PiggyBac转座子介导的肌肉特异表达A-FABP通用载体构建

摘要

本发明公开了一种PiggyBac转座子介导的肌肉特异表达A-FABP通用载体的构建方法。全基因合成一段包括PiggyBac转座子转座必需的PB5’端与PB3’端的DNA序列，并且在PB5’末端和PB3’末端中间引入多克隆位点。以pSP72商业化质粒为基础完成PiggyBac骨架载体构建。再将LoxP锚定的新霉素抗性基因、绿色荧光蛋白基因（LoxP-NEO-LoxP-EGFP）以及牛α-actin启动子和牛A-FABP基因克隆到PiggyBac骨架载体多克隆位点中，最终构建完成PiggyBac-NEO-EGFP-actin-AFABP通用型表达载体。通过分离并转染牛成纤维细胞，表明通过上述方法构建的通用型表达载体可在成纤维细胞中实现高效转座，在很大程度上提高了目的基因的整合效率。可用于制备提高肉中多不饱和脂肪酸、增加瘦肉率等多种用途，具有很高的通用性。

权利要求

1.一种PiggyBac转座子介导的肌肉特异表达A-FABP通用载体的构建方法，其特征在于，通过全基因合成PiggyBac转座子载体转座所发生转座必需的PB5'碱基序列和PB3'碱基序列，并在两序列中间引入多克隆位点FseI、MluI、PacI、NotI、HindIII、BamHI、BstBI和AscI；在商业化质粒pSP72基础上完成PiggyBac转座子骨架载体构建；再将LoxP锚定的新霉素抗性基因(Neomycine/NEO)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)以及α-肌动蛋白启动子(α-actin promoter)和牛A-FABP基因克隆到多克隆位点FseI、MluI、PacI、NotI、HindIII、BamHI、BstBI和AscI中，最终构建完成PiggyBac-NEO-EGFP-actin-AFABP通用型表达载体；

所述PB5’端和PB3’端碱基序列为：

PB5’端碱基序列：

CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATCGTGACTAATATATAATAAAATGGGTAGTTCTTTAGACGATGAGCATATCCTCTCTGCTCTTCTGCAAAGCGATGACGAGCTTGTTGGTGAGGATTCTGACAGTGAAATATCAGATCACGTAAGTGAAGATGACGTCCAGAGCGATACAGAAGAAGCGTTTATAGATGAGGTACATGAAGTGCAGCCAACGTCAAGCGGTAGTGAAATATTAGACGAACAAAATGTTATTGAACAACCAGGTTCTTCATTGGCTTCTAACAGAATCTTGACCTTGCCACAGAGGACTATTAGAGGTAAGAATAAACATTGTTGGTCAACTTCAAAGTCCACGAGGCGTAGCCGAGTCTCTGCACTGAACATTGTCAGAT；

PB3’端碱基序列：

CCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGCGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGGTTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACATACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAAAAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTAAACATTCTCTCTTTTACAAAAATAAACTTATTTTGTACTTTAAAAACAGTCATGTTGTATTATAAAATAAGTAATTAGCTTAACTTATACATAATAGAAACAAATTATACTTATTAGTCAGTCAGAAACAACTTTGGCACATATCAATATTATGCTCTCGACAAATAACTTTTTTGCATTTTTTGCACGATGCATTTGCCTTTCGCCTTATTTTAGAGGGGCAGTAAGTACAGTAAGTACGTTTTTTCATTACTGGCTCTTCAGTACTGTCATCTGATGTACCAGGCACTTCATTTGGCAAAATATTAGAGATATTATCGCGCAAATATCTCTTCAAAGTAGGAGCTTCTAAACGCTTACGCATAAACGATGACGTCAGGCTCATGTAAAGGTTTCTCATAAATTTTTTGCGACTTTGAACCTTTTCTCCCTTGCTACTGACATTATGGCTGTATATAATAAAAGAATTTATGCAGGCAATGTTTATCATTCCGTACAATAATGCCATAGGCCACCTATTCGTCTTCCTACTGCAGGTCATCACAGAACACATTTGGTCTAGCGTGTCCACTCCGCCTTTAGTTTGATTATAATACATAACCATTTGCGGTTTACCGGTACTTTCGTTGATAGAAGCATCCTCATCACAAGATGATAATAAGTATACCATCTTAGCTGGCTTCGGTTTATATGAGACGAGAGTAAGGGGTCCGTCAAAACAAAACATCGATGTTCCCACTGGCCTGGAGCGACTGTT；

在克隆新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因时所用到的引物序列为：

在克隆α-肌动蛋白启动子时所用到的引物序列为：

在克隆牛A-FABP基因时所用到的引物序列为：

所述的引入的多克隆位点为FseI、MluI、PacI、NotI、HindIII、BamHI、BstBI和AscI序列分别为：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多克隆位点还可引入Fat-1、leptin基因用于基因功能研究或制备转基因动物，体现载体的通用型。

