一种抑菌剂

摘要

本发明公开了一种抑菌剂，属于中药领域。抑菌剂中金银花提取液与水溶性纳米银以75:1～100:1的比例混合，两种药物的合用对抑制大肠杆菌O157:H7、藤黄微球菌起到协同的作用。本发明的一种金银花提取物与纳米银抑菌剂与现有的技术相比，解决了常规抑菌方法中金银花抑菌剂用量较大的问题，同时采用两种低剂量的抑菌物质减少了微生物耐药的发生机率、降低了其对人体的毒性，更加的安全。

权利要求

1.一种抑菌剂，其特征在于由金银花提取液、水溶性纳米银组成；所述金银花提取液制备包括如下步骤：加水量为金银花重量的9倍，经95 ℃水浴提取4 h，再经过真空旋转浓缩仪得到提取液； 所述水溶性纳米银依照下列方法制备：取22.8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氢氧化钠析出沉淀，过滤，将沉淀加入到100 mL浓度为10 mol/L水溶性的硝酸银溶液中得到十四烷酸银；称取6.7 g 浓度为20 mmol/L 十四烷酸银于100 mL烧杯中，向烧杯中加入58 mL浓度为40 mmol/L的三乙胺，

80℃下电磁搅拌2 h，白色的十四烷酸银粉末逐渐变成棕色，不溶的前体消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽滤，用丙酮洗涤沉淀数次后，真空干燥，即得到纳米银粒子粉末；所述菌为大肠杆菌O157:H7；抑制大肠杆菌O157:H7时金银花提取液、水溶性纳米银的体积比为75～

100:1，金银花提取液中绿原酸含量为23.62mg/g，水溶性纳米银浓度为10mg/mL。

2.如权利要求1所述的抑菌剂，其特征在于所得提取液经0.22μm滤膜过滤。

3.如权利要求1~2任一所述抑菌剂在制备抑制大肠杆菌O157:H7药物中的应用。

说明书

一种抑菌剂

技术领域

[0001] 本发明属于中药领域，尤其涉及一种中药抑菌组合。

背景技术

[0002] 金银花（Lonicera japonica Thumb），又名双花、银花、忍冬花，为忍冬科多年生缠绕性木质藤本植物忍冬的花蕾，是我国中草药资源最重要的成员之一，在我国南北各地均有分布。其对于人体的生理功能主要为清热解毒、疏散风热、凉血止痢。现代医学研究表明金银花富含绿原酸、异绿原酸、黄酮类物质、忍冬甙、肌醇及微量挥发油等，因而其对人体有积极作用。金银花可以抗病原微生物，实验证明金银花对各种致病菌、病毒，如金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌、百日咳杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、脑膜炎双球菌、皮肤真菌、流感病毒、钩端螺旋体等均有不同程度的抑制作用。另外金银花还可以增强免疫功能，促进淋巴细胞转化，增强白细胞的吞噬功能。金银花因其较高的医药价值和其抗菌性、抗炎性、抗老化、防癌症等许多医药应用而获得了人们的关注。

[0003] 中药制剂浓缩液制成口服液或抑菌剂、涂覆剂等一次用剂量大，影响效果。

发明内容

[0004] 针对金银花抑菌剂一次用量大的问题，本发明人经过大量实验，发现纳米银能有效增强金银花提取液抑菌性能，减少金银花抑菌剂的用量，且采用两种低剂量的抑菌组合物，更加的安全本。本发明的目的在于提供一种金银花纳米银抑菌剂，减少金银花抑菌剂一次的用剂量和降低药品对人体的毒性

[0005] 本发明提供如下技术方案：

[0006] 一种抑菌剂，包含金银花提取液、水溶性纳米银；

[0007] 金银花提取液制备包括如下步骤：取干药材金银花，加水量为金银花重量的9倍，经95 ℃水浴提取4 h，再经过减压浓缩得到提取液；所得提取液经0.22μm滤膜过滤。最后提取液经高压液相色谱法对提取液中绿原酸含量进行标准定量。

[0008] 抑制大肠杆菌O157:H7时金银花提取液、水溶性纳米银的体积比为75～100:1。抑制藤黄微球菌时金银花提取液、水溶性纳米银的体积比为6.73～12.5:1。算体积比时金银花提取液中绿原酸含量为 23.62 mg/g，水溶性纳米银浓度为10 mg/mL。

