6-修饰的双环核酸类似物

摘要

本发明提供了6-修饰的双环核苷类似物以及包含这些核苷类似物的寡聚化合物。在优选的实施方案中该核苷类似物在6位具有(R)或(S)-手性。这种双环核苷类似物可用于提高寡聚化合物的性质包括核酸酶抗性。

权利要求

1.一种反义寡聚化合物，其具有至少一个具有下式的单体：或下式：

或下式：

其中Bx是核苷碱基；

T3为H、羟基保护基团、联接的共轭基团或将具有通式III的双环核苷连接至所述反义寡聚化合物的其余部分的核苷间联接基团；

T4为H、羟基保护基团、联接的共轭基团或将具有通式III的双环核苷连接至所述反义寡聚化合物的其余部分的核苷间联接基团；

其中至少T3和T4之一为与将具有通式III的双环核苷连接至所述反义寡聚化合物的其余部分的核苷间联接基团；且Z是C1-C6烷基、或取代的C1-C6烷基，其中所述取代基为C1-C6烷氧基，其中所述羟基保护基团选自乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、

1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、对氯苯基、2,4-二硝基苯基、苯甲基、2,6-二氯苯甲基、二苯基甲基、对硝基苯甲基、二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、2-三甲基硅烷基乙基、三甲基硅烷基、三乙基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、三苯甲基硅烷基、[(三异丙基硅烷基)氧基]甲基(TOM)、苯甲酰甲酸盐、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、特戊酰基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、9-芴甲基碳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、三苯甲基(trityl)、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、三甲氧基三苯甲基、

1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(FPMP)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)以及9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)，其中所述寡聚化合物是指具有至少一个能与核酸分子杂交的区域的聚合物。

2.如权利要求1所述的寡聚化合物，其中所述羟基保护基团选自：苯甲基、2,6-二氯苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、苯甲酰基、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)以及9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。

3.如权利要求1所述的寡聚化合物，其中至少一个Z为甲基。

4.如权利要求1所述的寡聚化合物，其中至少一个Z为取代的C1-C6烷基。

5.如权利要求4所述的寡聚化合物，其中至少一个Z为CH3OCH2-。

6.如权利要求1所述的寡聚化合物，其中各Z为甲基或CH3OCH2-。

7.如权利要求1-6任意一项所述的寡聚化合物，其中具有所述式的至少一个单体的Z基团为由下式表示的构型：或下式：

或下式：

8.如权利要求7所述的寡聚化合物，其中具有所述式的各单体的各Z基团为由下式表示的-构型：或下式：

或下式：

9.如权利要求1-6任意一项所述的寡聚化合物，其中所述至少一个单体的Z基团为由下式表示的构型：或下式：

或下式：

10.如权利要求9所述的寡聚化合物，其中具有所述式的各单体的各Z基团为由下式表示的构型：或下式：

或下式：

11.如权利要求1-6任意一项所述的寡聚化合物，其中T3为H或羟基保护基团。

12.如权利要求1-6任意一项所述的寡聚化合物，其中T3为将具有通式III的双环核苷连接至所述反义寡聚化合物的其余部分的核苷间联接基团。

13.如权利要求1-6任意一项所述的寡聚化合物，其中T4为H或羟基保护基团。

14.如权利要求1-6任意一项所述的寡聚化合物，其中T3和T4中至少一个是选自磷酸二酯或硫代磷酸酯的核苷间联接基团。

15.如权利要求1-6任意一项所述的寡聚化合物，其包含至少一个由至少两个相邻的具有所述式的单体组成的区。

16.如权利要求15所述的寡聚化合物，其包含至少两个由至少两个相邻的具有所述式的单体组成的区。

17.如权利要求16所述的寡聚化合物，其包含有间隙的寡聚化合物。

18.如权利要求15所述的寡聚化合物，其进一步包含至少一个由8至14个相邻的β-D-2’-脱氧核糖基核苷组成的区。

19.如权利要求18所述的寡聚化合物，其进一步包含至少一个由9至12个相邻的β-D-2’-脱氧核糖基核苷组成的区。

20.如权利要求15所述的寡聚化合物，其包含由2至3个具有所示式的相邻单体组成的一个区，任选的由1或2个具有所示式的相邻单体组成的第二区以及由8至14个β-D-2’-脱氧核糖基核苷组成的第三区，其中所述的第三区位于所述的第一和所述的第二区之间。

21.如权利要求20所述的寡聚化合物，其包含8至10个β-D-2’-脱氧核糖基核苷。

22.试剂盒，其特征在于包含如权利要求1-21任意一项所述的寡聚化合物。

说明书

6-修饰的双环核酸类似物

[0001] 本申请是申请号为200780010566.0(PCT/US2007/061183)，申请日为2007年1月27日的中国发明专利申请“6-修饰的双环核酸类似物”的分案申请。

[0002] 与相关申请的交叉引用

[0003] 本申请主张于2006年1月27日提交的题为“Substituted Bicyclic NucleicAcid Analogs”的美国临时申请60/762,722，以及于2006年6月23日提交的题为
“6-Substituted Bicyclic Nucleic Acid Analogs”的美国临时申请60/805,660的优先
权，这些披露的全文在此引用作为参考。

技术领域

[0004] 本发明提供了6-修饰的双环核苷及由其制备的寡聚化合物和组合物。更具体而言，本发明提供了具有2’-O-C(H)(R)-4’桥的核苷以及由其制备得到的寡聚物和组合物。
在优选的实施方案中，R具有形成(R)或(S)异构体的特定构型。在一些实施方案中，本发
明的寡聚化合物和组合物与靶标RNA的一部分杂交以使该靶标RNA丧失正常的功能。

背景技术

[0005] 反义技术是用于减少一种或多种特定基因产物表达的有效手段，因而被证明在治疗、诊断和研究应用中具有独特的用途。化学修饰的核苷常用于整合入反义序列以增强一
种或多种属性，例如核酸酶抗性。一类这样的化学修饰包括双环核苷，其中该核苷的呋喃糖部分包含了连接呋喃糖上两个原子以形成双环状环系统的桥。该种双环核苷具有各种名
称，包括对于双环核酸或锁核酸分别具有BNA和LNA的名称。

[0006] 各种BNA已得到制备，并报道于专利文献和科技文献，例如参见Singh等人，Chem.Commun.，1998，4，455-456；Koshkin等 人，Tetrahedron，1998，54，3607-3630；Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，5633-5638；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1998，8，2219-2222；Wengel等人，PCT国际申请WO 98-DK393 19980914；Singh等人，J.Org.Chem.，1998，63，10035-10039，各文献的全文在此引用作为参考。已授权的美国专利和公布的申请的实例包括，例如：美国专利7,053,207、6,770,748、6,268,490和6,794,499以及公布的美国申请20040219565、20040014959、20030207841、20040192918、
20030224377、20040143114和20030082807；各文献的全文在此引用作为参考。

[0007] 许多LNA具有毒性。例如，参见Swayze，E.E.；Siwkowski，A.M.；Wancewicz，E.V.；Migawa，M.T.；Wyrzykiewicz，T.K.；Hung，G.；Monia，B.P.；Bennett，C.F.，
Antisense oligonucleotides containing locked nucleic acid improve potency but
cause significant hepatotoxicity in animals.Nucl.Acids Res.，doi：10.1093/nar/
gkll071(2006年12月，提前在线出版)

[0008] 因此，对通过反义机制特异性调节基因表达的药剂仍有着长期需求。本文公开了可用于调节基因表达通路的6-取代的BNA和由其制备得到的反义化合物，包括依赖于RNA
酶H、RNAi和dsRNA酶等作用机制，以及基于靶标降解或靶标占用的其它反义机制的调节。
本领域的技术人员在获知本公开内容后将能够在不进行过度实验的情况下鉴定、制备反义
化合物和开发其用途。

[0009] 发明概述

[0010] 本发明提供了具有下式的双环核苷：

[0011]

[0012] 其中：

[0013] Bx是杂环碱基部分；

[0014] T1是H或羟基保护基团；

[0015] T2是H、羟基保护基团或活性磷基团；

[0016] Z是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、或取代的酰胺。

[0017] 在一实施方案中，各被取代的基团独立地被任选被保护的取代基单或多取代，所述取代基独立地选自卤素、氧代、羟基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中各J1、J2和J3独立地为H或C1-C6烷基，X是O、S或NJ1。

[0018] 在一实施方案中，各被取代的基团独立地被取代基单或多取代，所述取代基独立地选自卤素、氧代、羟基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1和NJ3C(＝X)NJJJ2的，其中各J1、J2和J3独立地为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基，X是O或NJ1。

[0019] 在一实施方案中，Z是C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基。在另一实施方案中，Z是C1-C6烷基。在另一实施方案中，Z是甲基(CH3-)。在另一实施方案中，Z是乙基(CH3CH2-)。
在另一实施方案中，Z是取代的C1-C6烷基。在另一实施方案中，Z是取代的甲基。在另一
实施方案中，Z是取代的乙基。

[0020] 在一实施方案中，该取代基为C1-C6烷氧基(例如，Z是被一或多个C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基)。在另一实施方案中，该C1-C6烷氧基取代基为CH3O-(例如，Z是CH3OCH2-)。
在另一实施方案中，该C1-C6烷氧基取代基可被进一步取代，例如N(J1J2)CH2O-(例如，Z是N(J1J2)CH2OCH2-)。在另一实施方案中，该取代基团为卤素(例如，Z是被一或多个卤素取代的C1-C6烷基)。在另一实施方案中，该卤素取代基为氟(例如，Z为CH2FCH2-、CHF2CH2-或
CF3CH2-)。在另一实施方案中，该取代基为羟基(例如，Z是被一或多个羟基取代的C1-C6烷基)。在另一实施方案中，Z是HOCH2-。在另一实施方案中，Z是CH3-、CH3CH2-、-CH2OCH3、-CH2F或HOCH2-。

[0021] 在一实施方案中，Z基团为被一个或多个Xx取代的C1-C6烷基，其中各Xx独立为OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2或CN；其中各J1、J2和J3独立为H或C1-C6烷基，X是O、S或NJ1。在另一实施方案中，Z基团为被一或多个Xx取代的
C1-C6烷基，其中各Xx独立为卤素(例如，氟)、羟基、烷氧基(例如，CH3O-)、取代的烷氧基或叠氮基。

[0022] 在一实施方案中，Z基团为-CH2XX，其中Xx为OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2或CN；其中各J1、J2和J3独立为H或C1-C6烷基，X是O、S或NJ1。X x
在另一实施方案中，Z基团为-CH2X，其中X 为卤素(例如，氟)、羟基、烷氧基(例如，CH3O-)或叠氮基。

[0023] 在一实施方案中，Z基团呈(R)-构型：

[0024]

[0025] 在另一实施方案中，Z基团呈(S)-构型：

[0026]

[0027] 在一实施方案中，T1和T2分别为羟基保护基团。羟基保护基团的优选列表包括苯甲基、苯甲酰基、2，6-二氯苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、甲磺酸、甲苯磺酸、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)以及9-(对甲氧基苯基)
黄嘌呤-9-基(MOX)。在一实施方案中，T1为羟基保护基团，该基团选自乙酰、苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基和二甲氧基三苯甲基，其中更优选的羟基保护基团
T1为4，4’-二甲氧基三苯甲基。

[0028] 在一实施方案中，T2为活性磷基团，其中优选的活性磷基团包括二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺和H-磷酸酯。在一优选的实施方案中，T1为4，4’-二甲氧基三苯甲基且T2
为二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺。

[0029] 本发明还提供了寡聚化合物，其具有至少一个具有下式的单体：

[0030]

[0031] 或下式：

[0032]

[0033] 或下式：

[0034]

[0035] 其中：

[0036] Bx是杂环碱基部分；

[0037] T3为H、羟基保护基团、联接的共轭基团或与核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、单体亚基或寡聚化合物连接的核苷间联接基团；

[0038] T4为H、羟基保护基团、联接的共轭基团或与核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、单体亚基或寡聚化合物连接的核苷间联接基团；

[0039] 其中T3和T4中至少一个为与核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、单体亚基或寡聚化合物连接的核苷间联接基团；且

[0040] Z是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、硫醇或取代的硫。

[0041] 在一实施方案中，各被取代的基团被任选被保护的取代基单或多取代，所述取代基独立地选自卤素、氧代、羟基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中各J1、J2和J3独立地为H或C1-C6烷基，X是O、S或NJ1。

[0042] 在一实施方案中，各被取代的基团独立地被取代基单或多取代，所述取代基独立地选自卤素、氧代、羟基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、和NJ3C(＝X)NJ1J2，其中各J1、J2和J3独立地为H或C1-C6烷基，X是O或NJ1。

[0043] 在一实施方案中，至少一个Z为C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基。在另一实施方案中，各Z独立地为C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基。在另一实施方案中，至少一个Z为C1-C6
烷基。在另一实施方案中，各Z独立地为C1-C6烷基。在另一实施方案中，至少一个Z为甲
基。在另一实施方案中，各Z均为甲基。在另一实施方案中，至少一个Z为乙基。在另一实
施方案中，各Z均为乙基。在另一实施方案中，至少一个Z为取代的C1-C6烷基。在另一实
施方案中，各Z分别独立为取代的C1-C6烷基。在另一实施方案中，至少一个Z为取代的甲
基。在另一实施方案中，各Z均为取代的甲基。在另一实施方案中，至少一个Z为取代的乙
基。在另一实施方案中，各Z均为取代的乙基。

[0044] 在一实施方案中，至少一个取代基为C1-C6烷氧基(例如，至少一个Z是被一或多个C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基)。在另一实施方案中，各取代基独立为C1-C6烷氧基(例
如，各Z独立地为被一或多个C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基)。

[0045] 在一实施方案中，至少一个C1-C6烷氧基取代基为CH3O-(例如，至少一个Z是CH3OCH2-)。在另一实施方案中，各C1-C6烷氧基取代基均为CH3O-(例如，各Z均为CH3OCH2-)。

[0046] 在一实施方案中，至少一个取代基为卤素(例如，至少一个Z是被一或多个卤素取代的C1-C6烷基)。在另一实施方案中，各取代基独立地为卤素(例如，各Z独立地为被一
或多个卤素取代的C1-C6烷基)。在另一实施方案中，至少一个卤素取代基为氟(例如，至
少一个Z为CH2FCH2-、CHF2CH2-或CF3CH2-)。在另一实施方案中，各卤素取代基均为氟(例
如，各Z独立地为CH2FCH2-、CHF2CH2-或CF3CH2-)。

[0047] 在一实施方案中，至少一个取代基为羟基(例如，至少一个Z是被一或多个羟基取代的C1-C6烷基)。在另一实施方案中，各取代基独立地为羟基(例如，各Z独立地为被一
或多个羟基取代的C1-C6烷基)。在另一实施方案中，至少一个Z为HOCH2-。在另一实施方
案中，各Z均是HOCH2-。

[0048] 在一实施方案中，至少一个Z是CH3-、CH3CH2-、CH2OCH3-、CH2F-或HOCH2-。在另一实施方案中，各Z独立地为CH3-、CH3CH2-、CH2OCH3-、CH2F-或HOCH2-。

[0049] 在一实施方案中，至少一个Z基团为被一或多个Xx取代的C1-C6烷基，其中各Xx独立地为OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2或CN；其中各J1、J2和J3独立地为H或C1-C6烷基，X是O、S或NJ1。在另一实施方案中，至少一个Z基团为被
x x
一或多个X 取代的C1-C6烷基，其中各X 独立地为卤素(例如，氟)、羟基、烷氧基(例如，
CH3O-)或叠氮基。

[0050] 在一实施方案中，各Z基团独立地为被一或多个Xx取代的C1-C6烷基，其中各Xx独立地为OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2或CN；其中各J1、J2和J3独立地为H或C1-C6烷基，X是O、S或NJ1。在另一实施方案中，各Z基团独立地为被
x x
一或多个X 取代的C1-C6烷基，其中各X 独立地为卤素(例如，氟)、羟基、烷氧基(例如，
CH3O-)或叠氮基。

[0051] 在一实施方案中，至少一个Z基团为-CH2XX，其中Xx为OJ1、NJ1J2、SJ1，、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2或CN；其中各J1、J2和J3独立地为H或C1-C6烷基，XX x是O、S或NJ1。在另一实施方案中，至少一个Z基团为-CH2X，其中X 为卤素(例如，氟)、
羟基、烷氧基(例如，CH3O-)或叠氮基。

[0052] 在一实施方案中，各Z基团独立地为-CH2XX，其中各Xx独立地为OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2或CN；其中各J1、J2和J3独立地为H或C1-C6X x
烷基，X是O、S或NJ1。在另一实施方案中，各Z基团独立地为-CH2X，其中各X 独立地为卤
素(例如，氟)、羟基、烷氧基(例如，CH3O-)或叠氮基。

[0053] 在一实施方案中，至少一个Z为CH3-。在另一实施方案中，各Z均是CH3-。

[0054] 在一实施方案中，至少一个单体的Z基团是由下式表示的(R)-构型：

[0055]

[0056] 或下式：

[0057]

[0058] 或下式：

[0059]

[0060] 在另一实施方案中，具有所述式的各单体的Z基团均为(R)-构型。在一实施方案中，至少一个单体的Z基团是由下式表示的(S)-构型：

[0061]

[0062] 或下式：

[0063]

[0064] 或下式：

[0065]

[0066] 在另一实施方案中，具有所述式的各单体的Z基团为(S)-构型。

[0067] 在一实施方案中，T3是H或羟基保护基团。在另一实施方案中，T4是H或羟基保护基团。在进一步的实施方案中，T3是与核苷、核苷酸或单体亚基连接的核苷间联接基团。
在另一实施方案中，T4是与核苷、核苷酸或单体亚基连接的核苷间联接基团。在另一实施
方案中，T3是与寡聚核苷或寡聚核苷酸连接的核苷间联接基团。在进一步的实施方案中，T4是与寡聚核苷或寡聚核苷酸连接的核苷间联接基团。在一实施方案中，T3是与寡聚化合物
连接的核苷间联接基团。在进一步的实施方案中，T4是与寡聚化合物连接的核苷间联接基
团。在更进一步的实施方案中，T3和T4中至少一个包含了选自磷酸二酯或硫代磷酸酯的核
苷间联接基团。

[0068] 在一实施方案中，寡聚化合物具有至少一个由至少两个具有下式的相邻单体构成的区域：

[0069]

[0070] 或下式：

[0071]

[0072] 或下式：

[0073]

[0074] 在另一实施方案中，寡聚化合物包含至少两个由至少两个具有上式的相邻单体构成的区域。在另一实施方案中，该寡聚化合物包含了有间隙的(gapped)寡聚化合物。在另
一实施方案中，该寡聚化合物包含至少一个由约8至约14个相邻β-D-2’-脱氧核糖基核
苷构成的区域。在进一步的实施方案中，该寡聚化合物包含至少一个由约9至约12个相邻
β-D-2’-脱氧核糖基核苷构成的区。

[0075] 在一实施方案中，该寡聚化合物包含至少一个由2至3个具有上式的相邻单体构成的区，任选的由具有上式的1或2个相邻单体构成的第二区以及由8至14个β-D-2’-脱
氧核糖基核苷构成的第三区，其中所述第三区位于该第一和该第二区之间。在另一实施方
案中，该寡聚化合物包含8至10个β-D-2’-脱氧核糖基核苷。

[0076] 在本发明的另一实施方案中，提供了具有长度为约8至约40个核苷和/或修饰的核苷或模拟物的寡聚化合物。在进一步的实施方案中，寡聚化合物包含了约8至约20个核
苷和/或修饰的核苷或模拟物。在更进一步的实施方案中，寡聚化合物包含了约10至约16
个核苷和/或修饰的核苷或模拟物。在另一实施方案中寡聚化合物包含了约10至约14个
核苷和/或修饰的核苷或模拟物。

