一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法

摘要

一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，本发明涉及建立鸡永生化前脂肪细胞的方法。本发明是要解决原代鸡前脂肪细胞不能无限传代、异质性、不同来源的细胞存在遗传背景差异等导致研究难以获得稳定可靠的结果的问题。一、克隆鸡端粒酶逆转录酶基因chTERT；二、克隆鸡端粒酶RNA基因chTR；三、构建逆转录病毒表达载体；四、包装制备逆转录病毒；五、永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1和永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-2的获得。本发明应用于建立鸡永生化前脂肪细胞领域。

权利要求

1.一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于建立鸡永生化前脂肪细胞的方法按以下步骤实现：

一、克隆chTERT的全长编码区序列：

首先利用RNA提取试剂盒提取4日龄AA肉鸡鸡胚组织总RNA，采用反转录试剂盒将提取的鸡胚组织总RNA进行反转录得到鸡胚组织cDNA，分别设计三对扩增引物，以鸡胚组织cDNA为模板，分三段PCR扩增chTERT的全部编码区序列chTERT-T1、chTERT-T2和chTERT-T3，将三段扩增产物分别经1%琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收试剂盒进行回收、纯化，设计PCR扩增引物P7并利用重叠延伸PCR的方法将chTERT-T1和chTERT-T2两个片段拼接起来，得到chTERT-T1T2，将chTERT-T1T2连接至pMD18-T Simple载体，将chTERT-T3连接至pMD18-T载体，然后将两种连接产物分别转化TOP10感受态细胞，进行阳性克隆子的筛选与鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液分别扩培并提取质粒DNA得到pMD18TS-T1T2与pMD18T-T3，然后对pMD18TS-T1T2质粒进行SalI-NcoI双酶切鉴定，对pMD18T-T3质粒进行SalI-NcoI和SalI-XhoI双酶切鉴定，酶切鉴定无误后将质粒送交测序公司进行测序，验证目的基因的正确性，将测序正确的pMD18TS-T1T2质粒和pMD18T-T3质粒分别进行SalI-NcoI双酶切，分别回收chTERT-T1T2片段与pMD18T-T3载体片段，将回收得到的chTERT-T1T2片段与pMD18T-T3载体片段连接，得到pMD18T-chTERT；

二、克隆鸡端粒酶RNA基因chTR：

利用AA肉鸡基因组DNA为模板，以P8和P9为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行回收、纯化，获得chTR的基因序列，将chTR与TA克隆载体pMD18-T进行连接，将连接产物转化TOP10感受态细胞，然后进行阳性克隆子的筛选与鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液进行扩培并提取质粒DNA得到pMD18T-chTR，然后对pMD18T-chTR质粒进行BglⅡ-ClaⅠ双酶切鉴定，酶切鉴定无误后将质粒送交测序公司进行测序，验证目的基因chTR的正确性；

三、构建逆转录病毒表达载体：

分别对pMD18T-chTERT和病毒载体pLXRN进行SalI-XhoI双酶切，分别回收chTERT和pLXRN的线性DNA片段并连接，构建了表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT，分别对pMD18T-chTR和pLPCX进行BglⅡ-ClaⅠ双酶切，分别回收chTR和pLPCX的线性DNA片段并连接，构建了表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR，将构建好的表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT和表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR送交测序公司进行测序，再次验证目的基因克隆和载体构建的正确性；

四、包装制备逆转录病毒：

采用转染试剂将步骤三中制备的表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT和表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR分别与被膜蛋白载体pVSV-G共转染包装细胞GP2-293，培养细胞，在24h、48h和72h收集细胞上清，过滤去除细胞碎片后加入病毒浓缩试剂，离心浓缩病毒，得到了分别表达chTERT基因的逆转录病毒和表达chTR基因的逆转录病毒，测定两种逆转录病毒的滴度，﹣80℃保存备用；

五、逆转录病毒的感染和筛选：

5

培养原代鸡前脂肪细胞，按照5×10cells/ml的细胞密度铺于培养皿中，用步骤四制备的表达chTERT基因的逆转录病毒感染原代鸡前脂肪细胞，感染48h后加入含有400μg/mlG418的选择培养基筛选表达chTERT基因的阳性细胞，对表达chTERT基因的阳性细胞换液培养6个月可获得永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1；或者先用步骤四制备的表达chTERT基因的逆转录病毒感染原代鸡前脂肪细胞，感染48h后加入含有400μg/ml G418的选择培养基筛选表达chTERT基因的阳性细胞，筛选结束后将表达chTERT基因的阳性细胞重新铺板，加入步骤四制备的表达chTR基因的逆转录病毒，感染48h后加入含有2.5μg/ml嘌呤霉素的选择培养基筛选表达chTERT基因和chTR基因的阳性细胞，对表达chTERT基因和chTR基因的阳性细胞传代培养2至3代，即可获得永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-2；

其中步骤一中PCR扩增chTERT-T1片段所用上游引物P1为5’-AAGTCGACCGTGGGGCCCGCTGCACGGCAG-3’，下游引物P2为5’-GCTCTGACTGGATAACTGCTGGAAGCAGATGGGCCGGGG-3’，步骤一中PCR扩增chTERT-T2所用上游引物P3为5’-TTCCAGCAGTTATCCAGTCAGAGCGAAGTCATC-3’，下游引物P4为5’-CCATACGCAGTCATTCACTCTCATCTTCCACATC-3’，步骤一中PCR扩增chTERT-T3所用上游引物P5为5’-GCCATAACAAATGCCGGTTCTTTAAAAACGTG-3’，下游引物P6为5’-CGCTCGAGAGACCTTCATCCCTTAGTCCAG-3’，步骤一中重叠延伸PCR扩增chTERT-T1T2片段所用上游引物P7为5’-GTCGACTTGTGGGGTCCGCTGCAC-3’，下游引物为P4；

