基于氯高铁血红素衍生物的抗微生物剂

摘要

本发明涉及新颖的基于通式(I)的氯高铁血红素衍生物的抗微生物剂(包括抗细菌剂和抗真菌剂)和组合物，也涉及新颖的氯高铁血红素衍生物的生产。基于氯高铁血红素衍生物的抗细菌剂的优点是：它们的生物相容性、生物可降解性、对危害人类的抗性细菌和广泛传播的微真菌的高度有效性以及没有毒性和副作用。

权利要求

1.通式(I)化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的应用，

其中

R1和R2中的任一个是-OH，且另一个是-ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH即化合物V、-ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH即化合 物VI、-Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Le u)-Trp-(D-Leu)-Trp-NHCH2CH2OH， 其δ中X＝Trp或Phe或Tyr即化合物XII、-N -环-(Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)2即化合物XIII、-Arg-Gly-Asp-OH即化合物XI或-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-OH即化合物XX；

或R1和R2各自是-ArgOMe即化合物VII、-SerOMe即化合物VIII、-βAlaHA即化合物IX、-βAlaHis即化合物X、-NHCH2CH2OH即化合物XIV、-GlyOMe即化合物XV、-NHCH(CH2OH)CH2OH即化合物XVI、-NHCH2CH(OH)CH2OH即化合物XVII、-Glu(ArgOMe)-ArgOMe即化合物XVIII、-HA即化合物XIX或-Arg-ArgOMe即化合物XXI，其中HA是组胺部分

且Men+是Fe2+或Fe3+；

所述药物是抗细菌剂和/或抗真菌剂，

其中化合物VI用于制备抗细菌剂，所述抗细菌剂针对枯草芽孢杆菌BKM B-501和藤黄微球菌BKM Ac-2230；

化合物V、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII和XIX用于制备抗细菌剂，所述抗细菌剂针对枯草芽孢杆菌BKM B-501、藤黄微球菌BKM Ac-2230、金黄色葡萄球菌209P和粪肠球菌BKMВ-871；

化合物V、VII、VIII、XII、XIII、XIV、XV、XVIII、XX和XXI用于制备抗细菌剂，所述抗细菌剂针对表皮葡萄球菌No.533、金黄色葡萄球菌No.25923ATCC、金黄色葡萄球菌No.100KC、屎肠球菌No.569和粪肠球菌No.559；以及化合物XII、XIII、XIV、XV和XX用于制备抗真菌剂，所述抗真菌剂针对白色念珠菌No.927；

化合物VII和XVIII用于制备抗真菌剂，所述抗真菌剂针对新型隐球菌No.3465和白色念珠菌No.927；

化合物V和VIII用于制备抗真菌剂，所述抗真菌剂针对新型隐球菌No.3465和白色念珠菌No.927。

2.根据权利要求1所述的应用，其中在通式(I)化合物中

R1和R2中的任一个是-OH，且另一个是-Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Le u)-Trp-(D-Leu)-Trp-NHCH2CH2OH，其中X＝Trp或Phe或Tyrδ即化合物XII、-N -环-(Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)2即化合物XIII、-Arg-Gly-Asp-OH即化合物XI或-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-OH即化合物XX；

或R1和R2各自是-NHCH2CH2OH即化合物XIV、-GlyOMe即化合物XV、-NHCH(CH2OH)CH2OH即化合物XVI、-NHCH2CH(OH)CH2OH即化合物XVII、-Glu(ArgOMe)-ArgOMe即化合物XVIII、-HA即化合物XIX或-Arg-ArgOMe即化合物XXI，其中HA是组胺部分

3.一种通式(I)的氯高铁血红素衍生物

其中

R1和R2中的任一个是-OH，且另一个是-Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Le u)-Trp-(D-Leu)-Trp-NHCH2CH2OH，其中X＝Trp或Phe或Tyrδ即化合物XII、-N -环-(Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)2即化合物XIII、-Arg-Gly-Asp-OH即化合物XI或-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-OH即化合物XX；

或R1和R2各自是-NHCH2CH2OH即化合物XIV、-GlyOMe即化合物XV、-NHCH(CH2OH)CH2OH即化合物XVI、-NHCH2CH(OH)CH2OH即化合物XVII、-Glu(ArgOMe)-ArgOMe即化合物XVIII、-HA即化合物XIX或-Arg-ArgOMe即化合物XXI，其中HA是组胺部分

n+ 2+ 3+

且Me 是Fe 或Fe ；

或者其药学上可接受的盐。

4.药物组合物，包含权利要求3的式(I)化合物作为活性成分。

5.组合物，包含权利要求3的式(I)化合物作为活性成分，其中所述组合物是杀菌剂和/或消毒剂组合物。

6.根据权利要求1的应用，其中化合物(I)用于制备抗细菌剂，所述抗细菌剂治疗或预防由枯草芽孢杆菌BKM B-501和藤黄微球菌BKM Ac-2230造成的疾病，其中化合物(I)选自化合物V、VI、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII和XIX。

7.根据权利要求1的应用，其中化合物(I)用于制备抗细菌剂，所述抗细菌剂治疗或预防由表皮葡萄球菌No.533、金黄色葡萄球菌No.25923ATCC、金黄色葡萄球菌No.100KC、屎肠球菌No.569和粪肠球菌No.559造成的疾病，其中化合物(I)选自化合物V、VII、VIII、XII、XIII、XIV、XV、XVIII、XX和XXI。

8.根据权利要求1的应用，其中化合物(I)用于制备抗细菌剂，所述抗细菌剂治疗或预防由金黄色葡萄球菌209P和粪肠球菌BKM В-871造成的疾病，其中化合物(I)选自化合物V、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII和XVIII。

9.根据权利要求1的应用，其中化合物(I)用于制备抗真菌剂，所述抗真菌剂治疗或预防由白色念珠菌No.927造成的疾病，其中化合物(I)选自化合物V、VII、VIII、XII、XIII、XIV、XV、XVIII和XX。

10.根据权利要求1的应用，其中化合物(I)用于制备抗真菌剂，所述抗真菌剂治疗或预防由新型隐球菌No.3465造成的疾病，其中化合物(I)选自化合物V、VII、VIII和XVIII。

11.一种用于生产在权利要求3中要求保护的通式(I)化合物的方法，所述方法包括：在溶剂中，使在羧基处被活化的氯高铁血红素衍生物与氨基组分反应。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述活化的氯高铁血红素衍生物是氯高铁血红素6,7-二-N-氧基琥珀酰亚胺酯或氯高铁血红素6(7)-单-N-氧基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺酯，且所述溶剂是N,N-二甲基甲酰胺。

13.根据权利要求11所述的方法，其中使用焦碳酸二叔丁酯来活化氯高铁血红素的羧基之一，该方法在有吡啶存在下在N,N-二甲基甲酰胺中进行。

说明书

基于氯高铁血红素衍生物的抗微生物剂

技术领域

[0001] 本发明涉及生物有机化学领域，并涉及新颖的抗微生物剂和氯高铁血红素衍生物组合物的开发以及新颖的氯高铁血红素衍生物的生产。

背景技术

[0002] 已知人类和动物的许多危险疾病是由微生物(诸如细菌和微真菌)造成。细菌会造成流行病，诸如霍乱、伤寒、副伤寒、瘟疫、白喉、土拉菌病、布鲁杆菌病、以及肺结核、败血症(血液中毒)、麻风、梅毒和其它流行病。在动物中，细菌会造成马鼻疽、炭疽、肺结核和其它疾病。真菌病主要影响皮肤和粘膜，具体实例是角膜霉菌病、小孢子菌病(microsporum)、发癣菌病和隐球菌病。

[0003] 与微生物斗争的策略包括施用抗微生物剂，诸如抗细菌剂(包括抗生素)和抗真菌剂。但是，许多已知的药剂具有缺点，诸如毒性、对蛋白水解酶的敏感性、溶血效应和抗微生物活性范围不足。具体地，细菌会迅速地形成对已知抗微生物剂(主要是抗生素)的抗性。在该背景下，不会造成抗性的新颖的无毒的且生物相容的抗微生物剂的搜寻具有极大利益。

[0004] 已知氯高铁血红素具有针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗微生物活性[Y.Nitzan，H.Ladan，S.Gozansky和Z.Malik，“Characterization of Hemin Antibacterial Action on Staphylococcus aureus，”FEMS Microbiol.Lett.，1987，Vol.48(3)，第401-406页]。但是，氯高铁血红素作为抗细菌剂的应用，受到它的水不溶性、溶血活性和短期抗细菌效应的阻碍。

[0005] 为了设计生物活性衍生物，已经尝试通过用氨基酸和肽进行缀合来修饰氯高铁血红素。作为通过制备对应的酰胺来修饰氯高铁血红素的羧基的结果，已经制备和表征了通式(I)的化合物，其中R1和R2相同地或不同地是-OH或氨基酸或肽部分，且其中R1和R2不可同时是-OH。

[0006]

[0007] 已经发现，有些通式(I)的肽氯高铁血红素衍生物，尤其是其中R1和R2之 一 是 -OH 且 另 一 个 是 -ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH( 化 合 物 V)或-ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH(化合物VI)的那些衍生物，具有核酸酶(核酸水解)活性，这表现为破坏质粒DNA的能力[俄罗斯专利No.2250906，2005年4月27日；Zheltukhina，G.A.，Lobanova，T.N.，Nebolsin，V.E.，Gallyamov，M.O.，Dranitsyna，S.M，.和Kostanyan，I.A.，Bioorg.Khim.，2006，Vol.32，No.2，第198-210页]。

[0008] 有些通式(I)的氨基酸和肽氯高铁血红素衍生物，即其中R1和R2之一是-OH且另一个是-ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH(化合物V)或R1＝R2＝-ArgOMe(化合物VII)的那些衍生物，能够抑制HIV蛋白水解酶，并因此发挥抗-HIV抗病毒作用[俄罗斯专利No.2238950，2004年10月27日]。

[0009] 对于有些通式(I)的氯高铁血红素衍生物，即其中R1＝R2＝-SerOMe(化合物VIII)、R1＝R2＝-βAlaHis(化合物X)、R1＝R2＝-ArgOMe(化合物VII)、R1＝R2＝-βAlaHA(化合物IX，HA＝组胺部分)或其中R1和R2之一是-OH且另一个是-ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH(化 合 物 V)或 -ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH(化合物VI)的那些衍生物，已经证实了抗病毒活性[俄罗斯申请号2007125604，2009年1月20日]。

[0010] 但是，本领域不知道前述氯高铁血红素衍生物的抗微生物(具体地，抗细菌和抗真菌)活性。

[0011] 另一方面，最近已经将大量注意力放在基于抗微生物肽(AMP)的新颖抗微生物剂的 设 计上[A.Giuliani，G.Pirri和 S.F.Nicoletto，“Antimicrobial Peptides：An Overview of a Promising Class of Therapeutics，”Central European Journal of Biology，2007，Vol.2(1)，第1-33页]。