[0077] 本发明还提供了抑制基因表达的方法，其包括将一种或多种细胞、组织或动物与本发明的寡聚化合物接触。

[0078] 发明详述

[0079] 本发明提供了6-修饰的双环核苷、由其制备的寡聚化合物及组合物、新的合成中间体，以及该核苷、寡聚化合物、组合物和新合成中间体的制备方法。更特定地，本发明提供了核苷，其在具有式2’-O-C(H)(Z)-4’的核糖部分的4’和2’位之间具有桥，以及由该核苷制备的寡聚体和组合物。在优选的实施方案中，Z具有可形成(R)或(S)异构体的特定构
型。在一些实施方案中，本发明的寡聚化合物和组合物经设计与靶标RNA的部分杂交。在
另一实施方案中，本发明的寡聚化合物可用于设计适体，该适体为能够在体内环境中结合
异常蛋白的寡聚化合物。

[0080] 本发明的双环核苷可用于增强整合了它们的寡聚化合物的所需性质。本发明的寡聚化合物还可用作诊断应用中的引物和探针。在优选的实施方案中，本发明的6-修饰的双
环核苷具有如下显示的结构：

[0081] 一方面，本发明提供了具有式I的双环核苷：

[0082]

[0083] 其中：

[0084] Bx是杂环碱基部分；

[0085] T1是H或羟基保护基团；

[0086] T2是H、羟基保护基团或活性磷基团；以及

[0087] Z是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷基茚基、C3-C6烯基茚基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基茚基、取代的C3-C6烯基茚基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、硫醇、或取代的硫。

[0088] 在一实施方案中，各被取代的基团独立地被任选被保护的取代基单或多取代，所述取代基独立地选自卤素、氧代、羟基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中各J1、J2和J3独立地为H或C1-C6烷基，X是O、S或NJ1。

[0089] 在本发明的一方面中，制备的双环核苷具有正交保护的活性基团并进一步包含活性磷基团。该种双环核苷可用作寡聚体合成的单体。该种双环核苷单体的示范性例子具有
下式：

[0090]

[0091] 其中由虚线框围绕的基团是可变的。在6位的基团还可制备为S构型(注意，根据基团的不同位置，对R和S的指定可因之而变化)。所显示的双环核苷单体一般被
称为二甲氧基三苯甲基亚磷酰胺，或者更正式地采用IUPAC系统命名法为(1S，3R，4R，
6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦酰基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧甲
基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷。

[0092] 本发明的6-修饰的双环核苷可用于在一个或多个位置修饰除此以外未经修饰的寡聚化合物。该种修饰的寡聚化合物可描述为具有特定的基序。适用于本发明的基序包括
但不限于有间隙的基序、半修饰(hemimer)基序、阻断修饰(blockmer)基序、全修饰基序、定点修饰基序以及交替基序。结合这些基序，还可采用多种联接方式，包括但不限于统一或组合使用磷酸二酯和硫代磷酸酯联接。可简单优化6-修饰的双环核苷的定位和联接策略
的使用以针对特定靶标形成最佳活性。指导制备代表性基序的代表性美国专利包括但不
限 于，5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；
5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；以及5,700,922，某些专利为与本申请共同拥有的申请或专利，其全文分别在此引用作为参考。基序还披露于2005年6月2日提交并
于2005年12月22日公布为WO 2005/121371的国际申请PCT/US2005/019219以及于2005
年6月2日提交并于2005年12月22日公布为WO 2005/121372的PCT/US2005/019220；
其全文分别在此引用作为参考。

[0093] 术语“稳定的化合物”和“稳定的结构”指具有足够稳固性可从反应混合物分离至有用的纯度，并制成有效的治疗剂的化合物。本发明仅预期稳定的化合物。

[0094] 此处描述的化合物中选定的取代基以递归度表示。上下文中的“递归取代基”指一个取代基可以引用其本身的另一实例。由于该种取代基的递归性，理论上，在任意给定权利要求中可出现大量取代基。医药化学和有机化学领域的普通技术人员可理解该种取代基
的总数受到靶标化合物的预期属性的合理限定。该种属性包括，例如但不限于，分子量、溶解性或log P等物理属性，靶向目的靶标的活性等应用属性，以及合成容易度等操作属性。

[0095] 递归取代基为本发明的目标方面。医药和有机化学领域的普通技术人员可以理解这样的取代基的多功能性。在本发明的权利要求所示的递归取代基的程度下，可根据上文
所述确定其总数。

[0096] 此处所用的术语“烷基”指含有最多二十四个碳原子的饱和直链或支链烃基。烷基基团的实例包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基基团通常包含1至约24个碳原子，更通常包含1至约12个碳原子(C1-C12烷基)，更优选包含1至约6个碳原子。此处所用的术语“低级烷基”包含1至约6个碳原子。此
处所用的烷基可任选地包含一个或多个进一步的取代基。

[0097] 此处所用的术语“烯基”指含有最多二十四个碳原子并至少具有一个碳-碳双键的直链或支链烃基。烯基基团的实例包括，但不限于，乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲
基-2-丁烯-1-基、如1，3-丁二烯的二烯等。烯基基团通常包含2至约24个碳原子，更通
常包含2至约12个碳原子，更优选包含2至约6个碳原子。此处所用的烯基可任选地包含
一个或多个进一步的取代基。

[0098] 此处所用的术语“炔基”指含有最多二十四个碳原子并至少具有一个碳-碳三键的直链或支链烃基。炔基基团的实例包括，但不限于，乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基等。炔基基团通常包含2至约24个碳原子，更通常包含2至约12个碳原子，更优选包含2至约6
个碳原子。此处所用的炔基可任选地包含一个或多个进一步的取代基。

[0099] 此处所用的术语“氨烷基”指氨基取代的烷基。该术语包括了在任何位置具有氨基取代基的C1-C12烷基基团，其中该烷基基团将氨烷基连接至母体分子。氨烷基基团的烷
基和/或氨基部分可以被取代基进一步取代。

[0100] 此处所用的术语“脂肪族”指最多包含二十四个碳原子的直链或支链烃基，其中任意两个碳原子之间的饱和度为单、双或三键。脂肪族基团优选包含1至约24个碳原子，更通常包含1至约12个碳原子，更优选包含1至约6个碳原子。脂肪族基团的直链或支链可
被包括氮、氧、硫和磷等的一个或多个杂原子所中断。该种被杂原子中断的脂肪族基团包括但不限于聚烷氧基，例如聚亚烷基二醇、聚胺和聚亚胺。此处所用的脂肪族基团可任选地包括其它取代基。

[0101] 术语“脂环族的”指环状的环系统，其中该环为脂肪族环。该环系统可包含一个或多个环，其中至少一个环为脂肪族环。优选的脂肪环包括环中具有约5至约9个碳原子的环。此处所用的脂肪环可任选地包括其它取代基团。

[0102] 此处所用的术语“烷氧基”指在烷基基团和氧原子之间形成的基，其中该氧原子用于连接烷氧基基团和母体分子。烷氧基基团的实例包括，但不限于，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等。此处所用的烷氧基基团可任选地包括其它取代基团。

[0103] 此处所用的术语“卤素”指选自氟、氯、溴和碘的原子。

[0104] 此处所用的术语“芳基”和“芳香族的”指具有一个或多个芳环的单或多环碳环系统的基团。芳基基团的例子包括，但不限于，苯基、萘基、四氢化萘基、茚满基、茚基等。优选的芳基环系统在一个或多个环中具有约5至约20个碳原子。此处所用的芳基基团可任选地包括其它取代基团。

[0105] 此处所用的术语“芳烷基”指在烷基基团和芳基基团之间形成的基，其中该烷基基团可用于连接芳烷基基团和母体分子。例子包括，但不限于，苯甲基、苯乙基等。此处所用的芳烷基基团可任选地包括与烷基、芳基或两者连接以形成基团的取代基。

[0106] 此处所用的术语“杂环基”指包括至少一个杂原子并且是不饱和、部分饱和或完全饱和的单或多环的环系统基团，因而包括了杂芳基。杂环还包括融合环系统，其中一种或多个融合环包含至少一个杂原子而其它环可包含一个或多个杂原子或任选地不包含杂原子。杂环基团通常包括至少一个选自硫、氮或氧的原子。杂环基团的实例包括，[1，3]二恶茂
烷、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、四氢噻唑基、异四氢噻唑基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基等。此处所用的杂环基团可任选地包括其它取代基。

[0107] 此处所用的术语“杂芳基”和“杂芳香族的”指包含单或多环芳环、环系统或融合环系统的基，其中至少一个环为芳环且包括一个或多个杂原子。杂芳基还包括例如融合环系统，其包含一个或多个不含杂原子的融合环的系统。杂芳基通常包括选自硫、氮或氧的一个环原子。杂芳基的例子包括，但不限于，吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、苯硫基、呋喃基、四氢喹啉基、异四氢喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等。杂芳基可直接或通过脂肪族基团或杂原子等连接部分连接至母体分子。此处所用的杂芳基任选地包括其它取代基。

[0108] 此处所用的术语“杂芳烷基”指具有可将杂芳烷基基团连接至母体分子的烷基的如前文定义的杂芳基。例子包括，但不限于，吡啶甲基、嘧啶乙基、萘啶基丙基等。此处所用的杂芳烷基基团可在杂芳环或烷基部分的一个或两者上任选地包括其它取代基团。

[0109] 本发明中采用的术语“单或多环结构”包括具有融合或联接的环的单或多环的所有环系统，并包括独立选自脂肪族、脂环族族、芳基、杂芳基、芳烷基、杂环、杂芳基、杂芳香族、杂芳烷基的单环和混合环系统。该种单或多环结构可包含一致或变化的饱和度(包括
完全饱和、部分饱和或完全不饱和)的环。各个环可包含选自C、N、O和S的环原子以形成
杂环以及仅含有C环原子的环，其可表示为混合基序，例如，苯并咪唑，其中一个环仅具有碳环原子而融合环具有两个氮原子。单或多环结构可进一步被取代基取代，例如，具有连接至其中一个环的两个＝O基的邻苯二甲酰亚胺。在另一方面，单或多环结构可直接通过环
原子，通过取代基或双功能连接部分连接到母体分子。

[0110] 此处所用的术语“酰基”指从有机酸去除羟基基团并具有通式-C(O)-X的基团，其中X通常为脂肪族、脂肪环族或芳香族。例子包括脂肪族羰基、芳香羰基、脂肪磺酰基、芳香亚磺酰基、脂肪族亚磺酰基、芳香磷酸酯、脂肪族磷酸酯。此处所用的酰基基团可任选地包括其它取代基。

[0111] 术语“烃基”包括包含C、O、H的基团。包括具有任意饱和度的直链、支链和环状基团。这样的烃基基团可包括一个或多个选自N、O和S的杂原子并可进一步被一或多个取代基单或多取代。

[0112] 此处所用的术语“取代基”包括通常添加至其它基团或母体化合物以增强所需性质或产生所需效果的基团。取代基可以是保护的或未保护的，并可添加至母体化合物
的一个或多个可能的位点。取代基还可进一步被其它取代基所取代并且可以直接或通过
联接基团(例如烷基或烃基基团)连接至母体化合物。该种基团包括但不限于卤素、羟
基、烷基、烯基、炔基、酰基(-C(O)Raa)、羧基(-C(O)O-Raa)、脂肪族基团、脂肪环族基团、烷氧基、取代的氧代(-O-Raa)、芳基、芳烷基、杂环基、杂芳基、杂芳烷基、氨基(-NRbbRcc)、亚氨基(＝NRbb)、氨基(-C(O)N-RbbRcc或-N(Rbb)C(O)Raa)、叠氮基(-N3)、硝基(-NO2)、氰基(-CN)、脲基(-OC(O)NRbbRcc或-N(Rbb)C(O)ORaa)、脲基(-N(Rbb)C(O)NRbbRcc)、硫脲基(-N(Rbb)C(S)NRbbRcc)、胍 基(-N(Rbb)C( ＝NRbb)NRbbRcc)、amidinyl(-C( ＝ NRbb)NRbbRcc或 -N(Rbb)C(NRbb)Raa)、硫醇(-SRbb)、亚磺酰基(-S(O)Rbb)、磺酰基(-S(O)2RH)、磺酰氨基(-S(O)2NRbbRcc或-N(RHbb)-S(O)2Rbb)以及共轭基团。其中Raa、Rbb和Rcc分别独立为H，任选联接的化学功能基团或进一步的取代基，其优选列表包括但不限于H、烷基、烯基、炔基、脂肪族、烷氧基、酰基、芳基、芳烷基、杂芳环、脂环族、杂环基和杂芳烷基。

[0113] 术语“氧代”指基团(＝O)。

[0114] 此处所述的化合物(例如，双环核苷)可通过例如，如下文实施例所示的任意有机合成的适用技术进行制备。众多该类技术已为本领域公知。多种已知技术列举
于Compendium of Organic Synthetic Methods(John Wiley & Sons，New York) 第 1
卷，Ian T.Harrison 和 Shuyen Harrison(1971)；第 2 卷，Ian T.Harrison 和 Shuyen Harrison(1974)；第3卷，Louis S.Hegedus和Leroy Wade(1977)；第4卷，Leroy G.Wade
Jr.，(1980)；第5 卷，Leroy G.Wade Jr.(1984)；和第 6卷，Michael B.Smith；以 及
March，J.，Advanced Organic Chemistry，第3版，John Wiley & Sons，New York(1985)；
Comprehensive Organic Synthesis.Selectivity，Strategy & Efficiency in Modern
Organic Chemistry，第9卷中，Barry M.Trost主编，Pergamon Press，New York(1993)；
Advanced Organic Chemistry，Part B：Reactions and Synthesis，第 4 版；Carey 和
Sundberg；Kluwer Academic/Plenum Publishers：New York(2001)；Advanced Organic
Chemistry，Reactions，Mechanisms，and Structure，第2版，March，McGraw Hill(1977)；
Protecting Groups in Organic Synthesis，第2版，Greene，T.W.，和Wutz，P.G.M.，John Wiley & Sons，New York(1991)；以及Comprehensive Organic Transformations，第2版，Larock，R.C.，John Wiley & Sons，New York(1999)。

[0115] 在本发明的一方面中，寡聚化合物可通过共价连接一个或多个共轭基团进行修饰。一般而言，共轭基团可修饰所连接的寡聚化合物的一种或多种属性，包括但不限于，药效动力学、药代动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、储存和清除。共轭基团常用于化学领域并直接或通过任选联接部分或联接基团联接至诸如寡聚化合物等的母体化合物。共轭
基团的优选列表包括但不限于，嵌入剂、报告分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、硫胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂肪、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素和染料。

[0116] 如本领域技术人员所知的联接基团或双功能联接部分可适用于本发明。联接基团可用于将化学功能基团、共轭基团、报告基团和其它基团连接至如寡聚化合物等母体化合
物的选择性位点。一般而言，双功能联接部分包含具有两个功能基团的烃部分。功能性基
团之一被选择用于结合母体分子或靶标化合物，而另一基团被选择用于主要结合任意选定
基团，例如化学功能性基团或共轭基团。在一些实施方案中，该接头包含重复单元例如乙
二醇或氨基酸单元的链结构或寡聚体。在双功能联接部分中常用的功能基团的实例包括，
但不限于，用于与亲核基团反应的亲电试剂以及用于与亲电基团反应的亲核试剂。在一些
实施方案中，双功能联接部分包括氨基、羟基、羧酸、硫醇、不饱和性(例如，双或三键)等。
双功能联接部分的部分非限制性实例包括8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(ADO)、琥珀酰亚胺
4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸(SMCC)以及6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其它
的联接基团包括但不限于，取代的C1-C10烷基、取代的或未取代的C2-C10烯基或取代的或未取代的C2-C10炔基，其中优选取代基的非限制性列表包括羟基、氨基、烷氧基、羧基、苯甲基、苯基、硝基、硫醇、硫烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基以及炔基。

[0117] 此处所用的术语“保护性基团”指如下所述的化学部分，其在本领域中已知可针对合成过程中不希望出现的反应来保护反应性基团(包括但不限于羟基、氨基和硫醇基等)。保护性基团通常可以选择性和/或正交采用以在其它活性位点的反应中保护位点，并可
随后去除以留下不受保护的基团或供进一步反应。本领域已知的保护性基团一般描述于
Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons，New York(1999)。

[0118] 基团可作为前体选择性地结合至本发明的寡聚化合物。例如氨基基团可作为叠氮基团结合进本发明的化合物，并可在合成中理想的时间点被化学转化为氨基基团。一般来
说，基团可被保护或作为前体存在，其对于修饰母体分子其它部位的反应呈现惰性，以在适当的时间转化成为其最终的基团。其它代表性保护或前体基团的讨论参见Agrawal，等人，Protocols for Oligonucleotide Conjugates，Eds，Humana Press；New Jersey，1994；第
26卷，第1-72页。

[0119] 羟基保护基团的实例包括，但不限于，乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、对氯苯基、2，4-二硝基苯基、苯甲基、2，6-二氯苯甲基、二苯基甲基、对硝基苯甲基、二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、2-三甲基硅烷基乙基、三甲基硅烷基、三乙基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、三苯甲基硅烷基、[(三异丙基硅烷基)氧基]甲基(TOM)、苯甲酰甲酸盐、氯乙酰
基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、特戊酰基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、9-芴甲基碳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、三苯甲基(trityl)、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、三甲氧基三苯甲基、1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(FPMP)、9-苯基黄嘌呤-9-基
(Pixyl)以及9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。其中优选的羟基保护基团包括但不
限于，苯甲基、2，6-二氯苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、苯甲酰基、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)以及9-(对
甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。

[0120] 氨基保护基团的实例包括但不限于，氨基甲酸盐保护基团，例如，2-三甲基硅烷基乙氧基羰基(Teoc)、1-甲基-1-(4-联苯基)-乙氧基羰基(Bpoc)、叔丁氧基羰基(BOC)、烯丙氧基羰基(Alloc)、9-芴甲基甲基氧基羰基(Fmoc)、以及苯甲基氧基羰基(Cbz)；酰胺保
护基团，例如甲酰基、乙酰基、三卤代乙酰基、苯甲酰基、以及硝基苯基乙酰基；磺酰胺保护基团，例如2-硝基苯磺酰基；以及亚胺和环状酰亚胺保护基团，例如苯二甲酰亚胺和二硫
琥珀酰基。

[0121] 硫醇保护基团的实例包括，但不限于，三苯甲基(trityl)、苯甲基(Bn)等。

[0122] 在一些优选的实施方案中，可以用任选被保护的含磷核苷间联接来连接核苷从而制备寡聚化合物。含磷核苷间联接(例如磷酸二酯和硫代磷酸酯联接)的代表性保护基团
包括β-氰乙基、二苯基硅烷基乙基、δ-氰丁烯基、氰对二甲苯基(CPX)、N-甲基-N-三
氟乙酰乙基(META)、乙酰氧基苯氧基乙基(APE)以及丁烯-4-基基团。例如参见美国专利
号4,725,677以及Re.34,069(β-氰乙基)；Beaucage，S.L.和Iyer，R.P.，Tetrahedron，
49No.10，第1925-1963页(1993)；Beaucage，S.L.和Iyer，R.P.，Tetrahedron，49No.46，第 10441-10488 页 (1993)；Beaucage，S.L. 和 Iyer，R.P.，Tetrahedron，48No.12， 第
2223-2311页(1992)。

[0123] 此处所用的术语“正交保护”指以不同类别的保护性基团保护的功能基团，其中各类保护性基团可以按任意顺序并在所有其它类别存在的情况下去除(例如，Barany，G.和Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc，1977，99，7363；idem，1980，102，3084.)。正交保护已在例如自动寡核苷酸合成等领域得到了广泛应用。功能基团可在一种或多种不受去阻断过程
影响的其它被保护功能基团的存在下被去阻断。该被去阻断的功能基团以某种形式反应，
且在某一时间点另一正交保护性基团在一组不同反应条件下被去除。这使得可以用选择性
化学法获得所需的化合物或寡聚化合物。

