通过敲除基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌的方法

摘要

通过敲除（yvoA）基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌的方法属于生物工程技术领域。本方法首先以苏云金芽胞杆菌ATCC35646为出发菌株，以温度敏感型载体pKSV7为骨架构建一个基因敲除载体pKSV-ued，利用同源重组原理，通过双交换过程敲除苏云金芽胞杆菌ATCC35646菌株基因组yvoA基因的方法，构建了一个高产几丁质酶菌株CJ212。经过几丁质酶活测定，确定改良菌株产几丁质酶的能力大大提高。

权利要求

1.一种通过敲除yvoA基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）的方法，其特征在于该方法包括：第1、yvoA基因敲除载体pKSV-ued的构建

第1.1、设计序列表中SEQ ID No.1所示的引物yvoAup-F和SEQ ID No.2所示的引物yvoAup-R，以苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组DNA为模版PCR扩增yvoA基因上游序列，获得1059bp的yvoAup核酸片断；

第1.2、设计序列表中SEQ ID No.3所示的引物yvoAdown-F和SEQ ID No.4所示的引物yvoAdown-R，以苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组DNA为模版PCR扩增yvoA基因下游序列，获得1033bp的yvoAdown核酸片断；

第1.3、设计序列表中SEQ ID No.5所示的引物erm-F和SEQ ID No.6所示的引物erm-R，以pHT315质粒为模版PCR扩增包括启动子和终止子的红霉素抗性基因表达框，获得

1197bp的erm基因片断；

第1.4、将第1.3步获得的erm基因片断和载体pKSV7用Sal I和Xba I双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV-e载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后于-20℃保存备用；

第1.5、yvoAup片断和载体pKSV-e用Sal I和Hind III双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV-ue载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后于-20℃保存备用；

第1.6、将第1.2步获得的yvoAdown片断和第1.5步获得的pKSV-ue载体用Xba I和Kpn I双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV-ued载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后于-20℃保存备用；

第2、CJ212突变菌株的构建

以苏云金芽胞杆菌ATCC35646制备感受态细胞，采用电转化方法，将第1步获得的yvoA基因敲除载体pKSV-ued转化入苏云金芽胞杆菌ATCC35646，在基因组yvoA位点发生双交换，红霉素抗性平板上筛选得到红霉素抗性菌株，命名为CJ212；该菌株的yvoA基因被红霉素抗性基因所取代，成为缺失了yvoA基因的突变菌株，即为所构建的菌株。

2.一种权利要求1所述方法获得的敲除yvoA基因的苏云金芽胞杆菌菌株CJ212在生产几丁质酶中的应用。

说明书

通过敲除基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及通过敲除yvoA基因提高苏云金芽胞杆菌几丁质酶产量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

[0002] 苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种革兰氏阳性菌，其在生长周期的稳定期形成的芽胞及伴胞晶体使其独具特性。由于苏云金芽胞杆菌制剂对靶标昆虫有特异性毒杀作用，且对人畜安全、不危害环境，在农业、林业和卫生害虫的防治上得到了广泛应用。

[0003] 许多Bt菌除了合成杀虫晶体蛋白外，也能产生几丁质酶。Bt几丁质酶不仅具有杀虫增效作用，对病原真菌也有抑制作用，具有防治农作物病虫害的作用（Liu D,Cai J,Xie CC,Liu C,Chen YH.Purification and partial characterization of a 36-kDa chitinase from Bacillus thuringiensis subsp.colmeri,and its biocontrol potential.Enzyme and Microbial Technology,2010, 252–256.Xiao L,Xie CC,Cai J,Lin ZJ,Chen YH.Identification and characterization of a chitinase-produced Bacillus showing significant antifungal activity.Current Microbiology,2009,58(5):528–533.）。此外，由几丁质酶分解产生的几丁寡糖有明显的抗肿瘤作用，可激活巨噬细胞和淋巴细胞,增强机体免疫力,已用于抗癌的临床治疗以及药物及保健食品的开发领域（Khoushab F,Yamabhai M.Chitin research revisited.Marine Drugs,2010,8(7):1988–2012.；Zhao Y,Park RD,Muzzarelli RAA.Chitin deacetylases:properties and applications.Marine Drugs,2010,8(1):24-46.；Zhou Z,Zheng T,Homer R J,Kim Y,Chen N Y,Cohn L,Hamid Q and Elias J A.Acidic Mammalian Chitinase in AsthmaticTh2 Inflammation and IL-13Pathway Activation.Science,2004,304:1678~1682.）。因此几丁质酶在农业、工业、食品、医药等领域展现出良好前景，具有重要的经济价值。但由于Bt菌株几丁质酶产量普遍较低，制约了其在实际生产中的应用。因此，提高Bt几丁质酶产量是几丁质酶开发应用的关键问题之一。

