微环基因载体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种微环基因载体，不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，所述微环基因载体包括：启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分以及用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子。通过将病毒基因组中的负责基因表达和病毒复制的成分，克隆到载体中，得到重组的嵌合的微环基因载体。只要把少量的微环基因载体送入感染了病毒的靶细胞内，微环基因载体便可生产具有治疗性的和感染性的重组病毒，重组病毒通过感染新的靶细胞，生产新的感染性的重组病毒，最终扩散到所有的靶细胞，相对于传统的基因载体，能够高效投递到靶细胞内，具有强大、持久的治疗效果。本发明还提供上述微环基因载体的制备方法和应用。

权利要求

1.一种微环基因载体，其特征在于，不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，所述微环基因载体包括：启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分以及用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子；所述微环基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达所述治疗性转基因产物至少两个星期；

所述病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分为乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分；

所述乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分包括：包装信号、第一增强子以及病毒复制调节区域；

所述包装信号、所述转基因或转基因表达盒子、所述第一增强子以及所述病毒复制调节区域依次连接，所述病毒复制调节区域和包装信号连接到一起，形成核心蛋白基因的启动子。

2.如权利要求1所述的微环基因载体，其特征在于，所述治疗性转基因产物为蛋白质或非编码RNA。

3.如权利要求2所述的微环基因载体，其特征在于，所述非编码RNA为小发夹RNA、微小RNA、反义RNA、诱饵RNA和核酶中的至少一种。

4.如权利要求1所述的微环基因载体，其特征在于，所述微环基因载体为双链DNA结构。

5.一种权利要求1～4中任一项所述的微环基因载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、提供具有重组酶ΦC31的细菌DNA附着点和重组酶ΦC31的噬菌体DNA附着点的标准质粒；

步骤二、将启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分、用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子三种DNA成分按照先后顺序依次插入到所述标准质粒的多克隆位点中，得到含有转基因或转基因表达盒子的载体；

步骤三、使用重组酶ΦC31处理所述含有转基因或转基因表达盒子的载体，重组得到所述微环基因载体；

所述病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分为乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分；所述乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分包括：包装信号、第一增强子以及病毒复制调节区域；所述包装信号、所述转基因或转基因表达盒子、所述第一增强子以及所述病毒复制调节区域依次连接，所述病毒复制调节区域和包装信号连接到一起，形成核心蛋白基因的启动子。

6.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～4中任一项所述的微环基因载体以及用于将所述微环基因载体送入靶细胞的工具。

说明书

微环基因载体及其制备方法和应用

【技术领域】

[0001] 本发明涉及基因治疗领域，尤其涉及一种微环基因载体及其制备方法和应用。【背景技术】

[0002] 基因治疗是治疗很多遗传性、获得性疾病最理想方法，目前已经有很多临床前实验成功的报道。然而，临床上成功的例子却鲜有报道。基因治疗的核心是将治疗载体送入靶细胞，但载体的构建和投送方面，还有若干技术问题有待解决。基因治疗载体可分为两类，即病毒载体和非病毒载体。病毒载体感染细胞的效率很高，但由于其免疫原性和插入性突变，容易引起严重的反应，包括致癌、致命，因而难以被临床接受；此外，制造成本高也是其应用的一大障碍。非病毒载体较安全、经济、转基因的大小无限制，相对于病毒载体具有一定的优势，但目前还缺乏送入体内细胞的有效手段。

[0003] 全球有超过全世界三亿五千万人，中国有超过一亿人，是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)携带者。HBV可诱发肝衰竭、肝硬化及肝癌，导致感染者过早死亡。现有的治疗药物，包括核苷酸类药物、干扰素等，疗效不能持久，需经常或每天给药，价格昂贵且副作用大，应用范围有很大限制。疫苗注射可有效预防乙肝病毒感染扩散产生新带毒者，但对己有带毒者无效。此外，疫苗注射覆盖不全，且有部份受注者不产生保护性免疫反应，故每年仍有大量新病例产生。市场需要一种高效、安全、价廉、方便的新治疗技术与产品。

