质粒载体

摘要

本发明的目的在于提供为了在产业上有效地利用考克氏菌属细菌而利用基因工程方法对考克氏菌属细菌进行修饰的技术。上述目的通过一种能够在细菌内自主复制的环状质粒来解决，所述环状质粒具有复制区，所述复制区包含：DNA结合蛋白样蛋白基因的碱基序列；复制酶样蛋白基因的碱基序列；和序列号45所示的碱基序列。作为上述质粒，可以列举例如来源于考克氏菌MBE131(Kocuria sp.MBE131)株(FERM P-21885)的包含序列号3或4所示的碱基序列的质粒。

权利要求

1.一种质粒，其包含

(1)序列号3所示的碱基序列、(2)序列号4的第559～3170位的碱基序列、(3)序列号4的第312～3170位的碱基序列、(4)序列号4的第7～3170位的碱基序列、或(5)序列号4所示的碱基序列。

2.如权利要求1所述的质粒，其来源于考克氏菌MBE131(Kocuria sp.MBE131)株，所述考克氏菌MBE131株的保藏编号为FERM P-21885。

3.一种转化体，其含有权利要求1所述的质粒。

说明书

质粒载体

[0001] 相关申请的相互参考

[0002] 本申请要求2010年3月31日提交的日本特愿2010-81774号的优先权，将该申请的全部记载作为公开的内容特别援引到本说明书中。

技术领域

[0003] 本发明涉及使用基因工程方法的有助于提高微生物的功能的技术。详细而言，本发明涉及来源于考克氏菌属(Kocuria)细菌的质粒载体。

背景技术

[0004] 微球菌科(Micrococcaceae)细菌中的很多细菌在食品工业、药品制造业、化学工业、环境净化等领域确认到有用性。例如，在奶酪等乳制品的制作等中使用丙酸杆菌(propionibacteria)。另外，作为L-谷氨酰胺的生产菌，已知有短杆菌属(Brevibacteria)细菌。

[0005] 但是，这些细菌的野生株存在产物的生成能力低、培养困难等各种问题。因此，为了解决上述问题，正在尝试通过对这些细菌实施基因操作来得到产物的生成能力、环境适应性等得到提高的突变株。此时利用的是能够在上述细菌中自主复制的质粒等载体。例如，能够用于丙酸杆菌的载体有作为专利文献1的日本特开2002-112790号公报中记载的载体(特别将专利文献1的记载作为公开的内容援引到本说明书中)。

[0006] 作为属于微球菌科的细菌，已知考克氏菌属(Kocuria)细菌。考克氏菌属细菌显示出高度的耐有机溶剂性、耐重金属性和增殖能力，因而期待其在燃料或医药化学产品的制造、环境净化等领域中的应用。

发明内容

[0007] 发明所要解决的问题

[0008] 但是，尚未获知在考克氏菌属细菌中稳定保持外源性基因的技术。也没有成功地使用该细菌并利用基因工程方法进行微生物修饰的例子。结果，也不能赋予新的生物学功能或使原来的功能达到最佳化，因此，考克氏菌属细菌在产业界中几乎未得到应用。

[0009] 因此，本发明中，发明所要解决的问题在于，提供为了在产业上有效地利用考克氏菌属细菌而利用基因工程方法对考克氏菌属细菌进行修饰的技术。

[0010] 用于解决问题的手段

[0011] 本发明人为了解决上述问题进行了深入研究，结果，成功地从相模湾内的深度约2000m的底泥中分离出具有大小较小且容易处理的环状质粒的新的考克氏菌属细菌即考克氏菌MBE131(Kocuria sp.MBE131)株(FERM P-21885；以下有时也称为MBE131株)。

[0012] 本发明人将由MBE131株获取的质粒命名为pKR100，将外源性基因和能够在大肠杆菌内自主复制的质粒连接，构建了MBE131株和大肠杆菌的穿梭载体。将该穿梭载体导入MBE131株和大肠杆菌中，结果在任意一种细菌内均表达外源性基因。

[0013] 此外，本发明人进一步对质粒pKR100进行了研究，结果弄清了推测在质粒pKR100中负责DNA复制的区域(复制区)。接着，准备在质粒pKR100中不同于复制区的区域中插入外源性基因而得到的重组质粒，将其导入作为与MBE131株不同的考克氏菌属细菌的嗜根考克氏菌DC2201(Kocuria rhizophila DC2201)株(NBRC103217)中。结果，该重组质粒在嗜根考克氏菌DC2201株中也能够表达外源性基因并且能够自主复制。

[0014] 本发明基于上述发现而完成。因此，根据本发明，提供一种能够在细菌内自主复制的环状质粒，其具有复制区，所述复制区包含：DNA结合蛋白样蛋白基因的碱基序列；复制酶样蛋白基因的碱基序列；以及序列号45所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列。

[0015] 根据本发明的另一方面，提供一种能够在细菌内自主复制的环状质粒，其具有复制区，所述复制区包含：DNA结合蛋白样蛋白基因的碱基序列；复制酶样蛋白基因的碱基序列；以及选自由DNA结合蛋白结合序列和重复基序组成的组中的至少一种序列。

[0016] 根据本发明的另一方面，提供一种能够在细菌内自主复制的环状质粒，其具有复制区，所述复制区包含：DNA结合蛋白样蛋白基因的碱基序列；复制酶样蛋白基因的碱基序列；以及包含选自由DNA结合蛋白结合序列和重复基序组成的组中的至少一种序列、氧化剂敏感性序列及反向重复序列的碱基序列。

[0017] 优选本发明的质粒在复制区中包含选自由DNA结合蛋白结合序列和重复基序组成的组中的至少一种序列中的1个以上的DNA结合蛋白结合序列以及2个以上的重复基序。

[0018] 优选DNA结合蛋白结合序列选自由CACCGGTG、ACCGGTG、CCGGTG、ACCGGT、CACAGGT、CACCGGT、CACCGG、GTGCGCAC、GGCCGGCC、TCGGAGCTCCGA(序列号46)、TCCCGGGA、TGCCGGCA、TGATCGATCA(序列号47)和GCACGTGC组成的组。

[0019] 优选重复基序的重复单元选自由TGGCGTGGTCGTTG(序列号48)、GCGCTGGGGTG(序列 号 49)、TGGGGCTGTGGTGG( 序 列 号 50)、GCGGTGGTG、GCGGTGGTGTG( 序 列 号 51)、GGGCCGGGGTTG(序 列 号 52)、GCCGGGGTTGT(序 列 号 53)、TGGTCGTGTTG(序 列 号 54)、TGTTGCTGGGGTG(序列号55)、TGGCGGTGTTGTGG(序列号56)和GGGGTGCCGGTGG(序列号57)组成的组。

[0020] 优选本发明的质粒在复制区中包含1个以上的氧化剂敏感性序列。

[0021] 优 选 氧 化 剂 敏 感 性 序 列 选 自 由 TGTGGGGTGGCCCCTCAGCGAAATA(序 列号 58)、GGCCTCTCAGC( 序 列 号 59)、CTGCGGGCACCTCCTAC( 序 列 号 60)、TTCGATGAG、GGTGAGGGGTAACCC(序 列 号 61)、GTGGGGTGGC(序 列 号62)、GGGGGGTGGCTTCCTATCG( 序列 号 63)、GTGGGGTGGCCC( 序 列 号 64)、TGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAA( 序 列 号 65)、GCGGGGGCACCCGA(序列号66)和CTGAGGGTCCTC(序列号67)组成的组。

[0022] 优选本发明的质粒在复制区中包含1个以上的反向重复序列。

[0023] 优选反向重复序列选自由GAAAAAGCCGGGCTGCTGCCCGGCTTTTTC(序列号68)和CACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTG(序列号69)组成的组。

[0024] 优选复制酶样蛋白基因的碱基序列为RepA蛋白基因的碱基序列。

[0025] 优选复制酶样蛋白基因的碱基序列为序列号2所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交且编码具有复制酶活性的蛋白的碱基序列。

[0026] 优选DNA结合蛋白样蛋白基因的碱基序列为螺旋-转角-螺旋蛋白基因的碱基序列。

[0027] 优选DNA结合蛋白样蛋白基因的碱基序列为序列号1所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交且编码螺旋-转角-螺旋蛋白的碱基序列。

[0028] 优选复制区为序列号3所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列。

[0029] 优选细菌为考克氏菌属(Kocuria)细菌。

[0030] 根据本发明的另一方面，提供一种能够在考克氏菌属细菌内自主复制的环状质粒，其中，作为限制性酶识别位点及其数量，以限制性酶识别位点：数量的形式表示，包含SmaI：2、SphI：1、SalI：1、XhoI：1和BamHI：1。

[0031] 优选本发明的质粒依次包含限制性酶识别位点SmaI、SmaI、SphI、SalI、XhoI、BamHI和SacI。

[0032] 优选本发明的质粒的碱基对数为3.0×103～3.4×103。

[0033] 优选本发明的质粒由以下的限制性酶图谱(I)表示：

[0034]

[0035] 优选本发明的质粒包含序列号3或4所示的碱基序列。

[0036] 优选本发明的质粒来源于考克氏菌MBE131(Kocuria sp.MBE131)株(FERM P-21885)。

[0037] 根据本发明的另一方面，提供一种DNA片段，其包含序列号3所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列。

[0038] 根据本发明的另一方面，提供一种载体，其包含本发明的DNA片段的碱基序列。

[0039] 根据本发明的另一方面，提供一种转化体，其含有本发明的质粒、本发明的DNA片段或本发明的载体。

[0040] 发明效果

[0041] 根据本发明的质粒，能够构建用于将外源性基因导入考克氏菌属细菌中并使其进行表达的载体。因此，使用本发明的质粒时，能够将有用基因导入考克氏菌属细菌等宿主细胞中，从而能够赋予宿主细胞新的生物学功能或提高宿主细胞原来的功能。

[0042] 使用本发明的DNA片段和载体时，能够制造能在考克氏菌属细菌和其他细菌中自主复制的穿梭载体。本发明的转化体中有对宿主细胞赋予新的生物学功能的转化体和使宿主细胞原来的功能提高的转化体等，可以根据用途在各种领域中使用。