[0012] 在已知的抗微生物肽中，我们可以提及直链短杆菌肽D，它是式(II)的肽和式(III)的环状短杆菌肽S的混合物：

[0013] Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Leu)-Trp-(D-Leu)-TrpNHCH2CH2OH (II)

[0014] 其中X＝Trp、Tyr或Phe

[0015] [W.E.Herrelland 和 D.Heilman，“Experimental and Clinical Studies on Gramicidin，”J.Clin.Invest.，1941，Vol.20，第583-591页]；

[0016]

[0017] [G.N agamurthi 和 S.Rambhav，“Gramicidin-S：Structure-Activity Relationship，”J.Biosci.，1985，Vol.7，No.3-4，第323-329页]。

[0018] 化合物II对革兰氏阳性细菌[W.E.Herrell和D.Heilman，“Experimental and Clinical Studies on Gramicidin，”J.Clin.Invest.，1941，Vol.20，No 583]和 某 些病毒、尤其是疱疹病毒[美国专利号6001808,1999]是有效的。浓度为5-15μM的化合物III主要对革兰氏阳性细菌是有效的[Jingbo Xiao，Bernard Weisblum和Peter Wipf，“Electrostatic versus Steric Effects in Peptidomimicry：Synthesis and Secondary Structure Analysis of Gramicidin S Analogues with(E)-Alkene Peptide Isosteres，”J.Am.Chem.Soc.，2005，127(16)，第5742-5743页]。化合物II和III在医学实践中仅用于局部施用。这些抗微生物剂的缺点包括：它们的相对长的用药时间和有关的相对高的成本；抗细菌、抗真菌和抗病毒效应的范围不足；和它们的用药副作用，主要是红细胞溶血和变态反应。

[0019] 此外，存在Arg-Gly-Asp肽(IV)，它是杀菌肽家族抗微生物肽、许多微生物蛋白和哺乳动物细胞表面纤连蛋白的片段[A.J.Kastin，“Handbook of Biologically Active Peptides，”Elsevier/Academic Press，美国，2006，第576页]。但是，尚未研究它作为治疗感染性疾病的药剂的有用性。

[0020] 在临床实践中使用AMP的主要障碍是，它们的相对高的成本、对蛋白水解酶的敏感性和许多AMP固有的溶血效应。

[0021] 另外，目前生产抗微生物肽的主要途径是固相方法，这使得它们非常昂贵，并使得它们的使用不经济。因此，更短的AMP类似物和它们的衍生物(具体地，与其它类别的化合物的缀合物)的搜寻具有极大利益。

[0022] 在持续需要改良抗微生物剂(在降低它们的毒性和其它副作用并增强它们对抗性株的活性方面)的背景下，已经提议将氯高铁血红素衍生物用作这样的药剂。

发明内容

[0023] 本发明涉及通式(I)的氯高铁血红素衍生物或其异构体或异构体混合物或者其药学上可接受的盐作为抗微生物剂的应用，

[0024]

[0025] 其中R1和R2是相同的或不同的，条件是R1和R2二者不同时是-OH，且其中[0026] R1和R2中的任一个是-OH，且另一个是-ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH、-ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH、-Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Leu)-Trp-(D-Leu)-Trp-NHCH2CH2OH，其 中 X ＝ Trp 或 Phe 或δTyr(短杆菌肽D)、-N -环-(Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)2(短杆菌肽S)、-Arg-Gly-Asp-OH或-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-OH；

[0027] 或R1和R2各自是-ArgOMe、-SerOMe、-βAlaHA、-βAlaHis、-NHCH2CH2OH、-GlyOMe、-NHCH(CH2OH)CH2OH、-NHCH2CH(OH)CH2OH、-Glu(ArgOMe)-ArgOMe、-HA或-Arg-ArgOMe，[0028] 其中HA是组胺部分n+ 2+ 3+

[0029] 且Me 是Fe 或Fe 。

[0030] 此外，本发明涉及基于前述式(I)化合物的抗微生物(具体地，抗细菌和/或抗真菌)剂和对应的药用的、杀菌的和/或消毒的组合物，以及用于治疗和/或预防由微生物造成的疾病的方法。

[0031] 另外，本发明涉及新颖的通式(I)的氯高铁血红素衍生物

[0032]

[0033] 其中R1和R2是相同的或不同的，条件是R1和R2二者不同时是-OH，

[0034] 且其中R1和R2中的任一个是-OH，且另一个是-Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Leu)-Trp-(D-Leu)-Trp-NHCH2CH2OH， 其 中δX＝Trp或Phe或Tyr(短杆菌肽D)、-N -环-(Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)2(短杆菌肽S)、-Arg-Gly-Asp-OH或-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-OH；

[0035] 或R1和R 2各 自 是 -NHCH 2CH2OH、-GlyOMe、-NHCH(CH2OH)CH2OH、-NHCH2CH(OH)CH2OH、-Glu(ArgOMe)-ArgOMe、-HA或-Arg-ArgOMe，

[0036] 其中HA是组胺部分

[0037] 且Men+是Fe2+或Fe3+；

[0038] 或其异构体或异构体混合物或者其药学上可接受的盐，以及用于生产这些化合物的方法。

附图说明

[0039] 图1显示了氯高铁血红素衍生物诱导的从模型脂质体释放羧基荧光素的动力学图。

[0040] 图2显示了溶血活性(评价为从红细胞血红蛋白的释放的强度)相对于氯高铁血红素衍生物浓度的图。

[0041] 发明详述

[0042] 发明人惊讶地发现，上式(I)的化合物(其代表氯高铁血红素与肽、氨基酸或它们的类似物的缀合物)是有前途的抗微生物剂。

[0043] 式(I)的氯高铁血红素衍生物的优点包括：它们的生物相容性和生物可降解性、对正常人细胞的低毒性、缺少溶血效应和与抗真菌活性相组合的高度抗细菌效力(具体地，针对抗性株)。

[0044] 无意将它们限制于任何特定理论，发明人提示，式(I)化合物的抗微生物效应可能部分地源自它们对脂膜的破坏作用，已知该作用是抗微生物效应的主要机理之一。在实施例12和图1中证实了该作用。

[0045] 因而，已经生产和研究了下述的新颖的式(I)化合物：

[0046] 化合物(XI)：R1和R2之一是-OH，且另一个是-Arg-Gly-Asp-OH；

[0047] 化合物(XII)：R1和R2之一是-OH，且另一个是-Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Leu)-Trp-(D-Leu)-Trp-NHCH2CH2OH，其中X＝Trp、Phe或Tyr(短杆菌肽D)；

[0048] 化合物(XIII)：R1和R2之一是-OH，且另一个是-Nδ-环-(Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)2(短杆菌肽S)；

[0049] 化合物(XIV)：R1＝R2＝-NHCH2CH2OH；

[0050] 化合物(XV)：R1＝R2＝-GlyOMe；

[0051] 化合物(XVI)：R1＝R2＝-NHCH(CH2OH)CH2OH；

[0052] 化合物(XVII)：R1＝R2＝-NHCH2CH(OH)CH2OH；

[0053] 化合物(XVIII)：R1＝R2＝-Glu(ArgOMe)-ArgOMe；

[0054] 化合物(XIX)：R1＝R2＝-HA；

[0055] 化合物(XX)：R1和R2之一是-OH，且另一个是-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-OH；和[0056] 化合物(XXI)：R1＝R2＝-Arg-ArgOMe；

[0057] 其中HA是

[0058] 除了前述的新颖的化合物以外，已经研究了一些已知的通式(I)的氯高铁血红素衍生物，并发现表现出类似的性质，即：

[0059] 化合物(V)：R1和R2之一是-OH，且另一个是-ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH；

[0060] 化合物(VI)：R1和R2之一是-OH，且另一个是-ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH；

[0061] 化合物(VII)：R1＝R2＝-ArgOMe；

[0062] 化合物(VIII)：R1＝R2＝-SerOMe；

[0063] 化合物(IX)：R1＝R2＝-βAlaHA，其中HA-是组胺部分；和

[0064] 化合物(X)：R1＝R2＝-βAlaHis；

[0065] 化合物(V)和(VI)公开在：俄罗斯专利No.2250906(2005年4月27日)以及Zheltukhina，G.A.，Lobanova，T.N.，Nebolsin，V.E.，Gallyamov，M.O.，Dranitsyna，S.M，.和Kostanyan，I.A.，Bioorg.Khim.，2006，Vol.32，No.2，第198-210页的文章；化合物(VII)公开在俄罗斯专利No.2238950(2004年10月27日)；化合物(VIII)、(IX)和(X)公开在：俄罗斯申请号2007125604(2009年1月20日)。但是，尚未研究这些化合物的抗微生物(具体地，抗细菌或抗真菌)活性。

[0066] 因而，本发明涉及通式(I)的氯高铁血红素衍生物或其异构体或异构体混合物或者其药学上可接受的盐作为抗微生物剂的应用

[0067]

[0068] 其中R1和R2是相同的或不同的，条件是R1和R2二者不同时是-OH，且其中[0069] R1和R2中的任一个是-OH，且另一个是-ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH、-ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH、-Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Leu)-Trp-(D-Leu)-Trp-NHCH2CH2OH，其 中 X ＝ Trp 或 Phe 或δTyr(短杆菌肽D)、-N -环-(Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)2(短杆菌肽S)、-Arg-Gly-Asp-OH或-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-OH；

[0070] 或R1和R2各自是-ArgOMe、-SerOMe、-βAlaHA、-βAlaHis、-NHCH2CH2OH、-GlyOMe、-NHCH(CH2OH)CH2OH、-NHCH2CH(OH)CH2OH、-Glu(ArgOMe)-ArgOMe、-HA或-Arg-ArgOMe，[0071] 其中HA是组胺部分

[0072] 且Men+是Fe2+或Fe3+。

[0073] 抗微生物活性包括抗细菌和抗真菌活性。

[0074] 上述的式(I)化合物对革兰氏阳性细菌诸如葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如，金黄色葡萄球菌)、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、肠球菌属(Enterococcus)(例如，粪肠球菌(Enterococcus faecalis))和微球菌属(Micrococcus)(例如，藤黄微球菌(Micrococcus luteus))等细菌属(具体地，对已知抗细菌剂有抗性的细菌)是有活性的。优选地，上面列出的细菌是枯草芽孢杆菌BKM B-501、金黄色葡萄球菌209P、粪肠球菌BKM B-871或藤黄微球菌BKM Ac-2230株。更优选地，前述化合物具有针对金黄色葡萄球菌No.25923ATCC、金黄色葡萄球菌No.100KC、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)No.533、粪肠球菌No.559或屎肠球菌(Enterococcus faecium)No.569抗性株的抗细菌活性。

