一种苦皮藤素母液及其制备方法和质量检测方法

摘要

本发明涉及一种苦皮藤素母液及其水乳剂，以及它们的制备方法和质量检测方法。所述苦皮藤素母液，含有以下质量百分含量的活性成分：苦皮素A 1.9~3.5%，苦皮素B 3.0~5.0%，苦皮素G2.5~4.0%，苦皮素E 2.50~4.10%。该苦皮藤素母液采用超声循环提取的方法制备得到，质量检测方法采用IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术。本发明的苦皮藤素母液含量大幅提高，质量检测方法准确性和稳定性、重复性和可行性也较高。

权利要求

1.一种苦皮藤素母液的质量检测方法，包括以下步骤：

1)对苦皮藤素母液进行提取，得到含有活性成分组的苦皮藤素母液特征提取物；

所述苦皮藤素母液的制备方法，包括：称取苦皮藤根或/和皮，粉碎，用体积为5～7倍的苯于45～55℃下超声循环提取1～2次，每次提取35～55分钟，滤液合并后减压浓缩成浸膏，即得苦皮藤素母液；

所述苦皮藤素母液特征提取物的制备方法，包括：称取苦皮藤素母液，过滤后在55～

65℃下减压浓缩，回收溶剂至浸膏状，浸膏用6～10倍量体积、80％～90％的甲醇溶解后，再用3～5倍量体积的石油醚萃取1～2次，每次萃取20～40分钟，甲醇层过滤后减压浓缩，回收溶剂至干，即得苦皮藤素母液特征提取物；

2)对苦皮藤素母液特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述苦皮藤素母液特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；

所述苦皮藤素母液特征提取物中的活性成分特征峰为：C-15吸收峰，其化学位移为δC

60.0～66.0；选择C-8作为特征峰进一步区别苦皮素A、苦皮素E、苦皮藤素C，C-8的化学位移为δC 73.3～74.7；选择C-11作为特征峰进一步区别苦皮素C、苦皮素F和苦皮藤素II，C-11的化学位移为δC 82.5～83.9；

所述标准参照品为苦皮素A；

3)通过定量分析手段测定得到苦皮藤素母液中所述标准参照品的绝对含量；

4)利用各活性成分特征峰峰强度及相应的标准参照品的特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤素母液中各活性成分的含量及活性成分组的含量。

2.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的苦皮藤素母液中标准参照品的质量百分含量；所述定量分析手段为高效液相色谱法。

3.根据权利要求1或2所述的质量检测方法，其特征在于，步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：其中：

X1为步骤3)用定量分析手段测定的苦皮藤素母液中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；

M1为所述某一活性成分对应的标准参照品的分子量；

h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤素母液特征提取物中所述某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；

Xn为苦皮藤素母液中某一活性成分的质量百分含量；

Mn为某一活性成分的分子量；

hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤素母液特征提取物中某一活性成分的特征峰峰强度。

4.根据权利要求3所述的质量检测方法，其特征在于，计算苦皮藤素母液中各活性成分的系数和总系数的公式为：其中Fn为苦皮藤素母液中某一活性成分与其对应的标准参照品质量百分含量的比值系数；M1、h1、Mn和hn的含义同权利要求3中的相应定义，总系数指各活性成分的系数Fn之和。

说明书

一种苦皮藤素母液及其制备方法和质量检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物源农药技术领域，具体地，涉及了一种苦皮藤素母液及其水乳剂，以及它们的制备方法和质量检测方法。

背景技术

[0002] 植物源农药属生物农药范畴内的一个分支，是用植物中所含的某类稳定成分作为活性成分实施杀虫、杀菌等作用。由于这些活性成分来源于植物本身，易于自然分解；且具有结构的多样性，有害生物难以产生抗药性。因此，植物源农药是今后世界各国绿色农药发展的主要方向之一。国内植物源农药包括除虫菊、苦楝素、苦参碱、烟碱类杀虫剂和苦皮藤素杀虫剂等[①魏艳敏.生物农药及其应用技术问答.中国农业大学出版社2007；②侯太平.植物农药研究进展.中国农业科技导报2006,8(6):12]。

[0003] 苦皮藤(Celastrus Angulatus Marim)为卫矛科(Celastraceae)南蛇藤属(Celastrus)多年生落叶藤状灌木植物，又名苦树皮、落霜红、扶芳藤、菜虫药、萝卜药，其根皮粉、叶子粉和茎皮粉在我国民间有着悠久的防治病虫害历史，是我国最有开发潜力的少数杀虫植物之一[卢令娴,等.杀虫植物苦皮藤引种繁殖研究初报.湖北林业科技,1987,3:8]。苦皮藤在我国拥有丰富的自然资源，在河南、陕西、湖北等10多个省丘陵山域均有分布生长[吴文君.杀虫植物苦皮藤研究概况.植物保护,1993,3(17):34.]。有关苦皮藤的杀虫活性研究已有较多报道，且已经证实苦皮藤提取物具有杀虫活性强、不易产生抗药性等特点[柯治国,等.杀虫植物——苦皮藤种子的研究.第三届湖北湖南植保农药学术研讨会论文集,2004,294.]。已从苦皮藤中分离出多种有效成分，并明确其对昆虫具有拒食、麻醉、毒杀等多样的生物活 性，可用来防治蔬菜上的菜青虫、稻苞虫、水稻的粘虫、芫菁叶蜂幼虫、贮粮害虫玉米象等[吴文君.植物杀虫剂苦皮藤素研究与应用.化学工业出版社,2010.]。目前，苦皮藤素杀虫剂主要液体剂型有1%苦皮藤素乳油[CN94103655.3；
1%苦皮藤素乳油正式农药登记证（PD20101574）]、0.2%苦皮藤素乳油[CN92113104.6]、
0.5%苦皮藤素微乳剂[CN99109275.9]、6%苦皮藤素母液[6%苦皮藤素母液正式农药登记证（PD20101575）]等。

[0004] 文献报道以及现有产品采用的苦皮藤的提取分离方法均为溶剂回流法、渗滤法等传统方法，这些方法耗时费事，提取率低。超声技术作为一种有效的提取方法，已经广泛应用于天然产物的提取研究中[付桂香,等.不同种及不同采收时间沙棘叶中总黄酮的含量测定与比较.中国中药杂志,1997,22(3):147～148.]。超声循环技术是在料液循环流动的过程中施加超声波的天然产物提取新技术[郑明昱;郑玲玲;温丽颖;吴英子;郭建鹏;老鹳草鞣质超声循环提取工艺研究中国实验方剂学杂志,2010,16(12):7.]，具有提取温度低、提取效率高、提取时间短的独特优势。我们对野生苦皮藤进行了深入、系统的研究[Hai-Lin Qin，et al.ANew Sesquiterpene from Celastrus Angulatus.Chin Chem Lett，1999，10(10)：825-826；Hai-Yan Zhang,et al.Two new sesquiterpene polyol esters from the root barks of Celastrus angulatus.Journal of asian natural products research,2011,13(4):304.]，找到了一系列杀虫活性成分并确定了其化学结构，并经超声循环提取其中的杀虫活性物质，制成绿色农药苦皮藤素母液。