[0009] 水溶性纳米银颗粒粒径为3～10 nm，纳米银外表包覆两性聚合物。

[0010] 水溶性纳米银粒径为3～10 nm，外表为羧基，依照下列方法制备：加水量为金银花重量的9倍，经95 ℃水浴提取4 h，再经过真空旋转浓缩仪得到提取液。所述水溶性纳米银依照下列方法制备：取22.8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氢氧化钠析出沉淀，过滤，将沉淀加入到100 mL浓度为10 mol/L水溶性的硝酸银溶液中得到十四烷酸银；称取6.7 g 20 mmoL/L 十四烷酸银于100 mL烧杯中，向烧杯中加入58 mL40 mmoL/L的三乙胺，80℃下电磁搅拌2 h，白色的十四烷酸银粉末逐渐变成棕色，不溶的前体消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽滤，用丙酮洗涤沉淀数次后，真空干燥，即得到纳米银粒子粉末。依照本方法制备的水溶性纳米银颗粒与金银花提取液具有良好的协同抗菌作用。

[0011] 本发明还涉及上所述抑菌剂在抑制大肠杆菌O157:H7中的应用。

[0012] 本发明还涉及上述抑菌剂在抑制藤黄微球菌中的应用。

[0013] 本发明的有益效果是：本发明水溶性纳米银能有效增强金银花抑菌性能，降低金银花抑菌剂的用量，两种药物的合用对抑制大肠杆菌O157:H7和藤黄微球菌起到协同作用，同时本抑菌剂采用两种低剂量的抑菌物质，相对于使用高剂量的金银花或者水溶性纳米银，更加的安全，可以作为安全可靠地外用涂覆剂等。

附图说明

[0014] 图1 金银花提取液与纳米银之比为100:1对大肠杆菌O157:H7协同抑菌作用[0015] （图1a 200 μL金银花提取液对大肠杆菌O157:H7的抑制作用，图1b 2 μL的纳米银对大肠杆菌O157:H7的抑制作用，图1c 100 μL金银花提取液与1 μL纳米银对大肠杆菌O157:H7的协同抑菌作用。）。

[0016] 图2 金银花提取液与纳米银之比为75:1对大肠杆菌O157:H7协同抑菌作用[0017] （图2a 150 μL金银花提取液对大肠杆菌O157:H7的抑制作用，图2b 2 μL的纳米银对大肠杆菌O157:H7的抑制作用，图2c 75 μL金银花提取液、1 μL纳米银对大肠杆菌O157:H7的协同抑菌作用。）。

[0018] 图3 金银花提取液与纳米银对藤黄微球菌协同抑菌作用

[0019] 图3a 200 μL金银花提取液对藤黄微球菌的抑制作用，图3b 16 μL的纳米银对藤黄微球菌的抑制作用，图3c 100 μL金银花提取液与8 μL纳米银对藤黄微球菌的协同抑菌作用。

[0020] 图4 金银花提取液与纳米银对藤黄微球菌协同抑菌作用

[0021] 图4a 100 μL金银花提取液对藤黄微球菌的抑制作用，图4b 16 μL的纳米银对藤黄微球菌的抑制作用，图4c 50 μL金银花提取液与8 μL纳米银对藤黄微球菌的协同抑菌作用。

具体实施方式

[0022] 实施例中所用试剂均为常规试剂，依照常规方式配制即可。

[0023] 实施例1

[0024] 1、金银花提取液的制备过程：称取干药材金银花50 g，加水量为450 mL，在95 ℃下提取4 h，经过真空旋转浓缩仪后，用0.22 μm滤膜除去提取液中的杂质和细菌，最后用高效液相色谱法测得提取液中绿原酸含量为 23.62 mg/g。

[0025] 2、水溶性银纳米颗粒制备：

[0026] 取22.8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氢氧化钠析出沉淀，过滤，将沉淀加入到100 mL浓度为10 mol/L水溶性的硝酸银溶液中得到十四烷酸银；称取6.7 g 浓度为20 mmoL/L 十四烷酸银于100 mL烧杯中，向烧杯中加入58 mL浓度为40 mmoL/L的三乙胺，80℃下电磁搅拌2 h，白色的十四烷酸银粉末逐渐变成棕色，不溶的前体消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽滤，用丙酮洗涤沉淀数次后，真空干燥，即得到纳米银粒子粉末。

[0027] 3、金银花提取液与水溶性纳米银协同抑菌作用。

[0028] a 细菌的培养

[0029] 挑取LB琼脂培养基上的大肠杆菌O157:H7的单菌落于10 mL LB肉汤培养基中，置于37 ℃培养箱中培养16 h，再按1％的接种量接种于5 mL的LB肉汤培养基中，37 ℃培6
养4 h后。取1 mL上述菌液用0.1%的蛋白胨水连续稀释三个梯度，最终的菌液大约为10 CFU/mL。