其中步骤二中PCR扩增鸡端粒酶RNA基因chTR所用上游引物P8为5’-ACGCGTCGACACGCGTGGCGGGTGGAAGGC-3’，下游引物P9为5’-CCGCTCGAGGCGTGTGGGAGCGACGCCGTC-3’。

2.根据权利要求1所述的一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于步骤一中PCR扩增chTERT的编码区序列chTERT-T1的反应体系为50μL，由下列成分组成：PCR扩增条件为：95℃变性5min，95℃变性60s，76.1℃退火25s，72℃延伸30s，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。

3.根据权利要求1所述的一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于步骤一中PCR扩增chTERT的编码区序列chTERT-T2的反应体系为50μL，由下列成分组成：PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性45s，63.7℃退火25s，72℃延伸130s，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。

4.根据权利要求1所述的一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于步骤一中PCR扩增chTERT的编码区序列chTERT-T3的反应体系为50μL，由下列成分组成：PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，54.1℃退火25s，72℃延伸130s，共35个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。

5.根据权利要求1所述的一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于步骤一中利用重叠延伸PCR的方法将chTERT-T1与chTERT-T2的PCR扩增产物连接获得chTERT-T1T2，反应体系为50μL，由下列成分组成：PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性45s，63.0℃退火30s，72℃延伸150s，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。

6.根据权利要求1所述的一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于步骤二中PCR扩增鸡端粒酶RNA基因chTR的反应体系为50μL，由下列成分组成：PCR扩增条件为：95℃变性5min，95℃变性60s，73.7℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。

7.根据权利要求1所述的一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于步骤一中pMD18TS-T1T2质粒和pMD18T-T3质粒分别进行SalI-NcoI双酶切反应体系如下：酶切反应条件：37℃水浴，反应1h。

8.根据权利要求1所述的一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于步骤一中pMD18T-T3质粒、步骤三中pMD18T-chTERT质粒和步骤三中pLXRN病毒载体质粒分别进行SalI-XhoI双酶切反应体系如下：酶切反应条件：37℃水浴，反应1h。

9.根据权利要求1所述的一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于步骤二中pMD18T-chTR质粒、步骤三中pMD18T-chTR质粒和步骤三中pLPCX病毒载体质粒分别进行BglⅡ-ClaⅠ双酶切反应体系如下：酶切反应条件：37℃水浴，反应1h。

说明书

一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及建立鸡的永生化前脂肪细胞的方法。

背景技术

[0002] 脂肪不仅是能量储藏组织，而且是机体生长发育过程中重要的内分泌器官。脂肪的功能发生紊乱可导致肥胖症，并可引发代谢综合症以及多种复杂疾病，如糖尿病、动脉粥样硬化、血脂异常、高血压和恶性肿瘤等。由于肥胖症及其相关疾病在全球发病率逐年上升，脂肪细胞分化和脂肪细胞功能研究成为了当今生命科学研究的热点。

[0003] 在农业生产领域，腹脂过度蓄积是肉鸡业生产的一个难题。为了解决实际生产中肉鸡腹脂过度蓄积的问题，培育优质低脂肉鸡，我们需要有针对性地开展肉鸡腹部脂肪细胞分化的研究。目前，鸡脂肪细胞分化研究仍然依赖于体外培养的原代鸡前脂肪细胞，而原代培养的细胞本身存在不能无限传代、异质性(混合了巨噬细胞、间皮细胞或者其它一些细胞类型)、不同来源的细胞存在遗传背景差异等难以克服的缺点和不足，从而导致了研究难以获得稳定可靠的结果。脂肪细胞分化的理想研究模型是永生化的前脂肪细胞。与体外培养的原代细胞相比，永生化的前脂肪细胞既具有无限增殖能力，又具有正常前脂肪细胞的特征，它能提供大量稳定均一、性状一致的细胞来源，排除由于不同发育阶段、不同生理条件以及不同细胞群体间的影响，保证了研究的重复性和可比性。目前，人类已通过多种方法建立了人(包括白色脂肪和棕色脂肪)、鼠、牛和猪等物种的永生化前脂肪细胞系，而鸡的永生化前脂肪细胞至今尚未建立。

[0004] 建立永生化细胞系主要有自发突变、射线照射、化学诱变、病毒感染、病毒癌基因转导和端粒酶活性重建等方法，其中端粒酶活性重建被认为是目前建立永生化细胞的首选方法。人的端粒酶基因hTERT已被广泛用于人及多种哺乳动物细胞的永生化。截至目前，国内、外尚无应用hTERT建立鸡永生化前脂肪细胞的研究报道，更无利用鸡的端粒酶逆转录酶(chTERT)和端粒酶RNA(chTR)建立鸡永生化前脂肪细胞的报道。

发明内容

[0005] 本发明是要解决原代鸡前脂肪细胞不能无限传代、异质性、不同来源的细胞存在遗传背景差异等导致研究难以获得稳定可靠的结果的问题而提供一种建立永生化的鸡前脂肪细胞的方法。

[0006] 本发明一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法按以下步骤进行：

[0007] 一、克隆chTERT的全长编码区序列：

[0008] 首先利用RNA提取试剂盒提取4日龄AA肉鸡鸡胚组织总RNA，采用反转录试剂盒将提取的鸡胚组织总RNA进行反转录得到鸡胚组织cDNA，分别设计三对扩增引物，以鸡胚组织cDNA为模板，分三段PCR扩增chTERT的全部编码区序列chTERT-T1、chTERT-T2和chTERT-T3，将三段扩增产物分别经1％琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收试剂盒进行回收、纯化，设计PCR扩增引物P7并利用重叠延伸PCR的方法将chTERT-T1和chTERT-T2两个片段拼接起来，得到chTERT-T1T2，将chTERT-T1T2连接至pMD18-TSimple载体，将chTERT-T3连接至pMD18-T载体，然后将两种连接产物分别转化TOP10感受态细胞，进行阳性克隆子的筛选与鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液分别扩培并提取质粒DNA得到pMD18TS-T1T2与pMD18T-T3，然后对pMD18TS-T1T2质粒进行SalI-NcoI双酶切鉴定，对pMD18T-T3质粒进行SalI-NcoI和SalI-XhoI双酶切鉴定，酶切鉴定无误后将质粒送交测序公司进行测序，验证目的基因的正确性，将测序正确的pMD18TS-T1T2质粒和pMD18T-T3质粒分别进行SalI-NcoI双酶切，分别回收chTERT-T1T2片段与pMD18T-T3载体片段，将回收得到的chTERT-T1T2片段与pMD18T-T3载体片段连接，得到pMD18T-chTERT；

