一种用于结核/HIV共感染基因治疗的逆转录病毒载体及其应用

摘要

本发明公开了一种用于结核/HIV共感染基因治疗的逆转录病毒载体及其应用。本发明分离出结核肽Ag85B199–207(KLVANNTRL)特异的TCR基因和HIV-1肽Env120-128(KLTPLCVTL)特异的TCR基因，进一步构建携带两种病原体表位特异TCR基因的逆转录病毒载体，将该逆转录病毒载体转染的CD8+T细胞，获得双TCR基因转染的T细胞。该T细胞具有双特异性，可针对Mtb和HIV-1两种病原体表位发生反应，并具有细胞因子分泌功能与杀伤活性。这种双特异性使得即使其中一种病原体发生突变产生免疫逃逸时，仍可对另一种病原体产生反应。该方法制备的逆转录病毒载体可应用于Mtb/HIV双重感染者的TCR基因治疗，为Mtb/HIV双重感染的过继细胞免疫治疗研究提供新的途径。

权利要求

1.一种用于结核/HIV共感染基因治疗的重组逆转录病毒载体，其含有可同时表达结核肽Ag85B199–207特异性TCR和HIV-1肽Env120-128特异性TCR的融合基因；所述结核肽Ag85B199–207特异性TCR包括α1链和β1链，其中，α1链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示，β1链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；所述HIV-1肽Env120-128特异性TCR包括α2链和β2链，其中，α2链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 25所示，β2链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 21所示；

编码α1链、β1链、α2链和β2链的基因序列通过自剪切多肽2A序列链接。

2.根据权利要求1所述的重组逆转录病毒载体，其特征在于，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 27所示。

3.根据权利要求1所述的重组逆转录病毒载体，其特征在于，出发载体包括pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。

4.权利要求1所述的重组逆转录病毒载体经包装后得到的逆转录病毒。

+

5.权利要求4所述的逆转录病毒转染的CD8 T细胞。

6.权利要求1所述的重组逆转录病毒载体、权利要求4所述的逆转录病毒、权利要求5+所述的逆转录病毒转染的CD8 T细胞在制备抗结核/HIV共感染药物中的应用。

说明书

一种用于结核/HIV共感染基因治疗的逆转录病毒载体及

其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种结核肽特异性T细胞受体（TCR）和一种HIV-1肽特异性TCR，以及利用这两种TCR制备得到的一种用于结核/HIV共感染基因治疗+的逆转录病毒载体，该重组逆转录病毒载体转染得到的CD8 T细胞及其在制备抗结核/HIV共感染药物中的应用。

背景技术

[0002] 结核菌/艾滋病病毒双重感染（TB/HIV双重感染）是结核病和艾滋病防治工作面临的严峻挑战。据WHO报道：2010年全球880万新增结核病患者中，有110万（1/8）合并HIV感染，其中约1/3患者病情迅速恶化，短期内发生死亡。目前针对TB/HIV双重感染者的治疗主要是抗结核和抗病毒药物治疗，面临服用多种药物、毒副作用大、疗程长、易产生耐药性等问题，难以获得明显疗效，因此亟须开发对双重感染者行之有效的治疗方法！[0003] 在TB/HIV双重感染者体内，免疫系统功能被极大破坏，尤其是对结核患者具有重+要保护作用的细胞免疫功能，在HIV感染时遭到严重破坏。由于CD4 1型辅助性T细胞+
(Th1)的快速损耗和CD8 细胞毒性T细胞(CTL)的细胞因子分泌功能和杀伤活性降低，T细胞介导的细胞免疫无法控制TB病菌和HIV病毒的复制和播散。

[0004] 通过过继输注效应T细胞给免疫低下或免疫缺陷的患者，可将保护性免疫传递给受者，增强受者体内效应T细胞对靶抗原的特异性识别及杀伤能力并改善患者的免疫状态。有研究表明，过继输注效应T细胞给耐药结核患者可有效清除患者体内的结核分枝杆+菌；将自体体外扩增的CD8 CTL过继输注治疗HIV患者也已取得了明显的疗效。但TB/HIV双重感染者体内效应T细胞数量很少，体外分离及扩增难度极大，限制了其临床应用。

[0005] T细胞受体（T cell receptor，TCR）是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的效应分子。近年来，有学者分离抗原特异TCR基因并将其转导至初始T细胞中，使其获得特异性识别抗原的能力，可短期内产生大量抗原特异的效应T细胞，为过继细胞免疫治疗（adoptive cellular immunotherapy，ACT）提供了新途径。抗原特异TCR基因修饰T细胞过继输注治疗白血病、转移性黑色素瘤、巨细胞病毒感染、EB病毒感染等疾病已取得了鼓舞人心的效果，被证明是一种有前景的治疗策略。

发明内容

[0006] 本发明的一个目的是提供一种用于结核/HIV共感染基因治疗的逆转录病毒载体。

[0007] 本发明的另一个目的是提供一种由上述逆转录病毒转染得到的CD8+ T细胞。

[0008] 本发明的另一个目的是提供上述逆转录病毒载体及CD8+ T细胞在制备抗结核/HIV共感染药物中的应用。

[0009] 本发明所采用的技术方案是：

[0010] 一种用于结核/HIV共感染基因治疗的重组逆转录病毒载体，其含有可同时表达结核肽Ag85B199–207特异性TCR和HIV-1肽Env120-128特异性TCR的融合基因；所述结核肽Ag85B199–207特异性TCR包括α1链和β1链，其中，α1链的CDR3区含有SEQ ID NO: 5所述的序列；β1链的CDR3区含有SEQ ID NO: 6所示的序列；所述HIV-1肽Env120-128特异性TCR包括α2链和β2链，其中，α2链的CDR3区含有SEQ ID NO: 7所述的序列；β2链的CDR3区含有SEQ ID NO: 8所示的序列。