[0124] 本发明提供了具有可用于形成核苷间联接(包括例如磷酸二酯和硫代磷酸酯核III V
苷间联接)的活性磷基团的化合物。该种活性磷基团已为本领域所知并包含处于P 或P
价态的磷原子，包括但不限于亚磷酰胺、H-磷酸酯、磷酸三酯和含磷手性助剂。优选的合成III
的固相合成采用亚磷酰胺(P 化学)作为反应性亚磷酸。在优选的实施方案中，中间体亚
v
磷酸化合物随后通过已知的方法被氧化至P 状态以获得磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷酸间
联接。其它的活性磷酸酯和亚磷酸披露于Tetrahedron Report Number 309(Beaucage和
Iyer，Tetrahedron，1992，48，2223-2311)。

[0125] 可用于本发明的寡聚化合物的特定实例包括含有修饰的例如非天然的核苷间联接的寡核苷酸。通过磷原子的存在或缺失可定义核苷间联接的两个主要类别。具有磷原子
的修饰的核苷间联接包括，但不限于，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基磷酸酯包括3’-亚烃基磷酸酯、5’-亚烃基磷酸酯以及手性磷酸酯、亚磷酸酯、氨基磷酸酯包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基磷酸酯，硫羰基烷基磷酸三酯、具有正常3’-5’键的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯、它们的2’-5’联接的类似物，以及具有反转极性的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，其中一种或多种核苷酸间联接为3’至3’、5’至5’或2’至2’联接。具有反转极性的寡核苷酸可在3’-最末端核苷酸间联接包含单个3’至3’联接，即，可能是无碱基(核苷碱基缺失或该位置被羟基取代)的单个反转核苷残基。可包括多种盐、混合盐和游离酸的
形式。

[0126] 指导制备上述含磷联接的代表性美国专利包括但不限于，美国专利号：3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；
5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；
5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；
5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；
5,672,697以及5,625,050，其中某些专利为与本申请共同拥有的专利，各专利全文在此引
用作为参考。

[0127] 不具有磷原子的修饰的核苷间联接包括但不限于，由短链烷基或环烷基核苷间联接、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间联接，或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间联
接构成的核苷间联接。这包括具有硅氧烷骨架；硫化物，亚砜和砜骨架；甲缩醛和硫甲缩醛骨架；亚甲基甲缩醛和硫甲缩醛骨架；核糖乙酰骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸盐骨架；亚甲基亚胺和亚甲基肼基骨架；磺酸盐和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其它具有混合的N，O，S和CH2的组成部分的核苷间联接。

[0128] 指导制备上述寡核苷酸的代表性美国专利包括但不限于，美国专利号：5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；
5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；
5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；
5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269 以 及
5,677,439，其中某些专利为与本申请共同拥有的专利，各专利全文在此引用作为参考。

[0129] 此处描述的化合物包含一个或多个不对称中心，并因此形成了对映体、非对映体以及其它立体异构形式，其从绝对立体化学的角度可定义为(R)-或(S)-、α或β、或
(D)-或(L)-(如氨基酸)。本发明意在包括所有这些可能的异构体，以及它们的外消旋
和光学纯形式。光学异构体可通过上述的过程由其相应的光学活性前体制备，或通过拆
分外消旋混合物进行制备。该种拆分可在拆分剂的存在下，通过色谱或重复结晶或本领
域技术人员已知的这些技术的组合进行。有关拆分进一步的细节可参见Jacques，等人，
Enantiomers，Racemates，and Resolutions(John Wiley & Sons，1981)。当此处所述的化合物包含烯烃双键、其它不饱和性或其它几何不对称中心时，除非另行指明，该化合物意在同时包括E和Z几何异构体或顺式-和反式-异构体。同样地，同样意在包括所有的互变
异构形式。此处所示的任意碳-碳双键的构型仅为便利目的选择，若非文中指明，并非意在指定特定的构型；因此，此处任意描述的碳-碳双键或碳-杂原子双键可以是顺式、反式或
任意比例的两者的混合物。

[0130] 本发明的上下文中的术语“寡聚化合物”指具有至少一个能与核酸分子杂交的区域的聚合物。术语“寡聚化合物”包括寡核苷酸、寡核苷酸类似物和寡核苷以及核苷酸模拟物和/或包含核酸和非核酸成分的混合聚合物。寡聚化合物通常可线性制备，但可连接或
以其它方式制备成环状，且还可包括分支。寡聚化合物可形成双链构建体，例如，杂交形成双链组合物的双链。该双链组合物可连接或分离并可在末端包含悬端(overhangs)。一般
而言，寡聚化合物包含联接的单体亚基的骨架，其中每个联接的单体亚基直接或间接地连
接至杂环碱基部分。寡聚化合物还可包括未联接至杂环碱基部分的单体亚基，从而提供非
碱基位点。这些联接连接单体亚基、糖部分或替代物，且该杂环碱基部分可被独立修饰。包括或不包括杂环碱基的联接-糖单元可被肽核酸单体等模拟物取代。在寡聚化合物的各个
位点修饰或取代部分或全部单体的能力可形成大量可能的基序。

[0131] 如本领域所知，核苷是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常为杂环碱基部分。该种杂环碱基最常见的两种类别为嘌呤和嘧啶。核苷酸为进一步包括了共价联接至核苷糖部
分的磷酸基团的核苷。对于包含了呋喃戊糖的核苷，该磷酸基团可被联接至糖的2’、3’或
5’羟基部分。在形成聚核苷酸时，该磷酸基团共价联接彼此相邻的核苷以形成线性聚合化合物。该线性聚合结构的相应末端可被连接以通过杂交或通过形成共价键得到环状结构，
然而，通常希望开放的线性结构。在寡核苷酸结构中，磷酸基团通常形成寡核苷酸的核苷间联接。RNA和DNA的常见核苷间联接为3’至5’磷酸二酯联接。

[0132] 在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚体或聚合物。该术语包括由天然存在的核苷碱基、糖和共价核苷间联接构成的寡核
苷酸。术语“寡核苷酸类似物”指具有一个或多个非天然存在部分的寡核苷酸。该种非天
然存在的寡核苷酸由于其具有理想的性质而通常比天然存在的形式更理想，例如，提高的
细胞摄取，对核酸靶标增强的亲和力以及在核酸酶存在下提高的稳定性。

[0133] 在本发明的上下文中，术语“寡核苷”指由不带磷原子的核苷间联接连接的核苷序列。该种类型的核苷间联接包括短链烷基、环烷基、混合杂原子烷基、混合杂原子环烷基、一或多种短链杂原子以及一或多种短链杂环。这些核苷间联接包括，但不限于，硅氧烷、硫化物、亚砜、砜、乙酰基、甲缩醛、硫甲缩醛、亚甲基甲缩醛、硫甲缩醛、烯基、氨基磺酸盐、亚甲基亚胺基、亚甲基肼基、磺酸盐、磺酰胺、酰胺和其它具有混合的N、O、S和CH2的组成部分的核苷间联接。

[0134] 指导制备上述寡核苷酸的代表性美国专利包括但不限于，美国专利号：5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；
5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；
5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；
5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269 以 及
5,677,439，其中某些专利为与本申请共同拥有的专利，各专利全文在此引用作为参考。

[0135] 此处所用的术语“核苷碱基”或“杂环碱基部分”意在与“核酸碱基或其模拟物”同义。一般而言，核苷碱基为含有一个或多个能与核酸碱基氢联接结合的原子或原子组合的任意结构。

[0136] 此处所用的“未修饰的”或是“天然的”核苷碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核苷碱基包括其它合成的和天然的核苷碱基，例如，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙
基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和
胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮
尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲
基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨
基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤和7-去氮腺嘌呤、3-去氮鸟
嘌呤和3-去氮腺嘌呤、通用碱基、疏水碱基、混杂碱基、大小扩增碱基以及此处定义的氟化碱基。其它修饰的核苷碱基包括三环嘧啶如吩噁嗪胞啶(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并
噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞啶(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G型夹
(G-clamps)例如取代的吩噁嗪胞啶(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]
苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞啶(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)、吡啶吲哚胞啶(H-吡
啶[3’，2’：4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮)。修饰的核苷碱基还可包括以其它杂环取
代嘌呤或嘧啶碱基的核苷碱基，例如7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡
啶酮。其它的核苷碱基包括披露于美国专利3,687,808的核苷碱基，披露于The Concise
Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering， 第 858-859 页，Kroschwitz，
J.I.编，John Wiley & Sons，1990的核苷碱基；披露于Englisch等人，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613的核苷碱基；以及披露于Sanghvi，Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，
CRC Press，1993的核苷碱基。

[0137] 修饰的核苷碱基包括，但不限于，此处定义的通用碱基、疏水碱基、混杂碱基、大小扩增碱基以及氟化碱基。这些核苷碱基中部分可特别用于提高本发明的寡聚化合物的结合亲和力。这包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨
基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代基已显示可以提
高核酸双链稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，Antisense Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，第276-278页)并且是目前优选的碱基取代基，特别是在与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。

[0138] 指导制备某些上述提到的修饰核苷碱基以及其它修饰的核苷碱基的代表性美国专利包括，但不限于，上述美国专利3,687,808以及美国专利：4,845,205；5,130,302；
5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；
5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；
5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；以及5,681,941，其中某些专利为与本申请共同拥有的专利，各专利全文在此引用作为参考；以及美国专利5,750,692，其为与本申请共同拥有的专利，并在此引用作为参考。

[0139] 本发明的寡聚化合物还可包含一种或多种具有修饰糖部分的核苷。呋喃基糖环可以多种方式修饰，包括以取代基取代，桥连形成BNA以及以S或N(R)等杂原子取代4’-O。
指导该种修饰糖的制备的部分代表性美国专利包括，但不限于，美国专利：4,981,957；
5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；
5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；
5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；5,700,920；6,600,032 以 及于2005年6月2日提交并于2005年12月22日公布为WO 2005/121371的国际申请PCT/
US2005/019219，其中一部分为与本申请共同拥有的申请或专利，各文献全文在此引用作为参考。优选的修饰糖的代表性列表包括但不限于具有2’-F、2’-OCH2或2’-O(CH2)2-OCH3取代基的取代糖；4’-硫代修饰的糖以及双环修饰的糖。

[0140] 此处所用的术语“核苷模拟物”意在包括那些用于替换寡聚化合物的一个或多个位点的糖或非联接的糖和碱基的结构，例如，具有吗啉或双环[3.1.0]己基糖模拟物(例
如，具有磷酸二酯联接的非呋喃糖)的核苷模拟物。术语“糖替代物”与含义更广的术语
“核苷模拟物”略微重叠，但仅指糖单元(呋喃糖环)的替换。术语“核苷酸模拟物”意
在包括用于替换寡聚化合物的一个或多个位点的核苷和联接的结构，例如，肽核酸或吗啉
(被-N(H)-C(＝O)-O-或其它非-磷酸二酯联接的吗啉)。

[0141] 如本发明所述的寡聚化合物可包含长度从约8至约80个的核苷和/或修饰核苷或模拟物。本领域的普通技术人员将可理解本发明包含长度为8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、
41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、
66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个或其中任意范围的核苷和/或修饰核苷或模拟物的寡聚化合物。

[0142] 在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物为长度8至40个的核苷和/或修饰核苷或模拟物。本领域普通技术人员将可理解其可具体为长度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个或其中任意范围的核苷和/或修饰核苷或模拟物的寡聚化合物。

[0143] 在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物为长度8至20个的核苷和/或修饰核苷或模拟物。本领域普通技术人员将可理解其可具体为长度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19或20个或其中任意范围的核苷和/或修饰核苷或模拟物的寡聚化合物。

[0144] 在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物为长度10至16个的核苷和/或修饰核苷或模拟物。本领域普通技术人员将可理解其可具体为长度是10、11、12、13、14、15或16或其中任意范围的核苷和/或修饰核苷或模拟物的寡聚化合物。

[0145] 在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物为长度10至14个的核苷和/或修饰核苷或模拟物。本领域普通技术人员将可理解其可具体为长度是10、11、12、13或14个或其
中任意范围的核苷和/或修饰核苷或模拟物的寡聚化合物。

[0146] 嵌合寡聚化合物在两个或多个位置具有不同的修饰的核苷并通常定义为具有基序。本发明的嵌合寡聚化合物可形成上述两个或多个寡核苷酸、寡核苷酸类似物、寡聚核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。指导制备这样杂交结构的代表性美国专利包括，但不
限于，美国专利：5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；
5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；以及5,700,922，其中某些专利为与本申请共同拥有的专利，各专利全文在此引用作为参考。

[0147] 本发明的一方面中，修饰和未修饰的核苷及其模拟物可参照文献描述的针对 DNA(Protocols for Oligonucleotides and Analogs，Ed.Agrawal(1993)，Humana
Press)和/或RNA(Scaringe，Methods(2001)，23，206-217；Gait等人，Applications of Chemically synthesized RNA in RNA：Protein Interactions，Ed.Smith(1998)，1-36；
Gallo等人，Tetrahedron(2001)，57，5707-5713)合成的适当方法进行寡聚。固相合成的
其它方法可参见Caruthers的美国专利4,415,732；4,458,066；4,500,707；4,668,777；
4,973,679；和5，132,418；以及Koster的美国专利4,725,677和Re.34,069。

[0148] 常规用于基于支持基质合成寡聚化合物和相关化合物的的商业可获取设备已由多家供应商出售，包括，例如Applied Biosystems(Foster City，CA)。本领域已知的任何其它该类合成方法均可另外或替代性采用。适用的固相技术(包括自动合成技术)的描述可
见F.Eckstein(编)，Oligonucleotides and Analogues，a Practical Approach，Oxford University Press，New York(1991)。

[0149] 随着对RNAi投入的增加，RNA和相关类似物的合成相对于DNA和相关类似物的合成也逐渐增加。目前在商业上采用的初级RNA合成策略包括5’-O-DMT-2’-O-叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)、5’-O-DMT-2’-O-[1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基](FPMP)、2’-O-[(三异丙基硅烷基)氧基]甲基(2’-O-CH2-O-Si(iPr)3(TOM)、以及5’-O-硅醚-2’-ACE(5’-O-二(三甲基硅氧基)环十二烷氧基硅醚(DOD)-2’-O-二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)。
目前提供RNA产品的主要的公司包括Pierce Nucleic Acid Technologies、Dharmacon
Research公司、Ameri Biotechnologies公司和Integrated DNA Technologies公司。
Princeton Separations公司正在推广RNA合成活化剂，该活化剂据宣传可以特别针对TOM
和TBDMS化学法减少偶合次数。该种活化剂也适用于本发明。

[0150] 用于商业RNA合成的初级基团为：

[0151] TBDMS＝5’-O-DMT-2’-O-叔丁基二甲基硅烷基；

[0152] TOM＝2’-O-[(三异丙基硅烷基)氧基]甲基；

[0153] DOD/ACE＝(5’-O-二(三甲基硅氧基)环十二烷氧基硅醚-2’-O-二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基

[0154] FPMP＝5’-O-DMT-2’-O-[1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基]。

[0155] 所有前述的RNA合成策略均适用于本发明。上述策略的混合(例如，采用一种策略中的5’-保护基团和另一策略中的2’-O-保护基团)通常可根据本发明而调整。

[0156] 在本发明的上下文中，“杂交”指寡聚化合物互补链的配对。在本发明中，一种配对机制涉及寡聚化合物链的互补核苷或核苷酸碱基(核苷碱基)之间的氢键结合，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键结合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶为通过形
成氢键进行配对的互补核苷碱基。杂交可在多种条件下进行。

[0157] 当寡聚化合物与靶标核酸的结合干扰靶标核酸的正常功能引起活性损失，且当具有足够程度的互补性以在希望产生特定结合的条件下(即，在体内测定或治疗时在生理条
件下，以及在进行体外测定时在测定条件下)避免寡聚化合物和非靶标核酸序列的非特异
性结合时，寡聚化合物具有特异可杂交性。

[0158] 此处所用的“互补性”指两个核苷碱基无论其所在位置精确配对的能力。例如，如果在寡聚化合物某位置的核苷碱基能够与靶标核酸(该靶标核酸为DNA、RNA或寡核苷酸分子)某位置的核苷碱基氢键结合，则寡核苷酸和靶标核酸之间的氢键结合的位置被认为是
互补性位置。当各分子中的互补性位置被可以彼此以氢键结合的核苷碱基占据时，该寡聚
化合物和该DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此具有互补性。术语“特异可杂交性”和“互补性”是用于表示足够数量的核苷碱基中有足够精确的配对或互补程度、由此在寡核苷酸和靶标
核酸之间形成稳定和特异性结合的术语。

[0159] 在本领域中可以理解寡聚化合物的序列不需要对其靶标核酸具有100％的互补性以达到特异可杂交性。此外，寡核苷酸可在一个或多个片段上杂交从而使中间的或邻近的
片段不参与杂交(例如，环结构或发夹结构)。本发明的寡聚化合物对其靶向的靶标核酸序
列中的靶标区域具有至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的
序列互补性。例如，当寡聚化合物中20个核苷中有18个与靶标区域互补，因而该寡聚化合
物具有特异杂交性，则该寡聚化合物具有90％互补性。在该实例中，剩余的非互补性核苷
碱基可以成簇或散布在互补性核苷碱基中，不需要彼此邻近或与互补性核苷碱基邻近。同
样地，具有4(四)个非互补性核苷碱基(其侧翼连接两个与靶标核酸完全互补的区域)的
长度为18个核苷碱基的寡聚化合物对靶标核酸具有77.8％的总体互补性，并因此在本发
明的范围之内。寡聚化合物与靶标核酸区域的互补性百分比可通过本领域已知的BLAST程
序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序常规测定(Altschul等人，J.Mol.Biol.，
1990，215，403-410；Zhang和Madden，Genome Res.，1997，7，649-656)。

[0160] 本发明进一步包括了如反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、核酶、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、选择性剪切体、引物、探针等寡聚化合物，以及与靶标核酸的至少一个部分杂交的其它寡聚化合物。因此，这些寡聚化合物可以以单链、双链、环状或发夹寡聚化合物的形式引入，并可包含例如内部或末端突起或环的结构元件。本发明的寡聚化合物在引入
系统后可引发一种或多种酶或结构蛋白的作用以实现对靶标核酸的修饰。

[0161] 该种酶的非限制性实例之一为RNA酶H，一种裂解RNA:DNA双链的RNA链的细胞内切酶。本领域已知“类DNA”单链寡聚化合物引发RNA酶H。RNA酶H的激活可导致RNA靶
标的裂解，从而大大增强寡核苷酸-介导的基因表达抑制的效率。其它的核糖核酸酶(例
如属于RNA酶III和核糖核酸酶L酶家族的核糖核酸酶)也假定具有类似的作用。

[0162] 尽管寡聚化合物的一种形式为单链反义寡核苷酸，在许多物种中已显示引入双链结构(例如双链RNA(dsRNA)分子)可以导致基因或其相关基因产物功能的强效和特异性
反义介导的减少。该现象同时存在于植物和动物，并被认为与病毒防御和转座子沉默具有
进化联系。

[0163] 在一些实施方案中，在筛选可以调节所选定蛋白表达的其它寡聚化合物中可采用“适当的靶标片段”。“调节剂”为降低或提高编码蛋白的核酸分子表达、并且至少包含与适当靶标片段互补的8-核苷碱基部分的寡聚化合物。该筛选方法包括将编码蛋白的核酸分
子的适当靶标片段与一种或多种候选调节剂接触，并选择一种或多种提高或降低编码蛋白
的核酸分子表达的候选调节剂的步骤。一旦显示候选调节剂能够调节(例如，提高或降低)
编码肽的核酸分子表达，该调节剂可进一步用于肽功能的研究，或如本发明所述用作研究、诊断或治疗剂。

[0164] 本发明的适当靶标片段还可与其相应的本发明互补性反义寡聚化合物组合形成稳定的双链寡核苷酸。本领域已显示该种双链寡核苷酸部分可通过反义机制调节靶标表达
并调节翻译和RNA加工。此外，对该双链部分还可进行化学修饰(Fire等人，Nature，1998，
391，806-811；Timmons 和 Fire，Nature 1998，395，854；Timmons 等 人，Gene，2001，263，
103-112；Tabara等人，Science，1998，282，430-431；Montgomery等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，15502-15507；Tuschl等人，Genes Dev.，1999，13，3191-3197；Elbashir等人，Nature，2001，411，494-498；Elbashir等人，Genes Dev.2001，15，188-200)。例如，这种双链部分已显示可通过双链的反义链与靶标进行经典杂交从而引发靶标的酶降解来抑
制靶标(Tijsterman等人，Science，2002，295，694-697)。