[0075] 此外，上述的式(I)化合物对隐球菌属(Cryptococcus)微真菌(具体地，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、优选新型隐球菌No.3465株)和念珠菌属(Candida)微真菌(具体地，白色念珠菌(Candida albicans)、优选白色念珠菌No.927株)是有活性的。

[0076] 式(I)化合物可以作为异构体或异构体混合物存在，它们都被要求保护的发明的范围完全覆盖。例如，如果氯高铁血红素的2个羧基之一被修饰，可以形成(6)和(7)衍生物的混合物。

[0077] 除非另有说明，在氯高铁血红素衍生物中的所有氨基酸都是L-氨基酸。

[0078] 式(I)化合物可以以下述形式使用：与药学上可接受的酸(例如，乳酸、酒石酸、柠檬酸、盐酸或其它酸)形成的盐，或它们的羧基与碱金属离子或碱土金属离子(诸如钠、钾和钙)或与例如药学上可接受的碱(诸如氨和乙醇胺)形成的盐。

[0079] 前述式(I)化合物和/或其盐可以用作用有机或无机载体或赋形剂配制的药物组合物(例如，固体、半固体或液体形式)的活性成分。

[0080] 可以用常规的无毒的且药学上可接受的载体配制组合物中的活性成分，所述载体适用于制备溶液剂、片剂、丸剂、胶囊剂、栓剂、乳剂、混悬剂、喷雾剂、吸入剂、滴剂、软膏剂或其它剂型。载体可以是水、葡萄糖、乳糖、阿拉伯树胶、明胶、淀粉、三木糖醇镁、滑石、玉米淀粉、尿素、聚乙二醇和适用于生产固体、软的或液体制剂的其它载体。在本文中，稳定剂、增稠剂、着色剂和矫味剂可以用作添加剂。

[0081] 式(I)化合物以足以提供抗微生物效应的量包含在组合物中。

[0082] 在生产单位剂型时，用载体配制的活性成分的量可以随治疗的接受者和治疗剂的具体给药途径而变化。

[0083] 例如，当本发明的化合物用作注射用溶液时，溶液中活性物质的含量是在0.001-1重量％范围内。化合物的稀释液可以是0.9％氯化钠溶液、蒸馏水、奴佛卡因注射液、林格氏溶液和葡萄糖溶液。当通式(I)的化合物用作片剂或栓剂时，每个单位剂型中的化合物的量是在1.0-100.0mg范围内。对于片剂和栓剂，药用赋形剂可以是任意药学上合适的基质。

[0084] 因为通式(I)的化合物是水溶性的且亲脂的，它们可以用作水溶液、醇溶液、软膏剂、乳膏剂等。

[0085] 此外，本发明涉及基于前述式(I)化合物的抗微生物治疗剂，和用于治疗由前述细菌和/或微真菌造成的疾病的方法，所述方法包括：给有此需要的患者施用所述式(I)化合物或其药物组合物。

[0086] 所述方法意图用于治疗哺乳动物患者，尤其是人类。式(I)化合物的推荐剂量是0.01-10mg/kg。

[0087] 因为式(I)化合物具有抗细菌和抗真菌活性，它们同样可以用作(或用于)杀菌剂和/或消毒剂。这些药剂可以制备成，例如溶液，其中使用不同的溶剂，诸如水和低级醇(例如，1-丙醇或2-丙醇)。

[0088] 本发明的另一个主题是，新颖的通式(I)的氯高铁血红素衍生物或其异构体或异构体混合物或者其药学上可接受的盐

[0089]

[0090] 其中R1和R2是相同的或不同的，条件是R1和R2二者不同时是-OH，

[0091] 且其中R1和R2中的任一个是-OH，且另一个是-Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Leu)-Trp-(D-Leu)-Trp-NHCH2CH2OH， 其 中δX＝Trp或Phe或Tyr(短杆菌肽D)、-N -环-(Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)2(短杆菌肽S)、-Arg-Gly-Asp-OH或-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-OH；

[0092] 或R1和R 2各 自 是 -NHCH 2CH2OH、-GlyOMe、-NHCH(CH2OH)CH2OH、-NHCH2CH(OH)CH2OH、-Glu(ArgOMe)-ArgOMe、-HA或-Arg-ArgOMe，

[0093] 其中HA是组胺部分

[0094] 且Men+是Fe2+或Fe3+。

[0095] 本发明的另一个方面涉及用于生产上述的新颖的式(I)化合物的方法。

[0096] 通过使在羧基处被活化的氯高铁血红素衍生物与氨基组分反应，生产式(I)化合物。

[0097] 氨基组分可以是：肽、氨基酸(主要是α-氨基酸)或它们的类似物，尤其是Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Leu)-Trp-(D-Leu)-Trp-NHCH2CH2OH，其中X＝Trp或Phe或Tyr(短杆菌肽D)、环-(Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)2(短杆菌肽S)、Arg-Gly-Asp-OH、NH2CH2CH2OH、GlyOMe、NH2CH(CH2OH)CH2OH、-NH2CH2CH(OH)CH2OH、Glu(ArgOMe)-ArgOMe、组胺(HA)、Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-OH和Arg-ArgOMe。

[0098] 优选地，用氯高铁血红素二-N-氧基琥珀酰亚胺酯酰化氨基组分的氨基(例如，氨基酸的α-氨基)；或者，为了制备单氯高铁血红素衍生物，使用氯高铁血红素6(7)-单-N-氧基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺(dicarboximide)酯进行所述酰化；或在吡啶存在下，用在一个羧基处被活化的氯高铁血红素衍生物进行所述酰化，其中所述活化剂是焦碳酸二叔丁酯。在-15℃至+30℃的温度，在DMF中进行该反应0.5-2h。

[0099] 因而，要求保护的是，基于氯高铁血红素衍生物的、具有抗细菌和抗真菌活性的新颖的有效的抗微生物剂。它们的优点包括生物相容性、生物可降解性、对抗性细菌株的活性、无毒性和没有副作用。此外，要求保护的化合物对正常细胞有毒性时的浓度超过它们的MIC(最小抑菌浓度)和MBC(最小杀菌浓度)2-3个数量级。因此，要求保护的化合物非常可能具有宽范围的抗微生物活性，这使得它们作为治疗剂的应用是有前途的。

[0100] 此外，实施例将例证本发明，所述实施例无意以任何方式限制本发明的范围。

[0101] 标志法

[0102] DCC＝N，N′-二环己基碳二亚胺

[0103] DMSO＝二甲亚砜

[0104] DOPC＝二油酰基磷脂酰胆碱

[0105] GrD＝短杆菌肽D

[0106] HA＝组胺

[0107] Hem＝氯高铁血红素部分

[0108] MeOH＝甲醇

[0109] MES＝2-(N-吗啉代)乙磺酸

[0110] MH＝Mueller-Hilton培养基

[0111] OMe＝甲醚

[0112] ONb＝N-氧基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺酯

[0113] OtBu＝叔丁醚

[0114] Z＝苄氧羰基

[0115] DMSO＝二甲基亚砜

[0116] DMF＝N，N′-二甲基甲酰胺

[0117] IR＝红外波谱学

[0118] GI＝生长抑制

[0119] CF＝羧基荧光素

[0120] MBC＝最小杀菌浓度

[0121] MIC＝最小抑菌浓度

[0122] MSC＝最小抑制浓度

[0123] RP-HPLC＝反相高效液相色谱法

[0124] Tris＝三(羟甲基)氨基甲烷

[0125] TLC＝薄层色谱法

[0126] CLF＝氯仿

[0127] EA＝乙酸乙酯

[0128] 除非另有说明，以百分比表示的所有量都是重量百分比。实施例

[0129] 使用的试剂是：购自Bachem(德国)和Reanal(匈牙利)的L-氨基酸和它们的衍生物；DOPC(购自Sigma-Aldrich)；羧基荧光素(Fluka，德国)；MES(Sigma-Aldrich)；Tris(Sigma-Aldrich)；短杆菌肽D(Sigma-Aldrich)；短杆菌肽S(Kraspharma，俄罗斯)；
和分析试剂级(俄罗斯标准)氯化钾(Khimmed，俄罗斯)。

[0130] 除了用于从水溶液中萃取的那些试剂以外，所有溶剂都是无水的。通过在Kieselgel 60F254平板(Merck，德国)上的TLC，在下述的系统中，验证制备的化合物的身份：(1)氯仿-甲醇(9∶1)，(2)氯仿-甲醇(8∶2)，(3)氯仿-甲醇(5∶3)，(4)氯仿-甲醇-醋酸(5∶3∶1)，(5)甲醇-醋酸-水(4∶1∶1)，和(6)丁醇-醋酸-水(4∶1∶1)。用氯-联甲苯胺试剂、茚三酮，或通过在紫外线下的荧光，使色谱图显影。

[0131] 使用基质辅助的激光解吸/电离(TOF MALDI)，在Ultraflex(Bruker，德国)飞行时间质谱仪上得到高分辨率质谱图；使用2，5-二羟基苯甲酸基质。

[0132] 在Magna 750(Nicolet，USA)傅里叶变换波谱仪上记录红外波谱。

[0133] 在Jasco UV/VS 7800型(日本)分光光度计上记录电子光谱。

[0134] 在Gilson 305(Gilson，法国)仪器上进行RP-HPLC。

[0135] 在下述条件下，在Luna 10μ柱、C5反相、250×21.2mm(Phenomenex，USA)上进行制备型RP-HPLC：

[0136] 用在水中的0.1％TFA溶液进行等度洗脱，流速为4mL/min。在220nm的波长记录吸收(7)。

[0137] 在Cary Eclipse(Varian，美国)荧光计上监测来自脂质体的CF释放动力学。

[0138] 使用Avanti(Avanti Polar Lipids，美国)微型挤压机，得到脂质体。

[0139] 实施例1

[0140] 6，7-双(Nα-甘氨酰甲基酯)-氯化血红素IX(化合物XV，R1＝R2＝-GlyOMe)[0141] 向0.030g(0.236mmol)H-GlyOMe·HCl在 1.5mL DMF中 的 悬 浮 液 中，加 入0.033mL(0.236mmol)Et3N，并在室温搅拌3min。向得到的溶液中，加入0.100g(0.118mmol)氯化血红素IX 6，7-二-N-氧基琥珀酰亚胺酯(I)在5mL DMF中的溶液，并在室温搅拌2h。
在条件(1)和(2)下，通过TLC监测反应。在真空下将溶液浓缩至0.5mL，并加入6mL二乙醚。将得到的残余物溶解于CLF中，以沉淀出Et3N·HCl白色晶体，倾析溶液，以去除它们。在真空下去除溶剂。为了导入Cl-抗衡离子，将残余物溶解于15mL CLF-MeOH(8∶2)中，与7.5mL 0.5N盐酸一起摇动2次，并用水洗涤至中性反应物。在真空下去除溶剂。
在装有Kieselgel 60F254硅胶(Merck，德国)的柱(20×2cm)上纯化该物质；洗脱液是CLF-MeOH(8∶2)。收集含有Rf为0.71(2)的物质的级分。在真空下去除溶剂。产量：
-3
0.063g(67％)；Rf：0.26(1)，0.71(2)。电子光谱，λmax，nm，CLF∶MeOH(8∶2)，(ε×10 )：
-1
400(115.9)，508(9.38)，640(3.81)。FT-IR波谱，v，cm ，KBr片(pellet)：1737(CO est.)，+
1648(酰胺I)，1539(酰胺II)。质谱，m/z：[M]758.5。