[0004] 下面通过基因载体表达干扰RNA(interference RNA，RNAi)，治疗HBV感染的研究现状，来说明基因治疗的巨大潜力和现有问题。

[0005] RNAi是最近发现的、生物细胞内的一种保守的分子机制，可将含有特定结构的双链RNA(dsRNA)，包括小发夹RNA(small hairpin RNA，shRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)加工成20～30碱基的RNA，形成RNA诱导的静默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，通过与靶mRNA淬火链合(annealing)，将其裂解或抑制其翻译，达到阻止蛋白质合成的目的。这是生物调节细胞反应过程、抵抗入侵病毒的普遍机制。科学家们正在做出巨大的努力，试图把这个机制转变成治疗技术，治疗各种疾病。已有很多成功的临床前实验的报道，包括抗癌、抗病毒感染等。目前已经有采用RNAi的方式，在体内、体外抑制HBV病毒复制，并且具有较好的效果的报道(McCaffrey，2003)。但该技术还存在一些问题，因而难以应用于临床，主要包括：合成的siRNA在肝细胞内的存留时间短，需反复给药，成本高；用质粒表达RNAi，在体外短期效果很好，但体内投递，效率不高，仅能到达少部分肝细胞，而HBV可存在于几乎所有的肝细胞，因而疗效不彰；标准质粒(plasmid)的骨架DNA成份(DNA复制起源，包括抗菌素抵抗基因等)，可抑制转基因表达，使质粒很快失去表达功能；病毒载体如AAV，肝细胞感染率很高，对HBV的抑制很完全(Li，2009)，但AAV载体可被宿主体内抗体中和失效，或诱发可致命的宿主免疫反应，同时病毒基因组插入性突变，潜藏着致癌的危险。因此，发展安全、高效的载体技术，是实现用RNAi治疗HBV感染的关键。

[0006] 除了RNAi，反义RNA(antisense RNA)、诱饵RNA(decoy RNA)和核酶(ribozyme)也有强效的抗HBV复制的效果。但它们与RNAi一样面临着载体的构筑和有效投送到靶细胞等问题。

[0007] Chen等发明的微环DNA(MC)技术(Chen，Z.Y.，et al.，Minicircle DNA vectors devoid of bacteial DNA result in persistent and high level transgene expression in vivo.Mol.Ther.，2003.)，有助于解决上述问题。MC是一个环状表达盒子，不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA，可在体内长期表达高水平的转基因产物。在肝细胞内，HBV病毒基因组也能形成环状的DNA结构，称为共价键密闭环状DNA(cccDNA)。导致HBV感染治疗困难的关键，是cccDNA可在肝内存在多年，且对几乎所有药物不敏感。MC在结构、转基因表达的持久性、细胞内的稳定性上，与HBV cccDNA相同，使MC成为安全、高效的理想载体。

[0008] 然而，MC也存在着投递到体内靶细胞效率不高的问题。【发明内容】

[0009] 基于此，有必要提供一种能够高效投递到靶细胞内的微环基因载体。

[0010] 此外，还有必要提供一种上述微环基因载体的制备方法和应用。

[0011] 一种微环基因载体，不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，所述微环基因载体包括：启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分以及用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子；所述微环基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达所述治疗性转基因产物至少两个星期。

[0012] 优选的，所述病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分为乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分。

[0013] 优选的，所述乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分包括：5’包装信号、3’包装信号、第一增强子以及病毒复制调节区域；

[0014] 所述启动子、所述5’包装信号、所述转基因或转基因表达盒子、所述第一增强子、所述病毒复制调节区域以及所述3’包装信号依次连接。

[0015] 优选的，所述乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分包括：包装信号、第一增强子以及病毒复制调节区域；

[0016] 所述包装信号、所述转基因或转基因表达盒子、所述第一增强子以及所述病毒复制调节区域依次连接，所述病毒复制调节区域和包装信号连接到一起，形成核心蛋白基因的启动子。