[0165] 本发明的寡聚化合物还可用于药物开发和靶标确证领域。本发明包含了在药物开发中使用本发明的寡聚化合物和靶标以阐明蛋白和疾病状态、表型或症状之间存在的关
系。这些方法包括检测或调节靶标肽，包括将样本、组织、细胞或生物体与本发明的寡聚化合物接触，在处理后一定时间检测靶标核酸或蛋白水平和/或相关的表型或化学终点，并
任选地将测量值与未处理样本或以本发明其它寡聚化合物处理的样本进行比较。这些方法
可以平行进行或与其它实验组合进行，以确定靶标确证过程中未知基因的功能，或者测定
特定基因产物作为治疗或预防特定疾病、症状或表型的靶标的有效性。

[0166] 核苷修饰对RNAi活性的作用参照现有文献进行了评估(Elbashir等人，Nature(2001)，411，494-498；Nishikura等人，Cell(2001)，107，415-416；以及Bass等人，Cell(2000)，101，235-238)。

[0167] 本发明的寡聚化合物可用于诊断、治疗、预防，并可作为研究试剂和试剂盒。此外，能特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸也常被本领域的普通技术人员用来阐明特定基因的功能或区分生物通路各种组分的功能。

[0168] 对于试剂盒或诊断应用，单独或与其它寡聚化合物或治疗剂联合使用的本发明寡聚化合物可用作差异性和/或组合分析的工具，以阐明在细胞和组织内表达的基因的部分
或完整互补体的表达模式。

[0169] 作为一个非限制性实例，以一种或多种寡聚化合物处理的细胞或组织的表达模式可与未以寡聚化合物处理的对照细胞或组织进行比较，并分析各模式基因表达的差异水
平，它们与例如疾病关联性、信号转导途径、细胞定位、以及所检测基因的表达水平、大小、结构或功能有关。这些分析可在影响表达模式的其它化合物和/或寡聚化合物存在或不存
在的情况下对刺激或未刺激细胞进行。

[0170] 本领域已知的基因表达分析方法的实例包括DNA阵列或微阵列(Brazma和Vilo，FEBS Lett.，2000，480，17-24；Celis等人，FEBS Lett.，2000，480，2-16)、SAGE(基因表达系列分析)(Madden等人，Drug Discov.Today，2000，5，415-425)、READS(消化的cDNA的限制性酶扩增)(Prashar和Weissman，Methods Enzymol.，1999，303，258-72)、TOGA(总基因表达分析)(Sutcliffe等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，1976-81)、蛋白阵列和蛋白组学(Celis等人，FEBS Lett.，2000，480，2-16；Jungblut等人，Electrophoresis，
1999，20，2100-10)、表达序列标记(EST)序列(Celis等人，FEBS Lett.，2000，480，2-16；
Larsson等人，J.Biotechnol.，2000，80，143-57)、消减RNA指纹(SuRF)(Fuchs等人，Anal.Biochem.，2000，286，91-98；Larson等人，Cytometry，2000，41，203-208)、消减克隆、差异展示(DD)(Jurecic和Belmont，Curr.Opin.Microbiol.，2000，3，316-21)、比较基因组杂交(Carulli等人，J.Cell Biochem.Suppl.，1998，31，286-96)、FISH(荧光原位杂交)技术(Going和Gusterson，Eur.J.Cancer，1999，35，1895-904)以及质谱方法(To，Comb.Chem.High Throughput Screen，2000，3，235-41)。

[0171] 本发明的寡聚化合物可用于研究和诊断，因为这些寡聚化合物可与编码蛋白的核酸杂交。例如，可在此处披露的条件下以在此披露的效率杂交从而成为有效蛋白抑制剂的
寡核苷酸将在有利于基因扩增或检测的条件下分别作为有效的引物或探针。这些引物和探
针可用于需要特异性检测编码蛋白的核酸分子的方法，并可用于核酸分子扩增以供检测或
在进一步研究中使用。本发明的反义寡核苷酸，特别是引物和探针与核酸的杂交可通过本
领域已知的方法进行检测。该种方法可包括将酶偶联至寡核苷酸，对该寡核苷酸放射性标
记或任何其它适用的检测方法。还可制备使用这些检测手段检测样本中选定蛋白水平的试
剂盒。

[0172] 本发明已根据其一些实施方案进行了具体描述，以下实施例仅用于阐述本发明，并非意在对其进行限制。

[0173] 实施例1

[0174] 尿苷6-(R)-甲基BNA亚磷酰胺，(1S，3R，4R，6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2，
5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(15)的制备

[0175]

[0176] 示意图1(a)TBSCl，Et3N，DMAP，CH2Cl2，室温，16小时，来自3的产率为59％；(b)Swern氧化(c)MeMgBr，CeCl3，THF，-78℃，来自3的产率为80％；(d)MsCl，Et3N，DMAP，CH2Cl2，室温，16小时，91％；(e)AcOH，Ac2O，H2SO4，室温，16小时，88％；(f)尿嘧啶，BSA，TMSOTf，CH3CN，回流，2小时；(g)K2CO3，MeOH，室温，16小时；(h)TBDPSCI，Et3N，DMAP，CH2Cl2，室温，16小时，来自8的产率为79％；(i)BCl3，CH2Cl2，-15℃，60％；(j)Et3N.3HF，Et3N，THF，室温，16小时；(k)DMTCl，嘧啶，室温，16小时，来自12的产率为89％；(l)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI，DMF。

[0177] A)5-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3-O-苯甲基-1，2-O-异亚丙基-4-C-羟甲基-α-D-赤式-戊呋喃糖(3)

[0178] 通过加料漏斗在10分钟内向含有二醇2(12g，38.8mmol，参照Mo ffatt等人，J.Org.Chem.1979，44，1301，参考1的方法进行制备)、三乙胺(11.44mL，81.5mmol)以及
4-二甲基氨乙基嘧啶(0.47g，3.9mmol)的CH2Cl2(184mL)冷(0℃)溶液中添加叔丁基二甲
基硅烷基氯(6.24g，40.7mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液。添加完成后，将反应逐渐加热至
室温，并继续搅拌16小时。用CH2Cl2稀释反应物，依次以5％HCl水溶液、饱和NaHCO3、盐
水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以10％至30％的EtOAc/己烷洗脱)纯
化产生白色固体的醇3(11.53g，59％)和醇4(3.93g，22％)。

[0179] B)醇(6)

[0180] 将二甲基亚砜(3.36mL，47.5mmol)逐滴加入含有草酰氯(2.08mL，23.7mmol)的CH2Cl2冷(-78℃)溶液(130mL)。搅拌30分钟后，向反应中添加醇3(6.7g，15.8mmol)的
CH2Cl2溶液(20mL)。在-78℃继续搅拌45分钟并向反应中添加三乙胺(10.0mL，71.2mmol)。
在-78℃下将反应物搅拌15分钟，随后取走冰浴，并在45分钟内对反应物逐渐加温。然后将反应物倒入CH2Cl2中，有机相先后以5％HCl水溶液、饱和NaHCO3、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩以提供醛5，其在不作进一步纯化下使用。

[0181] 将氯化铈III(5.84g，23.7mmol)的THF(130mL)悬浮液在室温下搅拌90分钟。在冰浴中冷却反应物，在5分钟内添加甲基溴化镁(17.0mL的1M甲基溴化镁的THF溶液)，
继续搅拌90分钟。将含有粗制醛5(由前面获得)的THF(20mL)加入反应物中。继续搅拌
90分钟后，以饱和NH4Cl溶液淬灭反应并将反应物倒入EtOAc。依次以5％HCl水溶液、饱
和NaHCO3、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以15％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供醇6(5.52g，来自3的产率为80％)。

[0182] C)甲磺酸(7)

[0183] 向含有醇6(2.77g，6.4mmol)、三乙胺(1.1mL，7.7mmol)和4-二甲基氨基嘧啶(84mg，0.7mmol)的CH2Cl2(14mL)冰(0℃)溶液添加甲烷磺酰氯(0.55mL，7.0mmol)。室温
搅拌1小时后，将反应物倒入CHCl3，有机层依次以5％HCl水溶液、饱和NaHCO3、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以15％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供甲磺酸
7(2.97g，91％)。

[0184] D)三乙酸酯(8)

[0185] 将浓H2SO4(3滴)加入甲磺酸7(2.97g，5.8mmol)的冰醋酸(29mL)和乙酸酐(5.8mL)溶液。室温搅拌1小时后，将反应物倒入EtOAc，有机层依次以水、饱和NaHCO3、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以33％至50％的EtOAc/己烷洗脱)纯
1
化提供三乙酸酯8(2.48g，88％)。H NMR(CDCl3，β异头体)：δ7.39-7.30(m，5H)，6.23(s，
1H)，5.37(d，1H)，5.19(q，1H)，4.62(d，1H)，4.52(d，1H)，4.38(s，1H)，4.34(d，1H)，3.98(d，
1H)，2.91(s，3H)，2.12(s，3H)，2.08(s，3H)，2.06(s，3H)，1.55(d，3H)。LCMS：保留时间1.35分钟；M+23计算值511.1，实测值511.0。

[0186] E)核苷(11)

[0187] 向三乙酸酯8(2.47g，5.0mmo1)和尿嘧啶(0.70g，6.3mmol)的CH3CN(15mL)悬浮液添加N，O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(4.9mL，20.0mmol)。在40℃下加热15分钟以获
得澄清溶液，向反应中添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐(1.18mL，6.5mmol)。回流2小时
后，将反应冷却至室温并倒入EtOAc。以饱和NaHCO3、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空浓缩以提供粗制核苷9，其可在不作任何纯化下使用。

[0188] 向核苷9(由前面获得)的MeOH(50mL)溶液添加K2CO3(2.07g，15mmol)。在室温下搅拌16小时后，真空去除溶剂并在25％嘧啶/EtOAc和盐水中分配残留物。收集有机相，
1
干燥(Na2SO4)并真空浓缩提供10，其在不作进一步纯化下使用。H NMR(MeOD)：δ7.74(d，
2H)，7.29-7.14(m，5H)，5.53(d，1H)，5.38(s，1H)，4.48(s，2H)，4.18(s，1H)，4.14(sm，1H)，
3.92(s，1H)，3.66(s，2H)，1.08(d，3H)。LCMS：保留时间2.40分钟；M+H计算值360.1，实测值361.0。

[0189] 向核苷10(由前面获得)、三乙胺(1.4mL，10.0mmol)和4-二甲基氨基嘧啶(80mg，0.7mmol)的CH2Cl2(9mL)冰(0℃)溶液中添加叔丁基二苯基硅烷基氯(1.73mL，6.7mmol)。
室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc，依次以5％HCl水溶液、饱和NaHCO3洗涤有机相，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以50％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体
的核苷11(2.02g，来自8的产率为79％)。

[0190] F)核苷(12)

[0191] 将三氯化硼(1M三氯化硼的16.7mL CH2Cl2溶液)小心加入核苷11(2.0g，3.3mmol)的CH2Cl2(40mL)冷(-15℃)溶液。在-15℃下搅拌1小时后，将反应物冷却
至-78℃并通过添加MeOH/CH2Cl2(1∶1，10mL)小心淬灭反应。继续搅拌10分钟后，将反
应物倒入CH2Cl2，依次以5％HCl水溶液、饱和NaHCO3、盐水洗涤有机相，干燥(Na2SO4)并
真空浓缩。柱层析(SiO2，以50％至80％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体的核苷
12(1.02g，60％)。

[0192] G)核苷(13)

[0193] 在聚丙烯管中向核苷12(1.86g，3.7mmol)和三乙胺(1.03mL，7.3mmol)的THF(36mL)溶液中添加三乙胺三氢氟酸盐(2.98mL，18.3mmol)。室温搅拌16小时后，真空浓缩反应物并将残留物溶解于EtOAc。依次以水、饱和NaHCO3、盐水洗涤有机相，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以15％的MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供白色固体核苷13(1.31g，
产物中掺杂了三乙胺)。

[0194] H)核苷(14)

[0195] 向核苷13(由前面获得)的嘧啶(18mL)溶液添加4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(DMTCl)(1.23g，3.7mmol)。室温搅拌16小时后，向反应添加额外的DMTCl(0.12g)，继续搅拌8小时。然后将反应物倒入EtOAc，随后以盐水萃取有机相，干燥(Na2SO4)并浓缩。柱
层析(SiO2，以15％的丙酮/CHCl3洗脱)纯化提供白色泡沫状的核苷14(1.85g，89％)。
1
H NMR(CDCl3)：δ8.03(d，1H)，7.44-2.28(m，14H)，6.86(d，4H)，5.63(d，1H)，5.60(s，1H)，
4.32(m，1H)，4.13(s，1H)，3.81(s，6H)，3.49(d，1H)，3.37(d，1H)，1.18(d，3H)。

[0196] I)亚磷酰胺，(1S，3R，4R，6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双
环[2.2.1]庚烷(15)的制备

[0197] 将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(0.69mL，2.2mmol)加入核苷14(0.83g，1.4mmol)、四唑(80mg，1.2mmol)和N-甲基咪唑(29μL，0.36mmol)的DMF(7.2mL)溶液中。
室温搅拌8小时后，将反应物倒入EtOAc，依次以90％盐水、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩。将残留物溶解于最少量的EtOAc中，将该溶液添加至己烷中。收集所得的沉淀物，进一步通过柱层析(SiO2，以66％至75％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体亚磷酰胺
31
15(1.04g，94％)。 PNMR(CDCl3)δ：149.21，149.79。

[0198] 实施例2

[0199] 尿苷N-Bz-胞嘧啶-6-(R)-甲基BNA亚磷酰胺，(1S，3R，4R，6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(21)的制备

[0200]

[0201] 示意图2(a)TBSCI，咪唑，DMF，室温，16小时，99％；(b)POCl3，1，2，4-三唑，Et3N，CH3CN，室温，4小时；(c)NH3水溶液，1，4-二恶烷，室温，16小时；(d)Bz2O，DMF，室温，16小时，来自15的产率为90％；(e)Et3N.3HF，Et3N，THF，室温，16小时，93％；(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI，DMF，95％。

[0202] A)核苷(16)

[0203] 将叔丁基二甲基硅烷基氯(0.79g，5.2mmol)添加至核苷14(1.0g，1.7mmol)和咪唑(0.70g，10.4mmol)的DMF(3.5mL)溶液。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc，以盐
水萃取有机相，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以50％的EtOAc/己烷洗脱)纯
化提供白色固体的核苷16(1.17g，99％)。

[0204] B)核苷(19)

[0205] 将三 氯氧 磷(1.27mL，13.6mmol)添 加至 1，2，4-三唑(4.0g，58.0mmol) 的CH3CN(21mL)冷(0℃)悬浮液中。搅拌15分钟后，向反应中添加三乙胺(9.57mL，68mmol)，
继续搅拌30分钟。在0℃下向反应中添加核苷16(1.17g，1.7mmol)的CH3CN(10mL)溶液。
搅拌10分钟后，去除冰浴并在室温下搅拌反应物4小时。真空去除溶剂，在EtOAc和水之
间分配残留物。然后以饱和NaHCO3、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空浓缩以提供粗产物17，其可在不作任何纯化下使用。

[0206] 将氨水(4mL)添加至核苷17(由前面获得)的二恶烷(20mL)溶液中。在室温下搅拌16小时，真空浓缩反应物并在高度真空下干燥8小时以提供核苷18，其可在不作任何
纯化下使用。

[0207] 向核苷18(由前面获得)的DMF(3mL)溶液添加苯甲酸酐(0.65g，2.9mmol)。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc，以饱和NaHCO3、盐水萃取有机相，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以50％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体的核苷19(1.2g，来
自16的产率为90％)。

[0208] C)核苷(20)

[0209] 在聚丙烯管中向核苷19(1.86g，3.7mmol)和三乙胺(1.03mL，7.3mmol)的THF(15mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(1.48mL，9.1mmol)。室温下搅拌16小时后，真空浓
缩反应物并将残留物溶解于EtOAc，依次以水、饱和NaHCO3、盐水洗涤有机相，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以5％MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供白色固体核苷20(0.91g，
1
90％)。H NMR(MeOD)δ：8.62(d，1H)，8.02(d.IH)，7.63(m，6H)，7.38(m，7H)，6.96(d，4H)，
6.65s，1H)，4.49(s，1H)，4.36(s，1H)，4.25(m，1H)，3.53(d，1H)，3.41(d，1H)，1.18(d，3H)。

[0210] D)(1S，3R，4R，6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(21)

[0211] 将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(0.63mL，2.0mmol)加入含有核苷20(0.89g，1.3mmol)、四唑(73mg，1.1mmol)和N-甲基咪唑(26μL，0.33mmol)的DMF(6.6mL)溶液中。
室温搅拌8小时后，将反应物倒入EtOAc，依次以90％盐水、盐水洗涤有机相，干燥(Na2SO4)并浓缩。将残留物溶解于最少量的EtOAc，将该溶液添加至己烷。收集所得的沉淀物，进
一步通过柱层析(SiO2，以75％至90％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体亚磷酰胺
31
21(1.1g，95％)。 P NMR(CDCl3)δ：149.34，149.77。

[0212] 实施例3

[0213] 尿苷-6-(S)-甲基BNA亚磷酰胺，(1S，3R，4R，6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(38)的制备

[0214]

[0215] 示意图3(a)NaH，溴化萘，DMF，室温，2h，98％；(b)醋酸，H2O，室温，16小时；(c)NaIO4，二恶烷，H2O，室温，90分钟；(d)HCHO，NaOH，THF，H2O，室温，16小时，由22为80％；(e)TBDPSCl，Et3N，DMAP，CH2Cl2，室温，16小时，61％；(f)草酰氯，DMSO，Et3N，-78℃；(g)MeMgBr，CeCl3，来自26的产率为89％；(h)草酰氯，DMSO，Et3N，-78℃；(i)DiBAL，CH2Cl2，-78℃；(j)MsCl，Et3N，DMAP，CH2Cl2，室温，1小时；(k)Ac2O，AcOH，H2SO4，由28为58％；(l)BSA，尿嘧啶，TMSOTf，MeCN，回流，2小时；(m)K2CO3，MeOH，室温，16小时，来自34的产率为76％；(n)DDQ，CH2Cl2，H2O，室温，8小时，80％；(o)Et3N.3HF，Et3N，THF，定量；(p)DMTCl，嘧啶，室温，16小时，86％；(q)CN(CH2)2OP(NiPr2)2，四唑，NMI，DMF，97％。

[0216] A)醇(22)

[0217] 将氢化钠(2.39g，59.8mmol)小心添加至可从市场购得的1，2：5，6-二-O-异亚丙基-α-D-呋喃阿洛糖1(12.0g，46mmol)的DMF(75mL)冷(0℃)溶液中。搅拌20分钟后，向反应中添加溴化萘(11.12g，50.8mmol)并继续搅拌2小时。以H2O小心淬灭反应并将其
倒入EtOAc，以水、盐水洗涤有机层，干燥并浓缩。柱层析(SiO2，以10％至33％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体醇22(18.1g，98％)。

[0218] B)二醇(25)

[0219] 将醇22(18g，46mmol)溶解于冰醋酸(150mL)和H2O(60mL)。在室温下搅拌反应物16小时，然后将其真空浓缩。然后将残留物溶解于EtOAc，以饱和NaHCO3、盐水洗涤有机层，干燥并浓缩得到粗品23，其在不作进一步纯化下使用。

[0220] 将高碘酸钠(48mmol，10g)水溶液(350mL)添加至上面获得的粗产品二醇23的1，4-二恶烷(140mL)的溶液。室温搅拌90分钟后，以EtOAc萃取反应物，以水、盐水进一步洗
涤有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩得到醛24，其可不作进一步纯化下使用。