[0030] b水溶性纳米银与金银花提取液在抑菌性能上的协同作用

[0031] 分别取1 mL上述已稀释好的菌液于1.5 mL灭菌的离心管中，向1号离心管中分别加入200 μL金银花提取液（绿原酸含量为 23.62 mg/g，下同），向2号离心管中加入2 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，向3号离心管中加入100 μL金银花提取液和1 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，不加入任何上述抑菌剂。为保证每管液体最终体积相等，差量用0.1%的蛋白胨水补齐。置于37 ℃培养2 h。每组实验平行三次。

[0032] c平板计数

[0033] 将实验组待测液用PBS连续稀释两个梯度，100、10-1、10-2各取出200μL分别均匀涂布在

[0034] LB固体平板上；空白组连续稀释四个梯度，从10-2、10-3、10-4三个梯度分别均涂布在

[0035] LB固体平板上。平板吹干后，37℃倒置培养12 h，长出菌落后计数，以30-300个菌落形成单位（CFU）为有效的计数范围。每毫升原菌液活菌数=平板计数*稀释倍数*5[0036] 实验结果如下：

[0037]

[0038] 如图1所示，图1a 200 μL金银花提取液对大肠杆菌O157:H7的抑制作用，图1b2 μL的纳米银对大肠杆菌O157:H7的抑制作用，图1c 100 μL金银花提取液与1 μL纳米银对大肠杆菌O157:H7的协同抑菌作用。

[0039] 实验表明：本发明提供的抑菌组合物具有减少金银花抑菌剂一次用量的作用，且两种药物的合用对抑制大肠杆菌O157:H7起到协同的作用。

[0040] 实施例2

[0041] 1、金银花提取液的制备过程：

[0042] 同实施例1。

[0043] 2、水溶性银纳米颗粒制备

[0044] a、取一定量的十四酸溶于按一定比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入一定量的氢氧化钠析出沉淀，过滤，将沉淀加入到水溶性的硝酸银溶液中得到十四烷酸银。

[0045] b、称取6.7 g 20 mmoL/L 十四烷酸银于100 mL烧杯中，向烧杯中加入58 mL浓度为40 mmoL/L的三乙胺，80℃下电磁搅拌2 h，白色的十四烷酸银粉末逐渐变成棕色，不溶的前体消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽滤，用丙酮洗涤沉淀数次后，真空干燥，即得到纳米银粒子粉末。

[0046] 3、金银花提取液与水溶性纳米银协同抑菌作用

[0047] a、细菌的培养

[0048] 挑取LB琼脂培养基上的大肠杆菌O157:H7的单菌落于10 mL LB肉汤培养基中，置于37 ℃培养箱中培养16 h，再按1％的接种量接种于5 mL的LB肉汤培养基中，37 ℃培6
养4 h后。取1 mL上述菌液用0.1%的蛋白胨水连续稀释三个梯度，最终的菌液大约为10 CFU/mL。

[0049] b、水溶性纳米银与金银花提取液在抑菌性能上的协同作用

[0050] 分别取1 mL上述已稀释好的菌液于1.5 mL灭菌的离心管中，向1号离心管中分别加入150 μL金银花提取液，向2号离心管中加入2 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，向3号离心管中加入75 μL金银花提取液、1 μL水溶性纳米银，4号离心管作为空白对照，不加入任何上述抑菌剂。为保证每管液体最终体积相等，差量用0.1%的蛋白胨水补齐。置于37 ℃摇床培养箱培养2 h。每组实验平行三次。

[0051] c 、平板计数

[0052] 将实验组待测液用PBS连续稀释两个梯度，100、10-1、10-2各取出200μL分别均匀涂

[0053] 布在LB固体平板上；空白组连续稀释四个梯度，从10-2、10-3、10-4三个梯度分别均涂布在

[0054] LB固体平板上。平板吹干后，37℃倒置培养12 h，长出菌落后计数，以30-300个菌落形成单位（CFU）为有效的计数范围。每毫升原菌液活菌数=平板计数*稀释倍数*5[0055]抑菌物质 加入抑菌剂后能数出来的菌落数
6
空白组 5.7×10CFU/mL
150μL的金银花提取液 2.7×106CFU/mL
含2μL浓度为10mg/mL的纳米银 4.8×102CFU/mL
含75μL的金银花提取液、1μL浓度为10mg/mL的纳米银溶液 420CFU/mL

[0056] 如图2所示，图2a 150 μL金银花提取液对大肠杆菌O157:H7的抑制作用，图2b2 μL的纳米银对大肠杆菌O157:H7的抑制作用，图2c 75 μL金银花提取液、1 μL纳米银对大肠杆菌O157:H7的协同抑菌作用。