[0011] 所述结核肽Ag85B199–207特异性TCR的α1链是由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性β1链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β1链是由SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性α1链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。

[0012] 优选的，所述结核肽Ag85B199–207特异性TCR的α1链的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，β1链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

[0013] 所述HIV-1肽Env120-128特异性TCR的α2链是由SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性β2链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β2链是由SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性α2链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。

[0014] 优选的，所述HIV-1肽Env120-128特异性TCR的α2链的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，β2链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 21所示。

[0015] 优选的，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 27所示。

[0016] 所述重组逆转录病毒载体的出发载体为pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。

[0017] 上述重组逆转录病毒载体经包装后得到的逆转录病毒。

[0018] 上述逆转录病毒转染的CD8+ T细胞。

[0019] 上述重组逆转录病毒载体、逆转录病毒、逆转录病毒转染的CD8+ T细胞在制备抗结核/HIV共感染药物中的应用。

[0020] 实现上述技术方案的具体操作如下：

[0021] 1、筛选结核肽Ag85B199–207特异的TCR与HIV肽Env120-128特异的TCR[0022] ①采用淋巴细胞分离液分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）；

[0023] ②计数PBMC，调整PBMC数目为1×106/孔, 每孔细胞分别加入含结核肽Ag85B199–207、HIV肽Env120-12850ng/ml的10% FBS-1640 培养基2ml；

[0024] ③ 贴壁培养2h后，加入25U/ml IL-2, 第3天补加IL-2 至50U/ml，第5天加入IL-2 100U/ml，之后以此浓度继续培养11天；

[0025] ④ 磁珠分选出CD8+ T细胞，提取其mRNA，并逆转录为cDNA；

[0026] ⑤ 互补决定区3（complementarity determining region3，CDR3）谱型分析检测刺激前后CDR3谱型，找出刺激后呈单克隆增生的结核肽Ag85B199–207特异的TCR α、β基因家族与HIV肽Env120-128特异的TCR α、β基因家族。

[0027] 2、构建重组逆转录病毒载体

[0028] ① 根据GeneBank报道的人TCR α、β基因家族上游可变区（variable region，V）和下游恒定区（constant region，C）基因序列，设计TCR α、β链全长基因上、下游引物，扩增出结核肽Ag85B199–207特异的α13、β16和HIV肽Env120-128特异的α11、β18全长基因；

[0029] ②设计C区突变位点上、下游引物，采用重组PCR方法将结核肽Ag85B199–207特异的TCR α13、β16链C区的9个关键氨基酸进行突变（参照文献：Luo W. et al. Development + +of genetically engineered CD4 and CD8 T-cells expressing TCRs specific for a
38 kDa M. tuberculosis antigen. J Mol Med. 2011,89(9):903-13）；

[0030] ③ 设计TCR α、β链C区下游与CD3ζ分子融合位点的重组引物，将HIV肽Env120-128特异的TCR α11、β18基因片段与CD3ζ分子进行融合；

[0031] 第②和第③步操作的目的在于在于减少内外源性TCR α、β链的错配，因为CD8+ T细胞存在内源性TCR α、β基因的表达，通过突变或者是通过以CD3ζ链替换α、β全长基因部分C区可以促使外源性α与β基因表达的蛋白正确装配成TCR蛋白分子并稳+ +定表达在CD8 T细胞表面，同时利于其竞争结合CD8 T细胞表面的CD3分子，增强信号+
传导功能，提高修饰后CD8 T细胞的抗结核活性。当然，此处还可以采取其他策略来减少内外源性TCR α、β链的错配，如：在外源性α、β基因C区引入二硫键（Boulter, J.M. et al. (2003) Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein Eng. 16, 707-711）；突变外源性α、β基因C区关键氨基酸以改变α、β链之间的静电荷（Voss, R.H. et al. (2008) Molecular design of the Cab interface favors specific pairing of introduced TCRab in human T cells. J. Immunol. 180, 391-401）；将外源性α、β基因V区合并为一条单链TCR并与CD3ζ链融合（Willemsen, R.A. et al. (2000) Grafting primary human T lymphocytes with cancer-specific chimeric single chain and two chain TCR. Gene Ther. 7,
1369-1377）；利用2A连接外源性α、β基因实现平衡表达（Leisegang M, Engels B, Meyerhuber P, Kieback E, Sommermeyer D, Xue SA, Reuss S, Stauss H, Uckert W. Enhanced functionality of T cell receptor-redirected T cells is defined by the transgene cassette. J Mol Med. 2008, 86:573-583.）等。

[0032] ④ 利用重组PCR技术，将结核肽Ag85B199–207特异的TCR α13、β16基因片段通过自剪切多肽P2A进行连接获得最小突变TCR；

[0033] ⑤ 通过F2A上的AgeI酶切位点将HIV肽Env120-128特异的α11-CD3ζ、β18-CD3ζ融合基因进行拼接。

[0034] ⑥ 通过T2A上的AatII酶切位点将上述两条α链、两条β链基因片段进行连接。上述三种基因片段经测序鉴定后插入逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP并酶切鉴定；

[0035] ⑦ 采用脂质体转染法，将三种重组逆转录病毒表达质粒pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-IRES-GFP、pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP、pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP分 别与包膜蛋白质粒VSV-G共转染GP2-293；