附图说明

[0043] 图1是在pKR100的限制性酶图谱中加入2个开放阅读框后的图。

[0044] 图2是表示明示出分别编码ORF1和ORF2的碱基序列的区域的pKR100的碱基序列的图。

[0045] 图3是表示明示出分别编码ORF1和ORF2的碱基序列的区域的pKR100的碱基序列的图(图2续)。

[0046] 图4是表示对例6所示的pKR100中的DNA复制区进行考察而得到的结果的图。图4所示的包含DNA片段的质粒中，“+”表示观察到复制的质粒，“-”表示未能确认到复制的质粒。

[0047] 图5是表示由例3中的考克氏菌MBE131(Kocuria sp.MBE131)株和玫瑰色考克氏菌(Kocuria rosea)标准株提取DNA而得到的质粒检测结果的图。泳道1表示由MBE131株提取的DNA。泳道2表示由玫瑰色考克氏菌标准株提取的DNA。泳道3表示DNA大小标记物。

[0048] 图6是表示以由例3中的MBE131株和玫瑰色考克氏菌标准株提取的DNA为模板并使用表1所示的引物组A～F实施PCR时的质粒检测结果的图。

[0049] 图7是表示以例3中的MBE131株和玫瑰色考克氏菌标准株的细胞溶解液中所含的DNA为模板并使用表1所示的引物组A～F实施PCR时的质粒检测结果的图。

[0050] 图8是表示例5中的、利用PCR得到的导入MBE131转化株中的重组质粒pR6632的检测结果的图。泳道1表示DNA大小标记物。

[0051] 图9是表示例5中的、利用限制性酶消化图谱得到的导入MBE131转化株中的重组质粒pR6632的确认结果的图。泳道1表示DNA大小标记物。

[0052] 图10是表示例7中的利用PCR得到的导入DC2201株中的质粒pR6632的检测结果的图。泳道3表示DNA大小标记物。

[0053] 图11A表示序列号3所示的碱基序列与奇迹束丝放线菌(Actinosynnema mirum)DSM43827株的碱基序列的比对结果。

[0054] 图11B表示序列号3所示的碱基序列与奇迹束丝放线菌DSM43827株的碱基序列的比对结果(图11A续)。

[0055] 图11C表示序列号3所示的碱基序列与奇迹束丝放线菌DSM43827株的碱基序列的比对结果(图11B续)。

[0056] 图12是表示例8中的各种合成质粒在考克氏菌属细菌内的质粒保持率(％)的图。

具体实施方式

[0057] 以下，对本发明的详细内容进行说明。

[0058] [1]质粒(1)

[0059] 首先，对作为本发明的质粒的一个实施方式的、能够在考克氏菌属细菌内自主复制的环状质粒进行说明。需要说明的是，本说明书中的“自主复制”是指质粒存在于宿主细菌的细胞质内且独立于宿主的染色体DNA而进行复制和/或增殖。

[0060] 考克氏菌属细菌是属于微球菌亚目(Micrococcineae)中的微球菌科的、不制造菌丝的革兰氏阳性球菌中的一种。考克氏菌属细菌由多种多样的分离源分离得到，例如，由哺乳类的皮肤、土壤、根际、发酵食品、临床样本、淡水、海底沉积物等分离得到。考克氏菌属细菌的鉴定方法可以不受限制地使用目前为止已知的方法，例如可以采用基于微生物基因组的16S rRNA区域的基因工程系统分析或基于微生物的生理/生物化学性质的鉴定方法。

[0061] 本发明的质粒可以利用例如限制性酶识别位点及其数量来表示。本发明的质粒的一个优选实施方式中，作为限制性酶识别位点及其数量，以限制性酶识别位点：数量的形式表示，包含SmaI：2、SphI：1、SalI：1、XhoI：1和BamHI：1。该方式中，限制性酶SmaI识别的位点为2处，SphI识别的位点为1处，SalI识别的位点为1处，XhoI识别的位点为1处，并且BamHI识别的位点为1处。

[0062] 本发明的质粒的一个更优选的实施方式中，依次包含限制性酶识别位点SmaI、SmaI、SphI、SalI、XhoI和BamHI。

[0063] 本发明的质粒中的限制性酶识别位点的确认方法没有特别限制，可以采用例如：确定质粒的碱基序列、然后对照限制性酶识别位点进行确认的方法；对质粒进行限制性酶处理、然后供于琼脂糖凝胶电泳并由生成的条带的图样确认限制性酶识别位点的方法。

[0064] 本发明的质粒优选GC含量为60～70％。需要说明的是，作为后述的本发明的具体方式之一的图1中所示的质粒pKR100的GC含量为约63％。确认GC含量的方法没有特别限制，可以采用例如：确定质粒的全部碱基序列、然后计算出碱基序列G和C的数量的方法；将质粒水解至碱基单元并利用HPLC等色谱法计算出G和C的数量的方法。

[0065] 本发明的质粒只要能够在考克氏菌属细菌内自主复制则没有特别限制，可以想出3 3 3
各种方式，其整体的大小为约3.2×10 碱基对，优选为3.0×10 ～3.4×10 碱基对。该“约
3
3.2×10 碱基对”是指从考克氏菌属细菌分离出的天然质粒的碱基对数，可以通过将推测负责在考克氏菌属细菌内自主复制和/或增殖的功能的区域(以下也称为复制区)以外的区域切掉或插入外源性基因来改变其碱基对数。

[0066] 本发明的质粒的一个优选实施方式包含例如由以下的限制性酶图谱(I)表示的限制性酶识别位点。

[0067]

[0068] 上述质粒的更具体的方式为由图1所示的质粒pKR100。

[0069] 图1中，orf1和orf2分别表示不同的开放阅读框。由orf1编码的蛋白(ORF1)由70个氨基酸构成，推测分子量为8.1kDa并且等电点为10.4。通过二级结构预测，推测ORF1具有由无规卷曲结构隔开的2个螺旋结构，因此，推测其为形成螺旋-转角-螺旋(HTH)结构的DNA结合蛋白或其类似物。本说明书中，将上述推测形成螺旋-转角-螺旋(HTH)结构的DNA结合蛋白及其类似物统称为DNA结合蛋白样蛋白。进而，将编码DNA结合蛋白样蛋白的碱基序列称为DNA结合蛋白样蛋白基因。

[0070] 由orf2编码的蛋白(ORF2)由385个氨基酸构成，推测分子量为41kDa，等电点为11.1。ORF2与玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)来源的复制蛋白RepA(登记-6号YP_345164)具有31％的同源性(80/257个氨基酸、E值6e )。本说明书中，将这样的与RepA具有30％以上的同源性且推测具有与RepA类似的活性的蛋白称为复制酶样蛋白。另外，将编码复制酶样蛋白的碱基序列称为复制酶样蛋白基因。

[0071] 由图1表示的质粒含有作为DNA结合蛋白样蛋白基因的orf1和作为复制酶样蛋白基因的orf2。orf2编码的蛋白与作为具有θ型复制方式的质粒的、来源于偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)的质粒pAL5000所编码的RepA(登记号AAA98171，74/263个氨基酸序列一致(同一性28％))和作为与pAL5000相关的质粒的、来源于玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)的质粒pNC500所编码的RepA(登记号BAF45389，60/210个氨基酸序列一致(同一性28％))显示出同源性，因此，本发明的质粒为稳定进行复制的θ(Theta)型质粒的可能性高。因此，本发明的质粒优选为复制方式为θ型的质粒。

[0072] 由图1表示的质粒的碱基序列只要包含图1中所示的限制性酶识别位点以及DNA结合蛋白样蛋白基因和复制酶样蛋白基因则没有特别限制，优选包含由图2和3表示的碱基序列(序列号4)。

[0073] 由图2表示的碱基序列在orf1的上游包含H位点样序列(H-site-like seq)(图2中由小字表示的序列)。H位点样序列是指与作为存在于偶发分枝杆菌(Mycobacteriu fortuitum)来源的质粒pAL5000的复制起始区的复制蛋白结合位点已知的高亲和性位点(H位点，H-site)中所含的称为GCbox的序列显示出同源性的序列(参考Stolt P,Stoker NG.,Nucleic Acids Res.1997,25(19):3840-6.，将该文献的记载作为公开的内容特别援引到本说明书中)。另外，pAL5000中的H位点具有以下结构特征：包含称为GCbox的由8个碱基构成的100％一致回文序列。由此，在本说明书中，将具有由8个碱基以上构成的100％一致回文结构的序列也称为H位点样序列。进而，在本说明书中，将H位点样序列等与复制蛋白等DNA结合蛋白结合的序列称为DNA结合蛋白结合序列。

[0074] 由图2表示的碱基序列在orf1的上游包含氧化剂敏感性序列(图2中上部具有虚线的以斜体表示的序列)。一般已知，作为DNA结合蛋白的RepB蛋白结合到DNA上的H位点时，会使该DNA产生弯折(参考Chatterjee S,Basu A,Basu A,Das Gupta SK.,J Bacteriol.2007,189(23):8584-92.，将该文献的记载作为公开的内容特别援引到本说明书中)。在该DNA的弯折部分的周围存在对氧化剂显示出敏感性的碱基序列的区域(称为氧化剂敏感性序列)。可以推测氧化剂敏感性序列对氧化剂显示出敏感性是因为上述序列中发生了DNA的解离。因此暗示，从氧化剂敏感性序列开始复制。作为氧化剂敏感性序列及其周围的碱基序列，已知TGTGGGGTGGCCCCTCAGCGAAATA(序列号58)及其互补链。如图所示，由图2表示的碱基序列包含与序列号58及其互补链具有同源性的序列作为氧化剂敏感性序列。

[0075] 由图2表示的碱基序列在orf1的上游包含近似的重复基序(正向重复序列)(图2中下部具有实线的由粗体字表示的序列)。另外，由图2表示的碱基序列在orf1的上游和orf1与orf2之间包含近似的反向重复序列(图2中下部具有箭头的序列)。一般已知，作为重复基序的重复区(iteron)作为顺式元件(cis-element)对θ型质粒家族的复制和拷贝数调控担负着重要的功能(参考Chattoraj DK.,Mol Microbiol.2000,37(3):467-76. 和 Cha KI,Lim K,Jang S,Lim W,Kim T,Chang H.,J Microbiol Biotechnol.2007,17(11):1841-7.，将上述文献的记载作为公开的内容特别援引到本说明书中)。顺式元件是指基因自身含有的负责基因调控的元件，区别于基因组或其他质粒等能够从外部供给的元件(反式元件(trans-element))。例如，有如下报道：在作为θ型质粒的pCD3.4中，通过删除1个重复区而使拷贝数降低，从而使质粒的稳定性降低(参考van Belkum MJ,Stiles ME.,Microbiology.2006,152:171-8.，将该文献的记载作为公开的内容特别援引到本说明书中)。另外，有如下报道：在作为θ型质粒的p705/5中，通过使RepA蛋白与存在于repA基因的启动子区域的反向重复序列结合，抑制RepA蛋白的转录，从而调节质粒的拷贝数(参考上述Cha KI等人的文献)。另一方面，也有还存在未发现反向重复序列的θ型质粒的报道(参考上述van Belkum MJ等人的文献)。