[0057] 实验表明：本发明提供的抑菌组合物具有减少金银花抑菌剂一次用量的作用，且两种药物的合用对抑制大肠杆菌O157:H7起到协同的作用

[0058] 实施例3

[0059] 1、金银花提取液的制备过程：

[0060] 同实施例1。

[0061] 2、水溶性银纳米颗粒制备：

[0062] 同实施例1。

[0063] 3、金银花提取液与水溶性纳米银协同抑菌作用。

[0064] a 、细菌的培养

[0065] 挑取牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上的藤黄微球菌单菌落于5mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于30 ℃培养基中培养24 h，再按1％的接种量接种于5 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30 ℃培样12 h后。取1 mL上述菌液用PBS与液体培养基按4:1比例混合的6 7
混合液中连续稀释三个梯度，最终的菌液大约为10 ～10 CFU/mL。

[0066] b、水溶性纳米银与金银花提取液在抑菌性能上的协同作用

[0067] 分别取1 mL上述已稀释好的菌液于1.5 mL灭菌的离心管中，向1号离心管中分别加入200 μL金银花提取液，向2号离心管中加入16 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，向3号离心管中加入100 μL金银花提取液和8 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，4号离心管作为空白对照，不加入任何上述抑菌剂。为保证每管液体最终体积相等，差量用PBS与液体培养基按4:1比例混合的混合液补齐。置于30℃摇床培养箱培养6 h。每组实验平行三次。

[0068] c 、平板计数

[0069] 将实验组待测液用PBS连续稀释两个梯度，10-1、10-2、10-3各取出100μL分别均匀涂

[0070] 布在牛肉膏蛋白胨固体平板上；空白组连续稀释四个梯度，从10-2、10-3、10-4三个梯度分别均匀涂布在牛肉膏蛋白胨固体平板上。平板吹干后，30℃倒置培养48 h，长出菌落后计数，以20-200个菌落形成单位（CFU）为有效的计数范围。每毫升原菌液活菌数=平板计数*稀释倍数*10

[0071]

[0072] 如图3所示，图3a 200 μL金银花提取液对藤黄微球菌的抑制作用，图3b 16 μL的纳米银对藤黄微球菌的抑制作用，图3c 100 μL金银花提取液与8 μL纳米银对藤黄微球菌的协同抑菌作用。

[0073] 实验表明：本发明提供的抑菌组合物具有减少金银花抑菌剂一次用量的作用，且两种药物的合用对抑制藤黄微球菌起到协同的作用。

[0074] 实施例4

[0075] 1、金银花提取液的制备过程：

[0076] 同实施例1。

[0077] 2、水溶性银纳米颗粒制备：

[0078] 同实施例1。

[0079] 4、金银花提取液与水溶性纳米银协同抑菌作用。

[0080] a 、细菌的培养

[0081] 挑取牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上的藤黄微球菌单菌落于5mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于30 ℃培养箱中培养24 h，再按1％的接种量接种于5 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30 ℃培样12 h后。取1 mL上述菌液用PBS与液体培养基按4:1比例混合的6 7
混合液中连续稀释三个梯度，最终的菌液大约为10 ～10 CFU/mL。

[0082] b、水溶性纳米银与金银花提取液在抑菌性能上的协同作用

[0083] 分别取1 mL上述已稀释好的菌液于1.5 mL灭菌的离心管中，向1号离心管中分别加入100 μL金银花提取液，向2号离心管中加入16 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，向3号离心管中加入50 μL金银花提取液、8 μL浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，4号离心管作为空白对照，不加入任何上述抑菌剂。为保证每管液体最终体积相等，差量用PBS与液体培养基按4:1比例混合的混合液补齐。置于30℃摇床培养箱培养6 h。每组实验平行三次。

[0084] c 、平板计数

[0085] 将实验组待测液用PBS连续稀释两个梯度，10-1、10-2、10-3各取出100μL分别均匀涂

[0086] 布在牛肉膏蛋白胨固体平板上；空白组连续稀释四个梯度，从10-2、10-3、10-4三个梯度分别均匀涂布在牛肉膏蛋白胨固体平板上。平板吹干后，30℃倒置培养48 h，长出菌落后计数，以20-200个菌落形成单位（CFU）为有效的计数范围。每毫升原菌液活菌数=平板计数*稀释倍数*10

[0087]

[0088] 如图4所示，图4a 100 μL金银花提取液对藤黄微球菌的抑制作用，图4b 16 μL的纳米银对藤黄微球菌的抑制作用，图4c 50 μL金银花提取液与8 μL纳米银对藤黄微球菌的协同抑菌作用。

[0089] 实验表明：本发明提供的抑菌组合物具有减少金银花抑菌剂一次用量的作用，且两种药物的合用对抑制藤黄微球菌起到协同的作用。