[0036] ⑧ 收集48h-72h病毒上清，低温超速离心浓缩纯化病毒；

[0037] ⑨ 重组病毒感染NIH3T3细胞，流式细胞术检测病毒滴度，计算公式：病毒滴度（IU/ml）=NIH3T3细胞数×GFP阳性率/病毒浓缩液量（ml）。

[0038] 3、鉴定重组逆转录病毒转染的CD8+ T细胞的抗结核和抗HIV活性

[0039] ① 采用Ficoll密度梯度离心法，分离HLA-A*0201型供者外周血PBMC；

[0040] ② 磁珠分选CD8+ T细胞；

[0041] ③ IL-2和抗CD3单抗活化分选出的T细胞；

[0042] ④ 按感染复数（multiplicity of infection, MOI）=13将上述三种重组逆转录+病毒感染CD8 T细胞；

[0043] ⑤ 使用IL-2和抗CD3单抗刺激感染后的CD8+ T细胞；

[0044] ⑥ 流式细胞术检测病毒感染后阳性细胞的百分比；

[0045] ⑦ 测定病毒转染的CD8+ T细胞的抗TB和抗HIV活性：

[0046] 实验设置以下十组：TB/HIV Td + DC组：TB/TCR和HIV/TCR共转染的CD8+ T细胞++DC；UnTd+Ag85B组：未转染CD8 T细胞+负载结核肽Ag85B199–207的DC；UnTd+Env组：未转+ +
染CD8 T细胞+负载HIV肽Env120-128的DC；EmTd+Ag85B组：空载体转染CD8 T细胞+负载+
结核肽Ag85B199–207的DC；EmTd+Env组：空载体转染CD8 T细胞+负载HIV肽Env120-128的+
DC；TB/HIV Td+CMVpp65组：TB/TCR和HIV/TCR共转染的CD8 T细胞+负载无关肽CMVpp65+
的DC；TB Td+Ag85B组：结核特异TCR转染CD8 T细胞+负载结核肽Ag85B199–207的DC；TB/+
HIV Td+Ag85B组：TB/TCR和HIV/TCR共转染的CD8 T细胞+负载结核肽Ag85B199–207的DC；
+
HIV Td+Env组：HIV特异TCR转染CD8 T细胞+负载HIV肽Env120-128的DC；TB/HIV Td+Env+
组：TB/TCR和HIV/TCR共转染的CD8 T细胞+负载HIV肽Env120-128的DC.

[0047] 用酶联免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测上述各组细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α的分泌水平；用时间分辨荧光免疫分析技术+（time-resolved fluoroimmuno-assay，TRFIA）检测CD8 T细胞对DC的杀伤活性。

[0048] 其中，CD8+ T细胞是人体内的一种细胞亚群，可由人外周血中分离获得，并进行体外扩增培养，分离和培养的实验设备要求低，技术成熟。

[0049] 逆转录病毒载体是由一种逆转录病毒序列构建的基因运载工具，能够携带外源基因或DNA进入宿主细胞，并整合到染色体基因组上，目前已成为商业化产品，容易购买和获得。

[0050] 重组逆转录病毒载体的构建方法为本领域常用的分子克隆技术，重组逆转录病毒转染方法是目前常用的生物技术手段，除本发明中使用的人工脂质体法外，还可以使用其它化学转染法，包括：DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法；以及物理方法，包括：显微注射、电穿孔、基因枪等。

[0051] 本发明的有益效果在于：

[0052] 本发明分离出结核肽Ag85B199–207(KLVANNTRL)特异的TCR基因和HIV-1肽Env120-128 (KLTPLCVTL)特异的TCR基因，构建携带两种病原体表位特异TCR基因的逆转录病毒载体，+鉴定其转染的CD8 T细胞的抗结核和抗HIV活性。结果表明双TCR基因转染的T细胞具有双特异性，可针对Mtb和HIV-1两种病原体表位发生反应，并具有细胞因子分泌功能与杀伤活性。这种双特异性使得即使其中一种病原体发生突变产生免疫逃逸时，仍可对另一种病原体产生反应。该方法制备的逆转录病毒载体可应用于Mtb/HIV双重感染者的TCR基因治疗，为Mtb/HIV双重感染的过继细胞免疫治疗研究提供新的途径。

附图说明

[0053] 图1结核肽Ag85B199–207与HIV肽Env120-128刺激前后CD8+ T细胞TCR α和β链CDR3谱型分析；

[0054] 图2 三种重组逆转录病毒载体构建示意图；

[0055] 图3重组病毒载体质粒的酶切鉴定（a. pMX-hVb16mCb-P2A-hVa13mCa-IRES-GFP重组质粒的酶切鉴定；b. pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP重组质粒的酶切鉴定；c. pMX-hVb16mCb-P2A-hVa13mCa-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP重组质粒的酶切鉴定；1-5泳道分别为：pMX-IRES-GFP空载体、pMX-IRES-GFP空载体的XhoI酶切产物、重组病毒载体质粒、重组病毒载体质粒的XhoI酶切产物、重组病毒载体质粒的XhoI+NotI双酶切产物）；

[0056] 图4荧光显微镜观察重组病毒转染后NIH3T3细胞GFP的表达(×10)（a-c. pMX-hVb16mCb-P2A-hVa13mCa-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ- IRES-GFP转染（TB/HIVTd）NIH3T3细胞GFP的表达；d-f. pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-IRES-GFP转染（TBTd）NIH3T3细胞GFP的表达；g-i. pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP转染（HIVTd）NIH3T3细胞GFP的表达；从左到右依次为明场、荧光、叠加图）；