[0221] 将由前面获得的粗品醛24溶解于THF∶H2O(1∶1，100mL)混合物，并将反应物在冰浴中冷却。向反应中添加甲醛(25mL，35％w/w)和1N NaOH(100mL)。室温搅拌16小
时后，向反应添加甲醛(5mL)并继续搅拌32小时。将反应物浓缩至干燥，在EtOAc和水之
间分配残留物。分层并以另外的1N NaOH、水、盐水洗涤有机相，干燥并浓缩得到白色固体二醇25(12.96g，80％，三步)。

[0222] C)醇(26)

[0223] 将叔丁基二苯基硅烷基氯(0.75mL，2.9mmol)添加至二醇25(1g，2.8mmol)和三乙胺(0.45mL，3.2mmol)的冷(0℃)溶液。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc，并依次
用5％HCl、饱和NaHCO3、盐水洗涤有机相，干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以10％至
40％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供油状的醇26(1.02g，61％)(还分离得到0.42g区域异
构硅保护的二醇)。

[0224] D)醇(28)

[0225] 将二甲基亚砜(1.6mL，22.4mmol)逐滴加入草酰氯(0.98mL，11.2mmol)的CH2Cl2(70mL)冷(-78℃)溶液。搅拌30分钟后，向反应中添加醇26(4.8g，8.0mmol)的
CH2Cl2(20mL)溶液。在-78℃继续搅拌45分钟并向反应中添加三乙胺(4.72mL，33.7mmol)。
在-78℃下将反应物搅拌15分钟，随后取走冰浴，并在45分钟内对反应物逐渐加温。然后
将反应物倒入CH2Cl2，依次以5％HCl水溶液、饱和NaHCO3、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩以提供醛27，其可在不作进一步纯化下使用。

[0226] 将氯化铈III(2.96g，12.0mmol)的THF(50mL)悬浮液在室温下搅拌90分钟。在冰浴中冷却反应物，历经5分钟添加甲基溴化镁(1.4M甲基溴化镁的8.6mL THF的溶
液，12mmol)，继续搅拌90分钟，然后将反应冷却至-78℃。将粗醛27(由前面获得)的
THF(20mL)溶液加入反应物。继续搅拌90分钟后，以饱和NH4Cl溶液淬灭反应并倒入EtOAc。
依次以5％HCl水溶液、饱和NaHCO3、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析
(SiO2，以20％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供醇28(4.37g，来自26的产率为89％)。

[0227] E)二乙酸(32)

[0228] 将二甲基亚砜(1.41mL，19.9mmol)逐滴加入草酰氯(0.87mL，10.0mmol)的CH2Cl2(70mL)冷(-78℃)溶液。搅拌30分钟后，向反应中添加醇28(4.35g，7.1mmol)的
CH2Cl2(20mL)溶液。在-78℃继续搅拌45分钟并向反应中添加三乙胺(4.20mL，30.0mmol)。
在-78℃下将反应物搅拌15分钟，随后取走冰浴，并在45分钟内对反应物逐渐加温。然后
将反应物倒入CH2Cl2，先后以5％HCl水溶液、饱和NaHCO3、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩以提供醛29，其可在不作进一步纯化下使用。

[0229] 将二异丁基氢化铝(13.7mL 1M二异丁基氢化铝的CH2Cl2溶液，13.7mmol)添加至酮29(由前面获得)的CH2Cl2(15mL)冷溶液。在-78℃下搅拌2小时后，添加饱和NH4Cl
淬灭反应并将其倒入CHCl3。然后以5％HCl水溶液、饱和NaHCO3、盐水洗涤有机层，干燥
(Na2SO4)并真空浓缩以提供醇30，其可在不作任何纯化下使用。

[0230] 向含有醇30(由前面获得)、三乙胺(1.77mL，10.5mmol)和4-二甲基氨基嘧啶(85mg，0.7mmol)的CH2Cl2(21mL)冷(0℃)溶液添加甲烷磺酰氯(0.11mL，1.4mmol)。室温
搅拌1小时后，将反应物倒入CHCl3，依次以5％HCl水溶液、饱和NaHCO3、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空浓缩以提供甲磺酸31，其在不作任何纯化下使用。

[0231] 将浓H2SO4(2滴)加入甲磺酸31(由前面获得)的冰醋酸(15mL)和乙酸酐(3.0mL)溶液。室温搅拌1小时后，将反应物倒入EtOAc，依次以水、饱和NaHCO3、盐水洗涤有机相，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以20％至33％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供二
乙酸32(3.0g，由28为58％)。

[0232] F)核苷(34)

[0233] 向二乙酸32(3.0g，4.1mmol)和尿嘧啶(0.57g，5.1mmol)的CH3CN(20mL)悬浮液添加N，O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(3.45mL，14.0mmol)。在40℃下加热15分钟以获得
澄清溶液后，向反应中添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐(0.95mL，5.3mmol)。回流2小时
后，将反应冷却至室温并倒入EtOAc。以饱和NaHCO3、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空浓缩以提供粗制核苷33，其可在不作任何纯化下使用。

[0234] 向核苷33(由前面获得)的MeOH(40mL)溶液添加K2CO3(1.66g，12.0mmol)。室温下搅拌16小时后，真空浓缩反应物并将残留物溶解于25％嘧啶/EtOAc，以盐水萃取，干燥
(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以40％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体核苷
34(2.0g，来自32的产率为76％)。

[0235] G)核苷(35)

[0236] 向核苷34(2.0g，3.1mmol)的二氯甲烷(30mL)和H2O(1.5mL)溶液添加2，3-二氯-5，6-二氰-1，4-苯醌(DDQ)(1.4g，6.2mmol)。室温下搅拌3小时，再次向反应添加
DDQ(0.5g)。再搅拌10分钟后，真空浓缩反应物并将残留物溶解于EtOAc。依次以水、水：
饱和NaHCO3(1∶1)、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，80％的EtOAc/己烷)纯化提供白色固体核苷35(1.25g，80％)。

[0237] H)核苷(36)

[0238] 在聚丙烯管中向核苷35(1.25g，2.5mmol)和三乙胺(1.0mL，7.4mmol)的THF(25mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(2.4mL，14.7mmol)。室温搅拌24小时后，真空浓
缩反应物并将残留物溶解于EtOAc。依次以水、饱和NaHCO3、盐水洗涤有机层，干燥并浓
缩(Na2SO4)。柱层析(SiO2，以5％至10％的MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供白色固体核苷
36(0.88g)(产物混有Et3N)。

[0239] I)核苷(37)

[0240] 向核苷36(由前面获得)的嘧啶(12mL)溶液添加二甲氧基三苯甲基氯(0.91g，2.7mmol)。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc，以盐水洗涤有机层，干燥并浓缩。柱层析(SiO2，以90％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体核苷37(1.28g，来自36的产率
为86％)。

[0241] J)(1S，3R，4R，6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(38)

[0242] 将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(0.46mL，1.5mmol)加入含有核苷37(0.59g，1.0mmol)、四唑(57mg，1.1mmol)和N-甲基咪唑(20μL，0.25mmol)的DMF(5mL)溶液。室
温搅拌8小时后，将反应物倒入EtOAc，依次以90％盐水、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)
并浓缩。柱层析(SiO2，以66％至75％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体亚磷酰胺
31
38(0.75g，97％)。 P NMR(CDCl3)δ：149.36，149.53。

[0243] 实施例4

[0244] N-Bz-胞嘧啶-6-(R)-甲基BNA亚磷酰胺，(1S，3R，4R，6S，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧
啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(44)的制备

[0245]

[0246] 示意图4(a)TBSCl，Et3N，DMAP，CH2Cl2，室温，16小时97％；(b)POCl3，1，2，4-三唑，Et3N，CH3CN，室温，4小时；(c)NH3水溶液，1，4-二恶烷，室温，16小时；(d)Bz2O，DMF，室温，16小时，来自39的产率为91％；(e)Et3N.3HF，Et3N，THF，室温，16小时，87％；(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI，DMF，90％。

[0247] A)核苷(39)

[0248] 将叔丁基二甲基硅烷基氯(0.45g，5.2mmol)添加至核苷37(0.59g，1.0mmol)和咪唑(0.41g，6.0mmol)的DMF(2mL)溶液中。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc，随后
以盐水萃取有机相，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以50％的EtOAc/己烷洗脱)
纯化提供白色固体的核苷39(0.68g，97％)。

[0249] B)核苷(42)

[0250] 将三氯氧化磷(0.74mL，8.0mmol)添加至1，2，4-三唑(2.35g，34.0mmol)的CH3CN(16mL)冷(0℃)悬浮液。搅拌15分钟后，向反应添加三乙胺(5.6mL，40mmol)，继续
搅拌30分钟。在0℃下向反应添加核苷39(0.68g，1.0mmol)的CH3CN(7mL)溶液。搅拌10
分钟后，去除冰浴并在室温下搅拌反应物4小时。真空去除溶剂，在EtOAc和水之间分配残
留物。然后以饱和NaHCO3、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空浓缩以提供粗产物40，其可在不作任何纯化下使用。

[0251] 将氨水(2.5mL)添加至核苷40(由前面获得)的二恶烷(12mL)溶液。在室温下搅拌16小时，真空浓缩反应物并在高度真空下干燥8小时以提供核苷41，其可在不作任何
纯化下使用。

[0252] 向核苷41(由前面获得)的DMF(25mL)溶液添加苯甲酸酐(0.38g，1.7mmol)。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc，以饱和NaHCO3、盐水萃取有机层，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以50％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体的核苷42(0.72g，
来自39的产率为91％)。

[0253] C)核苷(43)

[0254] 在聚丙烯管中向含有核苷42(0.72g，0.91mmol)和三乙胺(0.30mL，2.2mmol)的THF(9mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(0.89mL，5.5mmol)。室温下搅拌16小时后，
真空浓缩反应物并将残留物溶解于EtOAc，依次以水、饱和NaHCO3、盐水洗涤有机层，干
燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以25％至40％的丙酮/CHCl3洗脱)纯化提供白
1
色固体核苷43(0.53g，87％)。H NMR(CDCl3)：δ8.34(s，br，1H)，8.33(d，1H)，7.83(d，
1H)，7.57-7.26(m，16H)，6.89(d，4H)，5.72(s，1H)，4.75(s，1H)，4.22(s，1H)，4，14(m，1H)，
3.83(s，6H)，3.63(d，1H)，3.46(s，1H)，1.20(d，3H)。

[0255] D)(1S，3R，4R，6S，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(44)

[0256] 将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(0.37mL，1.2mmol)加入含有核苷43(0.89g，1.3mmol)、四唑(43mg，0.63mmol)和N-甲基咪唑(16μL，0.20mmol)的DMF(4mL)溶液。室
温搅拌8小时后，将反应物倒入EtOAc，依次以90％盐水、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)
并浓缩。柱层析(SiO2，以75％至90％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体亚磷酰胺
44(0.61g，90％)。

[0257] 实施例5

[0258] (1S，3R，4R，6S，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环
[2.2.1]庚烷(51)

[0259]

[0260] 示意图5(a)6-N-苯甲酰腺嘌呤，BSA，TMSOTf，DCE，回流，8小时；(b)K2CO3，MeOH，室温，16小时，来自32的产率为73％；(c)Bz2O，DMF，室温；(d)DDQ，CH2Cl2，H2O，室温；(e)Et3N.3HF，Et3N，THF，室温，16小时；(f)DMTCl，嘧啶，室温，16小时；(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI，DMF。

[0261] A)核苷(46)

[0262] 向二乙酸32(1.0g，1.4mmol)和6-N-苯甲酰腺嘌呤(0.48g，2.0mmol)的二氯乙烷(14mL)悬浮液添加N，O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(1.1mL，4.50mmol)。反应混合物
在回流45分钟后变澄清，并在冰浴中冷却，添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐(0.49mL，
2.7mmol)。回流8小时后，将反应冷却至室温并倒入EtOAc。以饱和NaHCO3和盐水洗涤有
机相，干燥(Na2SO4)并真空浓缩以提供粗制核苷45，其可在不作纯化下使用。

[0263] 向核苷45(由前面获得)的MeOH(14mL)溶液添加K2CO3(0.38g，2.7mmol)。室温搅拌24小时后将反应物真空浓缩。将残留物悬浮于EtOAc，用水和盐水萃取，然后干燥
(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以1％至2.5％的MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供白色固
体核苷46(0.69g，来自32的产率为73％)。

[0264] B)核苷47

[0265] 核苷47可由核苷46通过与干DMF中的苯甲酸酐(1.5-2当量)反应进行制备。

[0266] C)亚磷酰胺51

[0267] 亚磷酰胺51可通过实施例3所示的由核苷34得到亚磷酰胺38的方法由核苷47进行制备。

[0268] 实施例6

[0269] (1S，3R，4R，6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(60)

[0270]

[0271] 示意图6(a)MsCl，Et3N，DMAP，CH2Cl2，室温，4小时；(b)Ac2O，AcOH，催化量H2SO4，室温，3小时，来自28的产率为87％；(c)6-N-苯甲酰腺嘌呤，BSA，TMSOTf，DCE，回流，2小时；(d)K2CO3，MeOH，室温，16小时；(e)Bz2O，DMF，室温；(f)DDQ，CH2Cl2，H2O，室温；(g)Et3N.3HF，Et3N，THF，室温，16小时；(h)DMTCl，嘧啶，室温，16小时；(i)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI，DMF。

[0272] A)二乙酸(52)

[0273] 向含有醇28(7.37g，12.0mmol)、三乙胺(2.82mL，20.2mmol)和DMAP(0.20g，1.1mmol)的二氯甲烷(25mL)冷溶液(0℃)逐滴添加甲烷磺酰氯(1.33mL，16.8mmol)。室
温下搅拌2小时后，以二氯甲烷稀释反应物，以5％HCl、饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤有机相，干燥(Na2SO4)并浓缩。由此获得粗品甲磺酸52，其可在不作纯化下使用。

[0274] B)二乙酸(53)

[0275] 将浓硫酸(10滴)加入甲磺酸52(由前面获得)的乙酸酐(7.2mL)和醋酸(36mL)溶液。室温搅拌2小时后将反应物在高度真空下浓缩。将残留物溶解于乙酸乙酯，以水、饱和碳酸氢钠溶液(直至pH＞8)和盐水小心洗涤有机层，然后干燥(Na2SO4)并浓缩。以柱
层析(SiO2，以25％至35％EtOAc/己烷洗脱)纯化残留物以提供粘性油二乙酸53(7.66g，
来自28的产率为87％)。

[0276] C)亚磷酰胺(60)

[0277] 亚磷酰胺60可通过实施例3所示的由二乙酸32得到亚磷酰胺51的方法由二乙酸53进行制备。

[0278] 实施例7

[0279] (1S，3R，4R，6S，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-异丁酰鸟嘌呤-9-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环
[2.2.1]庚烷(67)

[0280]

[0281] 示意图7(a)2-氨基-6-氯嘌呤，BSA，TMSOTf，DCE，回流，2小时；(b)3-羟基丙腈，NaH，THF，4小时，来自32的产率为82％；(c)异丁酸酐，DMAP，DMF，60C，24小时，71％；(d)DDQ，CH2Cl2，H2O，室温，16小时，91％；(e)Et3N.3HF，Et3N，THF，室温，16小时，97％；(f)DMTCl，嘧啶，室温，16小时，85％；(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI，DMF。

[0282] A)核苷(61)

[0283] 向二乙酸32(3.44g，4.7mmol)和2-氨基-6-氯嘌呤(1.18g，7.0mmol)的二氯乙烷(46mL)悬浮液添加N，O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(3.8mL，15.5mmol)。回流45分
钟得到澄清溶液后，在冰浴中冷却反应物并添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐(1.69mL，
9.4mmol)。回流8小时后，将反应冷却至室温并倒入氯仿。以饱和NaHCO3和盐水洗涤有机
层，干燥(Na2SO4)并真空浓缩以提供粗制核苷61，其可在不作纯化下使用。

[0284] B)核苷(62)

[0285] 向氢化钠(1.07g，27.0mmol，60％w/w)的干THF(10mL)搅拌悬浮液逐滴添加3-羟基丙腈(1.67mL，24.5mmol)。搅拌20分钟后，添加粗品核苷61(由前面获得)的干
THF(25mL)溶液。室温下继续搅拌5小时，然后通过添加饱和氯化铵溶液小心淬灭反应。然
后将反应物倒入乙酸乙酯，以盐水萃取有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩。以柱层析(SiO2，以CHCl3至2.5％MeOH/CHCl3洗脱)纯化残留物以提供浅棕色固体的核苷62(3.18g，来自32
的产率为82％)。

[0286] C)核苷(63)

[0287] 将异丁酸酐(1.5mL，9.3mmol)添加至核苷62(3.19g，4.6mmol)和4-二甲氨基甲基嘧啶(0.11g，0.93mmol)的DMF(27mL)溶液。在60℃下搅拌14小时后，向反应再加入异
丁酸酐(1.5mL，9.3mmol)，继续在60℃下搅拌12小时。将反应冷却至室温，以EtOAc稀释，并以水、饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以5％至15％的丙酮/CHCl3洗脱)纯化提供黄色泡沫状的核苷63(2.5g，71％)。

[0288] D)核苷(64)

[0289] 向核苷63(2.5g，3.3mmol)的二氯甲烷(33mL)和H2O(1.7mL)溶液添加DDQ(1.12g，5.0mmol)。在室温下搅拌2小时后再次添加DDQ(1.0g)。继续在室温下搅拌6小时，然后将
反应物在冰箱(4℃)中储存16小时。然后真空浓缩反应物并将残留物溶解于乙酸乙酯。以
水、10％亚硫酸氢钠溶液(2×)、饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤有机层，然后干燥(Na2SO4)
并浓缩。柱层析(SiO2，以5％MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供核苷64(1.84g，91％)。

[0290] E)核苷(65)

[0291] 在聚丙烯管中向核苷64(1.84g，3.0mmol)和三乙胺(1.25mL，8.9mmol)的THF(30mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(2.88mL，17.9mmol)。室温搅拌24小时后，真空
浓缩反应物并将残留物溶解于EtOAc。依次以水、饱和NaHCO3、盐水洗涤有机层，然后干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以5％至10％的MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供白色固体的核
苷65(1.05g，97％)。

[0292] F)核苷(66)

[0293] 向核苷65(1.00g，2.7mmol)的嘧啶(13mL)溶液添加二甲氧基三苯甲基氯(1.07g，3.2mmol)。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc，以盐水洗涤有机层，干燥并浓缩。柱层析(SiO2，以2.5％至5％的MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供白色泡沫状的核苷66(1.52g，
85％)。

[0294] G)(1S，3R，4R，6S，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-异丁酰鸟嘌呤-9-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(67)

[0295] 将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(1.06mL，3.4mmol)加入含有核苷66(1.52g，2.2mmol)、四唑(0.12g，1.7mmol)和N-甲基咪唑(45μL，0.56mmol)的DMF(11mL)溶液。室
温搅拌8小时后，将反应物倒入EtOAc，依次以90％盐水、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以2.5％的MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供白色固体亚磷酰胺67(1.65g，
31
84％)。 P NMR(CDCl3)δ：148.70，145.81。

[0296] 实施例8

[0297] (1S，3R，4R，6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-异丁酰鸟嘌呤-9-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(74)

[0298]

[0299] 示意图8(a)2-氨基-6-氯嘌呤，BSA，TMSOTf，DCE，回流，2小时；(b)3-羟基丙腈，NaH，THF，4小时；(c)异丁酸酐，DMAP，DMF，60C，24小时；(d)DDQ，CH2Cl2，H2O，室温，16小时；(e)Et3N.3HF，Et3N，THF，室温，16小时；(f)DMTCl，嘧啶，室温，16小时；(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI，DMF。

[0300] 亚磷酰胺74可通过与所示的由二乙酸32得到亚磷酰胺67的相同方法由二乙酸53进行制备。

[0301] 实施例9

[0302] (1S，3R，4R，6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(83)

[0303]