[0017] 优选的，所述启动子为核心蛋白基因的启动子、第二型多聚酶基因启动子或第三型多聚酶基因启动子。

[0018] 优选的，所述治疗性转基因产物为蛋白质或非编码RNA。

[0019] 优选的，所述非编码RNA为小发夹RNA、微小RNA、反义RNA、诱饵RNA和核酶中的至少一种。

[0020] 优选的，所述微环基因载体为双链DNA结构。

[0021] 一种微环基因载体的制备方法，包括如下步骤：

[0022] 步骤一、提供具有重组酶ΦC31的细菌DNA附着点和重组酶ΦC31的噬菌体DNA附着点的标准质粒；

[0023] 步骤二、将启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分、用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子三种DNA成分按照先后顺序依次插入到所述标准质粒的多克隆位点中，得到含有转基因或转基因表达盒子的载体；

[0024] 步骤三、使用重组酶ΦC31处理所述含有转基因或转基因表达盒子的载体，重组得到所述微环基因载体。

[0025] 一种试剂盒，包括上述的微环基因载体以及用于将所述微环基因载体送入靶细胞的工具。

[0026] 通过将病毒基因组中的负责基因表达和病毒复制的成分，克隆到载体中，得到重组的嵌合的微环基因载体。只要把少量的微环基因载体送入感染了病毒的靶细胞内，微环基因载体便可生产具有治疗性的和感染性的重组病毒，重组病毒通过感染新的靶细胞，生产新的感染性的重组病毒，最终扩散到所有的靶细胞，相对于传统的基因载体，能够高效投递到靶细胞内，具有强大、持久的治疗效果。本发明还提供上述微环基因载体的制备方法和应用。【附图说明】

[0027] 图1为一实施方式的带有治疗性转基因或转基因表达盒子的微环基因载体MC.CMV.Ther.RC的结构示意图。

[0028] 图2为制备微环基因载体的标准质粒p2φC31的结构示意图。

[0029] 图3为不带有Ther.的空白载体pMC.CMV.GeneLess.RC的结构示意图。

[0030] 图4为MC1与肝细胞内cccDNA协同生产重组乙肝病毒rHBV示意图。

[0031] 图5为MC.Ther.RC的结构示意图。

[0032] 图6A为将转基因AntiHBV、转基因表达盒子UB.AntiHBV和转基因表达盒子H1.AntiHBV分别插入到空白载体pMC.CMV.GeneLess.RC的示意图。

[0033] 图6B为一实施方式的AntiHBV表达的抗乙肝病毒的miRNA的推测的细胞内结构。

[0034] 图6C为一实施方式的AntiHBV表达的抗乙肝病毒的shRNA的推测的细胞内结构。

[0035] 图7A为将AntiHBV插入到pMC.CMV.GeneLess.RC后得到的MC.CMV.AntiHBV.RC的结构示意图。

[0036] 图7B为RC.Cp.AntiHBV的结构示意图。

[0037] 图8A 为 将 UB.AntiHBV插 入 到 pMC.CMV.GeneLess.RC 后 得 到 的 MC.CMV.UB.AntiHBV.RC的结构示意图。

[0038] 图8B为RC.Cp.UB.AntiHBV的结构示意图。

[0039] 图9A 为 将 H1.AntiHBV插 入 到 pMC.CMV.GeneLess.RC 后 得 到 的 MC.CMV.H1.AntiHBV.RC的结构示意图。

[0040] 图9B为RC.Cp.H1.AntiHBV的结构示意图。

[0041] 图10A为MC.CMV.EGFP.RC的结构示意图。

[0042] 图10B为RC.Cp.EGFP的结构示意图。

[0043] 图11A为MC.CMV.UB.EGFP.RC的结构示意图。

[0044] 图11B为RC.Cp.UB.EGFP的结构示意图。

[0045] 图12A为MC.CMV.hAAT.RC的结构示意图。

[0046] 图12B为RC.Cp.hAAT的结构示意图。【具体实施方式】

[0047] 下面结合附图及实施例对微环基因载体及其制备方法和应用做进一步的解释说明。

[0048] 提供一种微环基因载体，当这种微环基因载体被送入到感染了病毒的靶细胞内后，可以生产病毒基因治疗载体。靶细胞包括哺乳动物体内的肝主质细胞(hepatocyte)，非肝主质细胞(nonparenchymal hepatocyte)如肝的内皮细胞、Kuffer细胞或其它器官的细胞。