[0009] 二、克隆鸡端粒酶RNA基因chTR：

[0010] 利用AA肉鸡基因组DNA为模板，以P8和P9为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行回收、纯化，获得chTR的基因序列，将chTR与TA克隆载体pMD18-T进行连接，将连接产物转化TOP10感受态细胞，然后进行阳性克隆子的筛选与鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液进行扩培并提取质粒DNA得到pMD18T-chTR，然后对pMD18T-chTR质粒进行BglII-Cla I双酶切鉴定，酶切鉴定无误后将质粒送交测序公司进行测序，验证目的基因chTR的正确性；

[0011] 三、构建逆转录病毒表达载体：

[0012] 分别对pMD18T-chTERT和病毒载体pLXRN进行SalI-XhoI双酶切，分别回收chTERT和pLXRN的线性DNA片段并连接，构建了表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT，分别对pMD18T-chTR和pLPCX进行BglII-Cla I双酶切，分别回收chTR和pLPCX的线性DNA片段并连接，构建了表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR，将构建好的表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT和表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR送交测序公司进行测序，再次验证目的基因克隆和载体构建的正确性；

[0013] 四、包装制备逆转录病毒：

[0014] 采用转染试剂将步骤三中制备的表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT和表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR分别与被膜蛋白载体pVSV-G共转染包装细胞GP2-293，培养细胞，在24h、48h和72h收集细胞上清，过滤去除细胞碎片后加入病毒浓缩试剂，离心浓缩病毒，得到了分别表达chTERT基因的逆转录病毒和表达chTR基因的逆转录病毒，测定两种逆转录病毒的滴度，-80℃保存备用；

[0015] 五、逆转录病毒的感染和筛选：

[0016] 培养原代鸡前脂肪细胞，按照5×105cells/ml的细胞密度铺于培养皿中，用步骤四制备的表达chTERT基因的逆转录病毒感染原代鸡前脂肪细胞，感染48h后加入含有400μg/ml G418的选择培养基筛选表达chTERT基因的阳性细胞，对表达chTERT基因的阳性细胞换液培养6个月可获得永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1；或者先用步骤四制备的表达chTERT基因的逆转录病毒感染原代鸡前脂肪细胞，感染48h后加入含有400μg/mlG418的选择培养基筛选表达chTERT基因的阳性细胞，筛选结束后将表达chTERT基因的阳性细胞重新铺板，加入步骤四制备的表达chTR基因的逆转录病毒，感染48h后加入含有2.5μg/ml嘌呤霉素的选择培养基筛选表达chTERT基因和chTR基因的阳性细胞，对表达chTERT基因和chTR基因的阳性细胞传代培养2至3代，即可获得永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-2；

[0017] 其中步骤一中PCR扩增chTERT-T1片段所用上游引物P1为5’-AAGTCGACCGTGGGGCCCGCTGCACGGCAG-3’，下游引物P2为5’-GCTCTGACTGGATAACTGCTGGAAGCAGATGGGCCGGGG-3’，步骤一中PCR扩增chTERT-T2所用上游引物P3为5’-TTCCAGCAGTTATCCAGTCAGAGCGAAGTCATC-3’，下游引物P4为5’-CCATACGCAGTCATTCACTCTCATCTTCCACATC-3’，步骤一中PCR扩增chTERT-T3所用上游引物P5为5’-GCCATAACAAATGCCGGTTCTTTAAAAACGTG-3’，下游引物P6为5’-CGCTCGAGAGACCTTCATCCCTTAGTCCAG-3’，步骤一中重叠延伸PCR扩增chTERT-T1T2片段所用上游引物P7为5’-GTCGACTTGTGGGGTCCGCTGCAC-3’，下游引物为P4；

[0018] 其中步骤二中PCR扩增鸡端粒酶RNA基因chTR所用上游引物P8为5’-ACGCGTCGACACGCGTGGCGGGTGGAAGGC-3’，下游引物P9为5’-CCGCTCGAGGCGTGTGGGAGCGACGCCGTC-3’。

[0019] 发明效果：

[0020] 本发明一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法通过导入chTERT基因(或先后导入chTERT基因和chTR基因)激活了鸡前脂肪细胞自身的端粒酶活性，能够迅速、有效的建立永生化的鸡前脂肪细胞，所建立的永生化鸡前脂肪细胞成功越过了复制衰老，获得了永生性，并且该永生化鸡前脂肪细胞保持了与原代鸡前脂肪细胞十分相近的表型，保持了细胞运动的接触抑制和细胞增殖的密度限制，体外利用油酸诱导能够分化形成脂滴，并能够冻存和长期保存。

附图说明

[0021] 图1是具体实施方式一中利用Sal I、Xho I限制性内切酶对pLXRN-chTERT逆转录病毒表达载体质粒进行双酶切后1％琼脂糖凝胶电泳检测图片，其中，M为DNA MarkerDL10000，1为双酶切后的产物，2为pLXRN-chTERT逆转录病毒表达载体质粒；

[0022] 图2是具体实施方式一中利用Bgl II、Cla I限制性内切酶对pLPCX-chTR逆转录病毒表达载体质粒进行双酶切后2％琼脂糖凝胶电泳检测图片，其中，M为DNA Marker DL5000，1为双酶切后的产物，2为pLPCX-chTR逆转录病毒表达载体质粒；

[0023] 图3是具体实施方式一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1和ICPA-2中chTERT基因的表达检测图，其中，1为ICPA-1，2为ICPA-2，3为CPA，4为pLXRN，5为β-actin；