[0304] 示意图9(a)草酰氯，DMSO，Et3N，CH2Cl2，-78℃；(b)MeOCH2Br，Mg，HgCl2，THF，-20℃，由26为＞95％；(c)MsCl，Et3N，DMAP，CH2Cl2，85％；(d)Ac2O，AcOH，H2SO4，室温，3小时，84％；(e)尿嘧啶，BSA，TMSOTf，MeCN，回流，2小时；(f)K2CO3，MeOH，来自77a-b的产率为89％；
(g)DDQ，CH2Cl2，H2O，8小时，室温，80a和80b的联合产率为98％；(h)Et3N.3HF，Et3N，THF，室温，16小时；(i)DMTCl，嘧啶，16小时，室温，90％；(J)CN(CH2)2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI，DMF，
96％。

[0305] A)醇(75a-b)

[0306] 在-78℃下向草酰氯(2.2mL，25.0mmol)的二氯甲烷(130mL)溶液添加二甲亚砜(3.5mL，50.0mmol)。搅拌30分钟后，在10分钟向反应中添加醇26(10.0g，16.7mmol)的二
氯甲烷(30mL)溶液。继续搅拌45分钟后，向反应中缓慢添加三乙胺(10.5mL，75.0mmol)。
添加完成后，去除冰浴并将反应逐渐升温至0℃(约1小时)并转移至分液漏斗。先后以
5％HCl、饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤有机层，然后干燥(Na2SO4)并浓缩以提供醛27，其在高度真空下干燥(18小时)并可在不作纯化下使用。

[0307] 以干THF(5mL)覆盖镁带(2.5g，102.8mmol)和氯化汞(II)(93mg，0.34mmol)的混合物，并将反应物冷却至-20℃。滴入数滴纯甲氧基甲基溴以起始反应。等待数分钟后，经大约3小时向反应加入甲氧基甲基溴(9.33mL，102.8mmol)的THF(12mL)溶液(1mL/10分
钟，通过注射器)。在添加过程中外部浴的温度小心维持在-20和-25℃之间。间歇(在3
小时内)加入少量的干THF(5mL)以促进搅拌。添加溴化物完毕后，在-25℃下搅拌反应物
100分钟，然后添加粗品醛(27)的THF(30mL)溶液。在-20℃下搅拌45分钟后，通过TLC
未检测到起始材料醛27。以饱和氯化铵溶液小心淬灭反应并用乙酸乙酯稀释。以5％HCl、
饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤有机层，然后干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以25％至
30％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供混合物醇75a-b(定量)(约1∶1的异构体)。

[0308] B)甲磺酸(76a-b)

[0309] 向溶于三乙胺(5.3mL，37.9mmol)的醇75a-b(13.38g，20.8mmol)和DMAP(0.36g，2.9mmol)的二氯甲烷(42mL)冷溶液(0℃)添加甲烷磺酰氯(2.3mL，29.2mmol)。搅拌2小
时后另外加入甲烷磺酰氯(0.5mL)。继续搅拌1小时，以氯仿稀释反应物。先后以5％HCl、
饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤有机层，然后干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以20％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供粘性油状的甲磺酸76a-b(12.8g，85％)。

[0310] C)二乙酸(77a-b)

[0311] 将浓硫酸(6滴)加入甲磺酸76a-b(12.8g，17.8mmol)的醋酸(50mL)和乙酸酐(10mL)溶液。室温下搅拌3小时后以LCMS对反应物进行完全鉴定，并在高度真空下挥发掉
大部分溶剂。用乙酸乙酯稀释浓缩的混合物，以水、饱和碳酸氢钠溶液(直至pH＞10)和
盐水洗涤有机相，然后干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以20％的EtOAc/己烷洗脱)纯
化提供粘性油状的二乙酸77a-b的异头体混合物(11.44g，84％)。

[0312] D)核苷(79a-b)

[0313] 向二乙酸77a-b(11.44g，15.0mmol)和尿嘧啶(3.35g，29.9mmol)的CH3CN(75mL)悬浮液添加N，O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(14.76mL，59.9mmol)。40℃加热15分钟得到澄
清溶液后，在冰浴中冷却反应物并添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐(4.06mL，22.5mmol)。
回流2小时后，将反应冷却至室温并倒入EtOAc。以半饱和碳酸氢钠和盐水洗涤有机层，干
燥(Na2SO4)并真空浓缩以提供粗品核苷78a-b，其可在不作纯化下使用。

[0314] 向核苷78a-b(由前面获得)的甲醇(130mL)溶液添加碳酸钾(5.30g，38.4mmol)。室温搅拌16小时后将反应物真空浓缩。将残留物溶剂于乙酸乙酯，用水和盐水萃取，然后
干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以5至7.5％的丙酮/氯仿洗脱)纯化提供白色
固体的核苷79a-b(9.0g，来自77a-b的产率为89％)。

[0315] E)核苷(80a和80b)

[0316] 向核苷79a-b(9.0g，13.3mmol)的二氯甲烷(130mL)和水(6.5mL)溶液添加DDQ(20.0mmol，4.5g)。将两相反应物在室温下搅拌2小时，然后再次添加DDQ(向反应添加
2.75g)。另外2小时后再次向反应添加DDQ(1.1g)，继续搅拌4小时，然后将反应物在冰箱中贮存16小时。第二日早，LCMS显示了痕量的核苷79a-b，因此再次向反应中加入DDQ(0.9g)，继续搅拌2小时，此时通过TLC和LCMS再未检测到核苷79a-b。真空挥发溶剂，并在乙酸乙
酯和水之间分配残留物。以亚硫酸氢钠溶液(2×)、饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤有机层，
然后干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以10至20％的丙酮/氯仿洗脱)纯化分别提供
核苷80a(洗脱较慢的点)和80b(洗脱较快的点)(7.0g，联合产率为98％)。

[0317] F)核苷(81)

[0318] 向核苷80a(6.7g，12.5mmol)和三乙胺(5.2mL，37.4mmol)的THF(120mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(12.2mL，74.8mmol)。室温搅拌16小时后将反应物真空浓缩至干燥。
柱层析(SiO2，以7.5至12.5％的MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供核苷81(混有三乙胺.氢氟
酸盐，产率＞100％)，其可在不作进一步纯化下使用。

[0319] G)核苷(82)

[0320] 向核苷81(约12.5mmol)的嘧啶(75mL)溶液添加4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(DMTCl，4.8g，14.3mmol)。在室温下搅拌16小时后再次向反应添加DMTCl(2.4g)。继续搅
拌4小时后添加MeOH(10mL)。搅拌30分钟后，以乙酸乙酯稀释反应物，并以水和盐水洗涤
有机相，然后干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，60至75％的EtOAc/己烷)纯化提供白
色泡沫状的核苷82(6.73g，90％)。

[0321] H)(1S，3R，4R，6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(83)

[0322] 将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(1.58mL，5.0mmol)加入核苷82(2.0g，3.3mmol)、四唑(0.19g，2.6mmol)和N-甲基咪唑(68μL，0.83mmol)的DMF(16mL)溶液。
室温搅拌8小时后将反应物倒入EtOAc。依次以90％盐水和盐水洗涤有机层，然后干燥
(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以66％至75％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体亚
31
磷酰胺83(2.54g，96％)。 P NMR(CDCl3)δ：149.78，149.44。

[0323] 实施例10

[0324] (1S，3R，4R，6S，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(86)

[0325]

[0326] 示意图10(a)Et3N.3HF，Et3N，THF，室温，16小时；(i)DMTCl，嘧啶，16小时，室温，91％；(j)CN(CH2)2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI，DMF，96％。

[0327] A)核苷(84)

[0328] 向核苷80b(6.43g，12.0mmol)和三乙胺(5.0mL，35.7mmol)的THF(125mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(11.6mL，71.5mmol)。室温搅拌16小时后将反应物真空浓缩至干
燥。柱层析(SiO2，以7.5至12.5％的MeOH/CHCl3洗脱)纯化残留物提供核苷84(混有三
乙胺.氢氟酸盐，产率＞100％)，其可在不作进一步纯化下使用。

[0329] B)核苷(85)

[0330] 向核苷84(约12.0mmol)的嘧啶(72mL)溶液添加4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(DMTCl，4.6g，13.8mmol)。在室温下搅拌16小时后再次向反应添加DMTCl(2.3g)。继续搅
拌4小时后添加MeOH(10mL)。搅拌30分钟后，以乙酸乙酯稀释反应物，并以水和盐水洗涤
有机相，然后干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，60至75％的EtOAc/己烷)纯化提供白
色泡沫状的核苷85(6.52g，91％)。

[0331] C)(1S，3R，4R，6S，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧杂-双
环[2.2.1]庚烷(86)

[0332] 将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(1.58mL，5.0mmol)加入核苷85(2.0g，3.3mmol)、四唑(0.19g，2.7mmol)和N-甲基咪唑(68μL，0.83mmol)的DMF(17mL)溶液。
室温搅拌8小时后将反应物倒入EtOAc。依次以90％盐水和盐水洗涤有机层，然后干燥
(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以66％至75％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体亚
31
磷酰胺86(2.55g，96％)。 P NMR(CDCl3)δ：149.97，149.78。

[0333] 实施例11

[0334] (1S，3R，4R，6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(92)

[0335]

[0336] 示意图11(a)TBSCl，Et3N，DMAP，CH2Cl2，室温，16小时98％；(b)POCl3，1，2，4-三唑，Et3N，CH3CN，室温，4小时；(c)NH3水溶液，1，4-二恶烷，室温，16小时；(d)Bz2O，DMF，室温，16小时，来自82的产率为91％；(e)Et3N.3HF，Et3N，THF，室温，16小时，94％；(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI，DMF，84％。

[0337] A)核苷(87)

[0338] 将叔丁基二甲基硅烷基氯(2.40g，15.9mmol)添加至核苷82(3.20g，5.3mmol)和咪唑(2.16g，31.8mmol)的DMF(10.6mL)溶液。室温搅拌16小时后将反应物倒入EtOAc。
以盐水萃取有机相，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以50％的EtOAc/己烷洗脱)
纯化提供白色固体核苷87(3.70g，98％)。

[0339] B)核苷(90)

[0340] 将三氯氧磷(3.86mL，41.4mmol)添加至1，2，4-三唑(12.15g，176.1mmol)的CH3CN(80mL)冷悬浮液(0℃)。搅拌15分钟后加入三乙胺(29.0mL，207.2mmol)，继续搅拌
30分钟。在0℃下向反应混合物添加核苷87(3.70g，5.2mmol)的CH3CN(20mL)溶液。搅拌
10分钟后，去除冰浴并在室温下搅拌反应物4小时。然后真空去除溶剂，在EtOAc和之间分
配残留物。然后以饱和NaHCO3和盐水洗涤有机相，然后干燥(Na2SO4)并真空浓缩以提供粗
产物88，其可在不作任何纯化下使用。

[0341] 将氨水(10mL)添加至核苷88(由前面获得)的二恶烷(50mL)溶液。在室温下搅拌16小时后，真空浓缩反应物并在高度真空下干燥8小时以提供核苷89，其可在不作纯化
下使用。

[0342] 向核苷89(由前面获得)的DMF(10mL)溶液添加苯甲酸酐(1.99g，8.8mmol)。室温搅拌16小时后将反应物倒入EtOAc。依次以饱和NaHCO3和盐水萃取有机层，然后干燥
(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以50％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体的核
苷90(3.86g，来自87的产率为91％)。

[0343] C)核苷(91)

[0344] 在聚丙烯管中向核苷90(3.81g，4.7mmol)和三乙胺(1.56mL，11.2mmol)的THF(46mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(4.54mL，27.9mmol)。室温搅拌16小时后，真空
干燥反应物并将残留物溶解于EtOAc。依次以水、饱和NaHCO3和盐水洗涤有机层，然后干
燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以5％MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供白色固体核苷
91(3.07g，94％)。

[0345] D)(1S，3R，4R，6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(92)

[0346] 将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(0.90mL，4.3mmol)加入核苷91(2.0g，2.8mmol)、四唑(0.16g，2.3mmol)和N-甲基咪唑(58μL，0.71mmol)的DMF(14mL)溶液。
室温搅拌8小时后将反应物倒入EtOAc。依次以90％盐水和盐水洗涤有机层，然后干燥
(Na2SO4)并浓缩。将残留物溶解于最小量的EtOAc，将该溶液添加至己烷。收集所得的沉淀物，进一步通过柱层析(SiO2，以75％至90％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体亚磷
31
酰胺92(2.14g，84％)。 P NMR(CDCl3)δ：149.82。

[0347] 实施例12

[0348] (1S，3R，4R，6S，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(98)

[0349]

[0350] 示意图12(a)TBSCl，Et3N，DMAP，CH2Cl2，室温，16小时，97％；(b)POCl3，1，2，4-三唑，Et3N，CH3CN，室温，4小时；(c)NH3水溶液，1，4-二恶烷，室温，16小时；(d)Bz2O，DMF，室温，16小时，来自93的产率为89％；(e)Et3N.3HF，Et3N，THF，室温，16小时，89％；(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI，DMF，84％。

[0351] A)核苷(93)

[0352] 将叔丁基二甲基硅烷基氯(2.25g，15.0mmol)添加至核苷85(3.0g，5.0mmol)和咪唑(2.03g，29.9mmol)的DMF(10mL)溶液。室温搅拌16小时后将反应物倒入EtOAc。以盐
水萃取有机相，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以50％的EtOAc/己烷洗脱)纯
化提供白色固体核苷93(3.45g，97％)。

[0353] B)核苷(96)

[0354] 将三氯氧磷(3.59mL，38.5mmol)添加至1，2，4-三唑(11.3g，163.9mmol)的CH3CN(80mL)冷悬浮液(0℃)。搅拌15分钟后向反应中加入三乙胺(27.0mL，192.8mmol)，
继续搅拌30分钟。在0℃下向反应中添加核苷93(3.45g，4.82mmol)的CH3CN(20mL)溶液。
搅拌10分钟后，去除冰浴并在室温下搅拌反应物4小时。真空去除溶剂，在EtOAc和之间
分配残留物。然后以NaHCO3饱和溶液和盐水洗涤有机相，然后干燥(Na2SO4)并真空浓缩以
提供粗产物94，其在不作任何纯化下使用。

[0355] 将氨水(10mL)添加至核苷94(由前面获得)的二恶烷(50mL)溶液。在室温下搅拌16小时，真空浓缩反应物并在高度真空下干燥8小时以提供核苷95，其在不作纯化下使
用。

[0356] 向核苷95(由前面获得)的DMF(9mL)溶液添加苯甲酸酐(1.63g，7.2mmol)。室温搅拌16小时后将反应物倒入EtOAc。依次以饱和NaHCO3和盐水萃取有机层，然后干燥
(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以50％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体核苷
96(3.53g，来自93的产率为89％)。

[0357] C)核苷(97)

[0358] 在聚丙烯管中向核苷96(3.53g，4.3mmol)和三乙胺(1.43mL，10.3mmol)的THF(43mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(4.20mL，25.8mmol)。室温搅拌16小时后，真空
干燥反应物并将残留物溶解于EtOAc。依次以水、饱和NaHCO3、盐水洗涤有机相，然后干燥(Na2SO4)并真空浓缩。柱层析(SiO2，以25％至40％的丙酮/CHCl3洗脱)纯化提供白色固
体的核苷97(2.87g，95％)。

[0359] D)(1S，3R，4R，6S，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(98)

[0360] 将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(1.35mL，4.3mmol)加入核苷97(2.0g，2.8mmol)、四唑(0.16mg，2.3mmol)和N-甲基咪唑(58μL，0.71mmol)的DMF(14mL)溶
液。室温搅拌8小时后，将反应物倒入EtOAc，依次以90％盐水和盐水洗涤有机相，干燥
(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以75％至90％的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体核
31
苷98(2.15g，84％)。 P NMR(CDCl3)δ：150.33。

[0361] 实施例13

[0362] (1S，3R，4R，6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(105)

[0363]

[0364] 示意图13(a)6-N-苯甲酰腺嘌呤，BSA，TMSOTf，CH3CN，回流，8小时；(b)K2CO3，MeOH，室温，16小时；(c)Bz2O，DMF，室温；(d)DDQ，CH2Cl2，H2O，室温；(e)Et3N.3HF，Et3N，THF，室温，16小时；(f)DMTCl，嘧啶，室温，16小时二(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI，DMF。

[0365] 亚磷酰胺105通过所示的由二乙酸混合物77a-b合成亚磷酰胺83的方法由二乙酸77a-b制备。

[0366] 实施例14

[0367] (1S，3R，4R，6S，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环
[2.2.1]庚烷(108)

[0368]

[0369] 示意图14(a)Et3N.3HF，Et3N，THF，室温，16小时；(b)DMTCl，嘧啶，室温，16小时；(c)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI，DMF。

[0370] 亚磷酰胺108通过所示的由80b合成亚磷酰胺86的方法由核苷102b制备。

[0371] 实施例15

[0372] (1S，3R，4R，6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-异丁酰鸟嘌呤-9-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(114)

[0373]

[0374] 示意图15(a)2-氨基-6-氯嘌呤，BSA，TMSOTf，CH3CN，回流，2小时；(b)3-羟基丙腈，NaH，THF，4小时；(c)异丁酸酐，DMAP，DMF，60℃，24小时；(d)DDQ，CH2Cl2，H2O，室温，16小时；(e)Et3N.3HF，Et3N，THF，室温；(f)DMTCl，嘧啶，室温；(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI，DMF。

[0375] 亚磷酰胺114通过所示的由二乙酸混合物77a-b合成亚磷酰胺83的方法由二乙酸77a-b制备。

[0376] 实施例16

[0377] (1S，3R，4R，6S，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-异丁酰鸟嘌呤-9-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(117)

[0378]

[0379] 示意图16(a)Et3N.3HF，Et3N，THF，室温，16小时；(b)DMTCl，嘧啶，室温，16小时；(c)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI，DMF。

[0380] 亚磷酰胺117通过所示的由80b合成亚磷酰胺86的方法由核苷111b制备。

[0381] 实施例17

[0382] 6-CH2OH BNA合成

[0383]

[0384] 示意图17(a)草酰氯，DMSO，Et3N，CH2Cl2，-78至0℃；(b)Ph3PCH2Br，nBuLi，THF，-78℃至室温，来自26的产率为97％；(c)TBAF，THF，室温，16小时，97％；(d)NaH，BnBr，DMF，室温，1小时，定量；(e)OsO4，NMO，95％丙酮水溶液，室温，48小时，87％；(f)TBSCl，嘧啶，0℃，4小时，定量；(g)MsCl，Et3N，DMAP，CH2Cl2，室温，16小时，分别为44％和40％收率；
(h)Et3N.3HF，Et3N，THF，定量；(i)PivCl，DIPEA，DMAP，CH2Cl2，室温，16小时；(j)AcOH，Ac2O，催化量H2SO4，来自125的产率为92％；(k)BSA，尿嘧啶，TMSOTf，CH3CN，回流2小时；(I)K2CO3，MeOH，来自127的产率为74％。

[0385] A)核苷118

[0386] 将二甲基亚砜(1.77mL，25.0mmol)逐滴加入草酰氯(1.10mL，12.5mmol)的二氯甲烷(60mL)冷溶液(-78℃)。搅拌30分钟后，向反应中添加醇26(5.0g，8.4mmol)的二氯
甲烷(20mL)溶液。在78℃下继续搅拌45分钟，然后逐滴向反应中添加三乙胺(5.05mL，
37.5mmol)。搅拌10分钟后，去除冰浴并将反应逐渐升温至约0℃，此时TLC显示没有起
始醇。以二氯甲烷稀释反应物，并先后以10％HCl、饱和NaHCO3、盐水洗涤有机相，干燥
(Na2SO4)并浓缩以提供醛27，其不经纯化用于下一步骤。

[0387] B)核苷118

[0388] 向三苯基溴化磷(3.88g，10.9mmol)的干THF(60mL)冷搅拌溶液(0℃)逐滴添加nBuLi(2.5M，4.34mL，10.9mmol)。搅拌1小时后，将红色溶液冷却至-78℃，并逐滴向反应中添加由前面获得的醛27(8.4mmol)的干THF(15mL)溶液。将反应物逐渐加热至室温，继续
搅拌16小时。使用饱和NH4Cl小心淬灭反应，且反应物在EtOAc和水之间分配。然后以盐
水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以10％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化
提供无色油状的烯烃118(4.84g，由26为97％)。