[0076] 例如，有如下报道：在pAL5000中，推测重复基序(重复区)、repA基因和repB基因为负责pAL5000的自主复制的序列。向不具有pAL5000来源的repA基因和repB基因而具有pAL5000来源的重复基序的质粒以反式供给其他质粒来源的RepA蛋白和RepB蛋白时，该具有pAL5000来源的重复基序的质粒能够进行复制(参考Stolt P,Stoker NG.,Microbiology.1996,142(Pt10):2795-802.，将该文献的记载作为公开的内容特别援引到本说明书中)。由该文献的报道也可知，推测重复基序为与质粒的不相容性、拷贝数、稳定性相关的顺式元件。

[0077] 如例8所示，本发明人制作了包含1组由图2表示的碱基序列中的多个重复基序和1个反向重复序列且包含第1031-3170位的碱基序列(序列号3)的区域的质粒pKR141，并且发现了该pKR141能够在考克氏菌属细菌内自主复制。因此，能够在由图2表示的碱基序列的除第1031-3170位的碱基序列以外的区域中导入或取代外源性基因。

[0078] 序列号3所示的碱基序列为单一的碱基序列。例如，通过利用DDBJ的FASTA检索对序列号3所示的碱基序列实施同源性检索时，碱基序列的同一性为约54％的奇迹束丝放线菌DSM43827(Actinosynnema mirum DSM43827)株显示在第一位(http://fasta.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html；关于FASTA检索，参考Pearson WR,Lipman DJ.,(1988),Proc Natl Acad Sci USA.85(8):2444-8，Lipman DJ,Pearson WR.,(1985),Science.227(4693):1435-41和Wilbur WJ,Lipman DJ.,(1983),Proc Natl Acad Sci USA.80(3):726-30，将上述文献的记载作为公开的内容特别援引到本说明书中)。将序列号3所示的碱基序列与奇迹束丝放线菌DSM43827株的碱基序列的比对结果示于图11中。

[0079] 由于序列号3所示的碱基序列为单一的碱基序列，因此，作为考克氏菌属细菌来源的质粒且在线性单链化的形态下、在严格条件下与包含序列号3所示的碱基序列中连续的500个碱基以上、优选1000个碱基以上、更优选1500个碱基以上、进一步优选1700个碱基以上、更进一步优选1900个碱基以上的碱基序列的互补碱基序列的DNA片段杂交的质粒在考克氏菌属细菌内自主扩增的可能性高。因此，这种质粒也包括在本发明的质粒中。

[0080] 本说明书中的“在严格条件下杂交”是指通过使用DNA作为探针并使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法、DNA印迹杂交法等得到的DNA的碱基序列，可以列举例如可通过下述进行鉴定的DNA等：使用固定有来源于菌落或噬菌斑的DNA或该DNA的片段的过滤器，在0.5～2.0M的NaCl存在下在40～75℃下实施杂交、优选在0.7～1.0M的NaCl存在下在65℃下实施杂交，然后，使用0.1～2×SSC溶液(1×SSC溶液为150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)在65℃的条件下清洗过滤器。探针的制备和杂交可以依据Molecular Cloning:A laboratory Manual(分子克隆实验指南),第二版,冷泉港实验室,冷泉港,NY.,1989(以下简称为分子克隆第二版)、Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验方法汇编),附录1～38,约翰威立父子出版公司(1987-1997)(以下简称为最新分子生物学实验方法汇编)等中记载的方法来实施(将上述文献的记载作为公开的内容特别援引到本说明书中)。需要说明的是，本领域技术人员可以通过在上述缓冲液的盐浓度、温度等条件的基础上对探针浓度、探针长度、反应时间等其他各条件进行设计来设定用于在本发明的质粒中得到复制区的条件。

[0081] 作为包含在严格条件下杂交的碱基序列的DNA片段，可以列举与作为探针使用的DNA的碱基序列具有一定水平以上的同源性(同一性)的DNA，例如，可以列举与作为探针使用的DNA的碱基序列具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选93％以上、特别优选95％以上、最优选98％以上的同源性的DNA片段。

[0082] 作为在严格条件下与序列号3所示的碱基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列，包括例如在序列号3所示的碱基序列中缺失、取代和/或添加1个～数个、优选1个～50个、更优选1个～30个、进一步优选1个～20个、更进一步优选1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个碱基而得到的碱基序列。

[0083] “碱基的缺失”是指序列中的碱基存在缺损或消失，“碱基的取代”是指序列中的碱基被取代成其他碱基，“碱基的添加”是指附加有碱基。

[0084] 包含在严格条件下与序列号3所示的碱基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列的质粒能否在考克氏菌属细菌内自主复制可以通过实施例中记载的方法来确认。概括地说，该方法包括如下步骤：准备将在严格条件下与序列号3所示的碱基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列与药剂抗性基因连接而得到的重组质粒，然后将该重组质粒导入考克氏菌属细菌中来制造转化体，然后在与药剂抗性基因对应的药剂的存在下培养该转化体，然后确认该转化体的增殖。

[0085] 具有由图2和图3(序列号4)表示的碱基序列的质粒可以由考克氏菌MBE131(Kocuria sp.MBE131)株(FERM P-21885)(以下有时也仅称为MBE131株)分离。但是，本发明的质粒也可以是由MBE131株分离得到、不含序列号4所示的全部碱基序列而至少包含序列号3所示的碱基序列的质粒。

[0086] 由考克氏菌属细菌提取质粒的方法没有特别限制，可以列举例如以下方法：使用YTNM培养基等适当的培养基，在适合考克氏菌属细菌增殖的条件下例如通过在15～30℃下静置1～3天或振荡培养使考克氏菌属细菌增殖，然后通过离心分离等操作回收菌体，接着通过溶菌酶处理等使菌体的细胞壁溶解，然后使用高纯质粒纯化试剂盒(罗氏公司制造)等质粒提取试剂盒来回收质粒。

[0087] 确认由考克氏菌属细菌提取出的质粒是否包含由序列号3或4表示的碱基序列的方法没有特别限制，可以列举例如以下方法：使用基于由序列号3或4表示的碱基序列的信息制作的DNA或RNA探针的杂交法；基于pKR100的限制性酶图谱进行限制性酶处理、然后通过琼脂糖凝胶电泳确认处理后生成的DNA大小的方法等。

[0088] 作为获得本发明的质粒的其他方法，例如，可以使用基于序列号3或4所示的碱基序列的信息合成的、能够与该碱基序列杂交的探针或PCR用引物组从由MBE131株或其他考克氏菌属细菌提取出的质粒中进行分离。

[0089] 根据本发明的质粒，通过与外源性基因连接后利用电穿孔法、原生质体法、使用钙离子的方法等目前已知的DNA导入法导入考克氏菌属细菌等宿主细胞中，能够制造表达外源性基因的转化体。

[0090] 通过将本发明的质粒与能够在不同于考克氏菌属细菌的宿主细胞中自主复制的质粒的DNA复制区连接，能够构建能在考克氏菌属细菌和不同于考克氏菌属细菌的宿主细胞中自主复制的穿梭载体。使用本发明的质粒的穿梭载体的构建方法没有特别限制，例如，可以将本发明的整个质粒或包含负责DNA复制的区域的部分质粒连接到pHY300PLK等能够在大肠杆菌内自主复制的质粒的多克隆位点上，由此构建以考克氏菌属细菌和大肠杆菌为宿主细胞的穿梭载体。

[0091] [2]质粒(2)

[0092] 作为本发明的另一方式，可以列举具有以下(A)～(C)中任意一个推测担负在细菌内、优选考克氏菌属细菌以及其他微球菌科细菌内自主复制的功能的复制区的环状质粒：

[0093] (A)包含DNA结合蛋白样蛋白基因的碱基序列；复制酶样蛋白基因的碱基序列；和序列号45所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列的复制区。

[0094] (B)包含DNA结合蛋白样蛋白基因的碱基序列；复制酶样蛋白基因的碱基序列；及选自由DNA结合蛋白结合序列和重复基序组成的组中的至少一种序列的复制区。

[0095] (C)包含DNA结合蛋白样蛋白基因的碱基序列；复制酶样蛋白基因的碱基序列；及选自由DNA结合蛋白结合序列和重复基序组成的组中的至少一种序列、氧化剂敏感性序列以及反向重复序列的碱基序列的复制区。

[0096] DNA结合蛋白为具有能够与DNA结合的结构的蛋白，在结构上分为同源结构域(homeodomain)、锌指结构域(Zinc finger domain)、翼状螺旋(winged helix)、亮氨酸拉链蛋白(Leucine zipper protein)、螺旋-环-螺旋蛋白(helix-loop-helix：HLH protein)、螺旋-转角-螺旋蛋白(helix-turn-helix：HTH protein)等。作为本发明的质粒的复制区(A)～(C)中的DNA结合蛋白样蛋白基因的碱基序列，可以不受限制地列举例如上述DNA结合蛋白的基因的碱基序列，优选为螺旋-转角-螺旋蛋白基因的碱基序列，更优选为序列号1所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交且编码螺旋-转角-螺旋蛋白的碱基序列。

[0097] 复制酶样蛋白是具有沿着核酸的磷酸酯骨架将核酸的双螺旋或二级结构解开的复制酶活性的蛋白，可以采取各种结构。作为有关复制蛋白(或复制酶)的功能的记载，有文献Hiraga S,Sugiyama T,Itoh T.,J Bacteriol.1994Dec；176(23):7233-43的记载(将该文献的记载作为公开的内容特别援引到本说明书中)，可以列举例如以下记载：“Rep蛋白特异性地与复制起点结合且在复制起点合成单一的引物RNA”。