[0005] 苦皮藤的品质不在于某个单一活性成分，其效果是多个活性成分协同配比的结果。研究证明苦皮藤中主要杀虫活性成分是以β-二氢沉香呋喃倍半萜骨架的多元醇酯化合物及其生物碱，统称苦皮藤素。苦皮藤素含有以苦皮素A、苦皮素B为主的多种杀虫成分。目前，苦皮 藤素母液中苦皮藤素组分的检测方法：一是测定苦皮藤素母液水解后产生的苯甲酸，操作步骤极其复杂，结果不可靠，可行性差；二是仅对其中一个组分苦皮素A(或苦皮藤素V)进行定量分析[吴文君,等.植物杀虫剂0.2%苦皮藤素乳油的研究与开发.Pesticides(农药),2001,40(3):17.]，这种针对单一成分进行定量分析的质量检测模式不能有效控制苦皮藤素母液的内在质量，无法满足当前对于客观有效地评价和控制苦皮藤产品质量的迫切要求。指纹图谱技术己成为国际公认的区别评价植物天然产物及其原料的最有效的手段[罗国安,等.中药指纹图谱的分类和发展.中国新药杂志,2002,11(1):46.]。目前关于苦皮藤素母液及其水乳剂指纹图谱未见报道。

[0006] IGD核磁共振碳谱偶联（IGD13C NMR coupling）指纹图谱技术，也叫反门控去偶1
核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，是在已研究多年的核磁共振氢谱（H NMR）指纹图谱技术
1
[赵天增,等.HNMR指纹法鉴定植物中药.中草药，2000,31(11):868-870.]的基础上联合其他技术（例如目前应用最广泛的高效液相（HPLC）指纹图谱技术）提出的一种新的非单一手段综合指纹图谱技术。

[0007] 随着药品、食品安全日益受到国家和社会的高度重视，可广泛应用于无公害蔬菜、农作物和非作物类的害虫防治的苦皮藤素需求量很大，为IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术的应用提供了广阔的基础。苦皮藤素母液及其水乳剂IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术的研究与应用，不仅可以解决其中活性成分的定性问题，也为加强其内在成分研究的系统化与标准化，加快植物源农药苦皮藤素现代化的发展，实现与国际接轨提供了科学的保证。随着该技术在其他中药材及其提取物、植物源农药中的推广应用，该技术的重大科学价值必将日趋突出。

发明内容

[0008] 为了解决植物源农药现有技术、质量等方面存在的问题，本发明 的目的在于，提供一种优良的植物源农药苦皮藤素母液及其水乳剂。

[0009] 本发明的另一目的在于，提供一种所述苦皮藤素母液及其水乳剂的制备方法。

[0010] 本发明的又一目的在于，提供一种所述苦皮藤素母液及其水乳剂的质量检测方法。

[0011] 为实现上述目的，本发明提供的一种苦皮藤素母液，其中含有以下质量百分含量的活性成分：苦皮素A1.9~3.5%，苦皮素B3.0~5.0%，苦皮素G2.5~4.0%，苦皮素E2.50~4.10%。

[0012] 本发明提供的苦皮藤素母液，优选地，其中还含有以下质量百分含量的活性成分：苦皮素C、苦皮藤素II和苦皮素F1.2~3.5%，苦皮藤素IV0.3~1.0%，苦皮素A、苦皮素E和苦皮藤素C（celangulatinC）3.0~4.5%，苦皮素H0.3~2.0%。

[0013] 本发明苦皮藤素母液中的所述活性成分均为4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物。

[0014] 即，本发明本发明提供的苦皮藤素母液，其中含有以下质量百分含量的活性成分：苦皮素A1.9~3.5%，苦皮素B3.0~5.0%，苦皮素C、苦皮藤素II和苦皮素F1.2~3.5%，苦皮素G2.5~4.0%，苦皮藤素IV0.3~1.0%，苦皮素A、苦皮素E和苦皮藤素C（celangulatinC）
3.0~4.5%，苦皮素H0.3~2.0%。

[0015] 其中，苦皮素C的质量百分含量为0.35~1.40%，苦皮素F的质量百分含量为0.10~0.90%，苦皮藤素II的质量百分含量为0.60~1.21%，苦皮藤素C（celangulatin C）的质量百分含量为0.30~0.55%。

[0016] 本发明所述苦皮藤母液中各活性成分（4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物）总的质量百分含量不小于10%。

[0017] 进一步地，苦皮藤母液中各活性成分总的质量百分含量为11.5~18.5%。

[0018] 更进一步地，品种为河南淅川的苦皮藤母液中活性成分总的质量百分含量为16.3~18.4%，品种为陕西宝鸡的苦皮藤母液中活性成分总的质量百分含量为11.7~13.2%。

[0019] 本发明提供的苦皮藤素母液的制备方法包括：称取苦皮藤根或/和皮，粉碎，用体积为5~7倍的苯于45~55℃下超声循环提取1~2次，滤液合并后减压浓缩成浸膏，即得苦皮藤素母液。

[0020] 进一步地，苦皮藤根或/和皮粉碎后过10~24目筛，优选24目。

[0021] 进一步地，超声循环提取时，每次提取35~55分钟，优选55分钟。

[0022] 进一步地，超声循环提取的温度优选50℃。

[0023] 进一步地，浓缩的浸膏的密度为1.1~1.3。

[0024] 苦皮藤根或/和皮中的活性成分，除了本发明苦皮藤素母液所述的成分外，还包括苦皮素U、X；苦皮素P、苦皮藤素VII、苦皮藤素XIX；苦皮素J、苦皮藤素III等4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物，以及黄酮、生物碱、三萜等其他类别的成分。

[0025] 本发明提供的一种苦皮藤素水乳剂，包含所述苦皮藤素母液。

[0026] 本发明提供的所述苦皮藤素水乳剂，包括以下重量份的成分：所述苦皮藤素母液15~20份，乳化剂8~12份，抗冻剂3~4份。

[0027] 其中，所述乳化剂为：烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚或烷基芳基聚氧乙烯聚氧乙烯醚，优选烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚。

[0028] 其中，所述抗冻剂为：乙二醇或丙二醇，优选乙二醇。

[0029] 本发明提供的一种苦皮藤素水乳剂，还包括溶剂。

[0030] 其中，溶剂为水。

[0031] 本发明所述的苦皮藤素水乳剂，其中的辅料，即乳化剂、抗冻剂以及溶剂，也可以是本领域的常规种类及用量。还可以使用助剂，也是本领域的常规选择。

[0032] 本发明所述苦皮藤素水乳剂中各活性成分（4-OH-β-二氢沉香呋 喃倍半萜多醇酯类化合物）的总的质量百分含量不小于2%。

[0033] 进一步地，苦皮藤水乳剂中各活性成分总的质量百分含量为2.3~3.0%。

[0034] 更进一步地，品种为河南淅川的苦皮藤母液中活性成分总的质量百分含量为2.7~3.0%，品种为陕西宝鸡的苦皮藤母液中活性成分总的质量百分含量为2.3~2.7%。