[0389] C)核苷119

[0390] 将氟化四丁基铵(1M存在于THF中，10.00mL，10.0mmol)添加至烯烃118(4.83g，8.1mmol)的THF(35mL)溶液。室温搅拌反应物16小时后，真空去除溶剂并将残留物溶解于
EtOAc。然后以水、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以40％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供无色油状的醇119(2.79g，97％)。

[0391] D)核苷120

[0392] 将氢化钠(60％w/w存在于矿物油中，0.4g，10mmol)添加入醇119(1.44g，4.1mmol)和苯甲基溴(0.71mL，6.0mmol)的DMF(16mL)冷溶液(0℃)。在0℃下搅拌1小时
后，用水小心淬灭反应并在EtOAc和水之间分配。以盐水分离并洗涤有机相，干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以10至25％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供无色油状的烯烃
120(1.84g，定量)。

[0393] E)核苷121

[0394] 将四氧化锇(25％OsO4的iPrOH溶液，1mL)添加至烯烃120(1.80g，4.0mmol)和N-甲基吗啉-N-氧化物(NMO，0.94g，8.0mmol)的95％丙酮/水(25mL)溶液。在室温下搅
拌16小时后，向反应中再度添加OsO4溶液(0.5mL)和NMO(0.40g)。搅拌总计48小时后，
以EtOAc稀释反应物并以10％NaHSO3、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以
40％至50％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供无色油状的二醇121(1.68g，87％，约1∶1
的异构体混合物)。

[0395] F)核苷122和123

[0396] 将TBSCl(0.66g，4.4mmol)添加至二醇121(1.63g，3.4mmol)的嘧啶(17mL)冷溶液(0℃)。在0℃下搅拌4小时后，以EtOAc稀释反应物，以水、盐水洗涤有机层，干燥并浓
缩。柱层析(SiO2，以10至20％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供无色油状的醇122和
123(0.90g和1.117g，未指定绝对立体化学)。

[0397] G)核苷124

[0398] 向醇123(未指定绝对立体化学，0.9g，1.5mmol)、三乙胺(0.46mL，3.3mmol)和二甲基氨基嘧啶(37mg，0.3mmol)的二氯甲烷(5mL)冷溶液(0℃)添加甲烷磺酰氯(0.24mL，3.0mmol)。在室温下7小时后，再向反应中添加甲基磺酰氯(0.12mL)和三乙胺(0.23mL)。
室温下搅拌9小时后，将反应物倒入EtOAc，以10％HCl、饱和NaHCO3、盐水洗涤有机相，干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以10％至15％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供甲磺
酸124(0.44g，44％)和起始的二醇123(0.32g，40％)。

[0399] H)核苷125

[0400] 向甲磺酸124(0.44g，0.6mmol)和三乙胺(0.23mL，1.7mmol)的THF(7mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(0.64mL，4.0mmol)。室温下搅拌16小时后，以EtOAc稀释反应物，并
以饱和NaHCO3、盐水洗涤有机相，干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以50％EtOAc的己
烷溶液洗脱)纯化提供醇125(0.40g，定量)。

[0401] I)核苷127

[0402] 向醇125(0.72mmol，0.4g)、二异丙基乙基胺(DIPEA，0.17mL，1.0mmol)和二甲基氨基嘧啶(12mg，0.1mmol)的二氯甲烷(2mL)的冷溶液(0℃)逐滴添加特戊酰氯(0.12mL，1.0mmol)。去除冰浴，在室温下搅拌反应物2小时，然后再向反应中添加DIPEA(0.17mL)和
新戊酰氯(0.12mL)，并在室温下搅拌16小时。然后以EtOAc稀释反应物，以10％HCl、饱
和NaHCO3、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩得到粗品pivaloate 126，其在不作进一步纯化下使用。

[0403] 将浓硫酸(2滴)加入粗品pivaloate 126(由前面获得)的冰醋酸(2.5mL)和乙酸酐(0.5mL)溶液。在室温下搅拌2小时后在高度真空下去除溶剂并将残留物溶解于
EtOAc，以饱和NaHCO3、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，以10至15％EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供无色油状的二乙酸127(0.45g，来自125的产率为92％)
(异构体混合物)。

[0404] J)核苷129a

[0405] 向二乙酸127(0.45g，0.65mmol)和尿嘧啶(0.15g，1.3mmol)的CH3CN(3.5mL)悬浮液添加N，O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(0.8mL，3.3mmol)。在40℃下加热15分钟以获
得澄清溶液后，向反应中添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐(0.24mL，1.3mmol)。回流2小
时后，将反应冷却至室温并倒入EtOAc。以饱和NaHCO3、盐水洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空浓缩以提供粗制核苷128a，其在不作任何纯化下使用。

[0406] 向核苷128a(0.11g，0.15mmol)的MeOH(1.5mL)溶液添加K2CO3(40mg，0.3mmol)。在室温下搅拌16小时后，真空去除溶剂并在EtOAc和盐水之间分配残留物。收集有机相，
干燥(Na2SO4)并真空浓缩，提供129a(未确定绝对立体化学)。柱层析(SiO2，以35％丙酮
1
的CHCl3溶液洗脱)纯化提供核苷129a(57mg，由127为74％)。H NMR(CDCl3)：δ9.37(s，
1H)，7.92-7.61(m，5H)，7.55-7.23(m，9H)，5.58(s，1H)，5.43(d，1H，J ＝ 8.1)，4.79(d，
1H，J-11.7)，4.66(d，1H，J ＝ 11.7)，4.58(m，2H)，4.51(s，1H)，4.44(m，1H)，4.05(s，1H)，
3.95-3.72(m，4H)。LCMS：保留时间3.34min；M+H计算值517.19，实测值517.1。

[0407] 实施例18

[0408]

[0409] 示意图18(a)N-Bz-胞嘧啶或6-N-Bz-腺嘌呤或2-氨基-6-氯嘌呤，BSA，TMSOTf，MeCH，回流；(b)K2CO3，MeOH，室温，16小时(对于129b-c)；(c)NaH，3-羟基丙腈，室温(对于
129d)；(d)TMSCl，嘧啶，BzCl或Bz2O，DMF(对于130b-c)；(e)TMSCl，嘧啶，异丁酰氯(对于
130d)

[0410] 核苷128b、128c和128d可分别采用N-Bz-胞嘧啶，6-N-Bz-腺嘌呤和2-氨基-6-氯嘌呤通过Vorbrugen反应由糖前体127制备得到(示意图18)。以K2CO3和MeOH
处理128b和128c可分别提供核苷129b和129c。以氢化钠和3-羟基丙腈处理128d可提
供核苷129d。以TMSCl瞬时保护羟基基团然后与苯甲酰氯反应可分别提供核苷130b和
130c。可选择地，上述转化也可通过以DMF为溶剂，将核苷129b和129c与苯甲酸酐反应来
实现。核苷130d可通过以存在于嘧啶中的过量TMSCl瞬时保护，再与异丁酰氯反应制备得
到。

[0411] 实施例19

[0412] 6’-取代类似物的制备

[0413] 示意图19

[0414]

[0415] R、R1和R2分别独立为H、烷基、烯基、炔基、取代的烷基、取代的烯基、取代的炔基或保护性基团

[0416] 可以使用二氯甲烷为溶剂，通过如DAST等氟化剂处理核苷130制备得到核苷131。核苷132可通过首先以Dess-Martin高价碘或在Swern条件下氧化130的伯羟基，然后以
DAST处理所得的醛制备得到。核苷133可通过首先以Dess-Martin高价碘或在Swern条件
下氧化130的伯羟基，然后在冰醋酸和还原剂(例如，硼氢化氰钠)存在下以伯胺或仲胺将
所得的醛还原胺化制备得到。核苷134可通过先将130的羟基基团转化为离去基团(甲磺
酸、甲苯磺酸、卤化物)，然后与过量的叠氮化钠加热制备得到。核苷135可通过先将130的伯醇氧化为羧酸，然后在HATU或任意其它肽偶合剂的存在下与胺反应制备得到。核苷136
可通过先以羰基二咪唑活化130的羟基基团，然后与胺反应制备得到。核苷137可通过先
以适当的碱将130的羟基基团去质子化，然后以烷基化试剂淬灭阴离子制备得到。核苷138
可通过先将130的羟基基团转化为离去基团，然后以硫醇亲核试剂取代制备得到。核苷139
可通过还原134的叠氮基团，然后与异氰酸酯或异硫氰酸酯反应制备得到。核苷140可通
过还原134的叠氮基团并与FmocNCS反应提供活化的硫脲进行制备。fmoc活化的硫醇在
EDC存在下进一步与胺反应可提供取代胍。去除fmoc保护性基团释放核苷140。

[0417] 实施例20

[0418] 6-取代的BNA亚磷酰胺核苷的制备

[0419] 示意图20

[0420]

[0421] 可通过催化氢化去除核苷130-140的3’-和5’-O保护基团制备得到核苷142。或者，可通过首先以DDQ去除130-140的3’O-Nap基团，然后催化氢化去除5’O-苯甲基基
团制备得到142。将5’羟基基团后续保护为二甲氧基三甲苯基醚，然后通过亚磷酰化反应
可提供亚磷酰胺143。

[0422] 实施例21

[0423] 6-CH2F核苷的制备

[0424]

[0425] 示意图23(a)DAST，CH2Cl2，-78℃至室温，16小时，52％(b)DDQ，CH2Cl2，H2O，室温，8小时，定量，(e)10％Pd/C，H2气球，50％(d)DMTCl，嘧啶，55％(e)(iPr2)2NPOCH2CH2CN，四唑，NMI，DMF

[0426] A)核苷(131a)

[0427] 将二乙基氨基三氟化硫(DAST，0.16mL，1.4mmol)加入核苷129a(0.1g，0.2mmol)的二氯甲烷(2mL)的冷溶液(-50℃)。将反应逐渐加热至室温并搅拌16小时，然后以饱和
NaHCO3溶液小心淬灭反应。在EtOAc和盐水之间分配反应物，干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层
析(SiO2，33％EtOAc的己烷溶液)纯化提供核苷131a(51mg，52％，混有15-20％的开环杂
19
质)的异构体混合物。F NMR(CDCl3)：δ-227.98(m)和-231.07(m)。LCMS：保留时间3.84
分钟；M+H计算值519.19，实测值519.1，以及3.89min；M+H计算值519.19，实测值519.1。

[0428] B)核苷(141a)

[0429] 向核苷131a(51mg，0.1mmol)的二氯甲烷(1mL)和水(2滴)溶液添加DDQ(44mg，0.2mmol)。室温下搅拌8小时后，以EtOAc稀释反应物，并以10％NaHSO3溶液、饱和NaHCO3
溶液、盐水洗涤有机相，干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析(SiO2，30％丙酮的氯仿溶液)纯化提
19
供核苷141a(41mg，作为异构体混合物定量)。F NMR(CDCl3)：δ-229.3(m)和-230.97(m)。
LCMS：保留时间2.66分钟；M+H计算值379.12，实测值379.0。

[0430] C)核苷(142a)

[0431] 使用氢气球氢化核苷141a(41mg，由前面获得)和10％钯炭(10mg)在甲醇(2mL)中的混合物。3小时后，所有的起始核苷141a被耗尽(通过对反应混合物的LCMS分析显
示)。以硅藻土过滤反应物并减压浓缩滤除液。柱层析(SiO2，10至20％甲醇的氯仿溶
19
液)纯化提供作为异构体混合物的核苷142a(14mg，50％)。 F NMR(CDCl3)：δ-231.45(t)
和-232.88(dt)。LCMS：保留时间1.72分钟；M+Na计算值311.08，实测值311.0。

[0432] D)核苷(142aa)

[0433] 向 核 苷 142a(14mg，0.049mmol)的 嘧 啶(0.25mL) 溶 液 添 加 DMTCl(24mg，0.07mmol)。室温搅拌3小时后将反应物减压浓缩。柱层析(SiO2，20至30％丙酮的氯仿溶
19
液)纯化提供作为异构体混合物的核苷142aa(16mg，55％)。 FNMR(CDCl3)：δ-228.6(t)
和-230.91(dt)。LCMS：保留时间3.56分钟；M+Na计算值613.21，实测值613.1。

[0434] E)亚磷酰胺(143a)

[0435] 亚磷酰胺143a可参照实施例1的描述通过亚磷酰化(phosphitilation)反应由核苷142aa制备得到。

[0436] 实施例22

[0437] 核苷亚磷酰胺的合成

[0438] 核苷亚磷酰胺可参照此处和本领域(例如但不限于美国专利6,426,220和公开的PCT申请WO 02/36743)所述的方法进行制备。

[0439] 实施例23

[0440] 寡核苷酸和寡核苷的合成

[0441] 如本发明所述的寡聚化合物可通过公知的固相合成技术进行常规制备。进行该种合成的设备已由多家销售商出售，例如，Applied Biosystems(Foster City，CA)。本领域已知的任何其它该类合成方法均可额外或替代性采用。使用类似技术制备寡核苷酸如硫代磷
酸酯和烷基化衍生物已众所周知。

[0442] 寡核苷酸：未取代和取代的磷酸二酯(P＝O)寡核苷酸可在自动化DNA合成仪(Applied Biosystems 394型)上采用被碘氧化的标准亚磷酰胺化学法合成得到。

[0443] 除以下区别外，硫代磷酸酯(P＝S)的合成类似于磷酸二酯寡核苷酸：采用10％w/v的3，H-1，2-苯并二硫醇-3-酮1，1-二氧化物的乙腈溶液氧化亚磷酸联接以产生硫杂
化。该硫杂化反应步骤的时间提高至180秒且在此之前进行常规的带帽步骤。从CPG柱裂
解并在55℃下于浓氨水中去封闭(12-16小时)后，以大于3倍体积的乙醇从1M NH4OAc溶
液中沉淀回收寡核苷酸。亚磷酸酯寡核苷酸可参照美国专利5,508,270的描述进行制备。

[0444] 烷基磷酸酯寡核苷酸可参照美国专利4,469,863的描述进行制备。

[0445] 3’-脱氧-3’-亚甲基磷酸酯寡聚核苷酸可参照美国专利5,610,289或5,625,050的描述进行制备。

[0446] 亚磷酰胺寡核苷酸可参照美国专利5,256,775或5,366,878的描述进行制备。

[0447] 烷基硫代磷酸酯寡核苷酸可参照公布的PCT申请PCT/US94/00902和PCT/US93/06976(分别公布为WO 94/17093和WO 94/02499)的描述进行制备。

[0448] 3’-脱氧-3’-氨基磷酰胺酯寡核苷酸可参照美国专利5,476,925的描述进行制备。

[0449] 磷酸三酯寡核苷酸可参照美国专利5,023,243的描述进行制备。

[0450] 硼烷磷酸酯寡核苷酸可参照美国专利5,130,302和5,177,198的描述进行制备。

[0451] 寡核苷酸：亚甲基甲亚胺基连接的寡核苷(也被称为MMI连接的寡核苷)、亚甲基二甲基肼连接的寡核苷(也被称为MDH连接的寡核苷)、和亚甲基羰基氨基连接的寡核苷
(也被称为酰胺-3连接的寡核苷)、和亚甲基氨基羰基连接的寡核苷(也被称为酰胺-4连
接的寡核苷)，以及具有例如交替的MMI和P＝O或P＝S联接的混合骨架寡聚化合物可参
照美国专利5,378,825；5,386,023；5,489,677；5,602,240和5,610,289的描述进行制备。

[0452] 甲缩醛和硫甲缩醛连接的寡核苷可参照美国专利5,264,562和5,264,564的描述进行制备。

[0453] 环氧乙烷连接的寡核苷可参照美国专利5,223,618的描述进行制备。

[0454] 实施例24

[0455] 寡核苷酸分离

[0456] 从可控孔玻璃固相载体上裂解并在55℃的浓氨水中去封闭12-16小时后，以大于3倍体积的乙醇从1M NH4OAc溶液中沉淀回收寡核苷酸或寡核苷。合成的寡核苷酸可通过电
喷雾质谱(分子量测定)和毛细管凝胶电泳进行分析。在合成中获得的硫代磷酸酯和磷酸
二酯联接的相对数量可通过正确分子量相对-16amu产品(+/-32+/-48)的比例进行确定。
在某些研究中寡核苷酸通过HPLC进行纯化，例如描述于Chiang等人，J.Biol.Chem.1991，
266，18162-18171。HPLC-纯化材料所得的结果通常类似于从非-HPLC纯化材料获得的结
果。

[0457] 实施例25

[0458] 寡核苷酸合成-96孔板形式

[0459] 寡核苷酸可在能够以96-孔形式同时装配96个序列的自动化合成器中通过固相P(III)亚磷酰胺化学法合成得到。磷酸二酯核苷酸间联接可通过碘水溶液氧化得到。硫代
磷酸酯核苷酸间联接可通过使用无水乙腈中的3，H-1，2苯并二硫醇-3-酮1，1-二氧化物
(Beaucage试剂)硫化得到。标准的碱基被保护的β-氰乙基-二异丙基亚磷酰胺可从销
售商(例如PE-Applied Biosystems，Foster City，CA或Pharmacia，Piscataway，NJ)处购得。非标准核苷可参照标准和专利方法进行合成。它们可作为碱基保护的β-氰乙基-二
异丙基亚磷酰胺。

[0460] 寡核苷酸从载体上裂解并在升高的温度(55-60℃)下在浓NH4OH中去保护12-16小时，在真空下干燥所释放的产品。将干燥的产品重悬于无菌水中以提供主平板，从该平板上使用机械移液管稀释得到所有的分析和测试平板样本。

[0461] 实施例26

[0462] 采用96-孔板形式进行寡核苷酸分析

[0463] 各微孔中的寡核苷酸浓度可通过稀释样本和UV吸收广谱测定。单个产品的全长TM
完整性可以96-孔形式(Beckman P/ACE MDQ)或针对单独制备的样本在商用毛细管电泳
TM
设备(例如，Beckman P/ACE 5000，ABI 270)上通过毛细管电泳(CE)进行评估。碱基和
骨架组成可采用电喷雾质谱对寡聚化合物进行质谱分析确定。所有的测试平板均从主平板
采用单和多道机械移液器稀释得到。如果平板上至少85％的寡聚化合物具有至少85％全
长，则可认为该平板可接受。

[0464] 实施例27

[0465] 细胞培养和寡核苷酸处理

[0466] 寡聚化合物对靶标核酸表达的作用可在各种细胞类型中进行测试，只要该靶标核酸以可测水平在该细胞类型中存在。这可通过使用，例如PCR或Northern印迹分析等方法
常规测定。来自多种组织和物种的细胞系可从美国菌种保藏中心(ATCC，Manassas，VA)获
得。

[0467] 下列提供的细胞类型仅供阐述目的，也可常规采用其它细胞类型，只要靶标在选定的细胞类型中表达。这可通过本领域常规的方法，例如，Northern印迹分析、核糖核酸酶保护测定或RT-PCR等进行简便的测定。

[0468] b.END细胞：小鼠脑内皮细胞系b.END由Max Plank研究所(Bad Nauheim，Germany)的Werner Risau博士提供。b.END细胞常规培养于添加了10％胎牛血
清 (Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA) 的 高 糖 DMEM 中 (Invitrogen
Life Technologies，Carlsbad，CA)。在汇合度达到约90％时，通过胰蛋白酶化和
稀释进行常规的细胞传代。将细胞以大约3000细胞/微孔的密度接种至96-孔板
(Falcon-Primaria#353872，BD Biosciences，Bedford，MA)，从而用于包括但不限于寡聚化合物转染实验。

