牛大力种苗组织培养快速繁殖及育苗的方法

摘要

本发明公开了一种牛大力种苗组织培养快速繁殖及育苗的方法，其特征是通过采外殖体、无菌分化、快速增殖、壮苗培养，再装袋育壮苗，采用牛大力茎段、芽苞和叶片作为外植体，消毒，配制分化培养基，壮苗培养基，用定向聚丙烯薄膜袋作为培养皿器，接种，培养。当小苗形成的植株长至3～8厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，经2～5个月生长得到中苗，成为生产栽培的种苗。中苗最好为苗高15cm以上，每株苗有分叉2～8条，有3～10条根以上，须根多，叶片厚浓绿，无病虫，无变异苗白化苗。

权利要求

1.一种牛大力种苗组织培养快速繁殖的方法，其特征在于通过采外殖体、无菌分化、快速增殖、壮苗培养，再装袋育壮苗，采用牛大力芽苞为外植体，消毒，配制分化培养基，壮苗培养基，用定向聚丙烯薄膜袋作为培养器皿，接种，培养，其技术工艺步骤如下，(1)采外植体，选定牛大力的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜采集，选取芽苞和嫩叶放清水冲洗，然后用饱和洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗5～10分钟，(2)无菌分化，把漂洗干净的牛大力芽苞作为外植体，在无菌接种室工作台上用

72％～75％的酒精消毒10～15秒后，用无菌水冲洗3～8次后置于0.1％～0.2％的升汞中消毒10～30分钟，再用无菌水漂洗6～10次，后置于10～15％的过氧化氢中消毒

10～15分钟，再用无菌水漂洗4～8次去掉外表杂物，把所消毒的芽苞放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后取下顶尖的芽尖0.2～0.25mm组织，用接种针接种到分化培养基上培养5～20天得到小植株，所述的分化培养基每升含椰子汁50～150ml，蔗糖15～45g，卡拉胶6～10g，肌醇50～150mg，甘氨酸1～3mg，烟酸1～3mg，D-泛酸钙0.1～0.5mg，吡哆辛盐酸0.2～3.5mg，生长素0.09～0.25mg，分裂素6-BA0.1～0.3mg，烯腺嘌呤0.01～0.03mg，其余为MS培养基中的1/2大量元素和微量元素成分，(3)快速增殖，培养5～20天后，将诱导出的小植株切割成0.3～0.5mm后接入新的分化培养基中，多次继代采用分化培养基，在每次转袋过程中，不断淘汰白化苗和污染袋苗，剪除枯黄叶片，经5～10次转袋培养后，得到的小植株再进行壮苗培养，(4)壮苗培养，将无菌分化增殖获得的小植株接种到壮苗培养基上培养45～60天得到小苗，所述的壮苗培养基每升含水解酪蛋白1～5g，蔗糖10～35g，卡拉胶6～10g，a-萘乙酸0.2～5.0mg，肌醇20～120mg，盐酸硫胺5～15mg，甘氨酸1.5～6.0mg，烟酸0.5～

5mg，吲哚丁酸0.1～3mg，D-泛酸钙1～6mg，吡哆辛盐酸0.4～1.5mg，生长素0.09～

0.25mg，苹果汁10～30g，其余为MS培养基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分，步骤(2)～(4)中所用的培养基pH为4.5～6.5，培养温度18～32℃，每天光照6～

16小时，光照度800～2500Lx，芽尖为芽苞生长点0.2～0.25mm组织，小植株的高度为1～

3cm，小苗为苗高3～8cm，每株苗有2～8条根，无变异白化苗。

2.如权利要求1所述的牛大力种苗组织培养快速繁殖的方法，其特征在于步骤(2)～(4)中所用的培养基均分装入薄膜袋中，每袋20ml，分装好后密封、高温消毒10～20分钟，取出放在无菌室降温贮存，在无菌室的超净工作台上接上对应的外植体或小植株后，用封口机把接好种的培养基袋封口，再放到培养室培养，培养基分装的薄膜袋，均为定向聚丙烯薄膜袋。

说明书

牛大力种苗组织培养快速繁殖及育苗的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种珍稀食用植物油种苗繁育方法，具体地说，涉及一种牛大力种苗快速繁殖及育苗的方法。