[0035] 本发明提供的所述苦皮藤素水乳剂的制备方法，包括：将所述苦皮藤素母液与乳化剂、抗冻剂和溶剂按所述比例混合，即得。

[0036] 本发明提供的苦皮藤素母液的质量检测方法，包括以下步骤：

[0037] 1）对苦皮藤素母液进行提取，得到含有活性成分组的苦皮藤素母液特征提取物；

[0038] 2）对苦皮藤素母液特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述苦皮藤素母液特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式（IGD核磁共振碳谱指纹图谱）测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；

[0039] 3）通过定量分析手段测定得到苦皮藤素母液中所述标准参照品的绝对含量；

[0040] 4）利用所述特征峰峰强度（各活性成分特征峰峰强度及相应的标准参照品的特征峰峰强度）的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤素母液中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量，即活性成分组的含量。

[0041] 其中，步骤1）中，苦皮藤素母液特征提取物的制备方法，包括：称取苦皮藤素母液，过滤后在55~65℃下减压浓缩，回收溶剂至浸膏状，浸膏用6~10倍量体积、80%~90%的甲醇溶解后，再用3~5倍量体积的石油醚萃取1~2次，甲醇层过滤后减压浓缩，回收溶剂至干，即得苦皮藤素母液特征提取物。

[0042] 进一步地，用石油醚萃取，每次萃取20~40分钟，优选30分钟。

[0043] 进一步地，苦皮藤素母液过滤后优选在60℃下减压浓缩。

[0044] 苦皮藤素母液特征提取物处理及检测方法如下：取苦皮藤素母液特征提取物，溶于CDCl3中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测。

[0045] 其中，步骤2）中，所述苦皮藤素母液特征提取物中的活性成分特征峰为：C-15吸收峰，其化学位移为δC60.0~66.0。

[0046] 进一步地，选择C-8作为特征峰进一步区别苦皮素A、苦皮素E、苦皮藤素C，其（C-8）化学位移为δC73.3~74.7；选择C-11作为特征峰进一步区别苦皮素C、苦皮素F和苦皮藤素II，其（C-11）化学位移为δC82.5~83.9。

[0047] 其中，步骤2）中，所述峰强度，可以采用峰高法、面积积分法或重量法计算。

[0048] 其中，步骤3）中，所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的苦皮藤素母液中标准参照品的质量百分含量。

[0049] 其中，所述定量分析手段为高效液相色谱（HPLC）法。

[0050] 进一步地，HPLC法的条件为：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料，流动相为乙腈：水=(60:40)~(55:45)的混合溶剂，流速为1mL/min，检测波长为232nm。乙腈：水优选55:45。

[0051] 其中，所述标准参照品为苦皮素A。

[0052] 其中，苦皮藤素母液中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量计算是通过偶联计算公式将IGD核磁共振碳谱和定量分析手段偶联，即步骤4）中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：

[0053] 其中：

[0054] X1为步骤3）用定量分析手段测定的苦皮藤素母液中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量（质量百分含量）；

[0055] M1为所述某一活性成分对应的标准参照品的分子量；

[0056] h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤素母液特征提取物中所述某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；

[0057] Xn为苦皮藤素母液中某一活性成分的质量百分含量；

[0058] Mn为某一活性成分的分子量；

[0059] hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤素母液特征提取物中某一活性成分的特征峰峰强度。

[0060] 通过偶联公式还可计算苦皮藤素母液中各活性成分的系数和总系数。

[0061] 进一步地，所述系数的计算公式为：

[0062]

[0063] 其中Fn为苦皮藤素母液中某一活性成分与其对应的标准参照品质量百分含量的比值系数。M1、h1、Mn和hn的含义同计算苦皮藤素母液中各活性成分含量偶联公式中的相应定义。总系数指各成分的系数之和。

[0064] 该系数Fn也同样适用于计算苦皮藤素水乳剂中的活性成分及活性成分组。

[0065] 本发明提供的苦皮藤素水乳剂的质量检测方法，利用上述方法检测得到苦皮藤素母液中某各活性成分的含量，再推算出苦皮藤素水乳剂中各活性成分的质量百分含量。这里的苦皮藤素水乳剂是由苦皮藤素母液制备得到。

[0066] 其中，苦皮藤素水乳剂中各活性成分的含量计算公式为：

[0067] Wn=W1Fn；其中：

[0068] Wn为苦皮藤素水乳剂中某一活性成分质量百分含量；

[0069] W1为用定量分析手段测定的苦皮藤素水乳剂中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量（质量百分含量）。

[0070] 其中，所述定量分析手段为高效液相色谱法。

[0071] 苦皮藤素母液或苦皮藤素水乳剂中该类活性成分的总含量就是同类的各活性成分的Wn相加之和，即活性成分组的含量，单个活性化合物系数Fn相加之和即苦皮藤素总系数。

[0072] 本发明的质量检测方法可以用来检测本发明10%的苦皮藤母液、6%的苦皮藤母液或其他浓度的苦皮藤母液，以及本发明2%的苦皮藤水乳剂、1%的苦皮藤水乳剂或其他浓度的苦皮藤素水乳剂。

[0073] 本发明方法所述活性成分组，尤其是将苦皮藤药材进行超声循环提取后，得到的苦皮藤素母液和苦皮藤素水乳剂中的活性成分组。

[0074] 本发明的苦皮藤药材，是指苦皮藤植物的根或/和皮的部位。

[0075] 本发明各活性成分的含量及该类活性成分的总含量的计算，是通过偶联公式将13
IGD核磁共振碳谱和分析定量手段偶联。和现有技术相比，本发明采用IGD C NMR偶联指纹图谱具有下面几个特点：

[0076] ①稳定性（重复性）：IGD13C NMR得到的化学位移数据为小数点后第二位，分辩性好，重复性好；HPLC、GC的非色谱条件（如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等）改变等，得到的保留时间数据变化很大，意味着整体色谱图形的变异，重复性不好。

[0077] ②整体性（全面性）：IGD13C NMR指纹图谱中包含样品中的每一个活性成分碳的相应谱峰；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。

[0078] ③可靠性（单一性）：IGD13C NMR谱峰与样品中不同活性成分及其不同基团上的碳是严格的一一对应关系；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。

[0079] ④可行性（易辨性）：IGD13C NMR指纹图谱规律性很强，一般情况下，可归属图谱中的每一个碳峰；HPLC、GC需要对照品；IR不易解析；UV信息量少；MS则有离子化程度和基质干扰等问题。

[0080] 本发明针对苦皮藤素母液中活性成分的多样性、复杂性，及高效液相色谱指纹图1
谱和核磁共振氢谱（H NMR）指纹图谱的局限性，构建IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，反映出苦皮藤素母液中含有哪些β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物，及其它们各自的含 量、比例关系以及总含量，达到对苦皮藤素母液及其水乳剂质量检测和控制的目的。
准确性和稳定性、重复性和可行性与现有技术相比有很大的提高。使得苦皮藤素母液及苦皮藤素水乳剂成分明确、含量清楚、质量可控、性能稳定，加强了苦皮藤素母液及其水乳剂内在成分研究的系统化与标准化。