3.权利要求1所述方法制备的PiggyBac转座子介导的肌肉特异表达

A-FABP通用型载体用于分离培养牛成纤维细胞的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，利用不同稀释比例和考马斯亮蓝染色法对载体转座效果进行鉴定分析。

说明书

PiggyBac转座子介导的肌肉特异表达A-FABP通用载体构

建

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程或转基因动物研究技术领域，涉及载体的构建，特别是一种高整合效率、高富集效率的PiggyBac转座子介导的肌肉特异表达A-FABP通用载体的构建，适用于基因功能研究及转基因动物制备。

背景技术

[0002] 研究证实，牛肉中肌内脂肪含量是影响牛肉品质的一个重要因素，肌内脂肪含量低将严重降低牛肉品质。肌内脂肪含量与甘油三脂的沉积密切相关，调节甘油三酯在动物体内不同位置的沉积是调节肌内脂肪含量的先决条件。随着生物技术的发展研究发现，甘油三酯在动物体内的代谢和运输与脂肪酸结合蛋白（FABPs）的关联性很大，尤其是脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因(A-FABP)，将A-FABP基因转入到哺乳动物细胞中能够加快甘油三酯的聚集（Kralisch S，StePan H，et al.Serum levels of adipocyte fatty acid Binding Protein are increased in gestational diabetes mellitus.Eur J Endocrinol,2009）。然而A-FABP基因只在脂肪组织中高表达，在肌肉细胞中表达很少，朱丹丹等人筛选了牛的骨骼肌特异性启动子α-actin，通过α-actin启动子特异性启动A-FABP基因在肌细胞中的表达，可以极大地提高肌内脂肪含量，具有重要的现实意义。

[0003] PiggyBac转座子具有转座活性高，负载量大，并且能长期稳定的表达等优点，能够用于转基因动物的研究。2005年，丁昇首次将PiggyBac转座子应用于人和小鼠的基因功能研究，实现了人和小鼠细胞株中高效导入外源基因并稳定表达，并且培育出了带荧光的转基因小鼠（Ding S，Wu X，et al.Efficient transposition of the piggyBac（PB）transposon in mammalian cells and mice.Cell，2005）。该研究证明PiggyBac转座子能够在哺乳动物中实现高效转座以及用于基因功能研究和转基因动物制备成为可能，并在很大程度上可以提高转基因动物的成功率；同时，PiggyBac转座子在基因组中TTAA位点特异识别并重组整合的特性，在一定程度上克服了传统转基因研究中随机整合所存在的外源基因受位置效应影响等而表达量低、干扰临近基因表达等的不足，这将在今后转基因研究中具有重要应用前景。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于，提供一种转基因牛的PiggyBac转座子通用型、高富集效率载体的构建方法，该载体可用于研究基因功能或制备生产转基因牛。

[0005] 为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

[0006] 一种PiggyBac转座子介导的肌肉特异表达A-FABP通用型载体的构建方法，其特征在于，通过全基因合成PiggyBac转座子载体转座所发生转座必需的PB5'碱基序列和PB3'碱基序列，并在两序列中间引入多克隆位点FseI、MluI、PacI、NotI、HindIII、BamHI、BstBI和AscI；在商业化质粒pSP72基础上完成PiggyBac转座子骨架载体构建；再将LoxP锚定的新霉素抗性基因（Neomycin/NEO）和绿色荧光蛋白基因（EGFP）以及α-肌动蛋白启动子（α-actin promoter）和牛A-FABP基因克隆到多克隆位点FseI、MluI、PacI、NotI、HindIII、BamHI、BstBI和AscI中，最终构建完成PiggyBac-NEO-EGFP-actin-AFABP通用型表达载体。