[0049] 生产出来的病毒基因治疗载体可以像野生的病毒一样，感染新的靶细胞，生产新的感染性的重组病毒，并且本身可以表达治疗性转基因产物，从而长期、有效的发挥作用，成为一种安全、高效、方便、经济的基因治疗技术。

[0050] 这种微环基因载体不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，包括：启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分以及用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子。这种微环基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达治疗性转基因产物至少两个星期。

[0051] 治疗性转基因产物为蛋白质或非编码RNA(noncoding RNA)。

[0052] 可以选择仅为表达治疗性转基因产物基因的转基因，也可以选择包含表达治疗性转基因产物基因以及自身启动子的转基因表达盒子。

[0053] 非编码RNA可以为小发夹RNA(small hairpin RNA，shRNA)、微小RNA(micorRNA，miRNA)、反义RNA(antissense RNA)、诱饵RNA(decoy RNA)和核酶(ribozyme)中的至少一种。

[0054] 微环基因载体表达的蛋白质可以与病毒蛋白特异性结合，表达的非编码RNA可以与病毒的靶mRNA淬火链合(annealing)，将其裂解或抑制其翻译，达到阻止蛋白质的合成和病毒复制的目的。

[0055] 这种微环基因载体为双链的DNA，可以通过如下方法制备：

[0056] 步骤一、提供具有重组酶ΦC31的细菌DNA附着点(attB)和重组酶ΦC31的噬菌体DNA附着点(attP)的标准质粒。

[0057] 步骤二、将启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分、用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子三种DNA成分按照先后顺序依次插入到标准质粒的多克隆位点中，得到包含有转基因或转基因表达盒子的载体。

[0058] 步骤三、使用重组酶ΦC31处理所述含有转基因或转基因表达盒子的载体，重组得到所述微环基因载体。

[0059] 通过Chen等的微环DNA技术(Chen，Z.Y.，et al.，Minicircle DNA vectors devoid of bacteial DNA result in persistent and high level transgene expression in vivo.Mol.Ther.，2003.)，得到微环基因载体，该微环基因载体不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，包括：启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分以及用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子；并且可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达治疗性转基因产物至少两个星期。

[0060] 通过将病毒基因组中的负责基因表达和病毒复制的成分，克隆到基因载体中，得到重组的嵌合的微环基因载体。只要把少量的微环基因载体送入感染了病毒的靶细胞内，微环基因载体便可生产具有治疗性的和感染性的重组病毒，重组病毒通过感染新的靶细胞，生产新的感染性的重组病毒，最终扩散到所有的靶细胞，相对于传统的基因载体，能够高效投递到靶细胞内，具有强大、持久的治疗效果。

[0061] 针对乙肝病毒(HBV)，介绍一实施方式的利用HBV基因负责基因表达和病毒复制的成分的微环基因载体。

[0062] 本实施方式中所用的HBV的基因组为Galibert所报道的ayw菌株(Galibert，F.，et al.，Nucleotide sequence of the hepatitis B virus genome(suntype ayw)cloned in E.coli.Nature 1979.281：p.646-650；GenBank号V01640)作为模范序列，简称ayw.Galibert，来自含有1.2单位的HBV基因组的质粒pTHBV2(McCafrey，A.P.，et al.，Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference.Nature Biotechnology，2003.21(6))。根据Nassal(NASSAL，M.and A.RIEGER，A Bulged Region of the Hepatitis B Virus RNA Encapsidation Signal Contains the Replication Origin for Discontinuous First-Strand DNA Synthesis.JOURNAL OF VIROLOGY，1996.70(5)：p.2764-2773)的建议，DNA序列以核心蛋白基因启始密码ATG为5’端，前基因组RNA第一个碱基为第3100。

[0063] 如图1所示的微环基因载体，包括：巨细胞病毒早期启动子(cytomegalovirus immediate early promoter，CMV)、HBV基因组中负责基因表达和病毒复制的成分以及转基因或转基因表达盒子。