[0004] 目前，国内外提高Bt 几丁质酶产量的方法主要是筛选高产菌株，优化发酵条件，而甚少应用分子生物学技术对菌株进行改良来提高其产量。

[0005] YvoA蛋白（Gene ID:JQ579452），作为芽孢杆菌中的一种调控蛋白，在N-乙酰葡糖胺的代谢过程中发挥着关键的作用，相关研究表明，YvoA蛋白对几丁质酶的合成具有一定的阻遏作用。

发明内容

[0006] 本发明的目的是解决现有Bt菌株几丁质酶产量普遍较低的问题，提供一种通过敲除基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌的方法及应用。

[0007] 本方法利用分子生物学技术，首先以温度敏感型载体pKSV7为骨架构建一个基因敲除载体pKSV-ued，经过电转化导入苏云金芽胞杆菌ATCC35646菌株中。利用同源重组原理，通过双交换过程敲除苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组yvoA基因，从而构建一种高产几丁质酶的苏云金芽胞杆菌CJ212（见图1）。

[0008] 本发明提供的通过敲除yvoA基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）CJ212的方法包括：

[0009] 第1、yvoA基因敲除载体pKSV-ued的构建（见图2）

[0010] 第1.1、设计序列表中SEQ ID No.1所示的引物yvoAup-F和SEQ ID No.2所示的引物yvoAup-R，以苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组DNA为模版PCR扩增yvoA基因上游序列，获得1059bp的yvoAup核酸片断；

[0011] 第1.2、设计序列表中SEQ ID No.3所示的引物yvoAdown-F和SEQ ID No.4所示的引物yvoAdown-R，以苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组DNA为模版PCR扩增yvoA基因下游序列，获得1033bp的yvoAdown核酸片断；

[0012] 第1.3、设计序列表中SEQ ID No.5所示的引物erm-F和SEQ ID No.6所示的引物erm-R，以pHT315质粒为模版PCR扩增包括启动子和终止子的红霉素抗性基因表达框，获得1197bp的erm基因片断。

[0013] PCR扩增体系如下：

[0014]

[0015] PCR程序：

[0016] 扩增erm基因的程序：94℃预变性4min；94℃变性40s，48℃复性35s，72℃延伸1.1min，共计30个循环，72℃延伸10min。

[0017] 扩增yvoAup序列和yvoAdown序列的程序：94℃预变性4min；94℃变性40s，50℃～47℃复性50s，72℃延伸1.1min，每个循环降低1℃，循环4次；然后，94℃变性40s，
50℃复性50s，72℃延伸1.1min，循环26次，共计30个循环；72℃延伸10min。

[0018] 第1.4、将第1.3步获得的erm基因片断和载体pKSV7用SalI和Xba I双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV-e载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后于-20℃保存备用；

[0019] 第1.5、yvoAup核酸片断和载体pKSV-e用SalI和Hind III双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV-ue载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后于-20℃保存备用；

[0020] 第1.6、将第1.2步获得的yvoAdown核酸片断和第1.5步获得的pKSV-ue载体用XbaI和Kpn I双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV-ued载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后于-20℃保存备用。

[0021] 第2、CJ 212突变菌株的构建（见图3）

[0022] 以苏云金芽胞杆菌ATCC35646为出发菌制备感受态细胞，采用电转化方法，将第1步获得的yvoA基因敲除载体pKSV-ued转化入苏云金芽胞杆菌ATCC35646，在基因组yvoA位点发生双交换，ERM抗性平板上筛选得到红霉素抗性菌株，命名为CJ212；该菌株的yvoA基因被红霉素抗性基因所取代，成为缺失了yvoA基因的突变菌株，即为所得到的菌株。