[0007] 所述PB5’端和PB3’端碱基序列为：

[0008] PB5’端碱基序列：

[0009] CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAA

[0010] ATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGG

[0011] ACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGC

[0012] GGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATG

[0013] ACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATT

[0014] ATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTC

[0015] TTGTTATAGATATCGTGACTAATATAATAAAATGGGTAGTTCTTTAGAC

[0016] GATGAGCATATCCTCTCTGCTCTTCTGCAAAGCGATGACGAGCTTGTTG

[0017] GTGAGGATTCTGACAGTGAAATATCAGATCACGTAAGTGAAGATGACG

[0018] TCCAGAGCGATACAGAAGAAGCGTTTATAGATGAGGTACATGAAGTGC

[0019] AGCCAACGTCAAGCGGTAGTGAAATATTAGACGAACAAAATGTTATTG

[0020] AACAACCAGGTTCTTCATTGGCTTCTAACAGAATCTTGACCTTGCCACA

[0021] GAGGACTATTAGAGGTAAGAATAAACATTGTTGGTCAACTTCAAAGTC

[0022] CACGAGGCGTAGCCGAGTCTCTGCACTGAACATTGTCAGAT；

[0023] PB3’端碱基序列：

[0024] CCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATG

[0025] CGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGGTTTATTTAT

[0026] TAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACATACTAATAAT

[0027] AAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAAAAAAAAACA

[0028] AAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTAAACATTCTCT

[0029] CTTTTACAAAAATAAACTTATTTTGTACTTTAAAAACAGTCATGTTGTAT

[0030] TATAAAATAAGTAATTAGCTTAACTTATACATAATAGAAACAAATTATAC

[0031] TTATTAGTCAGTCAGAAACAACTTTGGCACATATCAATATTATGCTCTCG

[0032] ACAAATAACTTTTTTGCATTTTTTGCACGATGCATTTGCCTTTCGCCTTA

[0033] TTTTAGAGGGGCAGTAAGTACAGTAAGTACGTTTTTTCATTACTGGCTC

[0034] TTCAGTACTGTCATCTGATGTACCAGGCACTTCATTTGGCAAAATATTAG

[0035] AGATATTATCGCGCAAATATCTCTTCAAAGTAGGAGCTTCTAAACGCTT

[0036] ACGCATAAACGATGACGTCAGGCTCATGTAAAGGTTTCTCATAAATTTT

[0037] TTGCGACTTTGAACCTTTTCTCCCTTGCTACTGACATTATGGCTGTATAT

[0038] AATAAAAGAATTTATGCAGGCAATGTTTATCATTCCGTACAATAATGCCA

[0039] TAGGCCACCTATTCGTCTTCCTACTGCAGGTCATCACAGAACACATTTG

[0040] GTCTAGCGTGTCCACTCCGCCTTTAGTTTGATTATAATACATAACCATTT

[0041] GCGGTTTACCGGTACTTTCGTTGATAGAAGCATCCTCATCACAAGATGA

[0042] TAATAAGTATACCATCTTAGCTGGCTTCGGTTTATATGAGACGAGAGTAA

[0043] GGGGTCCGTCAAAACAAAACATCGATGTTCCCACTGGCCTGGAGCGAC

[0044] TGTT。

[0045] 克隆EGFP编码区时所用引物序列为：

[0046] EGFP-F:CTATGCTAGCTCGCCACCATGGTGAGCAAG；

[0047] NheI 翻译起始

[0048] EGFP-R:TACCTCTAGACGCGGCCGCTTTACTTGTAC。

[0049] XbaI 翻译终止

[0050] 克隆EGFP表达框（CMV启动子，EGFP编码区序列，SV40加尾信号）[0051] 时所用引物序列为：

[0052] EGFP-F:ATCGTCTAGAAGTTATTAATAGTAATCAATT；

[0053] XbaI

[0054] EGFP-R:ACTTGTCGACATGAGTTTGGACAAACCAC。

[0055] SalI

[0056] 克隆Neomycin和EGFP基因时所用到的引物序列为：

[0057] NE-F：CGAGTTCGAATCGTTAACCTACTCGAGATAAC；

[0058] BstBI

[0059] NE-R：CATTGGCGCGCCAGATACATTGATGAGTTTGGAC。

[0060] AscI

[0061] 克隆α-肌动蛋白启动子时所用到的引物序列为：

[0062] actin-F：CTATGGCCGGCCGGAAAAAACAGTGAGAAGCACCAAC；

[0063] FseI

[0064] actin-R：TCCGACGCGTGGTATCTGGTTTCTGCAAGGACAGG。

[0065] MluI

[0066] 克隆牛A-FABP基因时所用到的引物序列为：

[0067] FABP-F：TCCGACGCGTATGTGTGATGCATTTGTAGGTACCT；

[0068] MluI

[0069] FABP-R：ATCCTTAATTAAAAATCTAAAAAGTTTTATTTAACCA。

[0070] PacI

[0071] 所述的引入的多克隆位点为FseI、MluI、PacI、NotI、HindIII、BamHI、[0072] BstBI和AscI序列分别为：

[0073] GGCCGGCCGACGACGCGTCGACTTAATTAAGGTTTTCCTTTTGCGGCCGC

[0074] FseI MluI PacI NotI

[0075] TTTTTTCCTTCCCAAGCTTGGGCGCGGATCCGCGATGTTCGAAGTACTT

[0076] HindIII BamHI BstBI

[0077] GGCGCGCC。

[0078] AscI

[0079] 通过分离并转染牛成纤维细胞，表明通过上述方法构建的通用型表达载体可在成纤维细胞中实现高效转座，在很大程度上提高了目的基因的整合效率和阳性细胞富集效率。本发明构建的转座子通用型表达载体一方面可在成肌细胞和肌肉组织中特异表达，为培育富含肌内脂肪转基因肉牛提供高效的表达载体。同时，载体预留的多克隆位点可方便替换为其它功能基因（如Fat-1、Leptin）表达框，可用于制备提高肉中多不饱和脂肪酸、增加瘦肉率等多种用途，具有很高的通用性。