[0081] 本发明的苦皮藤素母液（即10%苦皮藤素母液）与现有的苦皮藤素母液（即6%苦皮藤素母液）相比，主要优势体现在苦皮藤素含量的大幅提高。

[0082] 并且，由本发明苦皮藤素母液（10%）配制的苦皮藤素水乳剂（2%）属于生产环境友好型农药，而6%苦皮藤素母液配制的1%苦皮藤素乳油，由于污染较大，环保性差，工业和信息化部在工原[2009]第29号文件中第四项明文规定：“自2009年8月1日起不再颁发农药乳油产品批准证书”，也就是说，其生产已与其他农药乳油产品一起叫停。

[0083] 微乳剂在发展初期曾因乳化剂、助溶剂用量较大而引起人们的忧虑，而且稳定性较差、成本较高，微乳剂在国际上不是剂型开发的趋势[华乃震.水基化制剂的开发和前景.农药2006,45(12):805.]。另外，0.5%苦皮藤素微乳剂由于临时批号到期已不再生产。

[0084] 因此，本发明苦皮藤素母液活性成分含量高，苦皮藤素水乳剂的防治效果已超过1%苦皮藤素乳油，其优点突出表现在污染小，属于生产环境友好型农药；且见效快、稳定性好、成本低，利于推广，具有很高的应用价值与经济价值。

附图说明

[0085] 图1-a为实施例210%苦皮藤素母液A（河南淅川）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

[0086] 图1-b为实施例210%苦皮藤素母液A（河南淅川）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。

[0087] 图2-a为实施例210%苦皮藤素母液B（河南淅川）特征提取物 IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

[0088] 图2-b-1为实施例210%苦皮藤素母液B（河南淅川）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱C-8特征峰局部拉宽放大图。

[0089] 图2-b-2为实施例210%苦皮藤素母液B（河南淅川）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱C-15特征峰局部拉宽放大图。

[0090] 图3-a为实施例210%苦皮藤素母液C（河南淅川）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

[0091] 图3-b-1为实施例210%苦皮藤素母液C（河南淅川）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱C-8特征峰局部拉宽放大图。

[0092] 图3-b-2为实施例210%苦皮藤素母液C（河南淅川）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱C-15特征峰局部拉宽放大图。

[0093] 图4-a为实施例310%苦皮藤素母液D（陕西宝鸡）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

[0094] 图4-b-1为实施例310%苦皮藤素母液D（陕西宝鸡）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱C-8特征峰局部拉宽放大图。

[0095] 图4-b-2为实施例310%苦皮藤素母液D（陕西宝鸡）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱C-15特征峰局部拉宽放大图。

[0096] 图5-a为实施例310%苦皮藤素母液E（陕西宝鸡）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

[0097] 图5-b-1为实施例310%苦皮藤素母液E（陕西宝鸡）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱C-8特征峰局部拉宽放大图。

[0098] 图5-b-2为实施例310%苦皮藤素母液E（陕西宝鸡）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱C-15特征峰局部拉宽放大图。

[0099] 图6-a为实施例310%苦皮藤素母液F（陕西宝鸡）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

[0100] 图6-b-1为实施例310%苦皮藤素母液F（陕西宝鸡）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱C-8特征峰局部拉宽放大图。

[0101] 图6-b-2为实施例310%苦皮藤素母液F（陕西宝鸡）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱C-15特征峰局部拉宽放大图。

[0102] 图7-a为实施例56%苦皮藤素母液特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

[0103] 图7-b-1为实施例56%苦皮藤素母液特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱C-8特征峰局部拉宽放大图。

[0104] 图7-b-2为实施例56%苦皮藤素母液特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱C-15特征峰（含C-15）局部拉宽放大图。

[0105] 图8为10%苦皮藤素母液特征提取物获取程度流程图。

具体实施方式

[0106] 以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步地详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。

[0107] 1.10%苦皮藤素母液、水乳剂的制备方法

[0108] （1）10%苦皮藤素母液

[0109] 称取阴干的苦皮藤根或/和皮，粉碎后过10~24目筛，用体积为5~7倍量的苯在45~55℃下超声循环提取1~2次，每次提取35~55分钟，滤液合并后减压浓缩至密度为1.1~1.3左右的浸膏，即得10%苦皮藤素母液。

[0110] （2）2%苦皮藤素水乳剂

[0111] 10%苦皮藤素母液与乳化剂按一定比例搅拌混合后，加入一定比例抗冻剂并用水补足余量，剪切匀质后，即得2%苦皮藤素水乳剂。

[0112] 2%苦皮藤素水乳剂混合比例如下：

[0113] 10%苦皮藤素母液15~20%、乳化剂8~12%、抗冻剂3~4%、水补足余量。这里的百分号“%”为质量百分比。其中，乳化剂烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚购自：山东天道生物工程有限公司。

[0114] （3）仪器、试剂与材料

[0115] 超声循环提取循环机DST-100型，上海砥实机械设备有限公司。

[0116] 2.IGD核磁共振碳谱指纹图谱质量检测方法

[0117] （1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱质量检测方法研究步骤

[0118] 1）特征提取物获取程序研究

[0119] 准确称取10%苦皮藤素母液，过滤后在55~65℃下减压浓缩，回收溶剂蒸干至浸膏状，浸膏用6~10倍量体积、80%~90%的甲醇溶解后，再用3~5倍量体积的石油醚萃取1~2次，80%~90%甲醇层过滤后减压浓缩，回收溶剂至干，即得苦皮藤素母液特征提取物。其程序流程图如图8所示，T10指含有10种活性成分物质。

[0120] 2）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测

[0121] 取10%苦皮藤素母液特征提取物80mg，溶于0.5mLCDCl3中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。

[0122] 3）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析

[0123] ①鉴别

[0124] 特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，应清楚地显示4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的特征信号，且含有苦皮素A、E、H、celangulatin C；苦皮素B、C、F、G、苦皮藤素II、苦皮藤素IV信号。

[0125] 具体数据如下：

[0126] δC74.9-75.8或70.5-70.9,66.9-68.1,41.1-42.7,72.1-72.5，91.3-91.7分别为A环1,2,3,4,5位脂环碳信号；76.2-77.0,53.0-53.8,73.3-74.7或75.6-76.7,74.9-75.5或70.6-72.6，50.1-50.8或53.9-54.5分别为B环6,7,8,9,10位脂环碳信号，82.5~84.6为4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物C-11碳信号，29.3-30.1,26.2-26.4或25.4-25.7,24.1-24.6为4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物C-12、C-13、C-14甲基碳信号，61.4-61.8或65.0-65.7为4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物C-15亚甲基碳信号。