[0024] 图4是具体实施方式一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1和ICPA-2中chTR基因的表达检测图，其中，1为ICPA-1，2为ICPA-2，3为CPA，4为pLPCX；

[0025] 图5是具体实施方式一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1、ICPA-2的生长曲线，其中， 为ICPA-I，为ICPA-II， 为CPA-1， 为CPA-2；

[0026] 图6是具体实施方式一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1在累积群体倍增数为22(PD22)时的亚汇合形态学图；

[0027] 图7是具体实施方式一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1在累积群体倍增数为22(PD22)时的汇合形态学图；

[0028] 图8是具体实施方式一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-2在累积群体倍增数为6(PD6)时的亚汇合形态学图；

[0029] 图9是具体实施方式一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-2在累积群体倍增数为6(PD6)时的汇合形态学图；

[0030] 图10是具体实施方式一中感染pLXRN病毒空载体的对照鸡前脂肪细胞在累积群体倍增数为2(PD2)时的形态学图；

[0031] 图11是具体实施方式一中原代培养的鸡前脂肪细胞的形态学图；

[0032] 图12是具体实施方式一中为1代鸡前脂肪细胞的形态学图；

[0033] 图13是具体实施方式一中为3代鸡前脂肪细胞的形态学图；

[0034] 图14是具体实施方式一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1、ICPA-2端粒酶活性的检测结果图；

[0035] 其中，Positive为2000个Hela细胞所具有的端粒酶活性，ICPA-1为单独感染chTERT病毒获得的永生化鸡前脂肪细胞的端粒酶活性、ICPA-2为先后感染chTERT病毒和chTR病毒获得的永生化鸡前脂肪细胞的端粒酶活性，chTR为单独感染chTR病毒的鸡前脂肪细胞的端粒酶活性，pLXRN为感染pLXRN病毒空载体的鸡前脂肪细胞的端粒酶活性，pLPCX为感染pLPCX病毒空载体的鸡前脂肪细胞的端粒酶活性，带有HT标记为热失活后的样品；MTC为端粒酶阴性对照，NTC为无模板对照；

[0036] 图15是具体实施方式一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1在群体倍增数为29(PD29)时的衰老检测图；

[0037] 图16是具体实施方式一中原代鸡前脂肪细胞在群体倍增数为8(PD8)时的衰老检测图；

[0038] 图17是具体实施方式一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-2在群体倍增数为13(PD13)时的衰老检测图；

[0039] 图18是具体实施方式一中感染pLXRN病毒空载体的鸡前脂肪细胞在群体倍增数为2(PD2)时的衰老检测图；

[0040] 图19是具体实施方式一中对永生化鸡前脂肪细胞ICPA-1进行体外油酸诱导分化图；

[0041] 图20是具体实施方式一中对永生化鸡前脂肪细胞ICPA-2进行体外油酸诱导分化图；

[0042] 图21是具体实施方式一中对永生化鸡前脂肪细胞ICPA-1进行油红氧染色的结果图；其中，1为经过油酸诱导的ICPA-1细胞进行油红氧染色的结果图，2为未经过油酸诱导的ICPA-1细胞进行油红氧染色的结果图；

[0043] 图22是具体实施方式一中对永生化鸡前脂肪细胞ICPA-2进行油红氧染色的结果图；其中，1为经过油酸诱导的ICPA-2细胞进行油红氧染色的结果图，2为未经过油酸诱导的ICPA-2细胞进行油红氧染色的结果图；

[0044] 图23是具体实施方式一中对永生化鸡前脂肪细胞ICPA-1进行油红氧提取比色的结果图，其中，1为经过油酸诱导的ICPA-1细胞进行油红氧提取后在510nm下的比色值，2为未经油酸诱导的ICPA-1细胞进行油红氧提取后在510nm下的比色值。

具体实施方式

[0045] 具体实施方式一：本实施方式建立鸡永生化前脂肪细胞的方法按以下步骤进行：

[0046] 一、克隆chTERT的全长编码区序列：

[0047] 首先利用RNA提取试剂盒提取4日龄AA肉鸡鸡胚组织总RNA，采用反转录试剂盒将提取的鸡胚组织总RNA进行反转录得到鸡胚组织cDNA，分别设计三对扩增引物，以鸡胚组织cDNA为模板，分三段PCR扩增chTERT的全部编码区序列chTERT-T1、chTERT-T2和chTERT-T3，将三段扩增产物分别经1％琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收试剂盒进行回收、纯化，设计PCR扩增引物P7并利用重叠延伸PCR的方法将chTERT-T1和chTERT-T2两个片段拼接起来，得到chTERT-T1T2，将chTERT-T1T2连接至pMD18-TSimple载体，将chTERT-T3连接至pMD18-T载体，然后将两种连接产物分别转化TOP10感受态细胞，进行阳性克隆子的筛选与鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液分别扩培并提取质粒DNA得到pMD18TS-T1T2与pMD18T-T3，然后对pMD18TS-T1T2质粒进行SalI-NcoI双酶切鉴定，对pMD18T-T3质粒进行SalI-NcoI和SalI-XhoI双酶切鉴定，酶切鉴定无误后将质粒送交测序公司进行测序，验证目的基因的正确性，将测序正确的pMD18TS-T1T2质粒和pMD18T-T3质粒分别进行SalI-NcoI双酶切，分别回收chTERT-T1T2片段与pMD18T-T3载体片段，将回收得到的chTERT-T1T2片段与pMD18T-T3载体片段连接，得到pMD18T-chTERT；

[0048] 二、克隆鸡端粒酶RNA基因chTR：

[0049] 利用AA肉鸡基因组DNA为模板，以P8和P9为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行回收、纯化，获得chTR的基因序列，将chTR与TA克隆载体pMD18-T进行连接，将连接产物转化TOP10感受态细胞，然后进行阳性克隆子的筛选与鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液进行扩培并提取质粒DNA得到pMD18T-chTR，然后对pMD18T-chTR质粒进行Bgl II-Cla I双酶切鉴定，酶切鉴定无误后将质粒送交测序公司进行测序，验证目的基因chTR的正确性；