[0142] 实施例2

[0143] 6，7-二-组胺基-氯化血红素IX(化合物XIX，R1＝R2＝HA)

[0144] 向0.026g(0.236mmol)组胺在1.5mL DMF中的溶液中，加入0.100g(0.118mmol)氯化血红素IX 6，7-二-N-氧基琥珀酰亚胺酯(I)在4mL DMF中的溶液，并在室温搅拌20min。在条件(2)和(3)下，通过TLC监测反应。在真空下将溶液浓缩至1mL，并加入10mL二乙醚。为了导入Cl-抗衡离子，将残余物溶解于4mL MeOH和0.093mL(0.354mmol)中，并加入
3.8N HCl/MeOH来调节pH至4。在30℃在真空下去除溶剂。在装有Kieselgel 60F254硅胶(Merck，德国)的柱(31×2cm)上纯化该物质；洗脱液是CLF-MeOH(5∶3)。收集含有Rf为
0.64(3)的物质的级分。在真空下去除溶剂。产量：0.049g(51％)；Rf：0.25(2)，0.64(3)。
-3
电子光谱，λmax，nm，CLF∶MeOH(8∶2)，(ε×10 )：388(49.1)，508(4.18)，640(1.76)。
-1 +
FT-IR波谱，v，cm ，KBr片：1644(酰胺I)，1543(酰胺II)。质谱，m/z：[M]802.3。

[0145] 实施例3

[0146] 6，7-二[双(Nα-L-精氨酰基甲基酯)-L-谷氨酰基]-氯化血红素IX(化合物XVIII，R1＝R2＝-Glu(ArgOMe)-ArgOMe)

[0147] (1)双(Nα-精氨酰基甲基酯)-L-谷氨酸二盐酸盐

[0148] 向0.069g(0.266mmol)H-ArgOMe·2HCl 在2mL DMF 中 的 悬 浮 液 中，加 入0.074mL(0.531mmol)Et3N，并在室温搅拌5min。向得到的溶液中加入0.077g(0.133mmol)Boc-谷氨酸双(五氟苯基)酯(其已经事先制备)，并在室温搅拌4h。在条件(5)下，通过TLC监测反应。在真空下将溶液浓缩至1mL，并加入10mL二乙醚。通过倾析，从溶剂中分离出油状沉淀物，在真空下去除残余的溶剂。在装有Kieselgel60F254硅胶(Merck，德国)的柱(23×1cm)上纯化该物质；洗脱液是甲醇-醋酸-水(4∶0.5∶0.5)。收集含有Rf为0.67(5)的物质的级分。在真空下去除溶剂。产量：0.073g(77％)；Rf：0.67(5)。[α]
25 -1
D -8.53°(C，0.38；MeOH)。FT-IR波谱，v，cm ，KBr片：1735(CO est.)，1653(酰胺I)，+
1542，1558(酰胺II)。质谱，m/z：[M]588.31。

[0149] 向0.073g(0.0946mmol)双(Nα-精氨酰基甲基酯)-Boc-L-谷氨酸(V)中，倒入6mL～3N HCl/MeOH。将得到的悬浮液在室温搅拌2h。在条件(6)下，通过TLC监测该过程。在完全转化成氨基-未保护的二肽以后，在30℃在真空下去除溶剂。在无水二乙醚下结晶油状残余物；通过倾析分离出溶剂。

[0150] (2)6，7-二[(Nα-L-精氨酰基二-甲基酯)-L-谷氨酰基]-氯化血红素IX(化合物XVIII)

[0151] 向 制 备 的H-Glu(ArgOMe)2·3HCl在 1.5mL DMF中 的 悬 浮 液 中，加 入0.047mL(0.335mmol)Et3N，并在室温搅拌2min。观察到Et3N·HCl沉淀物。向得到的悬浮液中，加入0.047g(0.0558mmol)氯化血红素IX 6，7-二-N-氧基琥珀酰亚胺酯(I)在2mL DMF中的溶液，并在室温搅拌22h。在条件(6)下，通过TLC监测反应。在真空下将溶液浓-
缩至1mL，并加入10mL二乙醚。为了导入Cl抗衡离子，将残余物溶解于4mL MeOH中，并加入3.8N HCl/MeOH来调节pH至4。在30℃在真空下去除溶剂。在装有Sephadex LH-20的柱(13×1cm)上纯化该物质3次；洗脱液是MeOH。收集含有Rf为0.07(6)的物质的级分。在真空下去除溶剂。产量：0.030g(34％)；Rf：0.07(6)；Rf(矾土)：0.70(6)。电子光谱，-3
λmax，nm，CLF∶MeOH(8∶2)，(ε×10 )：400(92.2)，508(6.31)，636(2.39)。FT-IR波谱，-1 +
v，cm ，KBr片：1737(CO est.)，1649(酰胺I)，1528(酰胺II)。质谱，m/z：[M]1554.97。

[0152] 实施例4

[0153] 氯化血红 素IX 6，7-二-N-(2-羟基乙基 )酰胺(化合物XIV，R1＝R2＝-NH-CH2-CH2-OH)

[0154] 向0.050g(0.0591mmol)氯化血红素IX 6，7-二-N-氧基琥珀酰亚胺酯(I)在3mL DMF中的溶液中，加入0.010mL(0.118mmol)氨基乙醇，并在室温搅拌20min。在条件(2)和(3)下，通过TLC监测反应。在真空下将溶液浓缩至1mL，并加入10mL二乙醚。为了导入Cl-抗衡离子，将残余物溶解于3mL MeOH中，并加入3.8N HCl/MeOH来调节pH至4。在30℃在真空下去除溶剂。在装有Kieselgel 60F254硅胶(Merck，德国)的柱(24×1cm)上纯化该物质；洗脱液是CLF-MeOH(5∶3)。收集含有Rf为0.52(3)的物质的级分。在真空下去除溶剂。产量：0.036g(82.5％)；Rf：0.35(2)，0.52(3)。电子光谱，λmax，nm，CLF∶MeOH(8∶2)，-3 -1(ε×10 )：400(183.0)，508(5.23)，640(2.08)。FT-IR波谱，v，cm ，KBr片：1632(酰胺+
I)，1549(酰胺II)。质谱，m/z：[M]702，5。

[0155] 实施例5

[0156] 氯化血红素IX 6，7-二-N-(1，3-二羟基丙-2-基)酰胺(化合物XVI，R1＝R2＝-HN-CH(CH2OH)-CH2OH)

[0157] 向0.050g(0.0591mmol)氯化血红素IX 6，7-二-N-氧基琥珀酰亚胺酯(I)在3mL DMF中的溶液中，加入0.012g(0.118mmol)2-氨基-1，3-丙二醇在0.5mL DMF中的溶液，并在室温搅拌20min。在条件(4)下，通过TLC监测反应。在真空下将溶液浓缩至0.5mL，并-加入6mL二乙醚。为了导入Cl抗衡离子，将残余物溶解于9mL CLF-MeOH(8∶2)中，与
4mL NaCl饱和的0.06N盐酸一起摇动1次，并用水洗涤至中性反应物。在真空下去除溶剂。在装有Sephadex LH-20的柱(21×2cm)上纯化该物质；洗脱液是MeOH。收集含有Rf为0.56(4)的物质的级分。在真空下去除溶剂。产量：0.018g(36％)；Rf：0.56(4)。电子-3
光谱，λmax，nm，CLF∶MeOH(8∶2)，(ε×10 )：400(40.5)，508(2.68)，640(1.02)。FT-IR-1 +
波谱，v，cm ，KBr片：1629(酰胺I)，1550(酰胺II)。质谱，m/z：[M]762，0。

[0158] 实施例6

[0159] 氯化血红素IX 6，7-二-N-(2，3-二羟基丙基)酰胺(化合物XVII，R1＝R2＝-HN-H2C-CH(OH)-CH2OH)

[0160] 向0.050g(0.0591mmol)氯化血红素IX 6，7-二-N-氧基琥珀酰亚胺酯(I)在3mL DMF中的溶液中，加入0.009mL(0.118mmol)3-氨基-1，2-丙二醇，并在室温搅拌20min。在条件(3)和(4)下，通过TLC监测反应。在真空下将溶液浓缩至0.5mL，并加入6mL二乙醚。-
为了导入Cl抗衡离子，将残余物溶解于3mL MeOH中，并加入3.8N HCl/MeOH来调节pH至4。
在30℃在真空下去除溶剂。在装有Kieselgel 60F254硅胶(Merck，德国)的柱(30×2cm)上纯化该物质；洗脱液是CLF-MeOH∶AcOH(5∶3∶0.5)。收集含有Rf为0.69(4)的物质的级分。在真空下去除溶剂。产量：0.023g(46％)；Rf：0.33(3)，0.69(4)。电子光谱，-3
λmax，nm，CLF∶MeOH(8∶2)，(ε×10 )：396-400(24.2)，488(2.14)，600(1.40)。FT-IR-1 +
波谱，v，cm ，KBr片：1634(酰胺I)，1565(酰胺II)。质谱，m/z：[M]762.0。

[0161] 实施例7

[0162] 氯化血红素IX6(7)-单(-Val-Gly-Ala-D-Leu-Ala-D-Val-Val-D-Val-Trp-D-Leu-X-D-Leu-Trp-D-Leu-Trp-NH-CH2CH2OH)酰胺(化合物XII，其中R1和R2之一是-OH，且另一个是-Val-Gly-Ala-D-Leu-Ala-D-Val-Val-D-Val-Trp-D-Leu-X-D-Leu-Trp-D-Leu-Trp-NH-CH2CH2OH，其中X＝Trp，Tyr，Phe)

[0163] 向32mg(0.017mmol)短杆菌肽D在0.650mL无水DMF中的溶液中，加入48μL在甲醇中的1N HCl。将反应混合物在暗处在室温搅拌72h。在30℃在真空下去除溶剂。产+量：30mg(98％)。质谱，m/z：[M]1854，0

