ ID No： 9和SEQ ID No：10（FPS基因表达）和SEQ ID No：11和SEQ ID No：12（ACT基因表达）为引物对，进行PCR，PCR反应液配制和程序控制见表2。
[0048] 表2
[0049]
[0050] SEQ ID No: 9 (FPS基因表达用上游引物) 5’- aaaggaattaaccgatgatgaaa[0051] SEQ ID No: 10 (FPS基因表达用下游引物) 5- tggcaggtaaaatgagtagtaagc[0052] SEQ ID No: 11 (参比ACT基因表达用上游引物) 5’-tccgttgccctgaagtcct[0053] SEQ ID No: 12 (参比ACT基因表达用下游引物) 5’-tgaagcgaataagcaatgaaaaat[0054] 将PCR产物在1.5%（w/v）琼脂糖凝胶上进行电泳，以捷达JD801凝胶电泳图像分析系统（江苏捷达科技发展有限公司）对电泳结果进行摄像，如图4，并读取目的片段吸光度，以同一样本的FPS基因目的片段的吸光度与参比ACT基因目的片段的吸光度之比作为该样本FPS基因相对表达强度。
[0055] 结果显示，“龙井43”病、健叶中FPS基因相对表达强度分别为0.35±0.05和0.17±0.03，“浙农25”病、健叶中FPS基因相对表达强度分别为0.45±0.03和0.21±0.02，“鸠坑”病、健叶中FPS基因相对表达强度为0.56±0.04和0.29±0.04。可见，不管不同品种罹患的是相同的病害还是不同的病害，这些品种病叶中FPS基因相对表达强度均较健康叶片高1倍左右。说明FPS基因表达上调是茶树对于病菌入侵的一种普遍应激响应之一，两者之间存在密切的因果关联关系。
[0056] 实施例3
[0057] 为了进一步验证FPS基因表达与病害之间的关系，采用可诱导损伤应激反应的植物信号分子茉莉酸甲酯处理茶树叶片，模拟病菌侵染损伤。具体做法为，在病害发生前，以浓度为0.2%（w/v，即2g/1L）茉莉酸甲酯药液喷雾方式处理“龙井43”茶树，药液使用量为2
70ml/m，以清水代替0.2%茉莉酸甲酯药液喷雾为对照，喷后6h和26h，分别采集相同成熟度的处理和对照叶片，并采用实施例2中相同的方法提取总RNA、合成cDNA第一链、RT-PCR、电泳和条带光密度分析。结果如图5所示，茉莉酸甲酯处理6h和24后，茶树叶片FPS基因相对表达强度较喷清水对照提高约1.2倍。同时，1个月后，对喷茉莉酸甲酯和清水的“龙井43”茶树的病害发生调查显示，喷施喷茉莉酸甲酯药液的茶树炭疽病的发病率较喷施清水的对照低75%左右。说明FPS基因表达可受病菌入侵等损伤信号诱导，通过外源信号诱导FPS基因高表达，可提高茶树抗病性。
70ml/m，以清水代替0.2%茉莉酸甲酯药液喷雾为对照，喷后6h和26h，分别采集相同成熟度的处理和对照叶片，并采用实施例2中相同的方法提取总RNA、合成cDNA第一链、RT-PCR、电泳和条带光密度分析。结果如图5所示，茉莉酸甲酯处理6h和24后，茶树叶片FPS基因相对表达强度较喷清水对照提高约1.2倍。同时，1个月后，对喷茉莉酸甲酯和清水的“龙井43”茶树的病害发生调查显示，喷施喷茉莉酸甲酯药液的茶树炭疽病的发病率较喷施清水的对照低75%左右。说明FPS基因表达可受病菌入侵等损伤信号诱导，通过外源信号诱导FPS基因高表达，可提高茶树抗病性。
[0058] 由此可见，FPS基因上调是茶树对病菌入侵的一种防御性反应之一，提高FPS基因表达水平可提高茶树对病菌的抵御能力。
[0059] 实施例4
[0060] 采用DNAStar软件包中MapDraw（DNAStar Inc.）对克隆的茶树FPS基因的开放阅读框，即SEQ ID No：1中第84位到1112位之间的核苷酸，进行内切酶切点分析，发现该开放阅读框中无NdeI和SacI酶切位点，设计了嵌入有NdeI和SacI酶切位点的、能扩增茶树FPS基因整个开放阅读框的引物对，其序列如SEQ ID No：13和SEQ ID No：14所示，在SEQ ID No：13的5’端包含了NdeI酶切位点序列（CATATG）以及2个保护碱基（AA），在SEQ ID No：14的5’端包含了SacI酶切位点序列（GAGCTC）以及2个保护碱基（AA）。以上述实施例1中的纯化的茶树叶片mRNA为起始物，以MMLV第一链cDNA合成试剂盒（上海生工生物工程有限公司）合成cDNA第一链，具体操作参照试剂盒使用说明。配制总体积为25μl PCR反应液，其中包括10×PCR缓冲液2.5μl、25mmol/L MgCl2 2μl 、10mmol/L dNTP 0.5μl、 cDNA第一链2μl、20μmol/L引物（SEQ ID No：13和SEQ ID No：14）各1μl、5U/μl Taq DNA聚合酶0.2μl、ddH2O 15.8μl；进行PCR反应，其程序为：95℃预变性4min、1个循环，94变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1.5min、40个循环，72℃后延伸10min。对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下割取目标条带，以TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（宝生物工程（大连）有限公司）对目标条带进行纯化，将纯化的目标条带®