附图说明

[0080] 图1合成载体所需的各个目的片段琼脂糖凝胶电泳图；

[0081] 图2构建PiggyBac-NEO-EGFP-actin-AFABP载体示意图；

[0082] 图3秦川牛耳尖原代成纤维细胞分离；

[0083] 图4PiggyBac-NEO-EGFP-actin-AFABP载体成纤维细胞高效转座鉴定；

[0084] 以下结合附图和具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。

具体实施方式

[0085] 按照本发明的技术方案，PiggyBac转座子介导的肌肉特异表达A-FABP通用载体的构建方法，运用全基因合成PiggyBac转座子转座所必需的PB5’末端与PB3’末端序列（两末端碱基为PiggyBac特征序列TTAA），其中PB5’末端加入酶切位点KpnI，PB3’末端加入酶切位点XhoI,PB5’末端和PB3’末端中间引入多克隆位点FseI、MluI、PacI、NotI、HindIII、BamHI、BstBI、AscI，然后通过KpnI和XhoI双酶切全基因合成序列和pSP72商业化质粒并将两个酶切片段通过上述酶切位点进行连接，完成PiggyBac骨架载体。

[0086] 以改造并去除PEGFP-N1多克隆位点质粒为模板，克隆EGFP表达框序列并与Ploxp质粒中新霉素抗性基因（Neomycin/NEO）相连接。通过BstBI/AscI内切酶双酶切将克隆得到的新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因（EGFP）序列（LoxP-NEO-LoxP-EGFP）连接到位于PiggyBac骨架载体多克隆位点的BstBI/Asc中；然后依次将牛α-肌动蛋白（α-actin）启动子连入FseI/MluI位点；牛A-FABP基因连入MluI/PacI位点，完成PiggyBac-NEO-EGFP-actin-AFABP通用性表达载体的构建。将载体通过脂质体法转染牛成纤维细胞，通过G418药物筛选并比较单克隆点数，对转座子载体功能进行验证。

[0087] 其中，新霉素抗性基因（Neomycin）由LoxP序列锚定，可通过CRE-LoxP系统用于转基因后期的标记去除（Marker free）。A-FABP基因包括该基因完整编码框（CDS区）和加尾信号（PolyA），双报告基因新霉素抗性基因（Neomycin）和绿色荧光蛋白基因（EGFP）分别由PGK启动子和CMV启动子来启动。多克隆位点也可加入其它外源基因进行转基因研究（见图1）。