[0127] ②10%苦皮藤素母液特征提取物中各活性成分特征峰选取

[0128] 由于特征提取物中含有一系列活性成分4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物，碳峰交叉厉害，为了测定各活性成分的比例，必须选择化学位移差别较大的相应峰作为特征峰。为此，经实际考察，选择了δC60.0~66.0左右一组C-15峰和δC73.8左右苦皮素A C-8峰。其原因为：一般情况下，C-15峰作为连氧碳，易于辨认；C-15位受C-9上α和β位取代基的γ效应不同，其化学位移差别较大。如苦皮素A、E、H、celangulatin C的化学位移为δC61.0左右；苦皮素B、C、F、G、苦皮藤素II、苦皮藤素IV的化学位移为δC65.0左右。由于苦皮素A、E、celangulatin C以及苦皮素C、F、苦皮藤素II的C-15位峰重叠，另选择δC73.3-74.7左右C-8峰作为特征峰区别苦皮素A、苦皮素E、celangulatin C峰没有重叠，选择δC82.5-83.9左右C-11峰作为特征峰区别苦皮素C、F、苦皮藤素II。

[0129] ③标准参照品的选择

[0130] 苦皮素A是杀虫植物苦皮藤的主要杀虫活性成分之一，标准品易得。因此，选择苦皮素A作为标准参照品。

[0131] 4）采用HPLC测定10%苦皮藤素母液或2%苦皮藤素水乳剂中苦皮素A的含量[0132] ①HPLC检测

[0133] i)色谱条件

[0134] 仪器：Agilent（安捷伦）1200

[0135] 流动相：乙腈：水=55：45

[0136] 流速：1mL/min

[0137] 色谱柱:Thermo C18（Thermo十八烷基键合硅胶）250*4.6mm

[0138] 检测器：紫外

[0139] 波长：232nm

[0140] 进样量：20μL；

[0141] ii)标准参照品溶液的配制

[0142] 精确称取苦皮素A5mg，置50mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，摇匀后即得标准参照品溶液（苦皮素A100μg/mL）。

[0143] iii)标准曲线和检出限

[0144] 浓度范围：1~100μg/mL（ppm）;标准参照品浓度分别为：1μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。

[0145] 在上述色谱条件下，进行HPLC分析，苦皮素A总峰面积Y对浓度C的线性回归方程为：

[0146] Y=23.85113*C+1.25004（n=5,R=0.9995）。

[0147] 检出限为：0.5ug/mL(S/N=3)。

[0148] 根据标准曲线图，在所选的浓度范围内，苦皮素A的标准溶液的工作曲线线性关系良好。

[0149] iv)供试品溶液的制备

[0150] 准确称取10%苦皮藤素母液或2%苦皮藤素水乳剂200mg于100mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，超声振荡后稀释至刻度，摇匀后即得10%苦皮藤素母液或2%苦皮藤素水乳剂供试品溶液。

[0151] v)精密度测定

[0152] 供试品溶液重复进样3次，峰面积相对标准偏差RSD=0.22%，保留时间相对标准偏差RSD=0.11%。

[0153] vi)供试品的测定

[0154] 吸取各供试品溶液，进样，测其峰面积，求得苦皮素A含量。

[0155] vii)回收率测定

[0156] 采用标准加入方法，在供试品中加标100μg/mL，平均回收率在89.0~101.2%之间。

[0157] ②苦皮素A绝对含量计算

[0158] i)由下式计算供试品溶液中苦皮素A质量浓度

[0159]

[0160] CX：10%苦皮藤素母液或2%苦皮藤素水乳剂供试品溶液中苦皮素A质量浓度（ug/mL）；

[0161] CR：标准参照品溶液苦皮素A质量浓度（ug/mL）；

[0162] AX：由HPLC测定的10%苦皮藤素母液或2%苦皮藤素水乳剂供试品溶液中苦皮素A的峰面积；

[0163] AR：由HPLC测定的标准参照品溶液中苦皮素A的峰面积。

[0164] ii)由下式计算10%苦皮藤素母液或2%苦皮藤素水乳剂苦皮素A质量百分含量[0165]

[0166] X1(%)：10%苦皮藤素母液或2%苦皮藤素水乳剂中苦皮素A质量百分含量，即标准参照品苦皮素A的绝对含量（质量百分含量）；

[0167] CX：10%苦皮藤素母液或2%苦皮藤素水乳剂供试品溶液中苦皮素A质量浓度(ug/mL)；

[0168] W供试品：称取的10%苦皮藤素母液或2%苦皮藤素水乳剂质量(mg)。

[0169] 5）通过偶联公式计算10%苦皮藤素母液中主要活性成分含量

[0170]

[0171] Xn（%）：10%苦皮藤素母液中某一活性成分质量百分含量%；

[0172] X1（%）：10%苦皮藤素母液中苦皮素A质量百分含量%，即标准参照品苦皮素A的绝对含量（质量百分含量）；

[0173] M1：苦皮素A（标准参照品）分子量；

[0174] h1：由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的10%苦皮藤素母液特征提取物中苦皮素A（标准参照品）特征峰峰强度（峰高）；

[0175] Mn：10%苦皮藤素母液特征提取物中某一活性成分分子量；

[0176] hn：由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的10%苦皮藤素母液特征提取物中某一活性成分特征峰峰强度（峰高）。

[0177] 6）通过偶联公式计算10%苦皮藤素母液中主要单个活性成分系数与总系数[0178] 系数计算公式

[0179]

[0180] Fn：10%苦皮藤素母液中某一活性成分与苦皮素A（标准参照品）质量百分含量的比值系数；

[0181] M1：苦皮素A（标准参照品）分子量；

[0182] h1：由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的10%苦皮藤素母液特征提取物中苦皮素A（标准参照品）特征峰峰强度（峰高）；

[0183] Mn：10%苦皮藤素母液特征提取物中某一活性成分分子量；

[0184] hn：由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的10%苦皮藤素母液特征提取物中某一活性成分特征峰峰强度（峰高）。

[0185] 总系数为Fn的加和。

[0186] 该系数Fn也同样适用于计算2%苦皮藤素水乳剂中的活性成分及活性成分组。

[0187] 7）2%苦皮藤素水乳剂中主要活性成分含量及总量计算

[0188] Wn（%）=W1（%）Fn

[0189] Wn：2%苦皮藤素水乳剂中某一活性成分质量百分含量%；

[0190] W1：2%苦皮藤素水乳剂中苦皮素A质量百分含量%，即标准参照品苦皮素A的绝对含量。

[0191] （2）仪器、试剂与材料

[0192] 核磁共振波谱仪Bruker DPX400型。

[0193] 质谱仪：Waters Micromass Q-Tof MicroTM型。

[0194] 半制备高效液相色谱仪：Waters600型。

[0195] 高效液相色谱仪：Agilent1200型。

[0196] 2000mL蒸馏烧瓶、5000mL蒸馏烧瓶、球型冷凝管、2000mL分液漏斗。

[0197] DE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

[0198] DEF-6020型真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。

[0199] 柱层析硅胶G和薄层层析硅胶H：青岛海洋化工厂。

[0200] 硅胶层析柱6cm×70cm（直径×高度）。

[0201] 苦皮藤药材（河南淅川，2009年11月大量收购自当地）、苦皮藤药材（陕西宝鸡，2009年11大量收购自当地），均经河南省农业大学朱长山教授鉴定。

[0202] 苦皮素A，标准参照品，实验室自制（经光谱数据鉴定）。

[0203] 试剂：色谱纯（甲醇，天津市四友精细化学品有限公司）及分析纯（天津市化学试剂一厂）。

[0204] （3）基础研究

[0205] 1）分离提取流程

[0206] 称取阴干的河南淅川产苦皮藤根、皮1kg，粉碎，用6倍量体积苯回流提取3次，滤液合并后60℃减压浓缩，回收溶剂至浸膏状，浸膏用6倍量体积纯度80%的甲醇溶解后，60mL的石油醚萃取1次，甲醇层过滤后减压浓缩，回收溶剂得浸膏（27.5g）。取此浸膏用硅胶柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯（10：1~4：6）溶剂体系进行梯度洗脱，每250mL收集1份，合并相同馏分。第38份经制备色谱纯化，得苦皮素E（18mg）；第42~43份得苦皮素A纯品（60mg）；第47份经制备纯化得celangulatin C(41mg);第54份经制备色谱纯化，得苦皮素B（25mg），苦皮素H（40mg）；第61份得苦皮素G（95mg）；第69~70份经制备色谱纯化，得苦皮素F（45mg）。