[0057] 图5流式细胞术检测重组病毒转染后NIH3T3细胞的GFP表达阳性率（a. 未 转 染 组；b. pMX-hVb16mCb-P2A-hVa13mCa-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A- hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP转染组；c. pMX-hVβ16mCβ-P2A- hVα13mCα- IRES-[0058] GFP转染组；d. pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP转染组）；

[0059] 图6荧光显微镜观察重组病毒转染后CD8+ T细胞GFP的表达（×10；EmTd：空载体转染组；TBTd、HIVTd、TB/HIVTd：重组病毒转染组）；

[0060] 图7流式细胞术检测重组病毒转染后CD8+ T细胞GFP的表达（UnTd：未转染组；EmTd：空载体转染组；TBTd、HIVTd、TB/HIVTd：重组病毒转染组）；

[0061] 图8 ELISA检测CD8+ T细胞IFN-γ的分泌水平；

[0062] 图9ELISA检测CD8+ T细胞TNF-α的分泌水平；

[0063] 图10 TRFIA检测CD8+ T细胞的杀伤活性。

具体实施方式

[0064] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

[0065] 以下实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件操作，例如Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0066] 以下实施例中，所有计量资料结果用±s表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）比较各组间细胞因子IFN-γ、TNF-α分泌水平的差异，方差不齐时用Welch校正，采用LSD法进行各组间两两比较，方差不齐时采用Dunnett’s T3法校正。检验水准α=0.05，双侧检验。采用SPSS17.0 for windows统计软件包进行数据分析。实施例

[0067] 1. 筛 选 结 核 肽 Ag85B199–207(KLVANNTRL)特 异 的 TCR 与HIV 肽 Env120-128 (KLTPLCVTL)特异的TCR

[0068] 1.1 密度梯度离心法分离纯化PBMC

[0069] (1)在15ml刻度无菌离心管加入适量Ficoll淋巴细胞分离液；

[0070] (2)取肝素抗凝的外周静脉血与等量RPMI 1640液充分混匀稀释，用巴斯德滴管吸取2倍体积的抗凝血沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，注意保持界面完整。18~20°C，1800~2000rpm/min水平离心20~30min；

[0071] (3)离心后管内液体分为四层，上层为血浆和稀释液，管底主要为红细胞和粒细胞层。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的灰白色云雾层；

[0072] (4)用吸管插到灰白色层，吸取单个核细胞，置于另一离心管内，加入5倍以上体积的RPMI 1640液，18~20°C，1500rpm/min离心10min，洗涤细胞两次去除大部分混杂的血小板后为PBMC；

[0073] (5)细胞计数及细胞活力检测：PBMC细胞悬液与1/10体积的0.4 %台酚蓝染液混4
合，于血球计数板上计数板上角上四个大方格总细胞数，总细胞数的四分之一数乘以10 即为每毫升浓度；死细胞可着色台盼蓝，活的不着色，计数200个淋巴细胞，计算活细胞百分率［活细胞率%=（活细胞数/总细胞数）×100%］。

[0074] 1.2 制备结核肽Ag85B199–207、HIV肽Env120-128特异T细胞克隆：

[0075] (1) 计数PBMC，调整PBMC数目为1×106/孔,分别加入含结核肽Ag85B199–207、HIV肽Env120-128 50ng/ml的10% FBS-1640培养基2ml；

[0076] (2) 37°C、5% CO2条件下培养2h后，加入IL-2 25U/ml；

[0077] (3) 第3天补加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2 100U/ml，之后以此浓度继续培养11天。

[0078] 1.3免疫磁珠（德国美天旎生物公司）分选CD8+ T细胞。

[0079] 1.4总RNA提取试剂盒（OMEGA）提取上述收集到的细胞沉淀的总RNA。

[0080] 1.5逆转录(RT)试剂盒（Fermentas）合成cDNA。

[0081] (1) 取总RNA 22μl，加oligo(dT) primer（0.5μg/μl）2μl，轻柔混匀，70°C，5min；

[0082] (2)加5×buffer 8μl，RiboLock™ Ribonuclease Inhibitor（20u/μl）2μl，10mM dNTP 4μl，轻轻混匀，37°C，5min；

[0083] (3)加RevertAid™ H Minus M-MuLV（200u/μl）2μl，总体积40μl，42°C，60min，70°C，10min。

[0084] 1.6 PCR扩增34 个TCR Vα基因家族CDR3片段：

[0085] 利用34条TCR Vα家族特异性上游引物和共用下游Cα外、内侧引物（参照文献：XIN-SHENG等，2006，Clinical & Laboratory Haematology, 28: 405-415. doi: 10.1111/j.1365-2257.2006.00827.x）做半巢式PCR：

[0086] 第一轮PCR：每样本做34 个PCR反应管，第1~34管分别加入TCR Vα1至Vα34家族上游引物，每管加共用下游Cα外侧引物1μl，各引物浓度均为10μM。每PCR反应管体积为25μl，含cDNA模板1.0μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，10×Buffer 2.5μl，25mmol/LMgCl21.5μl，Taq DNA聚合酶0.625U。PCR反应条件：95°C预变性3min；95°C 30s，60°C 30s，72°C 1min，35个循环；72°C延伸10min。

[0087] 第二轮PCR：反应总体积为25μl，含第一轮PCR产物2μl，10mmol/L dNTP0.5μl，10×Buffer 2.5μl，25mmol/L MgCl2 1.5μl，Taq DNA聚合酶0.625U，TCR Vα 34条家族上游引物1μl，下游FAM标记内侧Cα引物1μl，各引物浓度均为10μM。PCR反应条件：95°C 2min；60°C 2min，72°C 10min，4个循环。