背景技术

[0002] 牛大力属豆科豆藤属，直立或披散亚灌木，高1～2米。根系向下直伸，长1米许。幼枝有棱角，披白柔毛。叶互生；3出复叶；托叶2片，三角状，长约1厘米，具疏茸毛；叶柄长
2～3厘米，被长茸毛；小叶矩圆形至卵状披针形，长4～9厘米，宽2～4厘米，先端略钝，有时具小锐尖，全缘，基部在叶背边缘密被茸毛，上面被稀疏的短茸毛，下面密生长茸毛；小托叶2片，线形。花两性，腋生，短总状花序稠密；花梗长1～1.5厘米；花苞2裂；萼5裂，披针形，在最下面的1片最长；花冠略长于萼，粉红色，旗瓣秃净，圆形，基部白色，外有纵紫纹；翼瓣基部白色，有柄，前端紫色；龙骨瓣2片，基部浅白色，前部互相包着雌雄蕊；雄蕊
10，两体，花药黄色，圆形；雌蕊1，子房上位。荚果长8～10毫米，径约5毫米。种子2枚，圆形。花期8～9月。果期10月。生长于深山幽谷之中，气味甘香，性温和，具有壮阳，养肾补虚，强筋活络，平肝、润肺之功效，主治肾虚，气虚，腰酸腿痛、风湿病、慢性肝炎、支气管炎，咳嗽，肺结核等有很好的疗效。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种通过组织培养技术可以脱除多种植物病毒，避免病毒引起的品种退化和减产造成的损失，使原来的优良种性得到保持；繁殖快且量大、成苗快、种苗品质好、移栽成活率高，品种遗传物质变异小，高产的牛大力的种苗繁殖方法。

[0004] 本发明人通过选定的牛大力芽苞和叶片作为外植体，经消毒去掉杂质，将芽尖组织和叶片放在分化培养基上进行无菌培育成小植株，将诱导出的小植株切割后接入新的分化培养基中，多次继代采用分化培养，结果丛生芽数量多，生长快。再转移到壮苗培养基上培养，形成袋装苗，经过自然光照下炼苗后出袋栽培，移栽到营养杯中育中苗，成活率达到98％以上。经三年摸索筛选，由于靠本发明人利用了培养基上培养出壮苗，终于找到适合细胞分化，壮苗的培养基作为发明点，从而实现了本发明。

[0005] 本发明的牛大力繁殖及育苗方法，包括以下技术工艺步骤：一种牛大力种苗组织培养快速繁殖的方法，其特征在于通过采外殖体、无菌分化、快速增殖、壮苗培养，再装袋育壮苗，采用牛大力茎段、芽苞和叶片作为外植体，消毒，配制分化培养基，壮苗培养基，用定向聚丙烯薄膜袋作为培养皿器，接种，培养，其技术工艺步骤如下：

[0006] (1)采外植体，选定牛大力的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜采集，选取芽苞和嫩叶放清水冲洗，然后用饱和洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗5～10分钟。

[0007] (2)无菌分化，把漂洗干净的牛大力芽苞或嫩叶片作为外植体，在无菌接种室工作台上用72％～75％的酒精消毒10～15秒后，用无菌水冲洗3～8次后置于0.1％～0.2％的升汞中消毒10～30分钟，再用无菌水漂洗6～10次，后置于10～15％的过氧化氢中消毒10～15分钟，再用无菌水漂洗4～8次去掉外表杂物。把所消毒的芽苞、叶片放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后取下顶尖的芽尖
0.2～0.25mm组织，用接种针接种到分化培养基上培养5～20天得到小植株，所述的分化培养基每升含椰子汁50～150ml，蔗糖15～45g，卡拉胶6～10g，肌醇50～150mg，甘氨酸
1～3mg，烟酸1～3mg，D-泛酸钙0.1～0.5mg，吡哆辛盐酸0.2～3.5mg，生长素0.09～
0.25mg，分裂素6BA0.1～0.3mg，烯腺嘌呤0.01～0.03mg，其余为MS培养基中的1/2大量元素和微量元素成分。

[0008] (3)快速增殖，培养5～20天后，将诱导出的小植株切割成0.3～0.5mm后接入新的分化培养基中，多次继代采用分化培养基，在每次转袋过程中，不断淘汰白化苗和污染袋苗，剪除枯黄叶片，经5～10次转袋培养后，得到的小植株再进行壮苗培养，[0009] (4)壮苗培养，将无菌分化增殖获得的小植株接种到壮苗培养基上培养45～60天得到小苗，所述的壮苗培养基每升含水解酪蛋白1～5g，蔗糖10～35g，卡拉胶6～10g，a-萘乙酸0.2～5.0mg，肌醇20～120mg，盐酸硫胺5～15mg，甘氨酸1.5～6.0mg，烟酸0.5～5mg，吲哚丁酸0.1～3mg，D-泛酸钙1～6mg，吡哆辛盐酸0.4～1.5mg，生长素0.09～0.25mg，苹果汁10～30g，其余为MS培养基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。