[0023] 所述敲除yvoA基因的苏云金芽胞杆菌株CJ212可以在生产几丁质酶中应用。

[0024] 本发明的优点和积极效果：

[0025] 苏云金芽胞杆菌除了合成杀虫晶体蛋白外，也能产生几丁质酶。几丁质酶不仅具有杀虫增效作用，对病原真菌也有抑制作用，具有防治农作物病虫害的作用。此外，由几丁质酶分解产生的几丁寡糖有明显的抗肿瘤作用，可激活巨噬细胞和淋巴细胞,增强机体免疫力,已用于抗癌的临床治疗以及药物及保健食品的开发领域。因此几丁质酶在农业、工业、食品、医药等领域展现出良好前景，具有重要的经济价值。

[0026] 目前，国内外在几丁质酶发酵条件和分离技术方面进行了大量研究，对于提高几丁质酶产量有一定的效果，但发酵产量仍然难于满足大规模工业化生产的要求。因此利用基因工程技术，从分子水平对菌株进行改良将成为提高几丁质酶产量的手段。

[0027] 本发明通过分子生物学技术，成功构建一株高产几丁质酶菌株CJ212。与原始菌株ATCC35646相比，经过改良的菌株CJ212几丁质酶量提高5.23倍（见图5）。此外，还可以通过这种方法，对其他苏云金芽孢杆菌进行基因改造，以获得相应的改良菌株，达到提高几丁质酶产量的目的。附图说明：

[0028] 图1为本发明技术方案流程图。

[0029] 图2为yvoA基因敲除载体的构建。

[0030] 图3为yvoA基因敲除菌株的构建。

[0031] 图4为yvoA基因敲除菌株PCR验证，1：DNAMarker，2：ERM-F/Jiance-R负对照，[0032] 3：ERM-F/Jiance-R PCR产物，4：Jiance-F/ERM-R PCR产物，5：Jiance-F/ERM-R负对照。

[0033] 图5为BtATCC35646和Bt CJ212几丁质酶活力比较。具体实施方式：

[0034] 实施例1、构建高产几丁质酶的苏云金芽胞杆菌CJ 212

[0035] 本发明首先构建yvoA基因敲除载体pKSV-ued，经过电转化将pKSV-ued载体转化入苏云金芽胞杆菌ATCC35646，经过双交换重组过程将其基因组内的yvoA基因用红霉素抗性基因代替，达到敲除yvoA基因的目的，从而构建了一株高产几丁质酶的苏云金芽胞杆菌CJ212（见图1）。通过PCR方法对突变菌株进行鉴定并测序；利用测定几丁质酶活的方法对菌体所产几丁质酶的量进行鉴定。具体实施方式如下：

[0036] （1）yvoA基因敲除载体pKSV-ued的构建（见图2）

[0037] 根据苏云金芽胞杆菌yvoA基因（Gene ID:JQ579452）设计引物yvoAup-F（SEQ ID No.1）和yvoAup-R（SEQ ID No.2），以苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）ATCC35646基因组DNA为模版PCR扩增yvoA基因上游基因，获得1083bp的yvoAup核酸片断；

[0038] 设计引物yvoAdown-F（SEQ ID No.3）和yvoAdown-R（SEQ ID No.4），以苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组DNA为模版PCR扩增yvoA基因下游基因，获得1033bp的yvoAdown基因片断；

[0039] 设计引物erm-F（SEQ ID No.5）和erm-R（SEQ ID No.6），以pHT315质粒为模版PCR扩增包括启动子和终止子的红霉素抗性基因表达框，获得1197bp的erm基因片断。

[0040] PCR扩增体系如下：

[0041]

[0042] vPCR程序：

[0043] 扩增yvoAup序列和yvoAdown序列的程序：94℃预变性4min；94℃变性40s，50℃～47℃复性50s，72℃延伸1.1min，每个循环降低1℃，循环4次；然后，94℃变性40s，
50℃复性50s，72℃延伸1.1min，循环26次，共计30个循环；72℃延伸10min。