[0050] 三、构建逆转录病毒表达载体：

[0051] 分别对pMD18T-chTERT和病毒载体pLXRN进行SalI-XhoI双酶切，分别回收chTERT和pLXRN的线性DNA片段并连接，构建了表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT，分别对pMD18T-chTR和pLPCX进行Bgl II-Cla I双酶切，分别回收chTR和pLPCX的线性DNA片段并连接，构建了表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR，将构建好的表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT和表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR送交测序公司进行测序，再次验证目的基因克隆和载体构建的正确性；

[0052] 四、包装制备逆转录病毒：

[0053] 采用转染试剂将步骤三中制备的表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT和表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR分别与被膜蛋白载体pVSV-G共转染包装细胞GP2-293，培养细胞，在24h、48h和72h收集细胞上清，过滤去除细胞碎片后加入病毒浓缩试剂，离心浓缩病毒，得到了分别表达chTERT基因的逆转录病毒和表达chTR基因的逆转录病毒，测定两种逆转录病毒的滴度，-80℃保存备用；

[0054] 五、逆转录病毒的感染和筛选：

[0055] 培养原代鸡前脂肪细胞，按照5×105cells/ml的细胞密度铺于培养皿中，用步骤四制备的表达chTERT基因的逆转录病毒感染原代鸡前脂肪细胞，感染48h后加入含有400μg/ml G418的选择培养基筛选表达chTERT基因的阳性细胞，对表达chTERT基因的阳性细胞换液培养6个月可获得永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1；或者先用步骤四制备的表达chTERT基因的逆转录病毒感染原代鸡前脂肪细胞，感染48h后加入含有400μg/mlG418的选择培养基筛选表达chTERT基因的阳性细胞，筛选结束后将表达chTERT基因的阳性细胞重新铺板，加入步骤四制备的表达chTR基因的逆转录病毒，感染48h后加入含有2.5μg/ml嘌呤霉素的选择培养基筛选表达chTERT基因和chTR基因的阳性细胞，对表达chTERT基因和chTR基因的阳性细胞传代培养2至3代，即可获得永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-2；

[0056] 其中步骤一中PCR扩增chTERT-T1片段所用上游引物P1为5’-AAGTCGACCGTGGGGCCCGCTGCACGGCAG-3’，下游引物P2为5’-GCTCTGACTGGATAACTGCTGGAAGCAGATGGGCCGGGG-3’，步骤一中PCR扩增chTERT-T2所用上游引物P3为5’-TTCCAGCAGTTATCCAGTCAGAGCGAAGTCATC-3’，下游引物P4为5’-CCATACGCAGTCATTCACTCTCATCTTCCACATC-3’，步骤一中PCR扩增chTERT-T3所用上游引物P5为5’-GCCATAACAAATGCCGGTTCTTTAAAAACGTG-3’，下游引物P6为5’-CGCTCGAGAGACCTTCATCCCTTAGTCCAG-3’，步骤一中重叠延伸PCR扩增chTERT-T1T2片段所用上游引物P7为5’-GTCGACTTGTGGGGTCCGCTGCAC-3’，下游引物为P4；

[0057] 其中步骤二中PCR扩增鸡端粒酶RNA基因chTR所用上游引物P8为5’-ACGCGTCGACACGCGTGGCGGGTGGAAGGC-3’，下游引物P9为5’-CCGCTCGAGGCGTGTGGGAGCGACGCCGTC-3’。

[0058] 本实施方式效果：

[0059] 本发明一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法通过导入chTERT基因(或先后导入chTERT基因和chTR基因)激活了鸡前脂肪细胞自身的端粒酶活性，能够迅速、有效的建立永生化的鸡前脂肪细胞，所建立的永生化鸡前脂肪细胞成功越过了复制衰老，获得了永生性，并且该永生化鸡前脂肪细胞保持了与原代鸡前脂肪细胞十分相近的表型，保持了细胞运动的接触抑制和细胞增殖的密度限制，体外利用油酸诱导能够分化形成脂滴，并能够冻存和长期保存。

[0060] 本实施方式步骤一中的chTERT基因的全长编码区序列为GenBank中发表的原鸡端粒酶逆转录酶(chTERT)mRNA序列NM_001031007，其序列如Seq ID No：1所示，本实施方式步骤二中的chTR基因序列为GenBank中发表的原鸡端粒酶RNA(chTR)序列NR_001594，其序列如Seq ID No：2所示；

[0061] 本实施方式步骤一中提取4日龄AA肉鸡鸡胚组织总RNA的试剂盒为购买自OMEGA公司的OMEGA E.Z.N.A.Total RNA Kit II，具体操作步骤参照说明书；步骤一中使用的反转录试剂盒为购买自Promega公司的Promega ImProm-II，具体操作步骤参照说明书；步骤一中使用的胶回收试剂盒为购买自Axygen公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，具体操作步骤参照说明书；

[0062] 本实施方式中的大肠杆菌TOP10感受态细胞购买自哈尔滨海基公司；

[0063] 本实施方式中的转化方法为热激法；质粒DNA提取使用的试剂盒购买自Axygen公司的AxyPrep质粒DNA小量提取试剂盒；

[0064] AA肉鸡购买自哈尔滨益农禽业有限公司；

[0065] 本实施方式中的pLXRN和pLPCX逆转录病毒表达载体、pVSV-G被膜蛋白载体、GP2-293病毒包装细胞购买自Clontech公司；

[0066] 本实施方式中pMD18-T Simple载体和pMD18-T载体购买自TaKaRa公司；

[0067] 本实施方式中细胞端粒酶活性检测试剂盒购买自Chemicon公司的TRAPEZE RTTelomerase Detection Kit，具体操作步骤参照说明书；