[0098] 作为本发明的质粒的复制区(A)～(C)中的复制酶样蛋白基因的碱基序列，可以列举例如RepA蛋白的基因的碱基序列，优选为序列号2所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交且编码具有复制酶活性的蛋白的碱基序列。

[0099] 本发明的质粒的复制区(A)在包含DNA结合蛋白基因的碱基序列和复制酶样蛋白基因的碱基序列的基础上，还包含序列号45所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列。序列号45所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列包括作为推测与本发明的质粒在考克氏菌属细菌内的自主复制相关的区域的、DNA结合蛋白结合序列、重复基序、氧化剂敏感性序列、反向重复序列等。在严格条件下与序列号45所示的碱基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列优选包括作为DNA结合蛋白结合序列的选自由TGCCGGCA、TGATCGATCA(序列号47)、GCACGTGC和CACCGGT组成的组中的至少一种序列；作为重复基序的选自由GGGCCGGGGTTG(序列号52)、TGGTCGTGTTG(序列号54)、TGTTGCTGGGGTG(序列号55)、TGGCGGTGTTGTGG(序列号56)和GGGGTGCCGGTGG(序列号57)组成的组中的至少一种序列；作为氧化剂敏感性序列的选自由GGGGGGTGGCTTCCTATCG(序列号63)、GTGGGGTGGCCC(序列 号64)、TGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAA( 序 列 号65)、GCGGGGGCACCCGA(序 列 号 66)和CTGAGGGTCCTC(序列号67)组成的组中的至少一种序列；以及作为反向重复序列的GAAAAAGCCGGGCTGCTGCCCGGCTTTTTC(序列号68)或CACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTG(序列号69)。

[0100] 本发明的质粒的复制区(B)和(C)中的DNA结合蛋白结合序列的具体例可以列举：CACCGGTG、ACCGGTG、CCGGTG、ACCGGT、CACAGGT、CACCGGT、CACCGG、GTGCGCAC、GGCCGGCC、TCGGAGCTCCGA(序列号46)、TCCCGGGA、TGCCGGCA、TGATCGATCA(序列号47)和GCACGTGC。

[0101] 本发明的质粒的复制区(B)和(C)中的重复基序的重复单元的具体例可以列举：TGGCGTGGTCGTTG(序列号48)、GCGCTGGGGTG(序列号49)、TGGGGCTGTGGTGG(序列号50)、GCGGTGGTG、GCGGTGGTGTG(序列号51)、GGGCCGGGGTTG(序列号52)、GCCGGGGTTGT(序列号
53)、TGGTCGTGTTG(序列号54)、TGTTGCTGGGGTG(序列号55)、TGGCGGTGTTGTGG(序列号56)和GGGGTGCCGGTGG(序列号57)。

[0102] 本发明的质粒的复制区(C)的氧化剂敏感性序列的具体例可以列举：TGTGGGGTGGCCCCTCAGCGAAATA( 序 列 号 58)、GGCCTCTCAGC( 序 列 号 59)、CTGCGGGCACCTCCTAC( 序 列 号 60)、TTCGATGAG、GGTGAGGGGTAACCC( 序 列 号 61)、GTGGGGTGGC(序列号62)、GGGGGGTGGCTTCCTATCG(序列号63)、GTGGGGTGGCCC(序列号64)、TGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAA(序列号65)、GCGGGGGCACCCGA(序列号66)和CTGAGGGTCCTC(序列号67)。

[0103] 本发明的质粒的复制区(C)的反向重复序列的具体例可以列举：GAAAAAGCCGGGCTGCTGCCCGGCTTTTTC(序列号68)和CACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTG(序列号69)。

[0104] 如后述的例2中所述，推测包含DNA结合蛋白结合序列和重复基序中的任意一者或两者的区域与复制区中质粒的复制和稳定保持有关。因此，本发明的质粒的复制区(B)和(C)包含DNA结合蛋白结合序列、重复基序或者DNA结合蛋白结合序列和重复基序。另外，本发明的质粒的复制区(B)和(C)可以包含2个以上的DNA结合蛋白结合序列和重复基序中的任意一者或两者。

[0105] 本发明的质粒的复制区(C)包含氧化剂敏感性序列和反向重复序列。如上所述，氧化剂敏感性序列是推测与复制的起始相关的序列，并且，反向重复序列是结合复制酶样蛋白、结果能够调节质粒的拷贝数的序列。本发明的质粒的复制区(C)通过含有上述序列而能够调控质粒的自主复制。需要说明的是，本发明的质粒的复制区(A)和(B)中也优选包含反向重复序列。

[0106] 本发明的质粒的复制区(A)～(C)中的各序列的数量和配置顺序只要能够使本发明的质粒在细菌内自主复制则没有特别限制，可以采取各种方式。

[0107] 本发明的质粒中的复制区(A)～(C)的一个具体例为序列号3所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列。

[0108] [3]DNA片段、载体和转化体

[0109] 根据本发明的另一方面，提供一种DNA片段，其包含序列号3所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列。通过将本发明的DNA片段与外源性基因连接而成的产物导入考克氏菌属细菌等宿主细胞的染色体中或者以环状化的质粒的形式导入宿主细胞的细胞质内，能够得到表达外源性基因的转化体。

[0110] 本发明的DNA片段除了可以利用上述PCR来合成以外，也可以没有限制地利用目前已知的DNA合成方法来合成。作为DNA合成的具体例，可以列举：基于序列号3所示的碱基序列的信息利用磷酸三酯法、亚磷酸酰胺法等进行化学合成的方法[J.Am.Chem.Soc.,89,4801(1967)；J.Am.Chem.Soc.,91,3350(1969)；Science,150,178(1968)；Tetrahedron Lett.,22,1859(1981)；Tetrahedron Lett.,24,245(1983)]和在序列号3所示的碱基序列中导入定点突变的方法[Methods in Enzymology,154,350,367-382(1987)；
Methods in Enzymology,100,468(1983)；Nucleic Acids Res.,12,9441(1984)；続生化学実験講座1“遺伝子研究法II”，日本生化学会编，p105(1986)]等基因工程方法、以及将上述方法组合而得到的方法等(将上述文献的记载作为公开的内容特别援引到本说明书中)。
例如，DNA的合成既可以通过利用亚磷酸酰胺法或三酯法的化学合成进行，也可以使用市售的自动寡核苷酸合成装置。

[0111] 本发明的DNA片段可以通过插入到目前已知的载体中而导入与该载体对应的靶细胞中。上述载体例如可以是能够进行自主复制的载体，也可以是在导入靶细胞时重组到靶细胞的染色体中而与染色体一同复制的载体。载体的优选例为表达载体。作为表达载体的具体例，可以列举：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。本发明的DNA片段连同在表达载体中进行转录所需的要素(例如启动子等)一起进行功能性连接。启动子是在靶细胞中显示出转录活性的DNA序列，可以根据靶细胞的种类来适当选择。

[0112] 包含本发明的DNA片段的载体也作为本发明的另一方式包含在本发明中。本发明的载体的优选方式为本发明的质粒。此外，含有本发明的质粒或载体的转化体也作为本发明的另一方式包含在本发明中。

[0113] 本说明书中的、引物和探针的制备、质粒DNA的提取、连接、DNA导入、克隆等操作是本领域技术人员已知的，可以依据例如分子克隆第二版、最新分子生物学实验方法汇编等中记载的方法来实施。

[0114] 以下，通过实施例更详细地对本发明进行说明，但本发明不限于这些实施例。

[0115] 实施例

[0116] 例1考克氏菌属细菌来源的质粒的分离

[0117] 从相模湾内的深度约2000m的底泥中分离出约250株的放线菌亚目细菌。其中，以下述方式确认了作为考克氏菌属细菌的考克氏菌MBE131(Kocuria sp.MBE131)株含有质粒DNA。将MBE131株在YTNM培养基(1.6％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠、0.1％硫酸镁)中在25℃下振荡培养2天。通过离心操作从该培养物得到菌体。在含有溶菌酶(2mg/mL)的20mM Tris盐酸缓冲液中在37℃下保温1小时，使菌体的细胞壁溶解，然后使用高纯质粒纯化试剂盒(罗氏公司制)制备质粒DNA。

[0118] 例2质粒pKR100的碱基序列分析

[0119] 将用限制性酶BamHI或SalI消化例1中制备的质粒而得到的片段分别克隆化到质粒载体pUC18中，并确定各自的全长碱基序列。结果可知，各克隆为具有由完全相同的碱基序列构成的插入片段的环状质粒。将该质粒命名为pKR100，将其碱基序列示于序列号4和图1中。另外，将记载有ORF的该质粒的限制性酶图谱示于图1中。使用第12.1.1版GENETYX MAC程序(GENETYX公司制造)对质粒pKR100的碱基序列进行分析。质粒pKR100的长度为3187个碱基，其G+C含量为63％。

[0120] 在碱基号1的第1-1751号所示的区域中检测到多个由近似的重复基序构成的正向重复结构(图2中，在碱基序列下划实线并用粗体字表示)、反向重复序列(发卡结构)(图2中，用碱基序列下的箭头表示)(参考图1)。由此暗示，本区域为与质粒复制和拷贝数调节有关的区域。另外，利用GENETYX-MAC对pKR100的全长实施了正向重复序列(重复基序)的检索。结果，在第742-755号和第756-769号碱基检测到由14个碱基对(TGGGGCTGTGGTGG(序列号50))构成的100％一致重复序列。接着，使用由14个碱基对构成的重复基序(TGGGGCTGTGGTGG(序列号50))实施了与该重复基序显示出同源性的区域的检索。在第1278-1291号碱基发现了TGGCGGTGTTGTGG(序列号56)，与第742-755号碱基有11/14的碱基一致。另外，在第410-420、876-884、1000-1011、1170-1182、1723-1735号碱基也存在显示出同源性的部分。对于与重复基序(TGGGGCTGTGGTGG(序列号50)、第742-755和第756-769号碱基)显示出同源性的第1278-1291号碱基(TGGCGGTGTTGTGG(序列号56))也同样地进行了与其显示出同源性的区域的检索。结果，第742-755、376-389、876-886、
1002-1012、1164-1174号碱基显示出同源性。由此暗示，pKR100的这些近似的重复序列中的任意一个均与pKR100的复制和拷贝数调控有关。