[0088] 全基因合成PB5’末端和PB3’末端序列：

[0089] CCGCTCGAG CCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAG

[0090] XhoI PB3’末端→

[0091] ATAATCATGCGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAG

[0092] GTTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACA

[0093] TACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAA

[0094] AAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTA

[0095] AACATTCTCTCTTTTACAAAAATAAACTTATTTTGTACTTTAAAAACAGT

[0096] CATGTTGTATTATAAAATAAGTAATTAGCTTAACTTATACATAATAGAAAC

[0097] AAATTATACTTATTAGTCAGTCAGAAACAACTTTGGCACATATCAATATT

[0098] ATGCTCTCGACAAATAACTTTTTTGCATTTTTTGCACGATGCATTTGCCT

[0099] TTCGCCTTATTTTAGAGGGGCAGTAAGTACAGTAAGTACGTTTTTTCATT

[0100] ACTGGCTCTTCAGTACTGTCATCTGATGTACCAGGCACTTCATTTGGCA

[0101] AAATATTAGAGATATTATCGCGCAAATATCTCTTCAAAGTAGGAGCTTCT

[0102] AAACGCTTACGCATAAACGATGACGTCAGGCTCATGTAAAGGTTTCTCA

[0103] TAAATTTTTTGCGACTTTGAACCTTTTCTCCCTTGCTACTGACATTATGG

[0104] CTGTATATAATAAAAGAATTTATGCAGGCAATGTTTATCATTCCGTACAAT

[0105] AATGCCATAGGCCACCTATTCGTCTTCCTACTGCAGGTCATCACAGAAC

[0106] ACATTTGGTCTAGCGTGTCCACTCCGCCTTTAGTTTGATTATAATACATA

[0107] ACCATTTGCGGTTTACCGGTACTTTCGTTGATAGAAGCATCCTCATCAC

[0108] AAGATGATAATAAGTATACCATCTTAGCTGGCTTCGGTTTATATGAGACG

[0109] AGAGTAAGGGGTCCGTCAAAACAAAACATCGATGTTCCCACTGGCCTG

[0110] GAGCGACTGTTGGCCGGCCGACGACGCGTCGACTTAATTAAGGTTTTC

[0111] FseI MluI PacI

[0112] CTTTTGCGGCCGCTTTTTTCCTTCCCAAGCTTGGGCGCGGATCCGCGAT

[0113] NotI HindIII BamHI

[0114] GTTCGAAGTACTTGGCGCGCCATCTGACAATGTTCAGTGCAGAGACTC

[0115] BstBI AscI

[0116] GGCTACGCCTCGTGGACTTTGAAGTTGACCAACAATGTTTATTCTTACC

[0117] TCTAATAGTCCTCTGTGGCAAGGTCAAGATTCTGTTAGAAGCCAATGAA

[0118] GAACCTGGTTGTTCAATAACATTTTGTTCGTCTAATATTTCACTACCGCT

[0119] TGACGTTGGCTGCACTTCATGTACCTCATCTATAAACGCTTCTTCTGTAT

[0120] CGCTCTGGACGTCATCTTCACTTACGTGATCTGATATTTCACTGTCAGAA

[0121] TCCTCACCAACAAGCTCGTCATCGCTTTGCAGAAGAGCAGAGAGGATA

[0122] TGCTCATCGTCTAAAGAACTACCCATTTTATTATATATTAGTCACGATATC

[0123] TATAACAAGAAAATATATATATAATAAGTTATCACGTAAGTAGAACATGA

[0124] AATAACAATATAATTATCGTATGAGTTAAATCTTAAAAGTCACGTAAAAG

[0125] ATAATCATGCGTCATTTTGACTCACGCGGTCGTTATAGTTCAAAATCAGT

[0126] GACACTTACCGCATTGACAAGCACGCCTCACGGGAGCTCCAAGCGGC

[0127] GACTGAGATGTCCTAAATGCACAGCGACGGATTCGCGCTATTTAGAAA

[0128] GAGAGAGCAATATTTCAAGAATGCATGCGTCAATTTTACGCAGACTATC

[0129] TTTCTAGGG AAAAGATTTGCGCTTTACTCGACCTAAACTTTAAAC

[0130] ←PB5’末端

[0131] AGGTCATAGAATCTTCGTTTGACAAAAACCACATTGTGGGGTACCCCG

[0132] KpnI

[0133] 克隆EGFP编码区时所用引物序列为：

[0134] EGFPcds-F:CTATGCTAGCTCGCCACCATGGTGAGCAAG；

[0135] NheI 翻译起始

[0136] EGFPcds-R:TACCTCTAGACGCGGCCGCTTTACTTGTAC。

[0137] XbaI 翻译终止

[0138] 克隆EGFP表达框（CMV启动子，EGFP编码区序列，SV40加尾信号）时所用引物序列为：

[0139] EGFP-F:ATCGTCTAGAAGTTATTAATAGTAATCAATT

[0140] XbaI

[0141] EGFP-R:ACTTGTCGACATGAGTTTGGACAAACCAC

[0142] SalI

[0143] 克隆Neomycin和EGFP基因引物序列为：

[0144] NE-F：CGAGTTCGAATCGTTAACCTACTCGAGATAAC；

[0145] BstBI

[0146] NE-R：CATTGGCGCGCCAGATACATTGATGAGTTTGGAC。

[0147] AscI

[0148] 克隆α-actin启动子引物序列为：

[0149] actin-F：CTATGGCCGGCCGGAAAAAACAGTGAGAAGCACCAAC；

[0150] FseI

[0151] actin-R：TCCGACGCGTGGTATCTGGTTTCTGCAAGGACAGG。

[0152] MluI

[0153] 克隆牛A-FABP基因引物序列为：

[0154] FABP-F：TCCGACGCGTATGTGTGATGCATTTGTAGGTACCT；

[0155] MluI

[0156] FABP-R：ATCCTTAATTAAAAATCTAAAAAGTTTTATTTAACCA。

[0157] PacI

[0158] 以下是详细的构建过程：

[0159] 1）PB转座子骨架载体构建：运用全基因合成PiggyBac转座子转座所必需的PB5’末端与PB3’末端序列，其中全基因合成序列两端引入KpnI和XhoI位点，中间依次引入FseI、MluI、PacI、NotI、HindIII、BamHI、BstBI、AscI多克隆位点。将全基因合成序列与商业化质粒pSP72用KpnI/XhoI双酶切后将目的片段回收，回收产物用T4DNA连接酶进行连接,得到PiggyBac骨架载体；