[0164] 向30mg(0.016mmol)脱甲酰基化的短杆菌肽D在0.2mL DMF中的溶液中，加入13.2mg(0.016mmol)氯高铁血红素6(7)-单-N-氧基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺酯，并在室温搅拌1.5h。在30℃在真空下去除溶剂。将残余物溶解于氯仿中。在装有Kieselgel
60F254硅胶(Merck，德国)的柱(30×2cm)上纯化残余物；洗脱液是CLF-MeOH(9∶1)。产量：
-1
23.5mg(59％)。FT-IR波谱，v，cm ，KBr片：1634(酰胺I)，1565(酰胺II)。Rf：0.65(1)。

[0165] 实施例8

[0166] 氯化血红素IX 6(7)-单[环(Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)2])酰胺(化合物XIII，δ其中R1和R2之一是-OH，且另一个是-N -[环-(Orn-Leu-D-Ph e-Pro-Val)2])

[0167] 向50mg(0.077mmol)氯高铁血红素在0.5mL无水DMF中的溶液中，加入1mL吡啶和25.3mg(0.116mmol)焦碳酸二叔丁酯，并在室温搅拌15min。同时向93.5mg(0.077mmol)短杆菌肽S二盐酸盐在0.5mL DMF中的悬浮液中，加入22μL(0.154mmol)三乙胺，并搅拌2min。

[0168] 向得到的混合的氯高铁血红素酐中，加入氨基-未保护的短杆菌肽S溶液，并搅拌3h。在30℃在真空下去除溶剂。将残余物溶解于氯仿中。在装有Kieselgel 60F254硅胶(Merck，德国)的柱(30×2cm)上纯化残余物；洗脱液是CLF-MeOH(12∶1)。产量：+ -3
20mg(15％)。质谱，m/z：[M]1739.5.电子光谱，λmax，nm，氯仿∶甲醇(4∶1)，(ε×10 )：
400(105)，492(10.6)，640(6)。

[0169] 实施例9

[0170] 6(7)-单(Arg-Gly-Asp)-氯化血红素IX(化合物XI，其中R1和R2之一是-OH，且另一个是-Arg-Gly-Asp-OH)

[0171] 向20mg(0.038mmol)Arg-Gly-Asp·CH3COOH·CF3COOH在0.5mL DMF中的悬浮液中，加入5μL(0.038mmol)三乙胺，并搅拌2min。然后，加入62μL(0.251mmol)二-(O，N-三甲基甲硅烷基)乙酰胺，并在室温搅拌30min。向得到的悬浮液中，加入32mg(0.038mmol)氯化血红素IX 6，7-二-N-氧基琥珀酰亚胺酯，将反应混合物搅拌6h。然后，在真空下去除溶剂，将沉淀物溶解于甲醇中，以将三肽的羧基脱甲硅烷基化。从甲醇中结晶目标产物。产+量：20mg(54％)。质谱，m/z：[M]981.3。

[0172] 实施例10

[0173] Nα-[6(7)-(氯化血红素IX)-基]-ArgArgTrpTrpArgPhe-OH(化合物XX，其中R1和R2之一是-OH，且另一个是-ArgArgTrpTrpArgPhe-OH)

[0174] (a)ArgArgTrpTrpArgPhe-OH(化合物XXI)在2-氯三苯甲基氯聚合物上的固相合成

[0175] 起始氨基酸的连接程度的测定。将0.1g聚合物(含有1.43mmol反应基团，并在5mL二氯乙烷中预溶胀)加入新鲜制备的0.044g(0.1143mmol)Fmoc-Phe-OH和0.040mL(0.286mmol)三乙胺在2mL二氯乙烷中的溶液中，并在25℃用空气搅拌25min。通过加入2mL甲醇-三乙胺(9∶1)，停止反应，将该混合物搅拌1min。滤出肽基聚合物，用二氯乙烷(2min×3)、DMF(2min×2)、异丙醇(2min×2)、DMF(2min×2)、异丙醇(2min×2)、甲醇(2min×1)和二乙醚(2min×2)洗涤，并通过水力喷射进行真空干燥。通过分光光度计法，测定树脂取代程度。向10mg如此制备的Fmoc-Phe聚合物中，加入1mL哌啶在DMF中的
20％溶液，并在25℃搅拌20min。滤出树脂，取出滤液等分试样，在289nm测量产物N-(9-芴基甲基)哌啶的溶液的光吸收。从下式计算树脂取代程度

[0176] c＝A289×V×W/5800，

[0177] 其中c是聚合物中的活性基含量，A289是该溶液相对于参照物的光密度，W是聚合物样品的重量(mg)，5800是N-(9-芴基甲基)哌啶的摩尔吸光系数。聚合物的Fmoc-Phe含量是0.3mmol/g。

[0178] 向0.331g聚合物(含有0.099mmol Cl，并在3.3mL二氯乙烷中预溶胀)中，加入新鲜制备的0.115g(0.3mmol)Fmoc-Phe-OH和0.034mL(0.25mmol)三乙胺在0.6mL二氯乙烷中的溶液，并在25℃搅拌25min。通过加入6mL甲醇-三乙胺(9∶1)，停止反应，将该混合物搅拌1min。滤出肽基聚合物，用二氯乙烷(2min×3)、DMF(2min×2)、异丙醇(2min×2)、DMF(2min×2)、异丙醇(2min×2)、甲醇(2min×1)和二乙醚(2min×2)洗涤。每份洗涤溶液是2mL。合成循环包括：(1)用在1mL DMF中的DIC(3当量)和HOBt(3.6当量)活化要连接的Fmoc氨基酸(3当量)10-min；(2)通过暴露于哌啶在DMF中的20％溶液(3mL×3)30min，去封闭α-氨基；(3)用DMF(1.5mL×8×3min)洗涤肽基聚合物；(4)用HOBt(3.6当量)在1.5mL DMF中的溶液额外洗涤肽基聚合物3min；(5)使活化的Fmoc氨基酸(3当量)与肽基聚合物缩合24h；(6)用DMF(1.5mL×2×2min)洗涤肽基聚合物；和(7)在连接每个接下来的Fmoc氨基酸以后，通过茚三酮试验，监测氨基取代的完成；如果该试验是阳性的，重复
2 3 4 5 6
缩合步骤。对于下述氨基酸，进行2个缩合步骤：Arg、Trp、Trp、Arg和Arg 。

[0179] H-ArgArgTrpTrpArgPhe-OH合成条件

[0180]

[0181]

[0182] ＊在反应之前，通过加入1当量的12NHCl水溶液，将DMF中的

[0183] Fmoc-Arg-OH侧官能团(side function)转化成盐酸盐。在真空下馏出溶剂；

[0184] 经NaOH干燥。

[0185] 在合成结束并去封闭α-氨基以后，用DMF(1mL×8×2min)、然后用在1mL DMF中的HOBt(3.6当量)洗涤0.143g肽基聚合物。

[0186] (b)Nα-[6(7)-(氯化血红素IX)-基]-ArgArgTrpTrpArgPhe-OH(化合物XX)[0187] 向0.29g具有切断的Fmoc保护的肽基聚合物(XX)中，加入在4.5mL DMF中的3当量的氯化血红素IX 6(7)-单-N-氧基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺酯(II)，搅拌5h，并在室温静置24h。分离氯高铁血红素肽基聚合物，并用DMF(2mL×7×3min)洗涤。茚三酮试验是阴性的。用DCM(2mL×2×2min)洗涤氯高铁血红素肽基聚合物，用水喷射泵真空干燥，加入4.5mL TFA-TFE-DCM(1∶1∶8)，然后在氮气氛下搅拌3h。分离聚合物，并用TFA-TFE-DCM(1∶1∶8)(1mL×4×1min)洗涤。与冷的无水二乙醚(10-12倍体积过量)一起研磨残余物；滤出沉淀物，用二乙醚洗涤2次，并真空干燥。在装有Sephadex LH-20的柱(150×20mm)上纯化产物；用甲醇-水(20∶1)洗脱目标产物。产量：0.027g(25％)。-3 -1 -1
Rf：0.5(6)。电子光谱(甲醇)，λmax，nm(ε×10 ，M cm )：393.4(65.8)，474.8(8.7)，+
578.0(3.61)，607.2(3，19)。质谱，m/z：1605[M](计算值：1603.5)。

[0188] 实施例11

[0189] 6，7-二[(Nα-L-精氨酰基甲基酯)-L-精氨酰基]-氯化血红素IX(化合物XXI，R1＝R2＝-Arg-ArgOMe)

[0190] (a)Nα，NG，NG-三苄氧基羰基精氨酸N-氧基琥珀酰亚胺酯

[0191] 向0.410g(0.709mmol)Z3ArgOH在5mL CLF(无水)中的溶液中，加入在1mL DMF中的0.0816g(0.709mmol)N-氧基琥珀酰亚胺。将反应混合物冷却至-10℃，滴加在5mL CLF中的0.146g(0.709mmol)DCC 10min。将反应混合物在0℃搅拌2h，然后在室温搅拌5h，并在4-5℃的温度静置17h。在条件(11)下，通过TLC监测反应。通过双重过滤，分离DCU沉淀物；在真空下去除溶剂。用石油醚从乙酸乙酯中结晶残余物。在真空下经无水CaCl2干燥固-1
体残余物。产量：0.380g(81％)；Rf：0.68(11)。FT-IR波谱，v，cm ，KBr片：1742(CO est.)，+
1610(OCONH)，1541(OCONH)，1262(arom.)。质谱，m/z：[M]673.7.In[106]：mp 85-86.[α]
25
D -9.7°(C2；二噁烷)。

[0192] (b)Nα，NG，NG-三苄氧基羰基精氨酰基精氨酸甲基酯

[0193] 向0.023g(0.0890mmol)H-ArgOMe·2HCl在 2mL DMF中 的 悬 浮 液 中，加 入0.024mL(0.178mmol)Et3N，并在室温搅拌5min。向得到的溶液中，加入0.060g(0.890mmol)α G G
事先制备的N ，N，N-三苄氧基羰基精氨酸的N-氧基琥珀酰亚胺酯(其与1.5mL DMF混合)，并在室温搅拌22h。在条件(2)下，通过TLC监测反应。在真空下将溶剂浓缩至1mL，并加入10mL二乙醚。通过倾析，从溶剂分离出油状沉淀物；在真空下去除残余的溶剂。将残余物溶解于15mL CLF∶MeOH(8∶2)中，并用水洗涤。在真空下去除有机层。通过在Kieselgel 60F254硅胶(Merck，德国)(8×3cm)上的柱色谱法，纯化该物质；洗脱液是CLF-MeOH(9∶1)。收集含有Rf为0.48(2)的物质的级分。在真空下去除溶剂。产量：
-1
0.056g(78％)；Rf：0.48(2)。FT-IR波谱，v，cm ，KBr片：1727(CO est.)，1642(酰胺I)，+
1548(酰胺II)。质谱，m/z：[M]748。