插入TaKaRa pMD18-T Vector，并转化JM109感受态大肠杆菌，具体操作参照纯化试剂盒、载体和工程菌使用说明。经蓝白斑筛选，挑取白斑，转接于LB细菌培养基中扩增，采用上述相同的方法以M13通用引物（SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4）进行菌液PCR，PCR反应溶液配置和程序设置如表1所示。将有插入片段的阳性克隆，委托上海英维捷基公司进行测序，结果显示，获得的序列与实施例1中茶树FPS的开放阅读框序列一致。将测序验证后的阳性克隆接种于LB液体培养基中，37℃震荡培养12h，6000rpm离心5min，收集细菌沉淀，以UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒（上海生工生物有限公司）提取含FPS基因开放阅读框序® ®
列的重组pMD18-T Vector，并将该质粒命名为pMD18-T-FPS。分别以组合酶NdeI和SacI ®
（宝生物工程（大连）有限公司）对pMD18-T-FPS质粒进行双酶切，经过电泳，以胶纯化试剂盒分别回收含FPS基因目的片段，具体操作参照内切酶和试剂盒相关说明。采用相同方法对真核双元表达载体TaKaRa pRI 201-AN DNA（宝生物工程（大连）有限公司，将外源基因的开放阅读框插入该表达载体，可以实现外源基因在CaMV35S启动子的驱动下进行强烈表达）进行双酶切（NdeI和SacI）、电泳和割胶纯化线性化载体。以T4DNA连接酶（宝生物工程（大连）有限公司）将回收的FPS基因开放阅读框序列和线性化载体进行连接，连接反应体系为25μl，其中包括10×T4 DNA连接酶缓冲液2.5μl、FPS开放阅读框序列5μl（0.3 pmol）、线性化pRI 201-AN DNA载体2μl（0.03 pmol）、2000U T4DNA连接酶1μl 、以及ddH2O 14.5μl，于16℃条件下连接过夜。在连接体系中加入3mol/L醋酸钠（pH5.2）2.5 μl和62.5μl的冷无水乙醇，于-20℃放置60min，于12000rpm、4℃离心收集沉淀，并溶解在25μl TE缓冲液，并转化TG1感受态大肠杆菌，并涂布于含50 μg/ml卡那霉素LB固体培养基上尽进行抗性筛选，将阳性克隆转接于LB液体培养基中，37℃扩增。以上述SEQ ID No：13和SEQ ID No：14引物进行菌液PCR验证，将有FPS基因开放阅读框插入的序列阳性克隆进行扩增，并以UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒提取重组有FPS基因开放阅读框序列的双元表达载体，并将其命名为pRI-201-AN-DNA-FPS。采用冻融交替法[可参考：Hofgen R，Willmitzer L．Nucleic acid Research，1988，16(20)：9877.]，将pRI-201-AN-DNA-FPS导人野生发根农杆菌15834。将扩繁至OD600 为0.5~0.8的重组农杆菌菌液侵染已培养
60~70 d苗龄的“浙农25”无菌苗茎段15 min，在添加100 mmol/L 乙酰丁香酮的YMB 固体培养基上共培养2d，在含500 mg/L头胞噻肟钠（上海生工生物有限公司）的MS 培养基上诱导转化[可参考：张广辉，梁月荣，陆建良. 茶叶科学，2006，26(1):1-10]，将获得的有外源FPS基因的发根，转接于含2mg/L 2-4-D、1.5mg/L KT（6-糠氨基嘌呤）、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂的MS培养基上，12h光照/12h黑暗、25℃条件下培养，诱导愈伤组织，将该愈伤组织命名为FPS转基因愈伤。以类似的方法，以野生发根农杆菌15834侵染“浙农25”无菌苗茎段，并诱导发根和愈伤组织，将该愈伤组织命名为对照愈伤。将上述两种愈伤切成长宽厚为8mm×4mm×2mm的块状，于上述愈伤诱导培养基中培养3d（条件同上）以愈合伤口，之后
4
将愈伤块取出置于衬有湿润滤纸的培养皿中，采用针刺的方法将浓度约为10 个/ml的茶树炭疽病菌（Gloeosporium theae-sinesis Miyake）接种于愈伤块上，于12h光照/12h黑暗、28℃条件下培养3-5d。观察显示，转FPS基因愈伤块病斑很小，仅为对照愈伤块的1/4左右，如图6所示。对愈伤块进行取样，并采用实施例2中的方法进行FPS基因相对表达强度分析，结果显示，转FPS基因愈伤块中，FPS基因表达强度是对照愈伤的3倍以上。由此可见，转FPS基因的愈伤中，在CaMV35S强启动子的驱动下，大量表达外源转入的FPS基因，并使愈伤块的抗炭疽病能力显著提高。