[0121] 利用GENETYX对pKR100的全长实施了反向重复序列和互补序列的检索。结果，在第806-835、1322-1361号碱基检测到反向重复序列序列。

[0122] pKR100中，在第1-1751号所示的区域检测到与作为存在于偶发分枝杆菌(Mycobacteriu fortuitum)来源的质粒pAL5000的复制起始区的复制蛋白结合位点已知的高亲和性位点(H位点)中称为GCbox的序列显示出同源性的序列(图1中，用小字表示)。另外，使用H位点(DNA结合蛋白结合序列)中由最重要的8个碱基对构成的称为GCbox的序列CACCGGTG，利用12.1.0版基因分析软件GENETYX-MAC(GENETYX公司制造)对pKR100的全长实施了同源性检索。结果，在pKR100的第442-448号的碱基序列、第1399-1405号的碱基序列检测到连续的7个碱基完全一致的部位。可以预测上述H位点样序列是在RepB蛋白与质粒的结合时担负重要作用的碱基序列。因此，预料上述H位点样序列中的一者或两者与pKR100的复制相关。

[0123] 对于推测与复制起始相关的氧化剂敏感性序列，以pKR100的全长为对象，使用TGTGGGGTGGCCCCTCAGCGAAATA(序列号58)进行了利用GENETYX-MAC的同源性检索。结果，在pKR100的非orf区域检测到与上述序列显示出同源性的部位。认为与TGTGGGGTGGCCCCTCAGCGAAATA(序列号58)显示出同源性的序列部分中的一个成为pKR100的复制起始点的可能性高。特别是发现了TGTGGGG与第1200-1211号碱基(GTGGGGTGGCCC(序列号64))、第370-379号碱基(GTGGGGTGGC(序列号62))具有高同源性。除此以外，还在多个位置检测到显示出同源性的序列。推测这些序列中的任意一个或多个作为DNA的解离点参与复制起始的可能性高。

[0124] 如上所述，推测pKR100的非orf区域中包含由近似的重复基序构成的正向重复序列或H位点样序列中的任何一者或两者的区域为具有与质粒的复制和稳定保持有关的功能的区域。

[0125] 接着，进行了开放阅读框分析，结果暗示存在2个开放阅读框(orf1和orf2)(参考图1)。orf1编码的蛋白(ORF1)由70个氨基酸构成，并计算出其推测分子量为8.1kDa，等电点为10.4。使用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的BLAST程序进行了orf1编码的氨基酸序列的同源性检索。但是，未在数据库中找到与ORF1一致的氨基酸序列。

[0126] 使用ORF1的氨基酸序列，利用APSSP2(Advanced Protein Secondary Structure Prediction Server，高级蛋白二级结构预测服务器)(http://www.imtech.res.in/raghava/apssp2/)( 参 考 Raghava,G.P.S.(2002)APSSP2:A combination method for protein secondary structure prediction based on neural network and example based learning.CASP5.A-132.，将该文献的记载作为公开的内容特别援引到本说明书中)进行了二级结构预测，结果推测出其具有两个由无规卷曲结构隔开的螺旋结构，从而暗示其为形成DNA结合蛋白中典型可见的特征性螺旋-转角-螺旋(HTH)结构的DNA结合蛋白。orf2编码的蛋白(ORF2)由385个氨基酸构成，并计算出其推测分子量为41kDa，等电点为
11.1。利用NCBI的BLAST程序对与ORF2一致的蛋白进行检索的结果是，与复制酶超家族蛋白显示出同源性。但是，作为同源性最高的蛋白，只找到仅显示出31％(80/257个氨基酸、E值6e-6)的一致性的玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)来源的复制蛋白(登记号YP_345164)。由此暗示ORF2为与质粒pKR100的复制相关的蛋白。

[0127] 例3MBE131株的系统分析

[0128] 使用由序列号7和8所示的碱基序列构成的引物组，由例1中得到的MBE131株的总DNA扩增出16S rRNA基因。使用Wizard PCR纯化试剂盒(promega公司制造)对扩增片段进行纯化，并确定出其碱基序列。MBE131株的16S rRNA基因序列与登记在数据库中的玫瑰色考克氏菌(Kocuria rosea)标准株的16S rRNA基因序列(登记号X87756)显示出99％的碱基序列的同一性。由此预测MBE131株为系统分类学上与玫瑰色考克氏菌最接近的菌种。

[0129] 例4考克氏菌MBE131株与玫瑰色考克氏菌标准株的比较

[0130] 将MBE131株在YTMN培养基中在25℃下培养2天，按照与例1同样的步骤使用质粒纯化试剂盒由得到的菌体进行质粒提取操作。另一方面，将作为保藏在菌株保藏机构的考克氏菌属细菌的玫瑰色考克氏菌标准株(NBRC15588)在相同条件下进行培养，将由培养物获得的菌体供于同样的操作。接着，将由上述两个菌株提取出的各DNA溶液供于琼脂糖电泳(参考图5)。结果，在MBE131株的情况下，检测到质粒DNA的条带，但在玫瑰色考克氏菌标准株的情况下，未检测到质粒DNA的条带。

[0131] 另外，将提取出的各DNA溶液作为模板，使用具有与pKR100的碱基序列互补的序列的正向引物和反向引物的引物组A-F(表1)实施PCR。

[0132] [表1]

[0133]

[0134] PCR中，使用LA taq聚合酶(宝生物公司制造)，将热变性条件：98℃下30秒钟、退火条件：62℃下60秒钟、延伸条件：72℃下2分钟的反应作为一次循环，总计重复30次上述循环。将得到的PCR反应物供于琼脂糖电泳，结果，在使用由MBE131株获得的DNA溶液作为模板的情况下，检测到与基于序列号1计算出的大小一致的扩增片段，但在使用由玫瑰色考克氏菌标准株获得的DNA溶液作为模板的情况下，未检测到扩增片段(参考图6)。需要说明的是，图6的泳道、引物组和用作模板的DNA的关系示于表2中。

[0135] [表2]

[0136]

[0137] 进而，将MBE131株或玫瑰色考克氏菌标准株悬浊于含有0.1mg/mL蛋白酶K的0.1％TritonX溶液中，在65℃下保温20分钟后，在100℃下加热10分钟，制备细胞溶解液。
将由各菌株得到的细胞溶解液作为模板DNA溶液，实施使用上述引物组A-F(表1)的PCR。
PCR反应中，使用LA taq聚合酶(宝生物公司制造)，将热变性条件：98℃下30秒钟、退火条件：62℃下60秒钟、延伸条件：72℃下2分钟的反应作为一次循环，总计重复30次上述循环。将得到的PCR反应物供于琼脂糖电泳，结果，在使用由MBE131株获得的细胞溶解液作为模板DNA溶液的情况下，检测到与基于序列号1计算出的大小一致的扩增片段，但在使用由玫瑰色考克氏菌标准株获得的细胞溶解液作为模板DNA溶液的情况下，未检测到扩增片段(参考图7)。由以上结果可知，玫瑰色考克氏菌标准株中不存在质粒pKR100。需要说明的是，图7的泳道、引物组和用作模板的DNA的关系示于表3中。

[0138] [表3]

[0139]

[0140] 例5穿梭载体的构建

[0141] 将包含质粒pKR100的序列号4的第7-3170号所示的碱基序列的DNA片段与金黄色葡萄球菌(Staphyrococcus aureus)来源的氯霉素抗性基因连接到pHY300PLK的多克隆位点中，构建与大肠杆菌的穿梭载体pR6632。考克氏菌属细菌MBE131株的转化通过使用由具有pR6632的大肠杆菌HB101的转化体制备的质粒并利用采用以下各条件的电穿孔来实施。质粒DNA为0.1～10μg；电场强度为6～25kV/cm；电阻为50～900Ω。细胞在脉冲处理后的孵育时间设定为30℃下3小时。

[0142] 在含有2μg/mL的氯霉素或4μg/mL的四环素的YTNM琼脂培养基上在30℃下培养5～7天。将增殖后的菌落悬浊于含有0.1mg/mL蛋白酶K的0.1％TritonX溶液中，在65℃下保温20分钟后，在100℃下加热10分钟，制备细胞溶解液。将得到的细胞溶解液作为模板DNA溶液，使用与pR6632所具有的氯霉素抗性基因的碱基序列互补的引物组(由序列号21和22所示的碱基序列构成的引物组)进行PCR。该PCR中，由于MBE131野生株和质粒pHY300PLK中不存在氯霉素抗性基因，因此，可以对导入的pR6632进行选择性检测。
PCR中，使用LA taq聚合酶(宝生物公司制造)，将热变性条件：98℃下30秒钟、退火条件：
60℃下60秒钟、延伸条件：72℃下1分钟的反应作为一次循环，总计重复30次上述循环。
将得到的PCR反应物供于琼脂糖电泳，结果，在使用由MBE131株转化株获得的细胞溶解液作为模板DNA溶液的情况下，检测到由pR6632的碱基序列计算出的扩增片段(参考图8的泳道2)。作为比较，使用野生型MBE131株进行了相同的试验，但未检测到扩增片段(参考图8的泳道3)。

[0143] 另一方面，将MBE131转化体在YTNM培养基中在30℃下培养1天，与例1同样地，使用质粒纯化试剂盒进行质粒提取操作。使用得到的DNA溶液对大肠杆菌HB101株进行转化。使用相同的质粒纯化试剂盒由大肠杆菌转化体制备质粒，用限制性酶HindIII消化后，供于琼脂糖凝胶电泳(参考图9)。作为比较对象，将用相同的限制性酶消化后的pHY300PLK也同时进行电泳(图9的泳道2)。结果，由限制性酶消化图谱可知，得到的MBE131转化株所具有的质粒为pR6632(图9的泳道3)。

[0144] 结果可知，质粒pR6632可在MBE131株中复制和保持。包含pKR100的MBE131株所具有的在YTNM固体培养基上的氯霉素抗性低于1μg/mL，与此相对，用pR6632转化后的MBE131株对50μg/mL的氯霉素显示出抗性。另外，pR6632还具有粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)来源的四环素基因，包含pKR100的MBE131株所具有的四环素抗性低于3μg/mL，与此相对，用pR6632转化后的MBE131株对100μg/mL的四环素显示出抗性。因此，认为包含pKR100的质粒在MBE131株中作为用于保持、表达异种外源性基因的载体起作用。