[0160] 2）连接LoxP-NEO-LoxP-EGFP序列：用上述所述引物通过PCR和酶切连接先对PEGFP-N1质粒进行改造，去除质粒上多克隆位点。以修改后的PEGFP-N1质粒为模板，扩增得到EGFP表达框序列（不含多克隆位点），然后通过XbaI/SalI酶切位点与Ploxp质粒中新霉素抗性基因相连接，构建完成PN1-neo质粒。

[0161] 以PN1-neo质粒为模板，通过PCR方法克隆LoxP-NEO-LoxP-EGFP序列，并在序列两端引入AscI和BstBI酶切位点。所合成的序列与步骤1）中得到的PiggyBac骨架载体分别用AscI/BstBI进行双酶切，酶切产物回收后用T4DNA连接酶连接，连接后转化DH5α感受态细胞，并进行涂板，摇菌，提取质粒，AscI/BstBI双酶切鉴定，测序，得到PiggyBac-NEO-EGFP载体；

[0162] 3）克隆并连接牛α-actin启动子序列：以牛基因组DNA为模板，用上述所述的引物和DNA聚合酶进行扩增，得到α-actin基因启动子扩增产物，将扩增产物和步骤2）中得到的载体PiggyBac-NEO-EGFP用FseI/MluI双酶切，回收目的片段并进行连接，酶切产物回收后用T4DNA连接酶连接，连接后转化DH5α感受态细胞，并进行涂板，摇菌，提取质粒，FseI/MluI双酶切鉴定，测序，得到转基因载体PiggyBac-NEO-EGFP-actin；

[0163] 4）克隆并连接牛A-FABP序列并完成转座子载体构建：以含A-FABP基因的cDNA为模板，用上述所述的引物和DNA聚合酶进行扩增，得到的产物和步骤3）得到的载体PiggyBac-NEO-EGFP-actin用MluI/PacI双酶切，酶切产物回收后用T4DNA连接酶连接，连接后转化DH5α感受态细胞，并进行涂板，摇菌，提取质粒，MluI/PacI双酶切鉴定，测序。最终得到PiggyBac-NEO-EGFP-actin-AFABP通用型表达载体。

[0164] 5）分离牛成纤维细胞：剪取1周岁秦川牛耳尖组织，将血液擦干后装入密封袋迅速带回实验室。用碘酊擦拭牛耳尖，并用75%酒精脱碘。通过组织块培养法分离原代成纤维细胞。

[0165] 6）转座子载体功能验证：将构建好的PiggyBac-NEO-EGFP-actin-AFABP载体与转座酶质粒（GenBank号：EF591491）以不同的比例通过脂质体法转染分离得到的牛原代成纤维细胞。48h后，转染细胞分别以1：30，1：60和1：100三个稀释比例传代并添加600μg/ml的G418药物筛选。检测并验证通用型表达载体在牛成纤维细胞中转座效果，进一步筛选单克隆细胞通过体细胞核移植可用于转基因动物制备。

[0166] 7）转座子载体通用性：转座子载体多克隆位点中的MluI、PacI、NotI、HindIII、BamHI、BstBI也可用于连接其它目的基因如Fat-1、Leptin等基因开展基因功能研究。具体可以用MluI/PacI内切酶切除A-FABP基因，然后连入新的目的基因进行基因功能研究。同时也可以将两个基因同时连接到上述多克隆位点中，开展多基因功能研究。

[0167] 用本发明所构建的PiggyBac转座子载体，可以将脂肪型脂肪酸结合蛋白基因（A-FABP）在成肌细胞和肌肉组织中特异性表达，能应用于制备提高肌内脂肪含量的转基因牛。其通用性也可用于其它目的基因如Fat-1、Leptin等提高肌内脂肪含量或增加瘦肉率的功能研究及转基因牛制备。该表达载体携带有NEO-EGFP双报告基因，极大的提高了阳性细胞筛选的富集效率并减少了假阳性的发生，很大程度上提高了转基因的成功率。

[0168] 以下是发明人给出的具体实施例，在该实施例中所使用的材料为：

[0169] pSP72质粒：购自Invitrogen公司；

[0170] PEGFP-N1质粒：本实验室保存（GenBank号：CVU55762）；

[0171] Ploxp质粒：购于中国军事医学科学研究院，该Ploxp质粒由中国军事医学科学研究院杨晓教授研制（Xiao Yang,Cuiling Li et.al，The tumor suppressor SMAD4/DPC4is essential for epiblast proliferation and mesoderm induction in mice.PNAS，2001）。

[0172] DH5α感受态细胞：购自天根生化科技有限公司；

[0173] 转座酶质粒：本实验室保存（GenBank号：EF591491）；

[0174] 内切酶：购自Takara和NEB公司；

[0175] T4DNA连接酶：购自NEB公司；

[0176] 高保真DNA聚合酶：购自Toyobo公司；

[0177] G418（新霉素）：购自Sigma公司；

[0178] 细胞培养用血清及培养基等均购置Hyclone公司；

[0179] 细胞转染试剂购自Invitrogen公司Lipo2000;