[0194] (c)6，7-二[(Nα-L-精氨酰基甲基酯)-L-精氨酰基]-氯化血红素IX

[0195] 向0.054g(0.0511mmol)Nα-精氨酰基-Z3-精氨酸甲基酯中，倒入8mL甲醇-醋酸-水(6∶1∶1)。向该溶液中，加入钯催化剂，并在室温进行氢化1h，在系统(2)中通过TLC监测反应。当反应结束时，滤出催化剂，并用水洗涤；在40℃在真空下去除溶剂。向制备的H-ArgArgOMe·3CH3COOH在2mL DMF中的悬浮液中，加入0.0216mL(0.1542mmol)Et3N，并在室温搅拌2min。观察到Et3N·HCl沉淀物。向得到的悬浮液中，加入0.022g(0.0257mmol)氯化血红素IX 6，7-二-N-氧基琥珀酰亚胺酯(I)在1mL DMF中的溶液，并在室温搅拌3.5h。在条件(5)下，通过TLC监测反应。在真空下将溶液浓缩至1mL，-
并加入7mL二乙醚。为了导入Cl抗衡离子，将残余物溶解于15mLCLF-MeOH(8∶2)中，与7.5mL 0.1N盐酸一起摇动2次，并用水洗涤至中性反应物。在真空下去除溶剂。通过在Kieselgel 60F254硅胶(Merck，德国)(11×14cm)上的制备型TLC纯化该物质；洗脱液是MeOH∶AcOH∶H2O(4∶1∶1)。产量：0.015g(40％)。Rf：0.1(5)。电子光谱，λmax，nm，-3 -1
CLF∶MeOH(8∶2)，(ε×10 )：400(79.2)，478(5.72)，596(3.41)。FT-IR波谱，v，cm ，+
KBr片：1739(CO est.)，1642(酰胺I)，1531(酰胺II)。质谱，m/z：[M]1270.4。

[0196] 实施例12

[0197] 通式(I)的氯高铁血红素衍生物对脂膜的破坏效应研究

[0198] 在研究氯高铁血红素衍生物对脂膜的渗透性的影响时，如在[Y.N.Antonenko，T.B.Stoilova，S.I.Kovalchuk，等 人，“Large Unselective Pore in Lipid Bilayer Membrane Formed by Positively Charged Peptides Containing a Sequence of Gramicidin A，”FEBS Letters，2005，Vol.579，第5247-5252页]中所述，测量这些衍生物诱导的羧基荧光素(CF)从装载了羧基荧光素的脂质体的释放。使用浓度为20mg/mL的DOPC在氯仿中的储备溶液，制备脂质体。在氮流下浓缩200-μL份的储备溶液；加入0.4-mL份的含有10mM Tris、10mM MES、100mM KCl和100mM CF的缓冲溶液；将混合物摇动2min，然后进行3个冷冻/融化循环，在每个循环结束后进行摇动。使用Avanti(Avanti Polar Lipids，美国)微型挤压机，通过孔径为0.1μm的聚碳酸酯滤器，挤压得到的多层脂质体的混合物。通过在Sephadex G-50上的凝胶色谱法，分离未包含进脂质体中的CF。将Sephadex放在水中溶胀过夜。给20-mL柱装载溶胀的Sephadex，然后用60mL含有10mMTris、10mM MES和
100mM KCl的缓冲液(缓冲液A)平衡。含有CF的脂质体悬浮液的体积是500μL(脂质浓度是0.045mg/mL)。将该悬浮液置于池中，用缓冲液A调节体积至2mL。向得到的脂质体悬-4
浮液中，加入10μL通式(I)的氯高铁血红素衍生物在DMSO中的10 M溶液。通过荧光测定法监测CF释放动力学。在490nm的波长激发羧基荧光素荧光，并在520nm检测(2个裂缝各自5nm宽)。从下式计算在特定时刻从脂质体释放出的染料的相对量：

[0199] α＝(Ff-F0)/(Fm-F0)，

[0200] 其中F0和Ff分别是在加入肽之前和之后的荧光水平；Fm是在用去污剂Triton X-100完全破坏脂质体以后的荧光值，所述去污剂加入至2.4％(按重量计算)的终浓度。

[0201] 图1显示了对于10∶1(mol/mol)的脂质/氯高铁血红素衍生物比，在通式(I)的氯高铁血红素衍生物影响下羧基荧光素从脂质体释放的动力学。

[0202] 实施例13

[0203] 通式(I)化合物的抗细菌活性研究

[0204] 测定了化合物针对枯草芽孢杆菌BKM B-501、金黄色葡萄球菌209P、粪肠球菌BKM B-871和藤黄微球菌BKM Ac-2230株(来自位于俄罗斯科学院微生物生化和生理学研究所的全俄罗斯微生物保藏中心(All-Russia Collection of Microorganisms at the Institute for Biochemistry and Physiology of Microorganisms，Russian Academy of Sciences))的抗细菌活性。表征抗细菌活性的主要参数是最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。MIC是完全抑制细菌在液体培养基中的繁殖的受试化合物的最低浓度。MBC是造成所有细胞死亡的最低浓度。

[0205] 使用改进的规程[Amsterdam，D.，“Susceptibility Testing of Antimicrobials in Liquid Media，”见：Antibiotics in Laboratory Medicine，Loman，V.编，第4版，巴尔的摩：Williams和Wilkins，1996，第52-111页]，通过用化合物的系列稀释物抑制培养物在液体培养基中的生长，定量MIC。

[0206] 在37℃、100％湿度，并在搅拌下，在MH液体培养基(Mueller-Hinton培养基：干燥的牛肉汤提取物，4g/L；淀粉，1.5g/L；酪蛋白水解产物，17.5g/L；Sigma-Fluka目录号70192)上，培养细菌，并进行测试。将处于指数生长期的培养物(融化后第4次至第7次重新接种)用于实验。

[0207] 除了短杆菌肽D以外，所有受试化合物吸收595nm的光，该波长用于评价细菌培养物生长。因此，在估测每种化合物在细菌悬浮液中的光密度上，进行吸收校正，以补偿它在孔中的浓度。使用下述方程式，从在595nm波长在每个孔中测得的光密度(A)，得到在用受试化合物温育细胞20小时以后的细菌生长抑制百分比(GI)

[0208] GIi＝[(Act-Ac0)-(Ait-Ai0)]×100/(Act-Ac0)，(1)

[0209] 其中下标具有下述含义：i表示孔编号，c表示没有加入受试化合物的含有细菌的对照孔，0表示在受试化合物加入孔中以后立即进行的测量，t表示在受试化合物加入以后20小时进行的测量。

[0210] 受试化合物的实验性抗细菌活性测定方案如下。快速解冻在液氮中保存的装有实验株培养物(枯草芽孢杆菌BKM B-501、金黄色葡萄球菌209P、粪肠球菌BKM B-871或藤黄微球菌BKM Ac-2230，在含有7％DMSO的培养基中)的冷冻小瓶，用100μL细胞悬浮液接种1.5mL新鲜的MH培养基。在37℃培养细胞1天，并在150rpm在定轨摇床上摇动。如下验证菌株的形态特征，且没有外来细菌的污染：(a)接种到加入琼脂的(15g/L琼脂)MH培养基上，并观察生长的菌落的形状和颜色；(b)在配有40×物镜的显微镜(Mikmed-2，LOMO，俄罗斯)下，检查特有的形态特征。此外，在搅拌下在37℃在1mL液体MH培养基中培养细菌。每天重新接种细胞。从第3次重新接种开始，将细胞培养物用于实验中，并在第6次重新接种时结束。

[0211] 为了测试，将5μL处于静止生长期的细菌悬浮液转移至1mL无菌MH培养基，并温育至达到指数生长期(3-5h，37℃，在150rpm搅拌)。为了估测微生物浓度，在595nm波长测量得到的细菌培养物的光密度(A)。将从96-孔板中的200-μL份的细胞悬浮液测得8
的A＝0.2的值(并校正培养基吸收)设定成与使用的两种菌株的4×10细胞/mL相对
4 5
应。考虑到细胞浓度测量，用MH培养基稀释悬浮液为5×10至1×10 细胞/mL的浓度，并以100μL/孔的量转移至无菌的96-孔板。然后，给细胞添加受试化合物，并在平板孔中-4
制备这些化合物的2倍系列稀释物。所述系列中的化合物的最大浓度是10 M；最小浓度是-6
1.6×10 M。对于每种化合物，一式两份地进行抗细菌活性研究，并取结果的平均值。

[0212] 使用的对照是：100μL没有添加剂的细菌培养物(4个孔)；加入了1％DMSO或水的细菌培养物，其体积与装有最大浓度的受试化合物的孔相同(4个孔)；和100μL没有细菌且没有受试化合物的无菌MH培养基，用作平板中的偶然污染的对照(4个孔)。

[0213] 在加入化合物以后，立即使用Uniplan(Picon，俄罗斯)平板光度计，测量每个孔中的Ai0，并测量对照孔中的Ac0(这2个值是方程式(1)的计算所必需的)。在37℃温育平板20h，并在150rpm搅拌。然后，测量每个孔中的Ait和对照孔中的Act，并从方程式(1)计算细菌生长抑制。将MIC测定为，生长抑制是100％时的受试化合物的最低浓度。

[0214] 在MBC测定中，将来自其中受试化合物浓度等于MIC、MIC×2或MIC×4的孔的培养基转移至装有加入琼脂的MH培养基(15g/L琼脂)的培养皿中，并使用无菌铲，将其均匀地分布在培养皿范围上。将培养皿温育2天。将MBC测定为，在培养皿上不生长菌落时的受试化合物的最低浓度。

[0215] 以2天间隔重复所有抗细菌活性实验，以便评价细菌细胞对受试化合物的抗性的变异性。

[0216] 表1通式(I)化合物对革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌

[0217] BKM B-501的抗细菌活性特征

[0218]化合物 MIC，μM MBC，μM
V 19±7 38±13
VI 38±13 75±25
VII 3.1±0.8 3.1±0.8
VIII 6.3±1.6 9±4
IX 50±13 100±25
XI 12.5±4 25±7
XII 38±13 38±13
XIV 1.6±0.4 6.3±1.6
XV 12.5±4 25±7
XVI ＞200 ＞200
XVII ＞200 ＞200
XVIII 1.6±0.41 未达到
XIX 100±25 未达到
Hem 13±4 50±13
短杆菌肽S 2.5 5