[0145] 例6负责复制的区域的鉴定

[0146] 利用PCR扩增出包含质粒pKR100的一部分的各种DNA片段。将上述氯霉素抗性基因连接到pHY300PLK的多克隆位点中，进而连接图4所示的各片段。使用构建的各质粒对大肠杆菌HB101进行转化，由大肠杆菌HB101转化体制备质粒。使用制备的质粒，利用上述方法对MBE131株进行转化。结果，在使用具有包含序列号1的第1031-3170号的碱基序列的片段的质粒的情况下，能够转化MBE131株(参考图4)。因此，可以说由序列号1所示的第1031-3170号的碱基序列表示的区域是在MBE131株中负责质粒的复制、保持的区域。需要说明的是，包含序列号1的第1031-3170号的碱基序列的片段如下得到。以质粒pKR100为模板，使用选自由表4所示的G～Q的正向引物和反向引物构成的引物组中的一组引物组进行PCR反应。

[0147] [表4]

[0148]

[0149] PCR反应中，使用LA taq聚合酶(宝生物公司制造)，将热变性条件：94～98℃下15～30秒钟、退火条件：55～68℃下15～60秒钟、延伸条件：72℃下2～5分钟的反应作为一次循环，总计重复30次上述循环。

[0150] 例7以异种作为宿主细胞的转化体的制作

[0151] 使用质粒pR6632，对异种考克氏菌属细菌嗜根考克氏菌DC2201(NBRC103217)进行转化。将转化体在含有2μg/mL的氯霉素或4μg/mL的四环素的YTNM琼脂培养基上在30℃下培养5～7天。将增殖后的菌落悬浊于含有0.1mg/mL蛋白酶K的0.1％TritonX溶液中，在65℃下保温20分钟后，在100℃下加热10分钟，制备细胞溶解液。将得到的细胞溶解液作为模板DNA溶液，使用与pR6632所具有的氯霉素抗性基因的碱基序列互补的引物组(由序列号21和22的碱基序列构成的正向引物和反向引物)、与四环素抗性基因的碱基序列互补的引物组(由序列号43和44的碱基序列构成的正向引物和反向引物)进行PCR。

[0152] 由于DC2201株基因组上不存在氯霉素抗性基因和四环素抗性基因，因此，可以对pR6632进行选择性检测。PCR中，使用LA taq聚合酶(宝生物公司制造)，将热变性条件：98℃下30秒钟、退火条件：60℃下60秒钟、延伸条件：72℃下1分钟的反应作为一次循环，总计重复30次上述循环。将得到的PCR反应物供于琼脂糖电泳，结果，在使用由DC2201转化株获得的细胞溶解液作为模板DNA溶液的情况下，检测到由pR6632的碱基序列计算出的扩增片段(参考图10的泳道1和2)。另外，与使用MBE131株转化体时得到的PCR扩增片段的大小也高度一致(参考图10的泳道4和5)。作为比较，使用DC2201野生株进行了相同的试验，但未检测到扩增片段(参考图10的泳道6和7)，因此可知，检测到的扩增片段来源于导入的质粒pR6632。由以上结果可知，质粒pR6632也可在DC2201株中复制和保持。

[0153] 由此认为，质粒pR6632在其他异种的考克氏菌属细菌中也能够复制和保持。不包含质粒的DC2201株所具有的在YTNM固体培养基上的氯霉素抗性低于1μg/mL，与此相对，用pR6632转化后的DC2201株对10μg/mL的氯霉素显示出抗性。因此认为，包含负责pKR100的复制的区域的质粒在异种的考克氏菌属细菌中也能够作为用于保持、表达异种外源性基因的载体起作用。

[0154] 例8pKR100中的非蛋白编码区的功能分析

[0155] 为了明确pKR100所具有的不编码蛋白的DNA碱基序列的功能，进行了以下的实验。制作包含pKR100的部分缺损的DNA片段的质粒pKR111、pKR121、pKR141。上述质粒与pR6632同样地具有氯霉素抗性基因作为选择标记物。pKR111具有来源于pKR100的第312-3170号的DNA片段，pKR121具有来源于pKR100的第559-3170号的DNA片段，pKR141具有来源于pKR100的第1031-3170号的DNA片段。pKR111和pKR121与pR6632同样具有
2组包含由近似的重复基序构成的正向重复序列和反向重复序列的特征性序列，但pKR141中仅有1组。将包含各质粒的转化体MBE131(pR6632)、MBE131(pKR111)、MBE131(pKR121)、MBE131(pKR141)在25℃下在不含抗生素的YTNM培养基中培养20代。将培养后的培养液涂布到不含抗生素的YTNM琼脂培养基上，在25℃下培养3天，形成单个菌落。将固体琼脂培养基上增殖出的各菌落同时挑取到不含抗生素的YTNM琼脂培养基和含有氯霉素的个体琼脂培养基上。计算出在含有氯霉素的固体琼脂培养基上增殖出的菌落数相对于在不含抗生素的固体琼脂培养基上增殖出的菌落数的比率作为质粒保持率(％)(参考图12)。结果可知，仅具有1组包含由近似的重复基序构成的正向重复序列和反向重复序列的特征性序列的pKR141的质粒稳定性比其他受试质粒低。即可知，pKR100的第559-1031号碱基序列具有与质粒的稳定保持相关的功能。另外，进一步将存在于pKR141中的正向重复序列删除而得到的质粒不能在MBE131株中复制(根据已记载的实施例、例6)，由此判断出，包含正向重复序列和反向重复序列的特征性序列对pKR100的复制和稳定保持担负着重要的作用。另外判断出，pKR100的第559-3170号碱基对质粒的复制、稳定性具有重要的作用。

[0156] 考克氏菌MBE131(Kocuria sp.MBE131)株在2010年1月6日以FERM P-21885的保藏编号保藏于独立行政法人产业技术综合研究所的专利生物保藏中心(邮编305-8566，茨城县筑波市东1-1-1筑波中心中央第6)。

[0157] 以下，列出本说明书中记载的某些碱基序列。

[0158] [序列号1]pKR100中的orf1区域

[0159] ATGGGCGACCCTCAGCTTGTAATGGGCTTTTTCCAGGTCTTCCTTCGTGCCTTTCTCGTACAGAGCGTCTGCTTCGAGAAGGGCCCATTCCGCTTCGACAAACTGCCGGGCAAGAAGTTTTTTGCTGGATGGCTTAGTCATGGCAAGGAACGTAGCTGCCGAAGTAGTGAAGGCTGTACAGATCCGACGCGGTTCGCGCGGGTCCGTCAGTAG[0160] [序列号2]pKR100中的orf2区域

[0161] GTGACCAGTGTAGGCACGCACCTTCCCTCGTCCACCAGCCCCGCCGCAACACGGCAGGCGGCTGTTCGGCAGGCATTTGTTAACCATTTAGGCGTGCGCCACGTGCGTGTGGCGGCCACCAAGAACGGTGCGCCGCGCACCGTTCCCATTGAGGCGTTAGGCGAGTTCGCCTTTTGGACGCCACCGGCCTGGCCCAACCTCGGATTGCTGACTATTGACGTCGACCGGGATGCGGCCGTGCTCGAGCTCTTCGCCGCCCCTGCCCTGCCGCATGTGGTCGTGGAGACCCCCCGCGGGGCCCAAGCGGTGTGGCTGATCGACCGAGTACACACCGGCCCGAACGCCCGCCCGCACCCGATCGCCTATGCCGAAACCGTAGGAAGCGCTTTGCGTGCCTCCCTGGATGGAGACTCGGCCGTGGATCCATTGCGCCCGGTACGTACCCGTAACCCCTGCTACAGACCTGCACAGCGCGATGTGTTCACCACTGCCCGCCCGCTAACGGCGCCCTACCGTCTCGGAGAGCTCCAGAAATCCCTGGATGCTGCTGGAGCATGGCCAACACGTCCTGAGCGCTCTCAGGCCCGTGGAAGGGCGCAGAAGGCCGTTGACGGAGTGTTCGTGGGCCGTAACGACGCCGTCAACCGCTCCACCTGGCTGACCGTGCGCTACGGACTCGAAAATGGTTCCGTGACTCACTGGACCGATGCCGACGTGCTGGAGCTGGCCCATGGCATTAACGAGGCCGTCGCTGCTGAGCAAGGCGTGCCGCCCTTACCCGAGGATCAAGTGCGCGACTTGGCTGTCTCGATCTGCCGGCATCAACACCGACCTGGCCGCCGAGCCATCTCCGGACAAGGCTCGGCCACCGCCCGCGCCCTCGGCGCTAAAGGCGGCGCAGCCCGTTCCGAGGCCAAAACCATTAGCGGGCGGCGCAACGTGGGCAAGGCGACCGCTGTGCGTTCCGCATCCGCGGCCTTGCGTTCTGAGAGCATCCGAATCCTGGCCGAGCAAGGGCACACCTACGAGGCCATTGCCGCCGCTGTCGGATGCTCCACTAAGACCGTTCAGCGTGCTCTTCGCGACCTCTGA