[0180] 引物及全基因合成由南京金斯瑞公司完成。

[0181] 测序由北京生工和Invitrogen公司完成。

[0182] 实施例1：

[0183] 运用全基因合成PiggyBac转座子发生转座所必需的PB5’末端与PB3’末端序列，并且在PB5’末端和PB3’末端加入酶切位点KpnI和XhoI,PB5’末端和PB3’末端中间引入多克隆位点FseI、MluI、PacI、NotI、HindIII、BamHI、BstBI、AscI。

[0184] 将合成的PB5’末端与PB3’末端序列与pSP72质粒通过KpnI/XhoI双酶切，回收目的片段并将它们用T4DNA连接酶连接，并转化DH5α感受态细胞，进行涂板，摇菌，提取质粒，测序鉴定，得到PiggyBac骨架载体。其中连接体系为：合成的PiggyBac转座子PB5’末端和PB3’末端序列2ul,pSP72质粒1ul，T4DNA连接酶1ul，10×T4DNA连接酶缓冲液1ul，灭菌ddH2O5ul。

[0185] 实施例2：

[0186] 以PEGFP-N1质粒为模板，设计引物上游5’端引入NheI酶切位点，下游引入XbaI酶切位点，引物序列为：

[0187] EGFPcds-F:CTATGCTAGCTCGCCACCATGGTGAGCAAG；

[0188] NheI 翻译起始

[0189] EGFPcds-R:TACCTCTAGACGCGGCCGCTTTACTTGTAC。

[0190] XbaI 翻译终止

[0191] 在20ul反应体系中PCR扩增EGFP基因编码区序列，反应条件为95℃预变性5min，97℃/20sec，65℃/30sec，72℃/1.5min，反应35个循环，在72℃延伸10min。将得到的PCR产物与PEGFP-N1通过NheI/XbaI进行双酶切，酶切产物回收后用T4DNA连接酶连接，其中连接体系为：EGFP编码区1ul,PEGFP-N12ul，T4DNA连接酶1ul，10×T4DNA连接酶缓冲液
1ul，灭菌ddH2O5ul。连接后转化DH5α感受态细胞，并进行涂板，摇菌，提取质粒，NheI/XbaI双酶切鉴定，测序。因为NheI和XbaI为同尾酶，通过测序挑选NheI和XbaI酶切位点相连接的克隆，即通过上述两个酶不能切开序列的克隆为目的克隆（两酶切位点被破坏）。通过上述改造，将PEGFP-N1载体中多克隆位点去除，方便下一步应用。

[0192] 以改造后去除多克隆位点的PEGFP-N1质粒为模板，设计引物上游引入XbaI酶切位点，下游引入SalI酶切位点。

[0193] EGFP-F:ATCGTCTAGAAGTTATTAATAGTAATCAATT

[0194] XbaI

[0195] EGFP-R:ACTTGTCGACATGAGTTTGGACAAACCAC

[0196] SalI

[0197] 在20ul反应体系中PCR扩增EGFP基因表达框序列（CMV启动子，EGFP编码区序列，SV40加尾信号），反应条件为95℃预变性5min，97℃/20sec，60℃/30sec，72℃/1.5min，反应35个循环，在72℃延伸10min。将得到的PCR产物与Ploxp质粒通过XbaI/SalI进行双酶切，酶切产物回收后用T4DNA连接酶连接，其中连接体系为：EGFP表达框序列1ul,Ploxp2ul，T4DNA连接酶1ul，10×T4DNA连接酶缓冲液1ul，灭菌ddH2O5ul。连接后转化DH5α感受态细胞，并进行涂板，摇菌，提取质粒，XbaI/SalI双酶切鉴定，测序。完成PN1-neo质粒构建。

[0198] PN1-NEO质粒为模板，设计引物扩增Neomycin基因和EGFP基因，在引物两端分别添加AscI和BstBI酶切位点。引物序列为：

[0199] NE-F：CGAGTTCGAATCGTTAACCTACTCGAGATAAC

[0200] BstBI

[0201] NE-R：CATTGGCGCGCCAGATACATTGATGAGTTTGGAC。

[0202] AscI

[0203] 在20ul反应体系中PCR扩增Neomycin和EGFP基因序列（NEO-EGFP），反应条件为95℃预变性5min，97℃/20sec，68℃/30sec，72℃/3.5min，反应35个循环，在72℃延伸10min。将得到的扩增产物和PiggyBac骨架载体用AscI/BstBI双酶切，酶切产物回收后用T4DNA连接酶连接，其中连接体系为：PiggyBac骨架载体片段1ul,NEO-EGFP2ul，T4DNA连接酶1ul，10×T4DNA连接酶缓冲液1ul，灭菌ddH2O5ul。连接后转化DH5α感受态细胞，并进行涂板，摇菌，提取质粒，BstBI/AscI双酶切鉴定，测序。构建成PiggyBac-NEO-EGFP载体。