[0088] 1.7 PCR扩 增24个 TCR Vβ基 因 家 族CDR3片 段（参 照 文 献：XIN-SHENG等，2006，Clinical & Laboratory Haematology, 28: 405–415. doi: 10.1111/j.1365-2257.2006.00827.x）：

[0089] 每样本做24个PCR反应管，每管加入TCR Cβ-FAM下游引物1μl，第1至第24管分别加入TCR Vβ1至TCR Vβ24上游引物1μl，各引物浓度均为10μM。PCR反应体积为25μl，含cDNA模板1μl，10mmol/L dNTP 0.5μl， 10×Buffer 2.5μl，25mmol/L MgCl2
1.5μl，Taq DNA聚合酶0.625U。PCR反应条件：94°C变性3min；94°C 1min，55°C 1min，
72°C 1min，35个循环；72°C延伸10min。

[0090] 1.8琼脂糖凝胶电泳：

[0091] 取34个TCR Vα和24个TCR Vβ基因家族PCR产物各5μl，2%琼脂糖凝胶电泳，110V，20min，采用凝胶成像系统照相。剩余PCR产物-20°C保存备用。

[0092] 1.9 CDR3谱型分析：

[0093] 取34个Vα、24个Vβ基因家族FAM荧光标记PCR产物2μl，在373DNA序列分析仪（ABI，Perkin Elmer）上进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，收集电泳过程中不同时间出现的不同强度的荧光信号，GeneScan 672软件自动分析收集的数据，转换为不同位置、高度和形态的峰，代表各TCR家族CDR3成员出现的频率，由此反映各TCR家族的克隆性。其中，具有单峰分布的TCR家族即是抗原特异性单克隆增生的TCR家族。

[0094] CDR3谱型分析结果显示，抗原肽刺激CD8+ T细胞后，部分TCR基因家族谱型发生改变，由原来的8个或多于8个峰型的高斯分布变为少于8个峰的单寡峰分布，表明这些家族是由于抗原肽持续刺激引起的寡克隆或单克隆增生。比较刺激前后CDR3谱型的变化，找出刺激前为多克隆，结核肽Ag85B199–207和HIV肽Env120-128刺激后分别呈单克隆扩增的Vα13、Vβ16和Vα11、Vβ18基因家族（图1）。

[0095] 测序显示，Vα13、Vβ16和Vα11、Vβ18 CDR3区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~4所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5~8所示。

[0096] 2.构建重组逆转录病毒载体

[0097] 2.1引物合成：

[0098] 依据GeneBank报道的Vα13、Vβ16和Vα11、Vβ18基因家族V区序列设计全长基因上、下游引物，依据9个关键氨基酸突变后的C区序列分别设计突变位点处的上、下游引物，依据文献报道设计与CD3ζ分子融合处的重组引物，依据2A肽连接序列设计重组引物，全部引物Invitrogen由上海英骏生物技术有限公司合成，引物名称和序列（5’ to 3’）如下：

[0099]

[0100] 2.2重组PCR扩增hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα融合基因：

[0101] (1) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P1和P2，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增hVβ16hCβ基因上游至hCβ上第一群突变位点之间的序列B1（hVβ16mCβ-1区），其中hVβ16hCβ基因序列如SEQ ID NO: 9所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。

[0102] (2)以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P3和P4，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增hCβ上第一群突变位点至第二群突变位点之间的序列B2（mCβ-2区）。

[0103] (3)以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P5和P6，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增hCβ区上第二群突变位点至hCβ下游之间的序列及5’端P2A序列B3（mCβ-3-5’端P2A区）。

[0104] (4)以步骤(2)得到的B2和步骤(3)得到的B3作为模板，利用引物P3和P6，Pfu DNA聚合酶，重组PCR扩增hCβ上第一群突变位点至至hCβ下游之间的序列及5’端P2A序列B4（mCβ-2-5’端P2A区）。

[0105] (5)以步骤(1)得到的B1和步骤(4)得到的B4作为模板，利用引物P1和P6，Pfu DNA聚合酶，重组PCR扩增hVβ16上游至hCβ下游之间的序列及5’端P2A序列，即hVβ16mCβ-5’端P2A区的序列B5，其中，hVβ16mCβ段的序列如SEQ ID NO: 11所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。

[0106] (6)以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P7和P8，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增3’端P2A及 hVα13 hCα全长基因上游至hCα上突变位点之间的序列A1（3’端P2A-hVα13mCα-1区）。其中，hVα13 hCα全长基因序列如SEQ ID NO: 13所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示。

[0107] (7)以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P9和P10，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增hCα上突变位点至hCα下游之间的序列A2（hVα13mCα-2区）。

[0108] (8)以步骤(6)得到的A1和步骤(7)得到的A2作为模板，利用引物P7和P10，Pfu DNA聚合酶，重组PCR扩增3’端P2A及 hVα13上游至hCα下游之间的序列，即3’端P2A-hVα13mCα区序列A3。其中，hVα13mCα基因序列如SEQ ID NO: 15所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。

[0109] (9)以步骤(5)得到的B5和步骤(8)得到的A3作为模板，利用引物P1和P10，Pfu DNA聚合酶，重组PCR扩增hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-5’端T2A基因片段。

[0110] (10) 以步骤(5)得到的B5和步骤(8)得到的A3作为模板，利用引物P1和P10’，重组PCR扩增hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα全长基因（SEQ ID NO: 17）。