[0044] 扩增erm基因的程序：94℃预变性4min；94℃变性40s，48℃复性35s，72℃延伸1.1min，共计30个循环，72℃延伸10min。

[0045] erm基因片断和载体pKSV7用Sal I和Xba I双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV-e载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后与-20℃保存备用；

[0046] yvoAup核酸片断和载体pKSV-e用Sal I和Hind III双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV-ue载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后与-20℃保存备用；

[0047] yvoAdown核酸片断和pKSV-ue载体用Xba I和Kpn I双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV-ued载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后与-20℃保存备用。

[0048] （2）CJ 212突变菌株的构建

[0049] 以苏云金芽胞杆菌ATCC35646制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的yvoA基因敲除载体pKSV-ued转化入苏云金芽胞杆菌ATCC35646，在基因组yvoA位点发生双交换，红霉素抗性平板上筛选得到抗性菌株，命名为CJ212；该菌株的yvoA基因被红霉素抗性基因erm所取代，成为了缺失了yvoA基因的突变菌株，即为所得到的菌株（见图3）。

[0050] （3）缺失yvoA基因的突变菌株的验证

[0051] 对苏云金芽胞杆菌CJ212突变菌是否缺失了yvoA基因进行分子验证。由于菌株内的yvoA基因被红霉素抗性基因所取代，所以我们在yvoAup片段上游设计引物Jiance-F（SEQ ID NO.7），在yvoAdown片段的下游设计引物Jiance-R（SEQ ID NO.8），以得到的苏云金芽胞杆菌CJ212突变菌基因组DNA为模版，以引物Jiance-F和erm-R为一对引物，erm-F和Jiance-R为一对引物分别进行PCR扩增，扩增出与预期结果大小一致的产物（见图4）。

[0052] PCR程序：

[0053] PCR程序：94℃预变性4min；94℃变性40s，50℃～47℃复性50s，72℃延伸1.1min，每个循环降低1℃，循环4次；然后，94℃变性40s，50℃复性50s，72℃延伸1.1min，循环26次，共计30个循环；72℃延伸10min。

[0054] 同时，PCR产物的测序结果（SEQ ID NO.9）也表明原始菌株苏云金芽胞杆菌CJ212菌株中的yvoA基因确实被红霉素抗性基因所代替。结果证实我们成功得到了缺失yvoA基因的突变菌株苏云金芽胞杆菌CJ212。

[0055] 实施例2、苏云金芽胞杆菌CJ 212在生产几丁质酶中应用

[0056] 改良菌株苏云金芽胞杆菌CJ212几丁质酶活力的测定：

[0057] 取1mL菌体培养液于1.5mL离心管中，8000rpm离心10min。取200μL上清液加入200μL含10%胶体几丁质的磷酸盐缓冲液（pH 6.0），50℃水浴1h。加入200μL 1%NaOH溶液终止反应，混匀后8000rpm离心10min；取上清400μL于新的离心管中，加入等体积的DNS试剂溶液，混匀后沸水浴10min；以没有反应的培养液作对照，测OD535值。

[0058] 一个酶活力单位定义为50℃、pH 6.0条件下反应1min产生1μgN-乙酰-D-氨基葡萄糖（GlcNAc）所需要的酶量。酶活力测定结果均为3次以上实验结果的平均值。

[0059] GlcNAc标准曲线的制作：

[0060] 将500μg/mLGlcNAc贮液稀释成不同的浓度梯度，以不含GlcNAc为空白对照。取几支干净的试管，分别加入1mL稀释好的不同浓度的GlcNAc溶液，再在各试管中加入1mL磷酸盐缓冲液（pH 6.0）、1mL 1%的NaOH溶液和3mL DNS试剂溶液，混匀后在沸水浴中保温10min。取出试管，冷却后测定各溶液的OD535值，绘制标准曲线。

[0061] 经过几丁质酶活测定，发现改良后的菌株苏云金芽胞杆菌CJ212与原始菌株苏云金芽胞杆菌ATCC35646相比，酶活从0.832IU/mL提高到4.357IU/mL，提高了5.23倍（见图5）。