[0064] HBV基因组中负责基因表达和病毒复制的成分包括：5’包装信号(Encapsulation signal，Enc)、3’包装信号(3’Enc)、第一增强子(Enhancer 1，Enh1)以及病毒复制调节区域(Replication regulatory region，RCR)，上述基因主要负责HBV的包装、复制和表达。

[0065] 转基因或转基因表达盒子用于表达治疗型转基因产物，可以记为Ther.(Therapeutic transgene)。

[0066] 这种微环基因载体包含的各种成分为依次连接的CMV、5’Enc、Ther.、Enh1、RCR和3’Enc，连接CMV和Enc的序列中存在固有的重组产物attR。在其他的实施方式中，启动子可以选择启动子为核心蛋白基因的启动子(Cp)、第二型多聚酶基因启动子或第三型多聚酶基因启动子。第二型多聚酶基因启动子可以为CMV或UB(泛素基因的启动子)，第三型多聚酶基因启动子可以为H1。H1启动子可得自“pSilencer 3.1-H1neo”质粒(Applied Biosystem，Carlsbad，California，USA)。

[0067] 这种结构的微环基因载体可以记为MC.CMV.Ther.RC，简称MC1。

[0068] 结合图2和图3，以CMV启动子为例，对MC1的制备方法进行说明：

[0069] 参照Chen等的微环DNA技术，提供如图2所示的标准质粒p2φC31。标准质粒p2φC31具有：可诱导的重组酶ΦC31位点、可诱导的归巢内切酶(homing endonuclease)I-SceI位点、重组酶ΦC31的细菌DNA附着点(attB)、重组酶ΦC31的噬菌体DNA附着点(attP)以及多克隆位点。

[0070] 将CMV、HBV基因组中负责基因表达和病毒复制的成分共三个DNA片段用标准DNA克隆技术，依次插入到p2φC31的多克隆位点中，三个DNA片段为：(1)、CMV.Enc，CMV和5’Enc，相当于MC.2013的16～712共697bp(LiSB等，High expression of hepatitis B virus based vector with reporter gene in hepatitis B virus infection system.World J Gastroenterol 13(17)：2490，2007)；(2)、Enh 1，相当于ayw Galibert的2264～
2601共338bp；(3)、RCR.Enc，病毒复制调控区和3’Enc，相当于ayw Galibert的2913～
3182/1～20共290bp。RCR.Enc中包含第一、第二重复序列(DR1和DR2，图中未显示)，与DNA合成有关的序列Φ(图中未显示)，第二增强子(Enh 2，图中未显示)，核心蛋白基因增强子以及前基因组RNA的3’包装信号(3’Enc)。

[0071] 上述操作完成后，得到如图3所示的空白载体pMC.CMV.GeneLess.RC，接着将Ther.插入到5’Enh 1下游，最后利用Chen等的微环DNA技术，attB和attP序列重组形成attR，最终得到微环基因载体，该微环基因载体即为MC1。

[0072] 上述三个DNA片段均可从pTHBV2(McCafrey，A.P.，et al.，Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference.Nature Biotechnology，2003.21(6))中得到。

[0073] 得到MC1后，可以采用MC1转染细菌Top1，对MC1进行扩增。

[0074] 结合图4对MC1抑制在感染了HBV病毒的肝主质细胞中表达和复制的机理进行简单说明。MC1被送入到感染了HBV病毒的肝主质细胞后，启动子CMV驱动表达重组的HBV前基因组RNA，肝主质细胞内的HBV病毒表达病毒蛋白，并将重组的HBV前基因组RNA包装成治疗性的、感染性的重组HBV(rHBV)。rHBV的基因组是由两条螺旋的DNA链围成的环状结构，其中一条较长负链已经形成完整的开放式环状，另一条长度较短的正链，呈半环状。在感染肝细胞之后，这条半环状的DNA链要以负链为模板，在DNA聚合酶的作用下延长，最终形成完整的环状。这时的乙肝病毒基因组就形成了一个完全开放式的环状的双链DNA，经过DNA重组成为重组共价键密闭环状DNA(recombined covalent closed circular，rcccDNA)，具有野生乙肝病毒重组共价键密闭环状DNA(covalent closed circular，cccDNA)一样的表达和复制功能。rcccDNA没有CMV，可以记为MC.Ther.RC，简称MC2。MC2中RCR和新形成的的Enc相连形成核心蛋白基因的启动子(Cp)，加上上游Enh1，能够长期地、高水平地表达治疗性转基因产物。