[0068] 本实施方式中的细胞衰老检测试剂盒为碧云天公司的细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒，具体操作步骤参照说明书；

[0069] 本实施方式所用的完全培养基成分为：DMEM/F12添加了100units/ml的青霉素G钠，100μg/ml的链霉素和10％的胎牛血清，其中DMEM/F12购买自Gibco公司，胎牛血清购买自TBD公司。

[0070] 本实施方式所用的选择培养基成分为：完全培养基添加了终浓度为400μg/ml的G418或者完全培养基添加了终浓度为2.5μg/ml Puromycin，其中G418和Puromycin购买自Clontech公司。

[0071] 本实施方式步骤四中包装制备chTERT和chTR逆转录病毒的具体步骤如下：

[0072] (1)提取逆转录病毒载体pLXRN-chTERT、pLPCX-chTR、pLXRN和pLPCX的高纯质粒，-20℃冻存；

[0073] (2)选择罗氏FuGENE HD转染试剂进行细胞转染，具体步骤按照说明书操作；

[0074] (3)转染前12～24h将GP2-293细胞接种在25cm2细胞培养瓶中，待细胞生长至80％汇合时，配制转染混合液进行转染，转染后8～10小时吸出培养基，加入3ml完全培养基，分别在24h、48h和72h收集细胞上清；

[0075] (4)500×g、4℃离心10分钟，或经0.45μm滤器(低蛋白结合)过滤，去除细胞碎片；

[0076] (5)将所有病毒上清转移至50ml离心管中，按照1体积病毒液加入4体积浓缩试剂的比例加入Retro-X Concentrator病毒浓缩试剂，轻轻混匀，置于4℃孵育过夜；

[0077] (6)1500×g、4℃离心45min；

[0078] (7)移除上清，不要搅动管壁，用原体积0.5～1％的DMEM/F12培养基轻轻的再悬浮病毒沉淀，按感染用量将浓缩病毒分装到单独的EP管中以免反复冻融，最后将管冻存于-80℃备用；

[0079] 其中，步骤(3)中的转染混合液配制方法为：

[0080] (1)质粒DNA：逆转录病毒载体5μg，pVSV-G被膜蛋白载体5μg；

[0081] (2)FuGENE HD转染试剂：25μl；

[0082] (3)DMEM/F12培养基：加至终体积500μl。

[0083] 本实施方式步骤四中测定逆转录病毒滴度的具体步骤如下：

[0084] (1)测定滴度前一天准备好NIH3T3细胞：将细胞铺于6孔板中，密度为每孔0.5～5
1×10 个细胞，每孔加2ml完全培养基；

[0085] (2)准备20ml完全培养基并加入浓度为4mg/ml的聚凝胺60μl；

[0086] (3)按如下方法准备6组10倍病毒稀释液：①加1.35ml步骤(2)中制备的培养基到6个1.5ml EP管中；②加150μl要测定滴度的病毒液到1管中，混合；③从1管中转移150μl病毒稀释液到2管中，混合，再转移150μl稀释液到下一个管中连续稀释；

[0087] (4)感染NIH 3T3细胞：分别将6组10倍稀释的病毒液各取1ml加入到步骤(1)中6孔板的1至6孔中；

[0088] (5)感染24h后，使细胞在抗生素筛选浓度下培养一周；

[0089] (6)病毒的滴度等于含有克隆的最高稀释度下的克隆数量×稀释倍数：如：在1066
稀释倍数下存在4个克隆可表示为4×10cfu/ml。

[0090] 本实施方式步骤五中测定鸡前脂肪细胞的最佳药物筛选浓度和最佳细胞铺板密度的具体步骤如下：

[0091] A药物最佳筛选浓度的测定：

[0092] (1)将2×105的原代鸡前脂肪细胞铺于6孔板中，每孔加入2ml完全培养基，并加入终浓度为0，50，100，200，400，800μg/ml的G418，或加入终浓度为0，1，2.5，5，7.5，10μg/ml的Puro(嘌呤霉素)；

[0093] (2)培养细胞10～14天，每四天更换一次选择培养基(或更频繁)；

[0094] (3)每两天检查一次细胞活力；

[0095] 选择在5天内使得大量细胞死亡、在两周内杀死全部细胞的最低浓度作为该药物的最佳筛选浓度；

[0096] B细胞最佳铺板密度的测定：

[0097] (1)按照5×106，1×106，5×105，2×105，1×105，5×104的细胞密度将细胞铺于6孔板中，每孔加入2ml最佳浓度的选择培养基；

[0098] (2)培养细胞5～14天，每四天更换一次选择培养基；

[0099] (3)每两天检查一次细胞活力；

[0100] 选择细胞大量死亡之前(大约5天)汇合度达到80％的铺板密度作为该细胞的最佳铺板密度，测定结果见表1：

[0101] 表1

[0102]药物名称 药物筛选浓度 细胞铺板密度
G418 400ug/ml 5×105cells/ml
Puro(嘌呤霉素) 2.5ug/ml 5×105cells/ml

[0103] 表1：原代鸡前脂肪细胞的最佳药物筛选浓度和最佳细胞铺板密度的测定结果。该浓度可以保证原代鸡前脂肪细胞在抗生素筛选条件下5天内大量死亡，在14天内全部死亡；

[0104] 本实施方式步骤五中分离和培养原代鸡前脂肪细胞的具体步骤如下：

[0105] 取一只10日龄AA肉鸡迅速扑杀，然后无菌分离腹部脂肪组织，PBS清洗后去除血管和筋膜，然后剪碎脂肪组织，加入I型胶原酶消化65min，经100目筛网过滤后2000rpm离心10min(以下离心步骤相同)，去除悬浮脂肪层，重悬细胞，经600目筛网过滤后离心，弃上清，加入红细胞裂解液，重悬细胞并静置裂解10min，离心，用新培养基重悬细胞后离心，弃2
上清，加入DMEM/F12完全培养基，细胞计数后接种于25cm 细胞培养瓶中，37℃，5％CO2培养，2天后更换培养基，4天后传代培养；