[0204] 实施例3：

[0205] 以提取的牛基因组DNA为模板，设计引物扩增α-actin基因启动子（AC000185.1），在引物两端分别添加FseI和MluI酶切位点。引物序列为：

[0206] actin-F：CTATGGCCGGCCGGAAAAAACAGTGAGAAGCACCA AC；

[0207] FseI

[0208] actin-R：TCCGACGCGTGGTATCTGGTTTCTGCAAGGACAGG。

[0209] MluI

[0210] 在20ul反应体系中PCR扩增α-actin基因启动子，反应条件为95℃预变性5min，98℃/15sec，68℃/30sec，72℃/2.5min，反应35个循环，在72℃延伸10min。将得到的扩增产物和PiggyBac-NEO-EGFP用FseI/MluI双酶切，酶切产物回收后用T4DNA连接酶连接，其中连接体系为：PiggyBac-NEO-EGFP序列片段1ul,α-actin基因启动子2ul，T4DNA连接酶1ul，10×T4DNA连接酶缓冲液1ul，灭菌ddH2O5ul。连接后转化DH5α感受态细胞，并进行涂板，摇菌，提取质粒，MluI/FseI双酶切鉴定，测序。构建成PiggyBac-NEO-EGFP-actin载体。

[0211] 实施例4：

[0212] 以牛总RNA反转录得到的cDNA为模板，设计引物扩增牛A-FABP基因（GenBank号：AC_000171），在引物两端分别添加MluI和PacI酶切位点。引物序列为：

[0213] FA BP-F：TCCGACGCGTATGTGTGATGCATTTGTAGGTACCT；

[0214] MluI

[0215] FABP-R：ATCCTTAATTAAAAATCTAAAAAGTTTTATTTAACCA。

[0216] PacI

[0217] 在20ul反应体系中PCR扩增A-FABP基因，反应条件为95℃预变性5min，94℃/30sec，60℃/30sec，72℃/40sec，反应35个循环，在72℃延伸10min。

[0218] 将得到的扩增产物和PiggyBac-NEO-EGFP-actin用MluI/PacI双酶切，酶切产物回收后用T4DNA连接酶连接，其中连接体系为：PiggyBac-NEO-EGFP-actin片段1ul,A-FABP基因2ul，T4DNA连接酶1ul，10×T4DNA连接酶缓冲液1ul，灭菌ddH2O5ul。连接后转化DH5α感受态细胞，并进行涂板，摇菌，提取质粒，MluI/PacI双酶切鉴定，测序。最终构建完成PiggyBac-NEO-EGFP-actin-AFABP通用型表达载体。

[0219] 实施例5：

[0220] 剪取牛耳尖组织，将血液擦干后装入密封袋带回实验室。从密封袋中取出牛耳尖，用手术刀逆毛生长方向将表面毛刮干净，然后用碘酊擦拭两遍并用质量百分数为75%的酒精迅速脱碘。然后用手术刀在表皮切取一方块并取表皮层组织。将组织块放入质量百分数为75%的酒精消毒20秒~30秒，再用含2×双抗PBS反复冲洗。将清洗后的表皮组织放在玻璃培养皿中剪碎，并用眼科针将组织块铺于细胞培养皿底部，添加10%血清培养基倒置培养4h~6h后，待组织块贴壁牢固后，将培养瓶翻转并继续培养。

[0221] 实施例6：

[0222] 将构建好的PiggyBac-NEO-EGFP-actin-AFABP载体与转座酶质粒（4：1比例）通过脂质体法共转染分离得到的牛原代成纤维细胞。48h后，转染细胞分别以1：30，1：60和1：100三个稀释比例传代并添加600μg/ml的G418药物开始筛选。筛选10天左右抗性克隆出现，通过考马斯亮蓝染色并计数，检测转座载体在牛成纤维细胞中转座效果。抗性克隆通过挑取单克隆扩繁后可通过体细胞核移植用于转基因动物制备。

[0223] 表1给出了PiggyBac-NEO-EGFP-actin-AFABP载体在成纤维细胞转座结果统计分析。

[0224] 由图4和表1可以看出，转座子载体在牛成纤维细胞中高效转座，极大地提高了目的基因的整合效率。

[0225] 表1：

[0226]

[0227] 注：加与不加转座酶质粒在不同传代稀释比例下所得到的克隆数差别均极显著（P<0.01）。