[0207] 称取阴干的河南西峡苦皮藤根皮粉末1kg，加3倍量苯80℃温度下回流提取三次，过滤，合并滤液。减压真空浓缩为浸膏。按此方法共提取苦皮藤根皮粉末7kg，合并所有粗提液。粗提液经过减压真空浓缩为膏状物质（粗提物）。粗提物浸膏为206g。在粗提物浸膏中加入4200mL80%甲醇溶解后，300mL石油醚萃取1次，得甲醇部分浸 膏113.3g。取此浸膏用硅胶柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯（10:1~4:6）溶剂体系进行梯度洗脱（每500mL收集一份），经高效液相制备纯化得到下列β-二氢沉香呋喃多元醇酯类化合物。第66~70份经制备纯化，得苦皮素A纯品（60mg）；第80份经制备纯化得苦皮素E（18mg）；第127份经制备纯化得苦皮素H（40mg）和苦皮素B（60mg）；第161份经制备纯化得苦皮素G（95mg），第203份经制备纯化得苦皮素C。

[0208] 苦皮藤素II、IV数据见文献[吴文君.植物杀虫剂苦皮藤素研究与应用.化学工业出版社,2010]。

[0209] 2）10%苦皮藤母液及2%水乳剂中主要活性成分的结构及核磁共振碳谱数据[0210]

[0211] 苦皮素A:R1=R4=OiBu,R2=R5=H,R3=OBz,R6=OH,R7=OAc

[0212] 苦皮素B:R1=R5=OiBu,R2=OFu,R3=R4=H,R6=R7=OAc

[0213] 苦皮素C:R1=R5=OiBu,R2=OBu,R3=R4=H,R6=R7=OAc

[0214] 苦皮素E:R1=OiPet,R2=R5=H，R3=OBz,R4=OiBu,R6=OH,R7=OAc

[0215] 苦皮素F:R1=R6=R7=OAc,R2=R5=OFu,R3=R4=H

[0216] 苦皮素G:R1=R6=R7=OAc,R2=OFu,R3=R4=H,R5=OiBu

[0217] 苦皮素H:R1=R7=OAc,R2=R5=H，R3=OBz,R4=OiBu,R6=OH

[0218] Celangulatin C:R1=OiBu,R2=R5=H,R3=OBz,R4=R7=OAc,R6=OH

[0219] 苦皮藤素II:R1=OiBu,R2=OBz,R3=R4=H,R5=R6=R7=OAc

[0220] 苦皮藤素IV:R1=OiBu,R2=R5=OFu,R3=R4=H,R6=R7=OAc

[0221]

[0222] 苦皮素A

[0223] 13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:75.01(C-1)，67.26(C-2),41.15(C-3),72.13(C-4)，91.41(C-5)，76.89(C-6)，53.51(C-7)，73.69(C-8)，75.28(C-9)，50.52(C-10),84.54(C-11),30.05(C-12)，26.35(C-13)，24.14(C-14)，61.69(C-15)

[0224] OAC:169.49,169.60，20.50，21.13

[0225] OiBu:175.82,176.77,34.09,34.31,18.46,18.66,19.06,19.14

[0226] OBz:165.67,129.26,129.44,128.63,133.45

[0227] 苦皮素B

[0228] 13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:70.63(C-1)，67.96(C-2),42.00(C-3),69.84(C-4)，91.33(C-5)，75.39(C-6)，52.97(C-7)，76.05(C-8)，71.44(C-9)，53.87(C-10),83.44(C-11),29.59(C-12)，25.45(C-13)，24.47(C-14)，65.45(C-15)

[0229] OAC:169.54,169.66,169.79,20.55,21.12,21.48

[0230] OiBu:175.74,176.90,33.95,34.10,18.73,18.99,19.00,19.06

[0231] OFu:160.91,148.99,117.81,109.69,144.00

[0232] 苦皮素C

[0233] 13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:70.86(C-1),67.98(C-2),42.04(C-3),69.88(C-4)，91.42(C-5),75.48(C-6),53.04(C-7),76.19(C-8),72.03(C-9),54.10(C-10),83.54(C-11),29.61(C-12),25.66(C-13),24.50(C-14),65.55(C-15);

[0234] OAC:169.44,169.57,169.26,20.38,21.13*,21.50*(-CH3)(*归属可互换)[0235] OiBu:175.77,176.95,33.98,34.12,18.78,18.91,19.04,19.08

[0236] OBz:164.52,128.31,130.18,128.47,133.87

[0237] 苦皮素E

[0238] 13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:75.09(C-1)，67.31(C-2),41.21(C-3),72.15(C-4)，91.49(C-5)，76.92(C-6)，53.53(C-7)，73.80(C-8)，75.23(C-9)，50.49(C-10),84.54(C-11),30.08(C-12)，26.31(C-13)，24.06(C-14)，61.68(C-15)

[0239] OAC:169.55,169.46,20.48,21.13

[0240] OiBu:175.72,34.11,18.48,18.64

[0241] OiPet:176.19,41.56,26.59,11.69,16.92

[0242] OBz:165.68,129.36,129.49,128.61,133.42

[0243] 苦皮素F

[0244] 13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:70.53(C-1)，67.80(C-2),41.93(C-3),69.90(C-4)，91.31(C-5)，75.34(C-6)，53.80(C-7)，76.54(C-8)，71.65(C-9)，54.33(C-10),83.12(C-11),25.55(C-12)，29.51(C-13)，24.32(C-14)，65.56(C-15)

[0245] OAC:169.51,169.75,169.86,170.52,20.47,21.13,21.52,21.11

[0246] OFu:161.61,160.53,148.69,148.87,118.84,118.05,109.96,109.78,144.01,144.01

[0247] 苦皮素G

[0248] 13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:70.49(C-1)，67.82(C-2),41.92(C-3),69.81(C-4)，91.51(C-5)，75.00(C-6)，53.34(C-7)，76.10(C-8)，72.65(C-9)，53.97(C-10),83.27(C-11),29.45(C-123)，25.48(C-13)，24.35(C-14)，65.67(C-15)