[0106] 本实施方式步骤五中利用chTERT病毒单独感染原代鸡前脂肪细胞和筛选获得永生化鸡前脂肪细胞ICPA-1的具体步骤如下：5

[0107] 感染前一天将原代鸡前脂肪细胞铺于60mm皿中，接种密度为5×10cells/ml。加入足量的表达chTERT的逆转录病毒，加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺进行感染，感染24h后更换新鲜的培养基(可选：每隔12小时可以进行连续的感染，这样既可以增加感染效率，也可增加拷贝数，但是每次感染后，至少让细胞休息12小时)，感染48h后加入含有终浓度400μg/ml G418的选择培养基开始筛选，每4天更换一次选择培养基，筛选14天，得到表达chTERT的阳性细胞，对表达chTERT的阳性细胞进行传代培养，大部分细胞在PD8～PD10会进入生长停滞阶段，经过6个月精心的培养后，有少数细胞会发生突变，表现出增殖优势，并最终成为永生化的鸡前脂肪细胞，通过单独感染chTERT逆转录病毒获得的永生化鸡前脂肪细胞系命名为ICPA-1(Immortalized chick preadipocyte-1)，ICPA-1细胞系拥有与原代鸡前脂肪细胞十分相近的表型，保持了细胞运动的接触抑制和细胞增殖的密度限制，并且体外利用油酸诱导能够分化形成核周脂滴，分化效果较好。

[0108] 本实施方式步骤五中利用chTERT病毒和chTR病毒先后感染原代鸡前脂肪细胞和筛选获得永生化鸡前脂肪细胞ICPA-2的具体步骤如下：

[0109] 感染前一天将原代鸡前脂肪细胞铺于60mm皿中，接种密度为5×105cells/ml。加入足量的表达chTERT的逆转录病毒，加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺进行感染，感染48h后加入含有终浓度400μg/ml G418的选择培养基开始筛选，每4天更换一次选择培养基，筛选14天，得到表达chTERT的阳性细胞，将经G418筛选后得到的表达chTERT的阳性细5
胞按照5×10cells/ml的密度重新铺于60mm皿中，培养1天后细胞贴壁，加入足量的表达chTR的逆转录病毒，并加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺进行感染，感染48h后加入含有终浓度2.5μg/ml Puro的选择培养基开始筛选，每4天更换一次选择培养基，筛选14天，得到表达chTERT和chTR的阳性细胞，对表达chTERT和chTR的阳性细胞进行2至3次传代培养即可获得永生化的鸡前脂肪细胞，通过先后感染chTERT病毒和chTR病毒获得的永生化鸡前脂肪细胞系命名为ICPA-2(Immortalized chick preadipocyte-2)，ICPA-2同样保持了与原代鸡前脂肪细胞相近的表型，与ICPA-1不同的是，ICPA-2可以很快越过生长停滞期并表现出增殖优势，增殖速度更快，但是细胞的分化能力较ICPA-1有所降低。

[0110] 由图1可知，利用Sal I、Xho I限制性内切酶对pLXRN-chTERT逆转录病毒表达载体质粒进行双酶切，1泳道在4000bp可见chTERT基因的酶切产物，说明pLXRN-chTERT逆转录病毒表达载体构建成功；

[0111] 由图2可知，利用Bgl II、Cla I限制性内切酶对pLPCX-chTR逆转录病毒表达载体质粒进行双酶切，1泳道在500bp可见chTR基因的酶切产物，说明pLPCX-chTR逆转录病毒表达载体构建成功；

[0112] 由图3可知，chTERT基因由于受到发育调控，在原代鸡前脂肪细胞CPA(chickpreadipocyte的缩写)和感染病毒空载体的对照细胞pLXRN中的表达很低或不表达，而在成功感染chTERT病毒的永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1和ICPA-2中均有较高表达，说明chTERT基因成功导入到了ICPA-1和ICPA-2中，并且能够正确转录表达；

[0113] 由图4可知，chTR基因在永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1、原代鸡前脂肪细胞CPA和感染病毒空载体的对照细胞pLPCX中表达很低，而在ICPA-2中有较高表达，说明chTR基因成功导入到了ICPA-2中，并且能够正确转录表达；

[0114] 由图5永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1、ICPA-2与CPA的累积群体倍增数(PD)的比较可知：ICPA-1是导入chTERT获得的永生化鸡前脂肪细胞系，经过459天的培养，群体倍增数已达PD56；ICPA-2是导入chTERT和chTR获得的永生化鸡前脂肪细胞系，经过273天的培养，群体倍增数已达PD42；而CPA-1和CPA-2是原代鸡前脂肪细胞，CPA-1培养了390天，CPA-2培养了270天，原代鸡前脂肪细胞在体外经过8～9代的传代培养便会进入生长停滞期，此时细胞仍然能够存活但是已不再增殖；

[0115] 由图6、7、8、9、10、11、12、13中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1、ICPA-2、感染病毒空载体的对照细胞pLXRN与原代、1代、3代鸡前脂肪细胞的细胞形态学比较可知：ICPA-1、ICPA-2保持了原代鸡前脂肪细胞的基本形态，保持了细胞运动的接触抑制和细胞增殖的密度限制，图7和图9表明ICPA-1和ICPA-2细胞系在生长至过度汇合的情况下也呈单层生长；

[0116] 由图14永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1、ICPA-2端粒酶活性的检测结果可知，永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1、ICPA-2均检测出了较高的端粒酶活性，而单独感染chTR病毒、感染pLXRN和pLPCX病毒空载体的鸡前脂肪细胞的端粒酶活性较低；其中，Positive是2000个Hela细胞所具有的端粒酶活性，可作为阳性对照；带有HT标记为热失活后的样品；
MTC为端粒酶阴性对照(表明检测中是否存在欠佳的PCR条件、是否存在PCR污染和样品是否受到端粒酶阳性细胞的污染)；NTC为无模板对照(在无端粒酶活性的情况下形成的引物二聚体所产生的荧光信号)；