[0162] [序列号3]pKR100中的复制区

[0163] CGGTCAGGCTGGACGGTGCGTGGTCATAAACCGTGGGTCGGTTCGGAGAGCCGGGGGGTGGCTTCCTATCGTCGTGAGATGAGCAGAGAACGCTATGAGCCGATGAGTGAGGCCCGGTTGGAAGTCGCTTGGATGGTCGTGTTGCTGGGGTGTGCGCTGGTTCTTATGGGTGGGGTGGCCCTGGATGTGTTGATCGATCATCTCGCTGTCAGCTTCGCCTTGGCGGGGGTGCCGAGTGTGTTGGTGGTGGCGGTGTTGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAAGCCGTGTACGGGCACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTGGGGGAGAGTCTCGTACCCCGCGTCTCAGTGTCCTGCACACCGGTCGTGATGCCTACTGCCGCTACACGGAGCAAAGCTATGCGTTATGTGCCATAAACGCGGATCGCCCTTCGTCCAGCTCGTGGAGCTGGCTGAGTGCCTATGTGCCATAGGCGGGCGGGGGCACCCGAGCGGGCTCGTGTGAGCGCTGCGCTGGGCATAGGGAAGGCCGGGCGCTAGCCCAGCCCTCCATGGGGGCAGAGGGCCCCGTGGTGTTGAGAGTGGCGAGCCCTACTGAGGGTCCTCGAAGGCGTCGGGGGCGCTTCGTGTCCTCTTCAGTTTTTGATCCCTGGCGTCCTGAACTTCGTTCGCGACTGCCTCCGGGGTGCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCACATGGGCGACCCTCAGCTTGTAATGGGCTTTTTCCAGGTCTTCCTTCGTGCCTTTCTCGTACAGAGCGTCTGCTTCGAGAAGGGCCCATTCCGCTTCGACAAACTGCCGGGCAAGAAGTTTTTTGCTGGATGGCTTAGTCATGGCAAGGAACGTAGCTGCCGAAGTAGTGAAGGCTGTACAGATCCGACGCGGTTCGCGCGGGTCCGTCAGTAGGCCAGTGATGGGCCATAGGGTGACCAGGAAAGAGTTGAGCCCCGGAGATTCCACCCTCCGGGGCTCGACTTCCCCGATTGATAGCGGCAATCAGGAGAAGCCTTGTGACCAGTGTAGGCACGCACCTTCCCTCGTCCACCAGCCCCGCCGCAACACGGCAGGCGGCTGTTCGGCAGGCATTTGTTAACCATTTAGGCGTGCGCCACGTGCGTGTGGCGGCCACCAAGAACGGTGCGCCGCGCACCGTTCCCATTGAGGCGTTAGGCGAGTTCGCCTTTTGGACGCCACCGGCCTGGCCCAACCTCGGATTGCTGACTATTGACGTCGACCGGGATGCGGCCGTGCTCGAGCTCTTCGCCGCCCCTGCCCTGCCGCATGTGGTCGTGGAGACCCCCCGCGGGGCCCAAGCGGTGTGGCTGATCGACCGAGTACACACCGGCCCGAACGCCCGCCCGCACCCGATCGCCTATGCCGAAACCGTAGGAAGCGCTTTGCGTGCCTCCCTGGATGGAGACTCGGCCGTGGATCCATTGCGCCCGGTACGTACCCGTAACCCCTGCTACAGACCTGCACAGCGCGATGTGTTCACCACTGCCCGCCCGCTAACGGCGCCCTACCGTCTCGGAGAGCTCCAGAAATCCCTGGATGCTGCTGGAGCATGGCCAACACGTCCTGAGCGCTCTCAGGCCCGTGGAAGGGCGCAGAAGGCCGTTGACGGAGTGTTCGTGGGCCGTAACGACGCCGTCAACCGCTCCACCTGGCTGACCGTGCGCTACGGACTCGAAAATGGTTCCGTGACTCACTGGACCGATGCCGACGTGCTGGAGCTGGCCCATGGCATTAACGAGGCCGTCGCTGCTGAGCAAGGCGTGCCGCCCTTACCCGAGGATCAAGTGCGCGACTTGGCTGTCTCGATCTGCCGGCATCAACACCGACCTGGCCGCCGAGCCATCTCCGGACAAGGCTCGGCCACCGCCCGCGCCCTCGGCGCTAAAGGCGGCGCAGCCCGTTCCGAGGCCAAAACCATTAGCGGGCGGCGCAACGTGGGCAAGGCGACCGCTGTGCGTTCCGCATCCGCGGCCTTGCGTTCTGAGAGCATCCGAATCCTGGCCGAGCAAGGGCACACCTACGAGGCCATTGCCGCCGCTGTCGGATGCTCCACTAAGACCGTTCAGCGTGCTCTTCGCGACCTCTGAAACAGTCTCC[0164] [序列号4]pKR100

[0165] ATAAGCCCAAGGTGAGGGGACGCTCCCCGGGCCTCTCAGCCCCCCCTCTGAGGGCTCCTGCGGGCACCTCCTACGATCCTCCGAACAGCCCTGATCGTCACACCTCATGCATCATTCGATGAGCCAGGTCTAGGTGACCAAACGCAGGCGGCCACAGACTCAGCTGCACTCTCATCGTGAGGTGCCCAGAGCGTCGCAACAAGGCACCGACCCAGCCTCAATTTTCATCCGCCGGCCTTAACGGCGACCGTCACTGTTGATGACTTTTGCTGTCCTCGAATCACCCTTCGCGGGTGAGGGGTAACCCGCTTCGGGTGAGGCAACCAGAACGGGTCCCTGTGCTCGGCTATGTGGTCGAGCAGGTGCCTGGTGGGGTGGCGTGGTCGTTGTCGGCGGGCCGGTTTCGGGCGCGCTGGGGTGACCTAGCTGTGCGCACCGAGGACCGGTGCGAAGGACAAGATGAGCGTCTTTCCCGAGGGCCGGCCAAAGAATGCAAGAGGTGTGACGACTTGGATCAGAGTTCGGAGCTCCGACGCATTGGGAGGTGATTGGGTGCAGCGTGAGACCAGTCCGTAGCGTTTGACGAATGCAAATGCGACGCGGGGACCAGGAGGCTAGACATCGTCGAGATATGGCTTGGATTCTGGTGCTGCTGGCTGGAGTGCAGGTGGGTTTGCTGGCGACGGTGATCGGTGTCTTGGTCGAGGACCTCGTGGTGGGCACTGTCGTTGCTTTGGTTCCTGGGGCTGTGGTGGTGGGGCTGTGGTGGCGGCGGTTTTTGGACTAGCCGGCGTTGCTGGGCATGGAAAAAGCCGGGCTGCTGCCCGGCTTTTTCTTCTGGGAGGCGGGGCCTGGTCAACCGGGCCTCCCGGGAAGCGGTGGTGTGAGCACGTCAGTTCCCGCCTCCAGTGTTGGCCGTTCTTCGGTTTGTTCCCAAAAGTGACGGCGATGGGTGGGTGGAAGGTCCCGTCCAGGTCTGATTTGCCGGCACAGGTTGCTGGGCCGGGGTTGTCCCCGTAGGGGTCTGTCCCGGTCAGGCTGGACGGTGCGTGGTCATAAACCGTGGGTCGGTTCGGAGAGCCGGGGGGTGGCTTCCTATCGTCGTGAGATGAGCAGAGAACGCTATGAGCCGATGAGTGAGGCCCGGTTGGAAGTCGCTTGGATGGTCGTGTTGCTGGGGTGTGCGCTGGTTCTTATGGGTGGGGTGGCCCTGGATGTGTTGATCGATCATCTCGCTGTCAGCTTCGCCTTGGCGGGGGTGCCGAGTGTGTTGGTGGTGGCGGTGTTGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAAGCCGTGTACGGGCACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTGGGGGAGAGTCTCGTACCCCGCGTCTCAGTGTCCTGCACACCGGTCGTGATGCCTACTGCCGCTACACGGAGCAAAGCTATGCGTTATGTGCCATAAACGCGGATCGCCCTTCGTCCAGCTCGTGGAGCTGGCTGAGTGCCTATGTGCCATAGGCGGGCGGGGGCACCCGAGCGGGCTCGTGTGAGCGCTGCGCTGGGCATAGGGAAGGCCGGGCGCTAGCCCAGCCCTCCATGGGGGCAGAGGGCCCCGTGGTGTTGAGAGTGGCGAGCCCTACTGAGGGTCCTCGAAGGCGTCGGGGGCGCTTCGTGTCCTCTTCAGTTTTTGATCCCTGGCGTCCTGAACTTCGTTCGCGACTGCCTCCGGGGTGCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCACATGGGCGACCCTCAGCTTGTAATGGGCTTTTTCCAGGTCTTCCTTCGTGCCTTTCTCGTACAGAGCGTCTGCTTCGAGAAGGGCCCATTCCGCTTCGACAAACTGCCGGGCAAGAAGTTTTTTGCTGGATGGCTTAGTCATGGCAAGGAACGTAGCTGCCGAAGTAGTGAAGGCTGTACAGATCCGACGCGGTTCGCGCGGGTCCGTCAGTAGGCCAGTGATGGGCCATAGGGTGACCAGGAAAGAGTTGAGCCCCGGAGATTCCACCCTCCGGGGCTCGACTTCCCCGATTGATAGCGGCAATCAGGAGAAGCCTTGTGACCAGTGTAGGCACGCACCTTCCCTCGTCCACCAGCCCCGCCGCAACACGGCAGGCGGCTGTTCGGCAGGCATTTGTTAACCATTTAGGCGTGCGCCACGTGCGTGTGGCGGCCACCAAGAACGGTGCGCCGCGCACCGTTCCCATTGAGGCGTTAGGCGAGTTCGCCTTTTGGACGCCACCGGCCTGGCCCAACCTCGGATTGCTGACTATTGACGTCGACCGGGATGCGGCCGTGCTCGAGCTCTTCGCCGCCCCTGCCCTGCCGCATGTGGTCGTGGAGACCCCCCGCGGGGCCCAAGCGGTGTGGCTGATCGACCGAGTACACACCGGCCCGAACGCCCGCCCGCACCCGATCGCCTATGCCGAAACCGTAGGAAGCGCTTTGCGTGCCTCCCTGGATGGAGACTCGGCCGTGGATCCATTGCGCCCGGTACGTACCCGTAACCCCTGCTACAGACCTGCACAGCGCGATGTGTTCACCACTGCCCGCCCGCTAACGGCGCCCTACCGTCTCGGAGAGCTCCAGAAATCCCTGGATGCTGCTGGAGCATGGCCAACACGTCCTGAGCGCTCTCAGGCCCGTGGAAGGGCGCAGAAGGCCGTTGACGGAGTGTTCGTGGGCCGTAACGACGCCGTCAACCGCTCCACCTGGCTGACCGTGCGCTACGGACTCGAAAATGGTTCCGTGACTCACTGGACCGATGCCGACGTGCTGGAGCTGGCCCATGGCATTAACGAGGCCGTCGCTGCTGAGCAAGGCGTGCCGCCCTTACCCGAGGATCAAGTGCGCGACTTGGCTGTCTCGATCTGCCGGCATCAACACCGACCTGGCCGCCGAGCCATCTCCGGACAAGGCTCGGCCACCGCCCGCGCCCTCGGCGCTAAAGGCGGCGCAGCCCGTTCCGAGGCCAAAACCATTAGCGGGCGGCGCAACGTGGGCAAGGCGACCGCTGTGCGTTCCGCATCCGCGGCCTTGCGTTCTGAGAGCATCCGAATCCTGGCCGAGCAAGGGCACACCTACGAGGCCATTGCCGCCGCTGTCGGATGCTCCACTAAGACCGTTCAGCGTGCTCTTCGCGACCTCTGAAACAGTCTCCGTCGAGGTGGACATTTC