[0075] HBV感染肝主质细胞内后会先重组形成共价键密闭环状(covalent closed circular，ccc)DNA，接着表达核心蛋白、多聚酶(polymerase，pol)、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白。重组的rHBV前基因组RNA的包装过程包括如下步骤：首先重组的rHBV前基因组RNA与pol一起，被核心蛋白包装成不成熟的病毒粒子(nucleocapsid)。接着，重组的rHBV前基因组RNA逆转录形成两条DNA双链，其中一条较长负链已经形成完整的开放式环状，另一条长度较短的正链，呈半环状。最后不成熟的病毒颗粒被内质网包裹，大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白被加入到病毒粒子中，形成治疗性的、感染性的rHBV。

[0076] MC2的结构如图5所示，包含的各种成分为依次连接的Enc、Ther.、Enh1和RCR，RCR和Enc连接到一起，形成核心蛋白基因的启动子Cp，加上促进子Enh1，从而能够长期表达高水平的、治疗性转基因产物。包装信号、第一增强子以及病毒复制调节区域为乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分。因此，MC2中包括启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分以及用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子，并且不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分。

[0077] MC2为另一实施方式的微环基因载体。

[0078] MC2可以通过将MC1送入感染了HBV的肝主质细胞中后提取得到，也可以采用基因重组的手段，将相关序列插入到p2φC31的多克隆位点中，最后采用制Chen等的微环DNA技术，大量制备含有attR的MC2。

[0079] 本实施方式中，Ther.为不带有自身启动子的转基因AntiHBV，用于抑制HBV的复制，从而治疗乙肝。根据Ther.是否带有自身启动子，以及启动子的种类，可以得到不同的具体的MC1和MC2。

[0080] AntiHBV表达非编码RNA，可以为shRNA、miRNA、antissense RNA、decoyRNA和ribozyme中的至少一种。

[0081] 本实施方式中，AntiHBV表达miRNA，具体的信息见图6B。

[0082] 如图6A所示，将转基因AntiHBV、转基因表达盒子UB.AntiHBV和转基因表达盒子H1.AntiHBV分别插入到空白载体pMC.CMV.GeneLess.RC的5’Enh 1下游，再通过微环DNA技术，得到不同的MC1。

[0083] 如图6B所示的本实施方式的AntiHBV表达的抗乙肝病毒的miRNA的推测的细胞内结构。这种结构为RNAi两种基本形式之一，加黑斜体部分为抗HBVsiRNA，引自Ely等(Ely，A.，T.Naidoo，and P.Arbuthnot，Efficient silencing of gene expression with modular trimeric Pol II expression cassettes comprising microRNA shuttles.Nucleic Acids Research，2009.37(13)：p.e91)。

[0084] 如图6C所示的另一实施方式的AntiHBV抗乙肝病毒的shRNA的推测的细胞内结构。这种结构为RNAi的另外一种基本形式。加黑斜体部分为抗HBVsiRNA，引自McCaffrey AP et al.(McCafrey，A.P.，et al.，Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference.Nature Biotechnology，2003.21(6))。

[0085] 如图7A所示的MC.CMV.AntiHBV.RC，表达后得到的MC2如图7B所示，RCR和Enc连接到一起，形成启动子Cp，记为RC.Cp.AntiHBV。