[0219] 表2通式(I)化合物对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌209P的抗细菌活性特征[0220]化合物 MIC，μM MBC，μM
V 50 ＞4002
VII 50 200
VIII 25 200
IX 100 400
XI 12.5 未达到
XII 50 ＞502
XIV 1.6 3.2
XV 50 50
XVI ＞200 ＞200
XVII ＞200 ＞200
XVIII 6.3 ＞502
XIX 200 未达到
Hem 100 200
短杆菌肽S 0.8 3.1

[0221] 表3通式(I)化合物对革兰氏阳性细菌粪肠球菌BKM B-871的抗细菌活性特征[0222]化合物 MIC，μM MBC，μM
V 100 400
VII 50 400
VIII 12.5 25
IX 200 ＞4003
XI 100 未达到
XII 50 ＞503
XIV 25 100
XV 100 未达到

[0223]XVI ＞200 ＞200
XVII ＞200 ＞200
XVIII 12.5 ＞503
XIX 200 未达到
Hem 1000 ＞1000
短杆菌肽S 3.1 6.3

[0224] 表4通式(I)化合物对革兰氏阳性细菌藤黄微球菌BKM Ac-2230的抗细菌活性特征

[0225]化合物 MIC，μM MBC，μM
V 3.1 6.3
VI 25 25
VII 1.6 6.3
VIII 6.3 12.5
IX 6.3 25
XI 50 200
XII 1.6 ＞6.33
XIV 0.8 1.6
XV 1.6 6.5
XVI ＞200 ＞200
XVII ＞200 ＞200
XVIII 3.1 12.5
XIX 25 25
Hem 12.5 25
短杆菌肽S 0.4 0.8

[0226] 表1-4的注解1

[0227] 该化合物具有抑菌效应：它在指定的浓度抑制细菌的繁殖，但是不会杀死它们。2，3

[0228] 没有达到MBC。该值是所述化合物的最大使用浓度。

[0229] 因而，化合物VII、VIII和XVIII在最高50μM的浓度抑制革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌的生长(表2)。

[0230] 藤黄微球菌细菌对考虑的化合物是高度敏感的。化合物V、VI、VII、VIII、IX、氯高铁血红素、GrD和短杆菌肽S在最高30μM的浓度抑制藤黄微球菌的生长。对于化合物V、VII、VIII、GrD和短杆菌肽S(表4)，MIC稍低(低于10μM)。Hem和化合物VI的活性稍低(MIC分别为12.5和25μM)。所有受试化合物对藤黄微球菌都有杀菌作用，它们的MBC不超过30μM。

[0231] 粪肠球菌(平均而言)比藤黄微球菌或金黄色葡萄球菌更能耐受所考虑的化合物。化合物XVIII具有对粪肠球菌的最高效力：MIC＝12.5μM。

[0232] 所有受试化合物都对革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌有活性。化合物VII和XVIII在这点上最有活性(它们的MIC小于10μM)。

[0233] 实施例14

[0234] 氯高铁血红素衍生物对抗性细菌株的比活测定

[0235] 材料和方法

[0236] 受测试剂是水溶性的氯高铁血红素衍生物(化合物VII和XVIII)或DMSO可溶性的衍生物(化合物VIII、XV和XIV)。万古霉素是参比化合物。一式三份地测试每种化合物。

[0237] 在研究中使用无菌的一次性使用的平底96-孔平板、培养皿、吸液管、尖头和试管(Pan-Eco，莫斯科)。

[0238] 使用的营养培养基如下。从干燥培养基(Mueller Hinton培养液，Acumedia，巴尔的摩)制备Mueller Hinton工作培养液，并通过高压蒸汽灭菌法在121℃灭菌15min。

[0239] 在Tripticase Soy Agar(BBL)可商业得到的干燥培养基上培养金黄色葡萄球菌。在Columbia Agar Base(BBL)可商业得到的干燥培养基上培养粪肠球菌。通过高压蒸汽灭菌法在121℃灭菌这些培养基15min。

[0240] 抗性实验细菌株

[0241] 革兰氏阳性菌株：

[0242] 金黄色葡萄球菌No.25923ATCC(美国典型培养物保藏中心)；

[0243] 金黄色葡萄球菌No.100KC；

[0244] 表皮葡萄球菌No.533；

[0245] 粪肠球菌No.559；

[0246] 屎肠球菌No.569。

[0247] 细菌接种物是固定的，等于5×105CFU/mL。

[0248] 结果的平均值显示在下表中。

[0249] 实验方法

[0250] 对于水溶性的化合物，以15μL/孔的量，向第2-8个孔中加入溶剂(水)，然后向3
第1个孔中加入30μL受试化合物在水中的储备溶液，其浓度为1×10M，并通过系列2倍
3
稀释，将浓度调节至0.007×10M。从每个孔取出10-μL份，向每个孔中加入190μL细菌
5
培养物(10CFU)。

[0251] 对于DMSO可溶性的化合物，以10μL/孔的量，向第2-8个孔中加入溶剂(DMSO)，3
然后向第1个孔中加入20μL受试化合物在水中的储备溶液，其浓度为5×10M，并通过系
3
列2倍稀释，将浓度调节至0.039×10M。从每个孔取出2-μL份，向每个孔中加入198μL
5
细菌培养物(10CFU)。

[0252] 对照包含没有受试化合物的孔(培养物生长对照)。另外，使用营养培养基和溶剂的纯度对照。在恒温器中在36℃温育平板24小时。

[0253] 通过对比在有和没有受试化合物存在下的微生物生长情况，视觉地评价培养物生长。将MSC(最小压制浓度)设定为等于抑制细菌培养物生长的受测试剂的最后一个稀释度。

[0254] ///结果显示在下表中。

[0255] 表5氯高铁血红素衍生物对Gr+株的MIC(×10-5M)

[0256]

[0257] 表6万古霉素对Gr+和Gr-株的MIC(μg/mL)

[0258]细菌株 万古霉素
金黄色葡萄球菌No.25923ATCC 1,0
金黄色葡萄球菌No.100KC 1,0
表皮葡萄球菌No.533 1,0
粪肠球菌No.559 1,0
屎肠球菌No.569 ＞32,0

[0259] 因而，通式(I)的氯高铁血红素衍生物对抗性的Gr+细菌株具有不同程度的活性。

[0260] 实施例15

[0261] 通式(I)化合物的溶血活性测定方案

[0262] 在溶血活性研究中使用使用新鲜的人毛细血管血液。将溶血效力测定为，对于7
(1.0±0.1)×10细胞/mL的起始红细胞密度，在用试剂温育(37℃，5％CO2，100％湿度，在定轨摇床上搅拌)3h以后，从红细胞释放进RPMI-1640培养基(不含有酚红，且加入10％胎牛血清和20mM L-谷氨酰胺)中的血红蛋白。

[0263] 溶血活性的特征在于，从红细胞释放到外部培养基中的血红蛋白级分。通过离心，分离红细胞、红细胞影和含有未释放的血红蛋白的中间物质。通过上清液在414nm波长(接近血红素的索雷谱带最大值)处的吸收，定量血红蛋白。

[0264] 因为除了GrD以外的所有受试化合物吸收在该波长的光，在计算血红蛋白释放分数(fraction)时，校正每种化合物的吸收，以补偿(account for)它的浓度。使用下述方程式，从在414nm波长测得的光密度(A)，计算血红蛋白释放(HR)百分比：

[0265] HR＝[(Aei-Ae0)-(Ami-Am0)]×100/(Aet-Ae0)，(2)

[0266] 其中下标具有下述含义：e表示含有红细胞的样品的上清液，i表示加入的受试化合物的浓度，o表示没有加入化合物的样品的上清液，m表示没有红细胞的溶液，t表示其中红细胞裂解为100％的样品的上清液。血红蛋白释放分数等于裂解的红细胞分数，条件是，裂解是完全的，也就是说，在裂解以后，在红细胞中包含的所有血红蛋白都离开它。

[0267] 对于每种化合物，一式两份地进行溶血活性研究，并取结果的平均值。

[0268] 溶血活性测定的实验方案如下。从健康供体的手指收集血液(100μL)到装有0.9mL RPMI-1640培养基(没有酚红)和肝素(10单位/mL)的试管中。通过在200×g离心5min，使细胞沉淀，并转移至10mL RPMI-1640培养基(没有酚红，加入10％胎牛血清和
20mM L-谷氨酰胺；在下文中称作完全培养基)。通过使用Mikmed-2(LOMO，俄罗斯)显微镜在Goryachev氏室中计数，测定悬浮液中的红细胞密度，并用完全培养基稀释该悬浮液
7
至(2±0.2)×10细胞/mL。

[0269] 通过系列2倍稀释(最大浓度：200μM；最小浓度：1.6μM；体积：75μL)，制备受试化合物在完全培养基中的系列溶液。向制备的溶液中，快速地加入75μL密度为7
(2±0.2)×10细胞/mL的红细胞悬浮液。

[0270] 如下制备阴性对照。向75μL密度为(2±0.2)×107细胞/mL的红细胞悬浮液中，加入：(a)75μL完全培养基(4个样品)，(b)60μL完全培养基和15μL水(4个样品)，或(c)73.5μL完全培养基和1.5μL DMSO(4个样品)。为了测定100％血红蛋白释放(阳性对照；4个样品)，通过离心(5min，200×g)，使来自75-μL份的悬浮液的红细胞沉淀，将沉淀物重新悬浮于去离子水(50μL)中，在裂解结束后，用完全培养基调节样品体积至150μL。

[0271] 在37℃、5％CO2、100％湿度，并在150rpm搅拌下，温育所有样品(除了阳性对照以外)3h。然后，在2700g离心所有样品5min。向96-孔板的每个孔中，转移130μL来自每个样品的上清液。此后，使用Uniplan(Picon，俄罗斯)光度测定分析仪，在414nm波长测量平板的孔中的光密度。从关系(2)计算血红蛋白释放。图2显示了氯高铁血红素衍生物和参比化合物(短杆菌肽S、短杆菌肽D和氯高铁血红素)的溶血活性。将数据表示为2个副本的平均值±标准差。

[0272] 图2.