[0111] 以上常规PCR反应体系25μl，含10×Buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，Pfu DNA聚合酶0.2U，10μM引物各0.8μl，模板DNA 1μl。PCR反应条件：95°C 变性5min；95°C 1min，72°C 90s，35个循环；72°C延伸10min。

[0112] 重组PCR反应体系25μl，含10×Buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，Pfu DNA聚合酶0.2U，10μM引物各0.8μl，两种PCR产物模板各3μl。PCR反应条件：95°C变性5min；95°C 30s，50°C 45s，72°C 45s，3个循环；95°C 45s，72°C 90s，32个循环；72°C延伸10min。

[0113] 2.3重组PCR扩增及酶切连接制备hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ融合基因：

[0114] (1)以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P11与P12，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增3’端T2A-hVβ18hCβ序列中至hCβ 393bp处片段及连接序列ggggat与5’端CD3ζ的序列S1（3’端T2A-hVβ18hCβ区）。

[0115] (2)以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P11’与P12，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增hVβ18hCβ全长基因中至hCβ 393bp处片段及连接序列ggggat与5’端CD3ζ的序列S1’。hVβ18hCβ的基因序列SEQ ID NO: 18所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示。

[0116] (3)以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P13与P14，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增hCβ 393bp前部分序列、连接序列ggggat、CD3ζ全长序列及5’端F2A序列S2（hCβ393bp -CD3ζ-5’端F2A区）。

[0117] (4)以步骤(1)得到的S1和步骤(3)得到的S2作为模板，利用引物P11与P14，Pfu DNA聚合酶，重组PCR扩增3’端T2A-hVβ18hCβ393bp-CD3ζ-5’端F2A基因片段S3。其中，hVβ18hCβ393bp-CD3ζ段的序列如SEQ ID NO: 20所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 21所示。

[0118] (5)以步骤(2)得到的S1’和步骤(3)得到的S2作为模板，利用引物P11’与P14，Pfu DNA聚合酶，重组PCR扩增hVβ18hCβ393bp-CD3ζ-5’端F2A基因片段S3’。

[0119] (6)以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P15与P16，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增3’端F2A-hVα11hCα中至hCα 284bp处片段及连接序列ggggat与5’端CD3ζ的序列S4（3’端F2A -hVα911hCα区）。其中，hVα11hCα基因序列如SEQ ID NO: 22所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 23所示。

[0120] (7)以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P17与P18，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增hCα 284bp前部分序列、连接序列ggggat及CD3ζ全长序列S5（hCα284bp-CD3ζ区）。

[0121] (8)以步骤(4)得到的S4和步骤(5)得到的S5作为模板，利用引物P15与P18，Pfu DNA聚合酶，重组PCR扩增3’端F2A-hVα11hCα284bp-CD3ζ序列S6。其中，hVα11hCα284bp-CD3ζ段的基因序列如SEQ ID NO: 24所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 25所示。

[0122] (9) 利用限制性内切酶AgeI单酶切步骤(4)制备的S3与步骤(8)制备的S6，凝胶回收试剂盒（Omega）分离回收酶切后的片段并用T4 DNA连接酶进行连接以获得3’端T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ基因片段。

[0123] (10)利 用 限 制 性 内 切 酶AgeI 单 酶 切 步 骤(5) 制 备 的 S3’与 步骤(8)制备的S6，胶回收酶切后的片段并用T4 DNA连接酶进行连接以获得hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ（SEQ ID NO: 26）全长基因。

[0124] 以上常规PCR反应体系25μl，含10×Buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，Pfu DNA聚合酶0.2U，10μM引物各0.8μl，模板DNA 0.5μl。常规PCR反应条件：95°C 变性5min；95°C 1min，63°C 1min，72°C 1min，35个循环；72°C延伸10min。

[0125] 重组PCR反应体系25μl，含10×Buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 0.8μl，Pfu DNA聚合酶0.2U，10μM引物各0.6μl，两种PCR产物模板各6μl。PCR反应条件：95°C变性5min；95°C 1min，50°C 30s，72°C 1min，3个循环；95°C 90s，65°C 30s，72°C90s，32个循环；72°C延伸10min。

[0126] 2.4限制 性 酶切 连接 制备 hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-T2A-hVβ18hCβ- CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ全长融合基因：

[0127] 利用T2A序列中的AatII酶切位点，用限制性内切酶AatII单酶切步骤2.2 (9)与步骤2.3 (9)制备的基因片段，胶回收酶切产物并用T4 DNA连接酶进行连接以获得hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ融合基因片段（SEQ ID NO: 27）。

[0128] 2.5 分别构建含hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα、hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ、hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ基因片段的克隆载体

[0129] (1)用胶回收试剂盒（Omega）分别回收hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα、hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ、hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ基因片段。

[0130] (2) 用DNA A-Tailing试剂盒（TaKaRa）在上述3个基因片段末尾加A后，分别接入pGEM-T载体中，连接反应总体系10ml：pGEM-T载体1ml、10´ligation Buffer 1ml、T4 DNA连接酶1ml、0.2 pmol已加A纯化的基因片段，16°C连接过夜。

[0131] (3) 将连接正确的质粒转化E.coli DH5α感受态菌。然后将菌均匀涂布在含4ml200mg/ml IPTG、40ml 20 mg/ml X-gal的氨苄平板上，培养过夜。重组质粒转化的菌落呈白+
色，而空质粒转化的菌落呈蓝色。选择在平板上长出的白色菌落，挑至装有Amp 3ml LB液体培养基的试管中，37°C 220rpm振摇16-20h。