[0117] 由图15、16、17、18中β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老的结果可知：ICPA-1(PD29)和ICPA-2(PD13)永生化鸡前脂肪细胞均未被染成蓝色，说明所建立的永生化鸡前脂肪细胞没有衰老，而原代鸡前脂肪细胞(PD8)和感染pLXRN病毒空载体的鸡前脂肪细胞中有很大比例的细胞被染成蓝色，说明原代细胞和pLXRN对照细胞经过体外传代培养后均发生了衰老；

[0118] 由图19对永生化鸡前脂肪细胞ICPA-1进行体外诱导分化实验结果可知，加入终浓度为160mM油酸诱导培养基诱导2天，ICPA-1细胞形成了大量核周脂滴，说明所建立的永生化前脂肪细胞系保持了原代细胞的分化特性；

[0119] 由图20对永生化鸡前脂肪细胞ICPA-2进行体外诱导分化实验结果可知，加入终浓度为160mM油酸诱导培养基诱导2天，ICPA-2也能够形成核周脂滴；

[0120] 由图21永生化鸡前脂肪细胞ICPA-1油红氧染色结果可知：1经过油酸诱导的ICPA-1细胞与2未经过油酸诱导的ICPA-1细胞在油红氧染色后出现明显差异，说明永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1具有良好的分化能力；

[0121] 由图22永生化鸡前脂肪细胞ICPA-2油红氧染色结果可知：1经过油酸诱导的ICPA-2细胞与2未经过油酸诱导的ICPA-2细胞在油红氧染色后出现明显差异，说明永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-2具有良好的分化能力；

[0122] 由图23永生化鸡前脂肪细胞ICPA-1油红氧提取比色结果可知：对永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1的诱导组和未诱导组细胞进行油红氧提取比色，结果差异十分明显，同样说明ICPA-1具有良好的分化能力。

[0123] 具体实施方式二：本实施方式是对具体实施方式一所述的建立鸡永生化前脂肪细胞的方法步骤一中PCR扩增chTERT-T1片段做进一步的说明，步骤一中PCR扩增chTERT-T1片段的反应体系为50μL，由下列成分组成：

[0124]

[0125]

[0126] PCR扩增条件为：95℃变性5min，95℃变性60s，76.1℃退火25s，72℃延伸30s，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

[0127] 具体实施方式三：本实施方式是对具体实施方式一所述的建立鸡永生化前脂肪细胞的方法步骤一中PCR扩增chTERT-T2做进一步的说明，步骤一中PCR扩增chTERT-T2片段的反应体系为50μL，由下列成分组成：

[0128]

[0129] PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性45s，63.7℃退火25s，72℃延伸130s，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

[0130] 具体实施方式四：本实施方式是对具体实施方式一所述的建立鸡永生化前脂肪细胞的方法步骤一中PCR扩增chTERT-T3做进一步的说明，步骤一中PCR扩增chTERT-T3片段的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

[0131]

[0132]

[0133] PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，54.1℃退火25s，72℃延伸130s，共35个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。

[0134] 具体实施方式五：本实施方式是对具体实施方式一所述的建立鸡永生化前脂肪细胞的方法步骤一中PCR扩增chTERT-T1T2做进一步的说明，步骤一中利用重叠延伸PCR的方法将chTERT-T1与chTERT-T2的PCR扩增产物连接获得chTERT-T1T2，反应体系为50μL，由下列成分组成：

[0135]

[0136] PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性45s，63.0℃退火30s，72℃延伸150s，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

[0137] 具体实施方式六：本实施方式是对具体实施方式一所述的建立鸡永生化前脂肪细胞的方法步骤一与步骤二中目的基因与TA克隆载体pMD18-T进行连接做进一步的说明，步骤一与步骤二中目的基因与TA克隆载体pMD18-T进行连接的具体操作步骤参照TaKaRa公司的pMD18-T Vector试剂盒说明书。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。

[0138] 具体实施方式七：本实施方式是对具体实施方式一所述的建立鸡永生化前脂肪细胞的方法步骤一中pMD18TS-T1T2质粒和pMD18T-T3质粒分别进行SalI-NcoI双酶切做进一步的说明，步骤一中pMD18TS-T1T2质粒和pMD18T-T3质粒分别进行SalI-NcoI双酶切反应体系如下：

[0139]

[0140] 酶切反应条件：37℃水浴，反应1h。其他步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。

[0141] 具体实施方式八：本实施方式是对具体实施方式一所述的建立鸡永生化前脂肪细胞的方法步骤一中pMD18T-T3质粒、步骤三中pMD18T-chTERT质粒和步骤三中pLXRN病毒载体质粒分别进行SalI-XhoI双酶切做进一步的说明，步骤一中pMD18T-T3质粒、步骤三中pMD18T-chTERT质粒和步骤三中pLXRN病毒载体质粒分别进行SalI-XhoI双酶切反应体系如下：

[0142]

[0143] 酶切反应条件：37℃水浴，反应1h。其他步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。

[0144] 具体实施方式九：本实施方式是对具体实施方式一所述的建立鸡永生化前脂肪细胞的方法步骤二中PCR扩增chTR基因做进一步的说明，步骤二中PCR扩增chTR基因的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

[0145]

[0146] PCR扩增条件为：95℃变性5min，95℃变性60s，73.7℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。其它步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。

[0147] 具体实施方式十：本实施方式是对具体实施方式一所述的建立鸡永生化前脂肪细胞的方法步骤二中pMD18T-chTR质粒、步骤三中pMD18T-chTR质粒和步骤三中pLPCX病毒载体质粒分别进行Bgl II-Cla I双酶切做进一步的说明，步骤二中pMD18T-chTR质粒、步骤三中pMD18T-chTR质粒和步骤三中pLPCX病毒载体质粒分别进行BglII-Cla I双酶切反应体系如下：

[0148]

[0149] 酶切反应条件：37℃水浴，反应1h。其它步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。