[0010] 步骤(2)分化培养基每升含椰子汁50～100ml，蔗糖15～45g，卡拉胶8g，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.25mg，D-泛酸钙0.44mg，吡哆辛盐酸0.4～1.5mg，生长素0.09～
0.25mg，分裂素6BA0.1mg，烯腺嘌呤0.02mg，其余为MS培养基中的1/2大量元素和微量元素成分。

[0011] 步骤(4)壮苗培养基每升含水解酪蛋白0.12g，蔗糖22g，卡拉胶8g，a-萘乙酸0.8mg，肌醇60mg，盐酸硫胺6mg，甘氨酸3.0mg，烟酸1.5mg，吲哚丁酸0.3mg，D-泛酸钙
1.5mg，吡哆辛盐酸0.8mg，生长素0.12mg，苹果汁12g，其余为MS培养基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。

[0012] 步骤(2)～(4)中所用的培养基PH为4.5～6.5，培养温度18～32℃，每天光照6～16小时，光照度800～2500Lx，芽尖为芽苞生长点0.1～0.5mm组织，叶片为顶尖叶片
1/2处0.1～0.8mm组织，小植株的高度为1～3cm，小苗为苗高3～8cm，每株苗有2～8条根，无变异白化苗。

[0013] 步骤(2)～(4)中所用的培养基均分装入薄膜袋中，每袋20ml，分装好后密封、高温消毒10～20分钟，取出放在无菌室降温贮存，在无菌室的超净工作台上接上对应的外植体或小植株后，用封口机把接好种的培养基袋封口，再放到培养室培养，培养基分装的薄膜袋，均为定向聚丙烯薄膜袋。

[0014] 当小苗形成的植株长至3～8厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，经2～5个月生长得到中苗，成为生产栽培的种苗。

[0015] 中苗最好为苗高15cm以上，每株苗有分叉2～8条，有3～10条根以上，须根多，叶片厚浓绿，无病虫，无变异苗白化苗。

[0016] 本发明与现有技术相比具有的优点是：国内外没有关于利用组培技术生产牛大力种苗的专利和相关报道，只有实生苗繁殖的应用。本发明采用独创的培养基，使用定向聚丙烯薄膜袋作培养器皿，降低成本，可以脱除多种植物病毒，避免病毒引起的品种退化和减产造成的损失，使原来的优良种性得到保持；繁殖快且量大、成苗快、种苗品质好、移栽成活率高，品种遗传物质变异小，高产。本发明具有操作性强，应用价值高，环保，对环境无任何不良影响，具有独创性。牛大力经济价值高，全身是宝。鲜品可煲汤，藤与根可烘干入药，单株产量在2～5公斤。本方法具有繁殖快；移栽成活率高；基因不变异，能保持原来品种的优良性状；高产等特点。

具体实施方式

[0017] 本发明的最佳实施例是这样的，以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制：

[0018] 实施例1

[0019] (1)采外植体：选用当年成薯野生牛大力的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜采回，选取芽苞放清水冲洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗1～60分钟。

[0020] (2)无菌分化：把漂洗干净的牛大力芽苞作为外植体，在无菌接种室工作台上用72％～75％的酒精消毒10～15秒后，用无菌水冲洗3～8次后置于0.1％～0.2％的升汞中消毒10～20分钟，再用无菌水漂洗5～10次，后置于5～20％的次氯酸钠中消毒5～
20分钟，再用无菌水漂洗4～8次，去掉外表杂物。把所消毒的芽苞放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后用接种针将芽尖0.2～0.25mm组织接种到分化培养基上培养得到小植株。所述的分化培养基每升含椰子汁100ml、蔗糖25～
30g、卡拉胶8g、肌醇100mg、甘氨酸2mg、烟酸0.25mg、D-泛酸钙0.4mg、吡哆辛盐酸0.4～
1.5mg、生长素0.09～0.25mg、分裂素6BA0.1mg、烯腺嘌呤0.02mg，其余为MS培养基中的
1/2大量元素和微量元素成分。MS培养基中的1/2大量元素和微量元素出自中国农业出版社，新华书店发行：2004年10月第一版，书号：073841号的《兰花组织培养与快速繁殖技术》，大量元素为：硝酸铵1900mg、硝酸钾1650mg、硫酸镁370mg、氯化钙400mg、磷酚二氢钾
170mg；微量元素为：钼酸钠0.25mg、硫酸铜0.025mg、氯化钴0.025mg、碘化钾0.83mg、硼酸
6.2mg、硫酸锰22.mg、硫酸锌8.6mg。