[0166] [序列号5]由pKR100中的orf1编码的ORF1

[0167] MTSVGTHLPSSTSPAATRQAAVRQAFVNHLGVRHVRVAATKNGAPRTVPIEALGEFAFWTPPAWPNLGLLTIDVDRDAAVLELFAAPALPHVVVETPRGAQAVWLIDRVHTGPNARPHPIAYAETVGSALRASLDGDSAVDPLRPVRTRNPCYRPAQRDVFTTARPLTAPYRLGELQKSLDAAGAWPTRPERSQARGRAQKAVDGVFVGRNDAVNRSTWLTVRYGLENGSVTHWTDADVLELAHGINEAVAAEQGVPPLPEDQVRDLAVSICRHQHRPGRRAISGQGSATARALGAKGGAARSEAKTISGRRNVGKATAVRSASAALRSESIRILAEQGHTYEAIAAAVGCSTKTVQRALRDL

[0168] [序列号6]由pKR100中的orf2编码的ORF2

[0169] MGDPQLVMGFFQVFLRAFLVQSVCFEKGPFRFDKLPGKKFFAGWLSHGKERSCRSSEGCTDPTRFARVRQ

[0170] [序列号7]MBE131株的系统分类分析用的正向引物

[0171] AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

[0172] [序列号8]MBE131株的系统分类分析用的反向引物

[0173] AAAGGAGGTGATCCAGCC

[0174] [序列号9]表1的引物组A的正向引物

[0175] TGGTGGCGGTGTTGTG

[0176] [序列号10]表1的引物组A的反向引物

[0177] TCGCGAACGAAGTTCAGG

[0178] [序列号11]表1的引物组B的正向引物

[0179] GCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCACATGGGCGACCCTC

[0180] [序列号12]表1的引物组B的反向引物

[0181] CACTGGCCTACTGACGGACC

[0182] [序列号13]表1的引物组C的正向引物

[0183] GGTCCGTCAGTAGGCCAGTG

[0184] [序列号14]表1的引物组C的反向引物

[0185] GGAGACTGTTTCAGAG

[0186] [序列号15]表1的引物组D的正向引物

[0187] TGGTGGCGGTGTTGTG

[0188] [序列号16]表1的引物组D的反向引物

[0189] CACTGGCCTACTGACGGACC

[0190] [序列号17]表1的引物组E的正向引物

[0191] GCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCACATGGGCGACCCTC

[0192] [序列号18]表1的引物组E的反向引物

[0193] GGAGACTGTTTCAGAG

[0194] [序列号19]表1的引物组F的正向引物

[0195] TGGTGGCGGTGTTGTG

[0196] [序列号20]表1的引物组F的反向引物

[0197] GGAGACTGTTTCAGAG

[0198] [序列号21]与pR6632所具有的氯霉素抗性基因的碱基序列互补的正向引物[0199] GTTACAATAGCGACGGAGAG

[0200] [序列号22]与pR6632所具有的氯霉素抗性基因的碱基序列互补的反向引物[0201] AGGTTAGTGACATTAGAAAACC

[0202] [序列号23]表4的引物组G的正向引物

[0203] ATTAAAGCTTCCAAGGTGAGGGGACGC

[0204] [序列号24]表4的引物组G的反向引物

[0205] GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG

[0206] [序列号25]表4的引物组H的正向引物

[0207] ATTAAAGCTTCCAAGGTGAGGGGACGC

[0208] [序列号26]表4的引物组H的反向引物

[0209] AAAAAAGCTTCGGCGGCCAGGTCGGTGTTGATGC

[0210] [序列号27]表4的引物组I的正向引物

[0211] TTTTAAGCTTCGGGTGAGGCAACCAGAAC

[0212] [序列号28]表4的引物组I的反向引物

[0213] GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG

[0214] [序列号29]表4的引物组J的正向引物

[0215] ATTGGAAGCTTCGTGAGACCAGTCC

[0216] [序列号30]表4的引物组J的反向引物

[0217] GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG

[0218] [序列号31]表4的引物组K的正向引物

[0219] TTTTAAGCTTGGACTAGCCGGCGTTGC

[0220] [序列号32]表4的引物组K的反向引物

[0221] GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG

[0222] [序列号33]表4的引物组L的正向引物

[0223] AAGGGTAAGCTTCGGTCAGGCTGGACGGTGCGTGG[序列号34]表4的引物组L的反向引物[0224] GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG

[0225] [序列号35]表4的引物组M的正向引物

[0226] AAGGAAGCTTGTGCGCTAAGCCGTGTACG

[0227] [序列号36]表4的引物组M的反向引物

[0228] GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG

[0229] [序列号37]表4的引物组O的正向引物

[0230] TTTTAAGCTTCTCGTACCCCGCGTCTCAG

[0231] [序列号38]表4的引物组O的反向引物

[0232] GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG

[0233] [序列号39]表4的引物组P的正向引物

[0234] CACCCGAAGCTTCTCGTGTGAGCGCTGCG

[0235] [序列号40]表4的引物组P的反向引物

[0236] GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG

[0237] [序列号41]表4的引物组Q的正向引物

[0238] AGGTTAAGCTTGGTCCGTCAGTAGGCCAGTG

[0239] [序列号42]表4的引物组Q的反向引物

[0240] GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG

[0241] [序列号43]与pR6632所具有的四环素抗性基因的碱基序列互补的正向引物[0242] GTAACCAGCCAACTAATGAC

[0243] [序列号44]与pR6632所具有的四环素抗性基因的碱基序列互补的反向引物[0244] CTCGTAATGGTTGTAGTTGC

[0245] [序列号45]从pKR100的复制区中除去orf1区域和orf2区域而得到的区域[0246] CGGTCAGGCTGGACGGTGCGTGGTCATAAACCGTGGGTCGGTTCGGAGAGCCGGGGGGTGGCTTCCTATCGTCGTGAGATGAGCAGAGAACGCTATGAGCCGATGAGTGAGGCCCGGTTGGAAGTCGCTTGGATGGTCGTGTTGCTGGGGTGTGCGCTGGTTCTTATGGGTGGGGTGGCCCTGGATGTGTTGATCGATCATCTCGCTGTCAGCTTCGCCTTGGCGGGGGTGCCGAGTGTGTTGGTGGTGGCGGTGTTGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAAGCCGTGTACGGGCACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTGGGGGAGAGTCTCGTACCCCGCGTCTCAGTGTCCTGCACACCGGTCGTGATGCCTACTGCCGCTACACGGAGCAAAGCTATGCGTTATGTGCCATAAACGCGGATCGCCCTTCGTCCAGCTCGTGGAGCTGGCTGAGTGCCTATGTGCCATAGGCGGGCGGGGGCACCCGAGCGGGCTCGTGTGAGCGCTGCGCTGGGCATAGGGAAGGCCGGGCGCTAGCCCAGCCCTCCATGGGGGCAGAGGGCCCCGTGGTGTTGAGAGTGGCGAGCCCTACTGAGGGTCCTCGAAGGCGTCGGGGGCGCTTCGTGTCCTCTTCAGTTTTTGATCCCTGGCGTCCTGAACTTCGTTCGCGACTGCCTCCGGGGTGCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCAC

[0247] [序列号46]DNA结合蛋白结合序列1

[0248] TCGGAGCTCCGA

[0249] [序列号47]DNA结合蛋白结合序列2

[0250] TGATCGATCA

[0251] [序列号48]重复基序的重复单元1

[0252] TGGCGTGGTCGTTG

[0253] [序列号49]重复基序的重复单元2

[0254] GCGCTGGGGTG

[0255] [序列号50]重复基序的重复单元3

[0256] TGGGGCTGTGGTGG

[0257] [序列号51]重复基序的重复单元4

[0258] GCGGTGGTGTG

[0259] [序列号52]重复基序的重复单元5

[0260] GGGCCGGGGTTG

[0261] [序列号53]重复基序的重复单元6

[0262] GCCGGGGTTGT

[0263] [序列号54]重复基序的重复单元7

[0264] TGGTCGTGTTG

[0265] [序列号55]重复基序的重复单元8

[0266] TGTTGCTGGGGTG

[0267] [序列号56]重复基序的重复单元9

[0268] TGGCGGTGTTGTGG

[0269] [序列号57]重复基序的重复单元10

[0270] GGGGTGCCGGTGG

[0271] [序列号58]氧化剂敏感性序列1

[0272] TGTGGGGTGGCCCCTCAGCGAAATA

[0273] [序列号59]氧化剂敏感性序列2

[0274] GGCCTCTCAGC

[0275] [序列号60]氧化剂敏感性序列3

[0276] CTGCGGGCACCTCCTAC

[0277] [序列号61]氧化剂敏感性序列4

[0278] GGTGAGGGGTAACCC

[0279] [序列号62]氧化剂敏感性序列5

[0280] GTGGGGTGGC

[0281] [序列号63]氧化剂敏感性序列6

[0282] GGGGGGTGGCTTCCTATCG

[0283] [序列号64]氧化剂敏感性序列7

[0284] GTGGGGTGGCCC

[0285] [序列号65]氧化剂敏感性序列8

[0286] TGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAA

[0287] [序列号66]氧化剂敏感性序列9

[0288] GCGGGGGCACCCGA

[0289] [序列号67]氧化剂敏感性序列10

[0290] CTGAGGGTCCTC

[0291] [序列号68]反向重复序列1

[0292] GAAAAAGCCGGGCTGCTGCCCGGCTTTTTC

[0293] [序列号69]反向重复序列2

[0294] CACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTG

[0295] 产业上的可利用性

[0296] 使用本发明将有用基因导入作为宿主细胞的考克氏菌属细菌中时，能够得到赋予了有用的生物学功能的转化体。这种转化体能够进一步提高宿主细胞原来具备的高耐有机溶剂性、耐重金属性、增殖能力等，能够在食品工业、燃料/医药化学产品的制造、环境净化等领域中有效利用。