插入TaKaRa pMD18-T Vector，并转化JM109感受态大肠杆菌，具体操作参照纯化试剂盒、载体和工程菌使用说明。经蓝白斑筛选，挑取白斑，转接于LB细菌培养基中扩增，采用上述相同的方法以M13通用引物（SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4）进行菌液PCR，PCR反应溶液配置和程序设置如表1所示。将有插入片段的阳性克隆，委托上海英维捷基公司进行测序，结果显示，获得的序列与实施例1中茶树FPS的开放阅读框序列一致。将测序验证后的阳性克隆接种于LB液体培养基中，37℃震荡培养12h，6000rpm离心5min，收集细菌沉淀，以UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒（上海生工生物有限公司）提取含FPS基因开放阅读框序® ®
列的重组pMD18-T Vector，并将该质粒命名为pMD18-T-FPS。分别以组合酶NdeI和SacI ®
（宝生物工程（大连）有限公司）对pMD18-T-FPS质粒进行双酶切，经过电泳，以胶纯化试剂盒分别回收含FPS基因目的片段，具体操作参照内切酶和试剂盒相关说明。采用相同方法对真核双元表达载体TaKaRa pRI 201-AN DNA（宝生物工程（大连）有限公司，将外源基因的开放阅读框插入该表达载体，可以实现外源基因在CaMV35S启动子的驱动下进行强烈表达）进行双酶切（NdeI和SacI）、电泳和割胶纯化线性化载体。以T4DNA连接酶（宝生物工程（大连）有限公司）将回收的FPS基因开放阅读框序列和线性化载体进行连接，连接反应体系为25μl，其中包括10×T4 DNA连接酶缓冲液2.5μl、FPS开放阅读框序列5μl（0.3 pmol）、线性化pRI 201-AN DNA载体2μl（0.03 pmol）、2000U T4DNA连接酶1μl 、以及ddH2O 14.5μl，于16℃条件下连接过夜。在连接体系中加入3mol/L醋酸钠（pH5.2）2.5 μl和62.5μl的冷无水乙醇，于-20℃放置60min，于12000rpm、4℃离心收集沉淀，并溶解在25μl TE缓冲液，并转化TG1感受态大肠杆菌，并涂布于含50 μg/ml卡那霉素LB固体培养基上尽进行抗性筛选，将阳性克隆转接于LB液体培养基中，37℃扩增。以上述SEQ ID No：13和SEQ ID No：14引物进行菌液PCR验证，将有FPS基因开放阅读框插入的序列阳性克隆进行扩增，并以UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒提取重组有FPS基因开放阅读框序列的双元表达载体，并将其命名为pRI-201-AN-DNA-FPS。采用冻融交替法[可参考：Hofgen R，Willmitzer L．Nucleic acid Research，1988，16(20)：9877.]，将pRI-201-AN-DNA-FPS导人野生发根农杆菌15834。将扩繁至OD600 为0.5~0.8的重组农杆菌菌液侵染已培养
60~70 d苗龄的“浙农25”无菌苗茎段15 min，在添加100 mmol/L 乙酰丁香酮的YMB 固体培养基上共培养2d，在含500 mg/L头胞噻肟钠（上海生工生物有限公司）的MS 培养基上诱导转化[可参考：张广辉，梁月荣，陆建良. 茶叶科学，2006，26(1):1-10]，将获得的有外源FPS基因的发根，转接于含2mg/L 2-4-D、1.5mg/L KT（6-糠氨基嘌呤）、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂的MS培养基上，12h光照/12h黑暗、25℃条件下培养，诱导愈伤组织，将该愈伤组织命名为FPS转基因愈伤。以类似的方法，以野生发根农杆菌15834侵染“浙农25”无菌苗茎段，并诱导发根和愈伤组织，将该愈伤组织命名为对照愈伤。将上述两种愈伤切成长宽厚为8mm×4mm×2mm的块状，于上述愈伤诱导培养基中培养3d（条件同上）以愈合伤口，之后
4
将愈伤块取出置于衬有湿润滤纸的培养皿中，采用针刺的方法将浓度约为10 个/ml的茶树炭疽病菌（Gloeosporium theae-sinesis Miyake）接种于愈伤块上，于12h光照/12h黑暗、28℃条件下培养3-5d。观察显示，转FPS基因愈伤块病斑很小，仅为对照愈伤块的1/4左右，如图6所示。对愈伤块进行取样，并采用实施例2中的方法进行FPS基因相对表达强度分析，结果显示，转FPS基因愈伤块中，FPS基因表达强度是对照愈伤的3倍以上。由此可见，转FPS基因的愈伤中，在CaMV35S强启动子的驱动下，大量表达外源转入的FPS基因，并使愈伤块的抗炭疽病能力显著提高。
[0061] SEQ ID No: 13 5’ - aacatatgatgagcgatctaaagtcgaaattc
[0062] SEQ ID No: 14 5’ - aagagctcctacttctgcctcttatatatctt
[0063] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。