[0086] 如图8A所示的MC.CMV.UB.AntiHBV.RC，表达后得到的MC2如图8B所示，记为RC.UB.AntiHBV。

[0087] 如图9A所示的MC.CMV.H1.AntiHBV.RC，表达后得到的MC2如图9B所示，记为RC.H1.AntiHBV。

[0088] 在其他的实施方式中，根据Ther.的不同，可以获得针对不同病毒或具有不同功能的微环基因载体。

[0089] 一实施方式的用于表达报告基因的微环基因载体，本实施方式中，报告基因为增强型鱼绿色荧光蛋白(EGFP)基因。根据EGFP基因自身是否带有启动子，可以得到两种类型的微环基因载体。如图10A所示的微环基因载体，EGFP基因自身不带启动子，微环基因载体记为MC.CMV.EGFP.RC，表达后得到的MC2如图10B所示，RCR和Enc连接到一起，形成启动子Cp，记为RC.Cp.EGFP。如图11A所示的微环基因载体，EGFP基因自身带有启动子UB，微环基因载体记为MC.CMV.UB.EGFP.RC，表达后得到的MC2如图11B所示，记为RC.Cp.UB.EGFP。

[0090] 如 图12A 所 示 的 一 实 施 方 式 的 用 于 表 达 抗 胰 蛋 白 酶 (human alpha-1antitrypsin，hAAT)的微环基因载体，记为MC.CMV.hAAT.RC。表达后得到的MC2如图12B所示，RCR和Enc连接到一起，形成启动子Cp，记为RC.Cp.hAAT。

[0091] 本发明还提供一种试剂盒，包括如上所述的微环基因载体以及用于将该微环基因载体送入靶细胞的工具。

[0092] 在一般的实施例中，可以选择用脂质体(Lipofectamine)与微环基因载体混合，将微环基因载体送入靶细胞。

[0093] 下面通过具体的试验，来验证上述制备的微环基因载体的表达功能。

[0094] 1、测定MC1表达EGFP的功能。

[0095] 试验分成四组：

[0096] (1)、MC.CMV.EGFP.RC(图10A)；

[0097] (2)、MC.CMV.UB.EGFP.RC(图11A)；

[0098] (3)、MC.CMV.UB.antiHBV.RC(图8A)；

[0099] (4)、Lipofactamin 2000对照组。

[0100] 各种DNA载体，每种4μg，按供应商提供的程式加上Lipofactamin 2000后，转染6-井培养孟huh7细胞；Lipofactamin对照组仅用Lipofectamin处理。48小时后，用荧光显微镜检测发现：第1、2组，鱼绿色荧光蛋白阳性效率分别为8.5％和13.4％，而第3、4组阴性。实验结果表明，MC1能按照设计，表达EGFP基因。

[0101] Lipofectamine 2000是美国Invitrogen的产品(Carlsbad，California，USA)。

[0102] 2、测定MC1表达抗乙肝非编码RNA抑制HBV表达和复制功能。

[0103] (1)、MC2009+MC.CMV.AntiHBV.RC(图7A)；

[0104] (2)、MC2009+MC.CMV.UB.AntiHBV.RC(图8A)；

[0105] (3、MC2009+MC.CMV.H1.AntiHBV.RC(图9A)；

[0106] (4)、MC2009+pBS.KSII。

[0107] MC2009是一个带有两个相连拷贝的ayw.Galibert乙肝病毒基因组，可以生产完整的乙肝病毒颗粒(Li SB等，High expression of hepatitis B virus based vector with reporter gene in hepatitis B virus infection system.World J Gastroenterol13(17)：2490，2007)。2μg的MC2009，加上6μg的MC.CMV.AntiHBV.RC、MC.CMV.UB.AntiHBV.RC、MC.CMV.H1.AntiHBV.RC或pBS.KSII，溶解到2ml的生理盐水中，用标准的尾静脉高压注射法，注入小鼠肝脏。四天后，抽血用ELISA方法检测HBsAg，用qPCR方法检测乙肝病毒DNA。结果发现，血清中的HBsAg，水平分别为1624±582、922±352、1257±395和4865±1580ng/ml。与对照第四组相比，对HBsAg的抑制率分别为66.6-、
81.1-和74.2％，血清中HBV DNA的水平分别减少51.1-、70.7-和56.5％。这些结果，表明表达抗乙肝非编码RNA，对乙肝病毒的表达和复制有抑制作用。结果表明，三种抗乙肝MC1都有抑制乙肝病毒表达和辅助的作用。

[0108] 本实验中所用小鼠为10周大，雌性，NOD/SCID种。

[0109] 以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。