[0249] OAC:169.47,169.69,169.74,,170.53,20.45,21.14,21.52,21.04

[0250] OiBu:175.86,33.92,18.81,18.89

[0251] OFu:160.91,148.99,117.83,109.71,144.02

[0252] 苦皮素H

[0253] 13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:74.89(C-1)，67.31(C-2),41.10(C-3),72.11(C-4)，91.44(C-5)，76.87(C-6)，53.59(C-7)，73.36(C-8)，75.40(C-9)，50.64(C-10),84.52(C-11),30.03(C-123)，26.24(C-132)，24.23(C-14)，61.38(C-15)

[0254] OAC:169.39,169.55,170.28,20.49,21.10,21.47

[0255] OiBu:175.88,34.02,18.41,18.58

[0256] OBz:165.72,129.23,129.40,128.64,133.40

[0257] Celangulatin C（苦皮藤素C）

[0258] 13C NMR(100MHz,CDCl3)：δC：75.07（C-1），67.31（C-2），41.19（C-3），72.14（C-4），91.45（C-5），76.90（C-6），53.48（C-7），74.17（C-8），75.34（C-9），50.64（C-10），84.58（C-11），30.05（C-12），26.28（C-13），24.20（C-14），61.73（C-15）

[0259] OAC:169.44,169.54,169.95,20.44,21.10,20.82

[0260] OiBu：176.72，34.34，19.05，19.12

[0261] OBz：165.63，129.49，129.28,129.66,133.47

[0262] 苦皮藤素II

[0263] 13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:68.0*(C-1,)，70.8*(C-2),42.7(C-3),69.9(C-4)，91.5(C-5)，72.5*(C-6)，53.2(C-7)，75.8*(C-8)，76.7*(C-9)，54.4(C-10),83.3(C-11),29.5(C-12)，24.6(C-13)，24.6C-14)，65.6(C-15)(*归属可互换)

[0264] OAC:169.3,169.2×2,21.0×2,21.4

[0265] OiBu:176.9,34.1,19.0,19.1

[0266] OBz：164.5，129.5，130.2,128.4,133.8

[0267] 苦皮藤素IV

[0268] 13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:70.3*(C-1,)，70.6*(C-2),42.0(C-3),69.9(C-4)，91.4(C-5)，75.6*(C-6)，53.6(C-7)，76.1*(C-8)，68.0*(C-9)，54.4(C-10),83.4(C-11),29.6(C-12)，25.5(C-13)，24.4(C-14)，65.0(C-15)(*归属可互换)

[0269] OAC:169.6×3,20.5,21.0,21.4

[0270] OiBu:176.7,34.0,18.8,18.9

[0271] OFu:161.3,160.6,148.9,148.7,118.8,118.1,109.8,109.7,143.9×2

[0272] 实施例1：10%苦皮藤素母液及2%苦皮藤素水乳剂的制备与防效

[0273] （1）10%苦皮藤素母液制备

[0274] 将筛分后符合规定（24目）的苦皮藤根和皮，按照体积为5~7倍量的苯（原料：苯=kg：L，即1kg的苦皮藤根和皮用5~7L的苯）50℃超声循环提取35~55min(超声功率
500W)1~2次（每次提取条件均一致），滤液合并后减压浓缩成1.1~1.3的浸膏，即得到10%苦皮藤素母液。具体数据见下表。

[0275]

[0276] （2）2%苦皮藤素水乳剂配制

[0277] 将检测合格的10%苦皮藤素母液置于反应釜中，按照配比量加入下表中的辅料（乳化剂和抗冻剂），搅拌，再加溶剂至规定含量，搅拌至完全溶解，得到2%苦皮藤素水乳剂。配制比例见下表。

[0278]

[0279]

[0280] （3）田间试验

[0281] 2%苦皮藤素水乳剂田间药效实验参照农业部农药检定所生测室制定的农药田间药效试验准则进行。

[0282] 1）材料与方法

[0283] a．供试药剂

[0284] 2%苦皮藤素水乳剂（由上述10%苦皮藤素母液A配制而成），1%苦皮藤素乳油(新乡市东风责任有限公司生产)。

[0285] b．防治对象与试验作物

[0286] 防治对象为菜青虫(pieris rapae)。试验作物为甘蓝。

[0287] c．试验地及作物

[0288] 试验地设在云南省玉溪市通海县实验基地，黑色砂壤土质，肥力均匀，管理水平一致，种植甘蓝为十字花科蔬菜，菜青虫历年均有发生。

[0289] d．药剂处理

[0290] 设2%苦皮藤素水乳剂800、1000、1200倍液3个处理，以1%苦皮藤素乳油对水稀释800倍液为对照药剂，喷清水为空白对照。每处理设3个重复，共18个小区。小区面积2
20m，随机区组排列。

[0291] e．施药时间与方法

[0292] 初次施药于2011年10月13日进行，正值菜青虫幼虫为害盛期。试验当天为少云天气，平均气温25.5℃。用卫士牌WS-16P背负式手动喷雾器施药。将药剂稀释到试验所需浓度，喷至叶面湿润无滴液为宜。

[0293] f.调查时间与方法

[0294] 施药前以5点取样法于每小区定5点，每点定甘蓝4棵，挂牌标 记，并调查菜青虫的基数。喷药后3、5、10d在标记的甘蓝上调查残存活虫数，计算各处理区防治效果并进行差异显著性测验。

[0295] 防效(％)=[1一处理区药后活虫数×对照区药前活螨数／(对照区药后活虫数×处理区药前活虫数)]×100

[0296] 2）统计分析结果

[0297] 菜青虫田间药效实验分析结果见下表。从表中可看出，2%苦皮藤素水乳剂稀释成800~1000倍防效效果较好，其药后3~5天的防治效果为80.18%~91.86%；对水稀释800倍处理区防效最好，其药后3~5天的防治效果为85.61%~91.86%；明显优于对照药剂1%苦皮藤素乳油对水稀释800倍防效；其持效期10天。

[0298]

[0299] 按照本实施例配制的其他水乳剂和由10%苦皮藤素母液A配制 的水乳剂效果相似，以由10%苦皮藤素母液A配制的为最优。

[0300] 实施例2：10%苦皮藤素母液（河南淅川）IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱质量检测方法

[0301] （1）母液特征提取物制备

[0302] 选择10%苦皮藤素母液（河南淅川），按下述方法制备10%苦皮藤素母液特征提取物：称取10%苦皮藤素母液20g，过滤后60℃温度下减压浓缩，回收溶剂至浸膏状，浸膏用6倍量体积（120mL）、质量比为80%的甲醇溶解后，3倍量体积（60mL）的石油醚萃取1次，每次萃取30min，甲醇层过滤后减压浓缩，回收溶剂至干，即得10%苦皮藤素母液（河南淅川）特征提取物。

[0303] （2）特征提取物IGD核磁共振碳谱测试

[0304] 取10%苦皮藤素母液（河南淅川）特征提取物80mg，溶于0.5mLCDCl3中，作IGD核磁共振碳谱。

[0305] （3）IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析

[0306] 1）鉴别

[0307] 10%苦皮藤素母液（河南淅川）特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的特征信号。根据其母核信号及其C-15特征峰信号的化学位移，确证10个4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物苦皮素A、B、C、E、F、G、H、celangulatin C、苦皮藤素II、苦皮藤素IV在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-a，图2-a与图3-a。