[0021] (3)壮苗培养：将无菌分化获得的小植株接种到壮苗培养基上培养得到小苗。所述的壮苗培养基每升含水解酪蛋白0.1～0.5g，蔗糖20～25g，卡拉胶8g，a-萘乙酸0.5～3.0mg，肌醇40～100mg，盐酸硫胺4.5～12mg，甘氨酸1.5～4.0mg，烟酸1.0～2.5mg，吲哚丁酸0.3mg，D-泛酸钙1.5mg，吡哆辛盐酸0.4～1.5mg，生长素0.09～0.25mg，苹果汁
10～30g，其余为MS培养基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。

[0022] (4)袋装苗移栽：当小苗形成的植株长至4～6厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，得到中苗，成为生产栽培的种苗。

[0023] 在上述(2)～(3)各步骤中所用的培养基均为PH5.4～5.8，培养温度24～28℃，每天光照10～12小时，光照度1500～2000Lx。

[0024] 步骤(1)所述的采外植体为当年成薯野生牛大力嫩枝条的芽苞。

[0025] 步骤(2)所述的芽尖为芽苞生长点。

[0026] 步骤(2)所述的小植株的高度最好为1～2cm。

[0027] 步骤(3)所述的小苗最好为苗高4～6cm，每株苗有3～5条根。

[0028] 实施例2

[0029] (1)采外植体：选用野生牛大力的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜采回，选取嫩叶放清水冲洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗5～10分钟。

[0030] (2)无菌分化：把漂洗干净的牛大力茎段、嫩叶片作为外植体，在无菌接种室工作台上用72％～75％的酒精消毒10秒，用无菌水冲洗3～8次后，置于0.1～0.2％的升汞中消毒10～30分钟，再用无菌水漂洗5～10次，后置于5～15％的过氧化氢中消毒10～15分钟，再用无菌水漂洗4～8次。把所消毒的叶片放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割嫩叶叶尖下1/2处0.3～0.5mm组织，接种到分化培养基上培养得到小植株。所述的分化培养基每升含椰子汁120ml、蔗糖22～30g、卡拉胶7～8g、肌醇100mg、甘氨酸
2mg、烟酸0.25mg、D-泛酸钙0.4mg、吡哆辛盐酸0.4～1.5mg、生长素0.09～0.25mg、分裂素6BA0.2mg、烯腺嘌呤0.03mg，其余为MS培养基中的1/2大量元素和微量元素成分。

[0031] (3)壮苗培养：将无菌分化获得的小植株接种到壮苗培养基上培养得到小苗。所述的壮苗培养基每升含水解酪蛋白0.1～0.5g，蔗糖20～25g，卡拉胶8g，a-萘乙酸0.5～3.0mg，肌醇40～100mg，盐酸硫胺4.5～12mg，甘氨酸1.5～4.0mg，烟酸1.0～2.5mg，吲哚丁酸0.2mg，D-泛酸钙1.5mg，吡哆辛盐酸0.4～1.5mg，生长素0.09～0.25mg，苹果汁
25g，其余为MS培养基中的大量元素和1/2微量元素成分。

[0032] (4)袋装苗移栽：当小苗形成的植株长至4～6厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，得到中苗，成为生产栽培的种苗。

[0033] 在上述(2)～(3)各步骤中所用的培养基均为PH5.4～6.1，培养温度24～30℃，每天光照10小时，光照度1500～2000Lx。

[0034] 步骤(1)所述的采外植体为野生成薯牛大力嫩枝条的叶片。

[0035] 步骤(2)所述的叶片为顶尖叶片1/2处0.3～0.5mm组织。

[0036] 步骤(2)所述的小植株的高度最好为1～2cm。

[0037] 步骤(3)所述的小苗最好为苗高4～6cm，每株苗有3～5条根。

[0038] 实施例3

[0039] (1)采外植体：选用人工种植牛大力的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜采回，选取芽苞放清水冲洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗1～60分钟。