[0273] 在它的浓度是100μM之前，化合物XII没有表现出溶血活性。化合物V、VI、VIII、IX和XVIII具有低溶血活性(图2)；所有合成的化合物的溶血效力都低于氯高铁血红素，甚至对于最大浓度的化合物(100μM)，也是非常低的。

[0274] 实施例16

[0275] 通式(I)化合物对人白细胞的细胞毒性活性研究

[0276] 使用从健康供体新鲜收集的静脉血，通过自然沉积，从人血液中分离出总白细胞。

[0277] 将加入了10单位/mL的肝素的血液(10mL)在暗处在15-18℃的温度暴露2.5h。将淡色的液体上清液(4mL)收集到沉积红细胞层的上面，用平衡的Hank’s盐溶液洗涤3次，并重新悬浮于RPMI-1640培养基(加入8％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和10mM HEPES；
在下文中称作完全培养基)中。

[0278] 通过在Goryachev氏室中计数，测定悬浮液中的白细胞和红细胞的浓度，此后，用6
完全培养基调节悬浮液至(1.0±0.1)×10细胞/mL的白细胞浓度。用于测量的血细胞悬浮液中的红细胞浓度不超过白细胞浓度的30％。

[0279] 为了测定受试化合物对人白细胞的细胞毒性，将细胞悬浮液转移至无菌96-孔平板的孔中，加入系列2倍稀释的受试化合物(测试浓度范围是：3.2-100μM的GrD和短杆菌肽S；8-500μM的化合物XIII；和8-1000μM的化合物V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIV、XV、XIX和Hem)，小心地搅拌混合物。一式两份地进行实验。

[0280] 向作为对照的细胞添加等量的用于制备受试化合物的溶剂，即：水(对于化合物VII和X)；DMSO的水溶液(对于化合物V、VI、VIII和IX)；和DMSO(对于GrD、短杆菌肽S、Hem、XI、XIII、XIV、XV和XIX)。一份额外的对照是没有添加剂的白细胞悬浮液。

[0281] 用受试化合物温育(37℃，5％CO2，100％湿度)细胞3h。使用荧光显微术，定量白细胞死亡值。使用碘化丙啶(它只会渗入死细胞的细胞核中)和Hoechst 33342(它染色所有细胞核)进行染色，以识别死细胞和活细胞。与碘化丙啶和Hoechst 33342一起在平板中温育(37℃，5％CO2)细胞15min，然后将平板置于显微镜下进行分析。

[0282] 使用配有10×物镜(Plan-Neofluar 10×/0.3)的Axio Observer(Zeiss，德国)荧光显微镜，从在蓝色(Hoechst 33342)和红色(碘化丙啶)光谱范围中得到的细胞的荧光图像，得到死细胞分数。使用下述的荧光滤光器集合。对于碘化丙啶：530/585-nm带通激发滤光器，600-nm截止分光镜，和615-nm长通屏障滤光器(用于分析)。对于Hoechst33342：359/372-nm带通激发滤光器，395-nm截止分光镜，和397-nm长通屏障滤光器(用于分析)。

[0283] 数字照相机记录3类细胞图像：(a)在透射的白光中的图像，(b)用紫外激发得到的蓝色荧光图像，和(c)用绿光激发得到的红色荧光图像。对于每个孔，在孔的不同区域中的至少4个视野拍照。对于受试化合物的每个浓度，取1000-1500个细胞的分析结果的平均值。

[0284] 表7通式(I)化合物对人白细胞的细胞毒性活性

[0285]

[0286] 浓度最高为1mM的化合物V、VII、VIII、IX和X没有造成人血液白细胞的死亡。短杆菌肽S和化合物XI在DMSO中的溶液的微小毒性效应，完全是由于溶剂(DMSO)的毒性效应。对于化合物VI、XIII、XIV、XV和XIX，发现弱毒性效应出现在接近1mM的浓度(对于化合物XIV、XV和XIX)和大于125μM的浓度(对于化合物VI和XIII)。与要求保护的化合物相比，参比化合物(氯高铁血红素)对白细胞的毒性明显更高(40％相对于3-17％；表7)。

[0287] ///所述结果证实了要求保护的化合物用于制备它们的基本上无毒的生物相容的抗微生物剂的前景，尤其是用于预防和治疗由不同的革兰氏阳性细菌(特别是抗性菌株)造成的疾病的前景。

[0288] 实施例17

[0289] 通式(I)化合物的抗真菌活性研究

[0290] 作用对象是新型隐球菌No.3465保藏株细胞和白色念珠菌No.927保藏株细胞，所述细胞在32℃在葡萄糖-蛋白胨-酵母培养基上培养1天。参比化合物是下述的抗真菌剂：那他霉素、两性霉素和氟康唑。

[0291] 在圆底96-孔平板(Lenmedpolimer)上一式两份地进行实验。向第1列(0)中，加入10μL水溶性试剂的储备溶液，浓度为10-2-10-3mol/L；向第2列中，也加入相同的10μL+10μL与给定的化合物相对应的溶剂，悬浮，并将10μL转移至下一孔，以此类推，直到行的第8个孔。在DMSO中制备水不溶性的通式(I)化合物(化合物V、VIII、XII、XIII、XIV和氯高铁血红素)的储备溶液，并用DMSO和培养基稀释。孔中反应混合物的DMSO浓度≤5％。

[0292] 然后，向每个孔中加入190μL在合成的营养培养基中的新型隐球菌细胞培养物悬浮液(使得最终的细胞浓度是大约103CFU/mL)，该培养基含有溴甲酚蓝作为pH-指示剂(pH：5.5；指示剂颜色：蓝色)。随着pH降低至4.5，培养物中的指示剂的颜色变成黄色，从而指示真菌细胞生长。该合成的培养基包含下述的组分：盐、氨基酸、微量元素、维生素、抗生素和葡萄糖(共30种组分)[Yarrow，D.，“Methods for the Isolation，Maintenance and Identification of Yeasts，”见：The Yeasts.A Taxonomic Study，Kurtsman，C.P，和Fell，J.W.编，Elsevier，1998，第77-100页]。在接种新型隐球菌细胞悬浮液以后，在搅拌下在32℃温育平板1h，然后转移至静止恒温器，并在27℃温育2天和5天。在接种白色念珠菌细胞悬浮液以后，在搅拌下在32℃温育平板1h，然后转移至静止恒温器，并在27℃温育1天和4天。

[0293] 结果显示在下面的表8和9中。

[0294] 表8在有通式(I)化合物存在下的新型隐球菌培养物生长

[0295]

[0296] (-)没有生长；指示剂是蓝色；

[0297] (±)弱生长；指示剂是黄色，但是生长的细胞的沉淀物呈扩散斑点；

[0298] (+)强生长；指示剂是黄色，并且细胞沉淀物呈紧凑斑点；

[0299] ＊在第2天，在第6个孔之前观察到蓝色，但是小沉淀物出现在底部；在第5天，黄色出现；

[0300] ＊＊在第0个孔中的试剂浓度是5.00×10-4M。

[0301] 表9在有通式(I)化合物存在下的白色念珠菌培养物生长

[0302]

[0303]

[0304] 在暴露于通式(I)化合物以后第1-4天进行的来自孔的对照接种，证实了浓度为约5×10-5M的化合物XVIII的实际杀真菌作用。

[0305] 此外，化合物XII表现出对抗一种隐球菌病病原体(土生隐球酵母(Cryptococcus humicolus))，MSC为12.5μM。

[0306] 因而，通式(I)化合物会产生抑真菌效应和/或杀真菌效应，其中所述效应的大小是结构依赖性的，且它自身表现在10-4-10-6M的浓度范围内。

[0307] 实施例18

[0308] 实施例剂型

[0309] A.明胶胶囊

[0310] 如下配制要装入胶囊中的粉末：

[0311] 与通式(I)对应的化合物 1-50mg

[0312] 氧化镁 50mg

[0313] 淀粉 100-200mg

[0314] 混合上面列出的成分，以151-285mg的量，将混合物装入硬明胶胶囊中。

[0315] B.片剂剂型

[0316] 使用下面列出的成分，生产片剂剂型：

[0317]

[0318]

[0319] 混合所述组分，并压制，以生产各自重200mg的片剂。

[0320] C.气雾剂剂型

[0321] 如下配制用于10次给药的气雾剂混合物：

[0322] 与通式(I)对应的化合物 10-100mg

[0323] 硫酸镁 150mg

[0324] 乳糖 110-140mg

[0325] 将所述化合物与赋形剂混合，将混合物转移进专用的喷雾装置中。

[0326] D.栓剂

[0327] 可以使用下述的栓剂基质：

[0328] 水不溶性的基质(可可脂)；

[0329] 水可溶性的或水溶性的基质(明胶-甘油或聚氧化乙烯)；和

[0330] 组合(肥皂-甘油)基质。

[0331] 一个实施例栓剂配方：

[0332] 与通式(I)对应的化合物，1-50mg的量，和

[0333] 可可脂，要得到的栓剂所必需的量。

[0334] 在必要时，可以用适当的赋形剂生产直肠的、阴道的或尿道的栓剂。

[0335] E.软膏剂

[0336] 可以使用下述的软膏剂基质：

[0337] 碳氢化合物软膏剂基质，诸如白凡士林和黄凡士林(Vaselinum album and Vaselinum flavum)、凡士林油(Oleum Vaselini)，和白软膏剂和液体软膏剂(Unguentum album and Unguentum flavum)，其含有增稠添加剂诸如固体石蜡和蜡；

[0338] 可吸收的软膏剂基质，诸如亲水的凡士林(Vaselinum hydrophylicum)、羊毛脂(Lanolinum)和冷乳膏剂(Unguentum leniens)；

[0339] 水可去除的软膏剂基质，诸如亲水的软膏剂(Unguentum hydrophylum)；水溶性的软膏剂基质，诸如聚乙二醇软膏剂(Unguentum Glycolis Polyaethyleni)；皂粘土基质；和其它。

[0340] 一个实施例软膏剂配方：

[0341] 与通式(I)对应的化合物 0.01g-0.1g

[0342] 凡士林 10g

[0343] 通过适当的技术，制备软膏剂。

[0344] E.注射液

[0345] 可用于制备注射用溶液的溶剂包括：0.9％氯化钠溶液、蒸馏水和奴佛卡因溶液。单位剂型可以生产成安瓿、管形瓶和ampins。

[0346] 注射用溶液的配方如下：

[0347] 与通式(I)对应的化合物 1-50mg

[0348] 蒸馏水 1-2mL

[0349] 注射剂型可以生产为无菌的溶液、无菌的散剂和无菌的片剂。

[0350] 消毒剂和杀菌剂的实施例配方

[0351]

[0352]

[0353] 因而，通式(I)的氯高铁血红素衍生物具有抗细菌和抗真菌活性，尤其是针对人病原性金黄色葡萄球菌和它的抗性株。此外，几乎所有的要求保护的氯高铁血红素衍生物能够(在不同程度上)增加模型脂膜的渗透性，从文献得知，这是抗微生物剂的抗微生物(抗细菌、抗真菌)效应的机理的重要部分。通式(I)化合物的效力证实了它们适合大规模用于具有抗真菌和抗细菌效应的消毒剂、杀菌剂和治疗剂的配方中。