[0132] (4) 用质粒抽提试剂盒（Omega）提取质粒，用相应的内切酶对初筛阳性重组质粒进行酶切鉴定，并以重组质粒为模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小。最后将初筛阳性质粒送Invitrogen上海英骏生物技术有限公司进行测序。测序结果表明，上述重组质粒含有的外源基因序列与预测序列均完全一致。

[0133] 2.6重组逆转录病毒载体的构建：

[0134] (1) 用Xho I、Not I分别酶切含hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα、hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ、hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ基因片段的T载体与pMX-IRES-GFP空质粒，分别胶回收上述3种目的基因片段与载体基因片段（方法同步骤2.3）；

[0135] (2)分别将上述3种目的基因片段经T4 DNA连接酶连接装入pMX-IRES-GFP载体（方法同步骤2.3）后，转化感受态细菌XL-10，涂布于含氨苄青霉素的固体培养基培养12-16h后，挑选单个菌落，摇菌过夜；

[0136] (3) 抽提质粒，酶切鉴定结果显示，上述3种基因片段插入正确（见图3）；

[0137] (4) 选择阳性菌落进行扩增培养，大量抽提质粒DNA。

[0138] 2.7逆转录病毒重组载体的包装：

[0139] 将含不同目的基因片段的重组质粒分别与包膜蛋白质粒VSV-G以1:1的比例混合，采用脂质体转染法转染GP2-293细胞，包装得到携带不同目的基因的3种重组逆转录病毒。实验按Invitrogen的Lipofectamine 2000试剂盒说明操作。

[0140] 2.8重组逆转录病毒的浓缩纯化：

[0141] (1) 收集病毒上清，50000g，4°C离心1.5h；

[0142] (2) 1%原体积的无菌TNE重悬沉淀，病毒完全溶解后，分装，-80°C贮存。

[0143] 2.9流式细胞术测定病毒滴度：

[0144] (1) 预先将NIH3T3细胞（2×105/孔）接种培养24h；

[0145] (2) 加入聚凝胺（PB）至终浓度8mg/mL，加入10μl待测滴度的病毒上清；

[0146] (3) 感染24h后，更换新鲜培养液，去除假病毒颗粒；

[0147] (4) 37°C继续培养3d后，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达；

[0148] (5) 37°C继续培养5d，胰酶消化、PBS洗涤3次后，用200-300μl PBS重悬，制6
备密度为1-5×10/ml的单细胞悬液，流式细胞术检测其GFP表达阳性率，按下列公式计算病毒滴度：病毒滴度（GFU/ml）=NIH3T3细胞数×阳性率/转染病毒上清量（ml）。

[0149] 荧光显微镜下观察，三种经GP2-293细胞包装所得的逆转录病毒感染的NIH3T3细胞均表达绿色荧光，表明GFP在细胞中表达（图4）。计算得三种重组病毒的滴度分别为6 7 7
8×10 IU/ml、1.59×10 IU/ml和2.14×10 IU/ml（图5）。

[0150] 3．鉴定重组逆转录病毒转染的CD8+ T细胞的抗结核和抗HIV活性

[0151] 3.1 重组病毒感染CD8+ T细胞

[0152] (1) 将CD8+ T细胞感染前一天以 5×105个/孔接种于24孔板；

[0153] (2) 转染当日弃细胞培养旧液，按MOI为13加入病毒贮存液，加入PB至终浓度为8mg/L，37°C培养4h；

[0154] (3) 加入培养基，稀释PB至2mg/L，继续培养5天；

[0155] (4) 离心收集细胞，PBS洗涤2次，2%多聚甲醛固定；

[0156] (5) 流式细胞仪分析CD8+ T细胞GFP表达阳性率，在pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-IRES-GFP转染细胞中为33.1%，在pMX- hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP转染细胞中为29.5%，在pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-T2A-hVβ18hCβ-CD
3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP转染细胞中为28.1%（图6、7）。

[0157] 3.2 ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）测定CD8+ T细胞IFN-γ、TNF-α分泌水平

[0158] 实验设置如下：

[0159] ① TB/HIVTd+TB-DC组内比较包括：阴性对照 组（TB/HIVTd+DC组：结核+肽Ag85B199–207+HIV肽Env120-128特异TCRs基因共修饰的CD8 T细胞+ DC）、未转染+
（un-transfected）组（UnTd+TB-DC组：未转染CD8 T细胞+负载结核肽Ag85B199–207的DC）、+
空载体转染（empty vector-transfected）组（EmTd +TB-DC组：空载体转染CD8 T细胞+负载结核肽Ag85B199–207的DC）、无关肽组（TB/HIVTd+CMV-DC组：结核肽Ag85B199–207+HIV肽+
Env120-128特异TCRs基因共修饰的CD8 T细胞+负载CMVpp65的DC）、TBTd+TB-DC组（结+
核肽Ag85B199–207特异TCR基因修饰的CD8 T细胞+负载结核肽Ag85B199–207的DC）、TB/+
HIVTd+TB-DC组（结核肽Ag85B199–207+HIV肽Env120-128特异TCRs基因共修饰的CD8 T细胞+负载结核肽Ag85B199–207的DC）；

[0160] ② TB/HIVTd+HIV-DC组内比较包括：阴性对照组（TB/HIVTd+DC组：结核+肽Ag85B199–207+HIV肽Env120-128特异TCRs基因共修饰的CD8 T细胞+DC）、未转染组+
（UnTd+HIV-DC组：未转染CD8 T细胞+负载HIV肽Env120-128的DC）、空载体转染组+
（EmTd+HIV-DC组：空载体转染CD8 T细胞+负载HIV肽Env120-128的DC）、无关肽组（TB/+
HIVTd+CMV-DC组：结核肽Ag85B199–207+HIV肽Env120-128特异TCRs基因共修饰的CD8 T细胞+
+负载CMVpp65的DC）、HIVTd+HIV-DC组（HIV肽Env120-128特异TCR基因修饰CD8 T细胞+负载HIV肽Env120-128的DC）、TB/HIVTd+HIV-DC组（结核肽Ag85B199–207+HIV肽Env120-128特异+
TCRs基因共修饰的CD8 T细胞+负载HIV肽Env120-128的DC）；