[0040] (2)无菌分化：把漂洗干净的牛大力茎段、芽苞作为外植体，在无菌接种室工作台上用71％～76％的酒精消毒15秒后，用无菌水冲洗3～8次后置于0.2％的升汞中消毒15～30分钟，再用无菌水漂洗5～10次，后置于10～20％的次氯酸钠中消毒10～20分钟，再用无菌水漂洗4～8次，去掉外表杂物。把所消毒的芽苞放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后用接种针将芽尖0.3mm组织接种到分化培养基上培养得到小植株。所述的分化培养基每升含椰子汁100ml、蔗糖25～30g、卡拉胶
8g、肌醇100mg、甘氨酸2mg、烟酸0.25mg、D-泛酸钙0.4mg、吡哆辛盐酸0.4～1.5mg、生长素0.09～0.25mg、分裂素6BA0.1mg、烯腺嘌呤0.03mg，其余为MS培养基中的大量元素和微量元素成分。

[0041] (3)壮苗培养：将无菌分化获得的小植株接种到壮苗培养基上培养得到小苗。所述的壮苗培养基每升含水解酪蛋白1～5g，蔗糖20～25g，卡拉胶8g，a-萘乙酸0.5～3.0mg，肌醇40～120mg，盐酸硫胺4.5～12mg，甘氨酸1.5～5.0mg，烟酸1.0～2.5mg，吲哚丁酸0.6mg，D-泛酸钙1.5mg，吡哆辛盐酸0.4～1.5mg，生长素0.09～0.25mg，苹果汁
10～35g，其余为MS培养基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。

[0042] (4)袋装苗移栽：当小苗形成的植株长至4～6厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，得到中苗，成为生产栽培的种苗。

[0043] 在上述(2)～(3)各步骤中所用的培养基均为PH5.4～6.0，培养温度23～29℃，每天光照12小时，光照度1500～2000Lx。

[0044] 步骤(1)所述的采外植体为成薯牛大力嫩枝条的芽苞。

[0045] 步骤(2)所述的芽尖为芽苞生长点。

[0046] 步骤(2)所述的小植株的高度最好为1～3cm。

[0047] 步骤(3)所述的小苗最好为苗高4～8cm，每株苗有3～8条根。

[0048] 实施例4

[0049] (1)采外植体：选用种子种植的牛大力的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜采回，选取芽苞放清水冲洗，然后用洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗1～60分钟。

[0050] (2)无菌分化：把漂洗干净的牛大力茎段、芽苞作为外植体，在无菌接种室工作台上用72％～75％的酒精消毒10～15秒后，用无菌水冲洗2～5次后置于0.1％～0.2％的升汞中消毒8～20分钟，再用无菌水漂洗4～6次，后置于10～15％化钠中消毒10～20分钟，再用无菌水漂洗4～8次。去掉外表杂物。把所用消毒的芽苞、叶片放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后用接种针将芽尖0.2～0.25mm组织接种到分化培养基上培养得到小植株。所述的分化培养基每升含椰子汁100ml、蔗糖25～30g、卡拉胶8g、肌醇100mg、甘氨酸2mg、烟酸0.25mg、D-泛酸钙0.4mg、吡哆辛盐酸
0.4～1.5mg、生长素0.09～0.25mg、分裂素6BA0.1mg、烯腺嘌呤0.02mg，其余为MS培养基中的1/2大量元素和微量元素成分。

[0051] (3)壮苗培养：将无菌分化获得的小植株接种到壮苗培养基上培养得到小苗。所述的壮苗培养基每升含水解酪蛋白0.5～2.5g，蔗糖20～25g，卡拉胶8g，a-萘乙酸0.5～3.0mg，肌醇50～120mg，盐酸硫胺4.5～12mg，甘氨酸2.5～5.5mg，烟酸2.0～3.5mg，吲哚丁酸0.55mg，D-泛酸钙1.5mg，吡哆辛盐酸0.4～1.5mg，生长素0.1～0.35mg，苹果汁
35g，其余为MS培养基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。

[0052] (4)袋装苗移栽：当小苗形成的植株长至4～6厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，得到中苗，成为生产栽培的种苗。

[0053] 在上述(2)～(3)各步骤中所用的培养基均为PH5.5～6.0，培养温度24～30℃，每天光照12小时，光照度1500～2200Lx。

[0054] 步骤(1)所述的采外植体为种子种植嫩枝条的芽苞。

[0055] 步骤(2)所述的芽尖为芽苞生长点。

[0056] 步骤(2)所述的小植株的高度最好为1～2cm。

[0057] 步骤(3)所述的小苗最好为苗高4～6cm，每株苗有5条根。