[0308] 2）10%苦皮藤素母液A-C（河南淅川）各活性成分比例测定结果如下：

[0309] ①10%苦皮藤素母液A（河南淅川）

[0310]

[0311]

[0312] IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图1-b。

[0313] ②10%苦皮藤素母液B（河南淅川）

[0314]

[0315]

[0316] IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图2-a，其特征峰布局拉宽放大图见附图2-b-1和2-b-2。

[0317] ③10%苦皮藤素母液C（河南淅川）

[0318]

[0319] IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图3-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图3-b-1和3-b-2。

[0320] （4）10%苦皮藤素母液A-C（河南淅川）苦皮素A浓度含量测定结果如下：

[0321]母液A 母液B 母液C
母液中苦皮素A质量百分含量 2.85% 2.87% 3.03%

[0322] （5）10%苦皮藤素母液A-C（河南淅川）中各活性成分含量测定结果如下：

[0323] ①苦皮藤素母液A（河南淅川）

[0324] 下表中苦皮素C+苦皮藤素II+苦皮素F的分子式是以苦皮素C作为代表的分子式，苦皮素A+苦皮素E+celangulatin C的分子式是以苦皮素A作为代表的分子式，苦皮藤素II+苦皮素F的分子式是以苦皮素II作为代表的分子式（以下实施例均同实施例1）。

[0325]

[0326] ②10%苦皮藤素母液B（河南淅川）

[0327]

[0328]

[0329] ③10%苦皮藤素母液C（河南淅川）

[0330]

[0331] 实施例3：10%苦皮藤素母液（陕西宝鸡）IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱质量检测方法

[0332] （1）母液特征提取物制备

[0333] 与实施例2不同之处在于选用不同产地陕西宝鸡药材制备的母液，用10倍量体积、质量比90%的甲醇溶解，5倍量体积（100mL）的石油醚萃取1次，其他完全相同。

[0334] （2）母液特征提取物IGD核磁共振碳谱测试

[0335] 与实施例2相同。

[0336] （3）10%苦皮藤素母液（陕西宝鸡）IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱解析[0337] 1）鉴别

[0338] 10%苦皮藤素母液（陕西宝鸡）特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的特征信号。根据其母核信号及其C-15特征峰信号的化学位移，确证10个4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物苦皮素A、B、C、E、F、G、H、celangulatin C、苦皮藤素II、苦皮藤素IV在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图4-a，图5-a与图6-a。

[0339] 2）10%苦皮藤素母液（陕西宝鸡）各活性成分比例测定结果如下：

[0340] ①10%苦皮藤素母液D（陕西宝鸡）

[0341]

[0342] IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图4-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图4-b-1和4-b-2。

[0343] ②10%苦皮藤素母液E（陕西宝鸡）

[0344]

[0345] IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图5-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图5-b-1和5-b-2。

[0346] ③10%苦皮藤素母液F（陕西宝鸡）

[0347]

[0348]

[0349] IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图6-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图6-b-1和6-b-2。

[0350] （4）10%苦皮藤素母液D-F（陕西宝鸡）苦皮素A浓度含量测定结果如下：

[0351]A B C
母液中苦皮素A质量百分含量 2.16% 2.05% 1.96%

[0352] （5）10%苦皮藤素母液D-F（陕西宝鸡）中活性成分含量测定结果如下：

[0353] ①10%苦皮藤素母液D（陕西宝鸡）

[0354]

[0355] ②10%苦皮藤素母液E（陕西宝鸡）

[0356]

[0357] ③10%苦皮藤素母液F（陕西宝鸡）

[0358]

[0359]

[0360] 实施例4：2%苦皮藤素水乳剂中各活性成分含量测定

[0361] （1）10%苦皮藤素母液苦皮藤素系数计算

[0362] 取实施例2的10%苦皮藤素母液A-C（河南淅川）苦皮藤素总系数的平均值作为苦皮藤素母液（河南淅川）苦皮藤素总系数。

[0363] 取实施例3的10%苦皮藤素母液D-F（陕西宝鸡）苦皮藤素总系数的平均值作为苦皮藤素母液（陕西宝鸡）苦皮藤素总系数。

[0364] 计算结果如下:

[0365]药材产地 苦皮藤素母液苦皮藤素总系数
河南淅川 5.72
陕西宝鸡 6.14

[0366] （2）2%苦皮藤素水乳剂苦皮素A浓度含量测定结果如下：

[0367]

[0368] （3）2%苦皮藤素水乳剂苦皮藤素含量计算

[0369]

[0370] 其中，I~VI为不同批次2%苦皮藤素水乳剂。

[0371] 实施例5：6%苦皮藤素母液IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱质量检测方法

[0372] 参照实施例2的10%苦皮藤素母液（河南淅川）IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱质量检测方法。

[0373] （1）母液特征提取物制备

[0374] 选择6%苦皮藤素母液，按下述方法制备10%苦皮藤素母液特征 提取物：称取10%苦皮藤素母液20g，过滤后60℃温度下减压浓缩，回收溶剂至浸膏状，浸膏用6倍量体积（120mL）、质量比为80%的甲醇溶解后，3倍量体积（60mL）的石油醚萃取1次，甲醇层过滤后减压浓缩，回收溶剂至干，即得6%苦皮藤素母液特征提取物。

[0375] （2）特征提取物IGD核磁共振碳谱测试

[0376] 取6%苦皮藤素母液特征提取物80mg，溶于0.5mL CDCl3中，作IGD核磁共振碳谱。

[0377] （3）IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析

[0378] 1）鉴别

[0379] 6%苦皮藤素母液特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的特征信号。根据其母核信号及其C-15特征峰信号的化学位移，确证10个4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物苦皮素A、B、C、E、F、G、H、celangulatin C、苦皮藤素II、苦皮藤素IV在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。

[0380] 2）6%苦皮藤素母液各活性成分比例测定结果如下：

[0381]

[0382] IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图7-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图7-b-1和7-b-2。

[0383] （4）6%苦皮藤素母液苦皮素A浓度含量测定结果如下：

[0384]6%苦皮藤素母液中苦皮素A质量百分含量 1.75%

[0385] （5）6%苦皮藤素母液（河南淅川）中各活性成分含量测定结果如下：

[0386]

[0387] 实施例6：1%苦皮藤素乳油IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱质量检测方法

[0388] 参照实施例4的2%苦皮藤素水乳剂IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱质量检测方法。

[0389] （1）6%苦皮藤素母液苦皮藤素系数计算

[0390] 取实施例5的6%苦皮藤素母液苦皮藤素总系数。

[0391] （2）1%苦皮藤素乳油苦皮素A浓度含量测定结果如下：

[0392]1%苦皮藤素乳油中苦皮素A质量百分含量 0.35%

[0393] （3）1%苦皮藤素乳油中苦皮藤素含量计算

[0394]1%苦皮藤素乳油中苦皮藤素质量百分含量 1.50%