[0161] 实验步骤如下，实验重复3次：

[0162] (1) DC以5×103个/孔接种于96孔板，按已摸索好的E:T（测IFN-γ的分泌量+时E:T=7，测TNF-α的分泌量时E:T=20）加入CD8 T细胞，每组设三个复孔；

[0163] (2) CD8+ T细胞与DC混合培养一定时间（测IFN-γ时混合培养18h，测TNF-α时混合培养24h），收集各孔培养上清，按试剂盒说明书进行操作。

[0164] ELISA结果显示：

[0165] ① 在效靶比（E:T）=7，与负载结核肽Ag85B199–207的DC混合培养18h时，TB/+HIVTd+TB-DC组CD8 T细胞的IFN-γ分泌水平为1117.921±10.631 pg/ml，显著高于TB/HIVTd+DC 组（11.495±0.395 pg/ml，P=0.004），UnTd+TB-DC 组（15.622±3.977 pg/ml，P<0.001），EmTd+TB-DC组（86.264±8.499 pg/ml，P<0.001）和TB/HIV Td+CMV-DC组（118.248±10.190 pg/ml，P<0.001），但略低于TBTd+TB-DC组（1427.930±63.714 pg/ml，P=0.550）。

[0166] 在 效 靶 比（E:T）=7，与 负 载HIV 肽Env120-128 的DC混 合 培 养18h 时，TB/+HIVTd+HIV-DC组CD8 T细胞的IFN-γ分泌水平为655.336±33.426 pg/ml，显著高于TB/HIVTd+DC组（11.495±0.395 pg/ml，P=0.004），UnTd+HIV-DC组（30.564±2.109 pg/ml，P=0.004），EmTd+HIV-DC组（87.58±14.859 pg/ml，P=0.001）和TB/HIVTd+CMV-DC组（118.248±10.190 pg/ml，P=0.003），但低于HIVTd+HIV-DC组（1401.667±81.969 pg/ml，P=0.007）（图8）。

[0167] ②在E:T=20，与负载结核肽Ag85B199–207的DC混合培养24h时，TB/HIVTd+TB-DC+组CD8 T细胞的TNF-α分泌水平为738.840±46.864 pg/ml，显著高于TB/HIVTd+DC组（32.141±1.695 pg/ml，P=0.008），UnTd+TB-DC 组（65.644±4.781 pg/ml，P=0.008），EmTd+TB-DC组（49.697±0.629 pg/ml，P=0.008）和TB/HIVTd+CMV-DC组（55.735±6.689 pg/ml，P=0.007），但低于TBTd+TB-DC组（1040.184±31.769 pg/ml，P=0.013）。

[0168] 在E:T=20，与负载HIV肽Env120-128的DC混合培养24h时，TB/HIVTd+HIV-DC组+CD8 T细胞的TNF-α分泌水平为660.337±88.892 pg/ml，显著高于TB/HIVTd+DC组（32.141±1.695 pg/ml，P=0.029），UnTd+HIV-DC 组（60.478±7.153 pg/ml，P=0.031），EmTd+HIV-DC组（42.211±15.515 pg/ml，P=0.026）和TB/HIVTd+CMV-DC组（53.570±5.296 pg/ml，P=0.031），但低于HIVTd+HIV-DC组（1009.22 ± 67.073 pg/ml，P=0.049）（图9）。

[0169] 3. 3时间分辨荧光免疫分析试剂盒（PerkinElmer）测定CD8+ T细胞杀伤活性，按试剂盒说明书进行操作。

[0170] 时间分辨免疫荧光检测结果显示：

[0171] 在E:T=30，与负载结核肽Ag85B199–207的DC混合培养4h时，TB/HIVTd+TB-DC组CD8+ T细胞的杀伤率为35.162±2.670%，显著高于TB/HIVTd+DC组（2.900± 0.334%，P<0.001), UnTd+TB-DC组（3.886±0.346%，P<0.001），EmTd+TB-DC组（2.818±0.438%，P<0.001）和TB/HIVTd+CMV-DC组（8.611±0.470%，P<0.001），但低于TBTd+TB-DC组（57.499±3.060%，P<0.001）。

[0172] 同样，在E:T=30，与负载HIV肽Env120-128的DC混合培养4h时，TB/HIVTd+HIV-DC+组CD8 T细胞的杀伤率为23.885±3.257%，显著高于TB/HIVTd+DC组（2.900±0.334%，P=0.033），UnTd+HIV-DC组（2.283±0.321%，P=0.032）和EmTd+HIV-DC组（2.281±0.435%，P=0.030），略高于TB/HIVTd+CMV-DC组（8.611±0.470%，P=0.061），但低于HIVTd+HIV-DC组（46.446±3.677%，P=0.014）见图10。

[0173] 上述的实验结果显示：携带双病原体表位特异TCRs基因的逆转录病毒转染的CD8+ T细胞可成功表达两种外源性TCR基因，特异性识别两种抗原表位并介导IFN-γ、TNF-α细胞因子分泌和细胞毒活性，具有结核/HIV双重感染基因治疗的应用价值，可为结核/HIV双重感染的过继细胞免疫治疗开辟新径。