[0469] 涉及以寡聚化合物处理细胞的实验：

[0470] 当细胞达到适当的汇合度时，采用所述的转染方法以寡聚化合物对其进行处理。

[0471] LIPOFECTINTM

[0472] 当细胞达到65-75％汇合度时，以寡核苷酸对其进行处理。将寡核苷酸与TM TM
LIPOFECTIN (Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)在Opti-MEM -1低血清培
养基(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中混合，以实现寡核苷酸的理想浓
TM
度，且LIPOFECTIN 的浓度为每100nM寡核苷酸2.5或3μg/mL。将该转染混合物在室温
TM
下孵育约0.5小时。细胞生长于96-孔板时，以100μL OPTI-MEM -1洗涤微孔一次，然后
以130μL转染混合物处理。类似地，用适当体积的培养基和寡核苷酸处理生长于24-孔板
或其它标准组织培养板中的细胞。重复两次或三次处理细胞并取得数值。在37℃下处理
约4-7小时后，以新鲜培养基替换含转染混合物的培养基。寡核苷酸处理后16-24小时采
集细胞。

[0473] 本领域已知的其它适用转染试剂包括，但不限于，CYTOFECTINTM、LIPOFECTAMINETM、TM TMOLIGOFECTAMINE 和FUGENE 。本领域已知的其它适用的转染方法包括，但不限于电穿孔。

[0474] 实施例28

[0475] 寡核苷酸抑制靶标表达的分析

[0476] 靶标表达的反义调节可通过本领域已知的多种方法进行测定。例如，靶标mRNA水平可通过，例如，Northern印迹分析、竞争性聚合酶链式反应(PCR)或实时PCR进行定量。目前希望采用实时定量PCR。可对总细胞RNA或poly(A)+mRNA进行RNA分析。本发明的一种
RNA分析方法采用总细胞RNA，如本文其它实施例中所描述。RNA分离的方法已为本领域公
知。Northern印迹分析也是本领域的常规方法。实时定量(PCR)通过使用来自PE-Applied
TM
Biosystems，Foster City，CA的ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测系统并参照生产
商说明得以便利地实现。

[0477] 靶标蛋白水平可通过本领域公知的多种方法进行定量，例如免疫沉淀、Western印迹分析(免疫印迹)、酶联免疫吸附测定(ELISA)或荧光激活细胞分类(FACS)。针对靶标的抗体可从多种来源例如抗体的MSRS目录(Aerie Corporation，Birmingham，MI)鉴定并获
得，或者可通过本领域公知的常规单克隆或多克隆抗体生成方法制备得到。制备多克隆抗
血清的方法可参见，例如，Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，第11.12.1-11.12.9页，John Wiley & Sons，Inc.，1997。单克隆抗体的制备可
参见，例如，Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，第
11.4.1-11.11.5页，John Wiley & Sons，Inc.，1997。

[0478] 免疫沉淀法是本领域的标准方法，并可参见例如，Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，第10.16.1-10.16.11页，John Wiley & Sons，Inc.，1998。Western印迹(免疫印迹)分析是本领域的标准方法，并可参见例如，Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，第10.16.1-10.80.21页，John Wiley & Sons，Inc.，1997。酶联免疫吸附测定(ELISA)是本领域的标准方法，并可参见例如，Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，第
11.4.1-11.2.22页，John Wiley & Sons，Inc..1991。

[0479] 实施例29

[0480] 对靶标抑制剂用途的表型测定和体内研究的设计

[0481] 表型测定

[0482] 一旦靶标抑制剂通过此处披露的方法进行鉴定，可在一个或多个表型测定中进一步考察该寡聚化合物，其中每个测定具有预示对特定疾病状态或症状进行治疗的效力的可
测端点。

[0483] 表型测定、其中适用的试剂盒和试剂已为本领域技术人员公知，并在此处用于考察靶标在健康和疾病中的作用和/或关联。代表性的表型测定(可从多个销售商中购得)
包括测定细胞活性、细胞毒性、扩增或细胞存活的测定(Molecular Probes，Eugene，OR；
PerkinElmer，Boston，MA)，基于蛋白的测定包括酶法测定(Panvera，LLC，Madison，WI；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ；Oncogene Research Products，San Diego，CA)，细胞调节、信号转导、炎症、氧化过程以及凋亡(Assay Designs Inc.，Ann Arbor，MI)、甘油三酯积累(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、血管生成测定、管道形成测定、细胞因子和激素测定以及代谢测定(Chemicon International Inc.，Temecula，CA；Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。

[0484] 在一个非限制性实例中，经测定适用于特定表型测定的细胞(即，选择用于乳腺癌研究的MCF-7细胞；用于肥胖研究的脂肪细胞)用体外研究鉴定的靶标抑制剂和对照化
合物在最佳浓度下处理(通过上述方法测定的)。在处理末期，用一种或多种对测定特异的
方法来分析经处理和未经处理的细胞来确定表型结果和终点。

[0485] 表型终点包括细胞形态随时间或处理剂量的变化以及细胞成分如蛋白、脂质、核酸、激素、糖或金属等的水平变化。对细胞状态(包括pH、细胞周期阶段、细胞对生物指示剂的摄取或排除)的检测通常是感兴趣的。

[0486] 对处理后的细胞中一种或多种基因表达的检测同样可用作靶标抑制剂的效力或功效的指示。同时检测经处理和未经处理的细胞中的纯度印记基因或怀疑与特定疾病状
态、症状或表型有关的那些基因。

[0487] 体内研究

[0488] 本文所述的体内研究中的个体对象为温血脊椎动物，包括人。

[0489] 实施例30

[0490] RNA分离

[0491] Poly(A)+mRNA分离

[0492] Poly(A)+mRNA的 分 离 可 参 照 Miura等 人 的 方 法 (Clin.Chem.，1996，42，1758-1764)。其它的poly(A)+mRNA分离方法为本领域的常规方法。简言之，对于生长于
96-孔板的细胞，从细胞去除生长培养基并以200μL冷PBS洗涤每个微孔。向每个微孔添
加60μL裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.6，1mMEDTA，0.5M NaCl，0.5％NP-40，20mM氧钒-核糖核苷复合物)，轻柔摇动平板并在室温下孵育五分钟。将55μL裂解产物转移至涂
覆了寡聚d(T)包被的96-孔板(AGCT Inc.，Irvine CA)。将平板在室温下孵育60分钟，
以200μL洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.6，1mM EDTA，0.3M NaCl)洗涤3次。末次洗
涤后，以纸巾吸去多余的洗涤缓冲液，然后空气干燥5分钟。将预热至70℃的60μL洗脱缓
冲液(5mM Tris-HCl pH 7.6)添加至各微孔，将平板在90℃热板上孵育5分钟，然后将洗脱
物转移至新鲜的96-孔板。

[0493] 生长于100mm或其它标准平板的细胞也可采用适当体积的所有溶液进行类似处理。

[0494] 总RNA分离

[0495] 总RNA可采用由Qiagen Inc.(Valencia，CA)购得的RNEASY 96TM试剂盒和缓冲液并参照生产商的推荐方法进行分离。简言之，对于生长于96-孔板的细胞，从细胞去除生长培养基并分别以200μL冷PBS洗涤每个微孔。向每个微孔添加150μL缓冲RLT并将平
板剧烈摇动20秒。将150μL的70％乙醇添加至各微孔，然后通过上下吹吸三次混合内含
TM
物。随后将样本转移至装配了废物采集盘并连接至真空源的QIA V AC 集流腔所连接的
TM TM
RNEASY 96 孔板上。抽真空1分钟。将500μL缓冲RW1添加至RNEASY 96 板的各微孔中
TM
并孵育15分钟，再次抽真空1分钟。再次将500μL缓冲RW1添加至RNEASY 96 板的各微
TM
孔中并再次抽真空2分钟。然后将1mL的缓冲RPE添加至RNEASY 96 板的各微孔中并抽
TM
真空90秒钟。重复用缓冲RPE洗涤，再次吸真空3分钟。然后从QIA V AC 集流腔取走平
TM
板并用纸巾吸干。重新将平板连接至装配了含1.2mL采集管的采集管架的QIA V AC 集流
腔。然后通过向各微孔中移入140μL无RNA酶的水，孵育1分钟，抽真空3分钟洗脱RNA。

[0496] 重复移液和洗脱步骤可通过QIAGEN Bio-Robot 9604(Qiagen，Inc.，ValenciaCA)自动完成。简言之，裂解培养平板上的细胞之后，将平板转移至进行移液、DNA酶处理和洗脱步骤的机械平台上。

[0497] 实施例31

[0498] 靶标mRNA水平的实时定量PCR分析

[0499] 靶标mRNA水平可采用ABI PRISMTM 7600、7700或7900序列检测系统(PE-AppliedBiosystems，Foster City，CA)并参照生产商的说明通过实时定量PCR实现定量。这是
一个闭管、非凝胶式荧光检测系统，其允许对聚合酶链式反应(PCR)产物进行实时高通量
定量。与扩增产物在PCR完成后定量的标准PCR不同，在实时定量PCR中的产物在其积
累时定量。这一点可通过在PCR反应中包含在正向和反向PCR引物之间特异性退火并包
含两个荧光染料的寡核苷酸探针来实现。报告染料(例如，FAM或JOE，来自PE-Applied
Biosystems，Foster City，CA，Operon Technologies Inc.，Alameda，CA或Integrated DNA Technologies Inc.，Coralville，IA)被连接至探针的5’端而淬火染料(例如，TAMRA，来自PE-Applied Biosystems，Foster City，CA，Operon Technologies Inc.，Alameda，CA或Integrated DNA Technologies Inc.，Coralville，IA)被连接至探针的3’端。当探针和染料完整时，报告染料的发射被邻近的3’端淬火染料淬灭。在扩增过程中，探针与靶标序列的退火生成能被Taq聚合酶的5’-核酸外切酶活性裂解的底物。在PCR扩增周期的延伸阶
段，Taq聚合酶对探针的裂解从探针的剩余部分(并从而由淬火部分)释放了报告染料，从
而生成了序列特异性荧光信号。在每一个周期中，附加的报告染料分子从其相应的探针中
TM
裂解，并可通过整合在ABI PRISM 序列检测系统中的激光镜头定期监测荧光强度。在每一
个测定中，一系列包含来自未处理对照样本的mRNA系列稀释物的平行反应生成标准曲线，
它可用于对测试样本进行反义寡核苷酸处理后的抑制百分比进行定量。

[0500] 在定量PCR分析之前，对被测靶标基因特异性的引物-探针组与GAPDH扩增反应的“多重性(multiplexed)”能力进行评估。在多重化中，靶标基因和内标基因GAPDH在单个样本中同时扩增。在该分析中，从未处理细胞中分离的mRNA被系列稀释。各稀释物可在仅
特异性靶向GAPDH、仅特异性靶向靶标基因(“单重”)或对两者都特异(多重)的引物-探
针组的存在下扩增。PCR扩增之后，可同时从单重和多重样本生成作为稀释函数的GAPDH和
靶标mRNA信号的标准曲线。如果从多重样本中生成的GAPDH和靶标信号的斜率和相关联
系数均小于从单重样本所得相应数值的10％之内，则该对靶标具有特异性的引物-探针组
可认为具有多重性。其它PCR方法已为本领域所知。

[0501] RT和PCR试剂可从Invitrogen Life Technologies(Carlsbad，CA)获得。RT，实时PCR可通过向含有30μL总RNA溶液(20-200ng)的96-孔板添加20μLPCR混合物
(2.5×无MgCl2PCR缓冲液，6.6mM MgCl2，dATP、dCTP、dCTP和dGTP各375μM，正向引物和
反向引物各375nM，125nM探针，4单位RNA酶抑制剂，1.25单位 Taq，5单位
MuLV逆转录酶以及2.5×ROX染料)得以实现。RT反应可通过在48℃下孵育30分钟得以
实现。在95℃下孵育10分钟以激活 Taq后，进行40个循环的两步PCR法：
95℃下进行15秒(变性)后在60℃下进行1.5分钟(退火/延伸)。

[0502] 通过RT，实时PCR得到的基因目标量通过GAPDH(一种表达恒定的基因)的表达水TM
平或通过以RIBOGREEN (Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)定量总RNA来归一化。GAPDH
TM
表达可通过与靶标同时多重或单独运行实时RT-PCR来定量。总RNA可采用RiboGreen
TM
RNA定量试剂(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)进行定量。通过RIBOGREEN 进行RNA
定量的方法可参见Jones，L.J.，等人，(Analytical Biochemistry，1998，265，368-374)。

[0503] 在该测定中，170μL的RIBOGREENTM工作试剂(RIBOGREENTM试剂以1∶350稀释于10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5)以移液管移入含有30μL纯化细胞RNA的96-孔板。在
CytoFluor 4000(PE Applied Biosystems)中读板，激发波长为485nm，发射波长为530nm。

[0504] 实施例32

[0505] 靶标特异性引物和探针

[0506] 可采用公开的序列信息设计探针和引物，与靶标序列杂交。

[0507] 例如，对于人PTEN，可使用公开的序列信息(GENBANKTM录入号U92436.1，SEQ ID NO：1)设计下列引物-探针组：

[0508] 正向引物：AATGGCTAAGTGAAGATGACAATCAT(SEQ ID NO：2)

[0509] 反向引物：TGCACATATCATTACACCAGTTCGT(SEQ ID NO：3)

[0510] 以及PCR探针：

[0511] FAM-TTGCAGCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGG-TAMRA(SEQ ID NO：4)，其中FAM为荧光染料，TAMRA为淬火染料。

[0512] 实施例33

[0513] 靶标蛋白水平的Western印迹分析

[0514] Western印迹分析(免疫印迹分析)可采用标准方法进行。在寡核苷酸处理后16-20小时采集细胞，以PBS洗涤一次，悬浮于Laemmli缓冲液(100μl/微孔)，煮沸5分
钟并上样至16％SDS-PAGE凝胶。在150V下跑胶1.5小时，并转移到膜上进行western印
迹。采用适当的针对靶标的一抗，以及针对该一抗的放射标记或荧光标记的二抗。采用
TM
PHOSPHORIMAGER (Molecular Dynamics，Sunnyvale CA)显示条带。

[0515] 实施例34

[0516] 靶向PTEN的6-(R或S)-CH3和6-(R或S)-CH2-O-CH3BNA 2-10-2带间隙寡聚体：体外研究

[0517] 如本发明所述，合成寡聚化合物并在一定剂量范围内检测其减少PTEN表达的能力。采用此处所述的方法以0.3125、0.0625、1.25、2.5、5、10或20nM浓度的6-(R或
S)-CH3-BNA(分别为392748和392749)以及6-(R或S)-CH2-O-CH3(分别为396004和
396005)修饰的寡聚体处理b.END细胞。如此处其它实施例所述，PTEN的表达水平可通过实
TM
时PCR测定并对RIBOGREEN 归一化。所得的剂量-响应曲线可如下所示用于测定EC50。可
在pH 7的含0.1mM EDTA的100mM磷酸盐缓冲液中于260nm下使用4μM6-(R或S)-CH3-BNA
或6-(R或S)-CH2-O-CH3修饰的寡聚体和4μM互补RNA评估Tm。

[0518]

[0519] 所有的核苷间联接为硫代磷酸酯，粗体的核苷为6-(R或S)-CH3BNA核苷，加下划线和粗体的核苷为6-(R或S)-CH2-O-CH3BNA核苷，而下标R和S表示了在6位碳原子处的
构型。应当指出6-修饰的BNA寡聚化合物显示了更大的效力，尽管它的Tm略微下降。

[0520] 实施例35

[0521] 靶向PTEN的6-(S)-CH3-BNA和6-(R)-CH3-BNA 2-10-2带间隙的寡聚体：体内研究

[0522] 在3周中每周两次向六周大的Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)注射剂量为0.5或2μmol/kg的靶向PTEN的6-CH3-BNA修饰寡聚体(6-(S)或6-(R))。
在最后一次施用后48小时处死小鼠。将肝组织匀浆化并按照此处所述通过实时PCR对mRNA
水平定量，从而与未处理对照水平进行比较(％UTC)。

[0523]

[0524] 所有的核苷间联接为硫代磷酸酯，粗体核苷为6-CH3-BNA核苷而下标R和S表示了在6位碳原子处的构型。

[0525] 实施例36

[0526] 靶向PTEN的6-(S)-CH3-BNA和6-(R)-CH3-BNA 2-10-2带间隙的寡聚体：体内研究

[0527] 向六周大的Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)注射一次剂量为1、2、4或8μmol/kg的靶向PTEN的6-CH3-BNA修饰的寡聚体(6-(S)或6-(R))。在施用
后72小时处死小鼠。将肝组织匀浆化并按照此处所述通过实时PCR对mRNA水平定量，从
而与未处理对照水平进行比较(％UTC)。

[0528]

[0529] 所有的核苷间联接为硫代磷酸酯，粗体的核苷为6-CH3-BNA核苷而下标S和R表示了6位碳原子处的构型。

[0530] 实施例37

[0531] 靶向PTEN的6-(S)-CH3-O-CH2-BNA和6-(R)-CH3-O-CH2-BNA 2-10-2带间隙寡聚体：体内研究

[0532] 向六周大的Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)注射一次剂量为1、2、4或8μmol/kg(以下仅显示了8μmol/kg的数据)的靶向PTEN的6-CH3-BNA修饰的
寡聚体(6-(S)或6-(R))。在施用后72小时处死小鼠。将肝组织匀浆化并按照此处所述通
过实时PCR对mRNA水平定量，从而与未处理对照水平进行比较(％UTC)。

[0533]

[0534] 所有的核苷间联接均为硫代磷酸酯，粗体和带下划线的核苷为6-CH3-O-CH2-BNA核苷而下标S和R表示了6位碳原子处的构型。

[0535] 实施例38

[0536] 以SVPD处理的6-(R或S)-CH3-BNA修饰的寡聚体的核酸酶稳定性

[0537] 6-(R或S)-CH3-BNA(分别为392748和392749)修饰的寡聚体的核酸酶稳定性可采用蛇毒磷酸二酯酶(SVPD)进行测定。该研究分别包括了可进行比较的6-未取代的间隙体
(gapmer)(4’-CH2-O-2’桥连的BNA，392745，下标1)和2’-O-MOE间隙体(2’-O-(CH2)2-OCH3，
392753，下标e)。各寡聚体制备为含有以下成分的500μL混合物：5μL 100μM寡聚体，
50μL含于SVPD缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，8mM MgCl2)的0.5单位/mL磷酸二酯酶，
其最终浓度为0.05单位/mL，445μL SVP缓冲液。将样本在37℃下于水浴中孵育。在第0、
1、2和4天取等份(100μL)并在第1和2天添加新鲜的酶。在等份取出后立即添加EDTA
以终止酶活性。在IP HPLC/MS上分析样本。

[0538]

[0539]

[0540] 所有的核苷间联接为硫代磷酸酯，粗体核苷为修饰的核苷，下标R和S表示了6-CH3-BNA核苷在6位碳原子的构型，下标e表示了2’-O-MOE核苷而下标1表示了
4’-CH2-O-2’修饰的核苷。含有6-甲基取代的BNA的化合物(392748和392749)比含有
未取代BNA的化合物(392745)具有明显的提高。

[0541] 实施例39

[0542] 以SVPD处理的6-(R或S)-CH3-BNA、4’-CH2-O-2’BNA和2’-O-MOE修饰的寡聚体的核酸酶稳定性

[0543] 6-CH3-BNA修饰的寡聚体的核酸酶稳定性可采用蛇毒磷酸二酯酶(SVPD)进行测定。各寡聚体制备为含有以下成分的90μL混合物：5μL寡聚体(2μL5μM寡聚体和3μL
5’32P-标记的寡聚体)、75μL H2O以及10μL 10×缓冲液(500mM Tris-HCl，700mM NaCl
以及140mM MgCl2，pH 8.6)。在0分钟，从上述制备的寡聚体样本取出9μL并添加至10μL
终止缓冲液(6.67M尿素，16.67％甲酰胺和83.3mM EDTA)然后添加1μL H2O并在100℃下
加热2.5至3分钟。通过添加9μL SVPD(0.5单位/mL)开始测定动力学。最终的酶浓度
为0.05单位/mL。将每等份的10μL寡聚体动力学溶液添加至10μL终止缓冲液并按如上
所述热灭活。取1、3、9、27、80、240和1290为动力学时间点。通过12％丙烯酰胺PAGE在
45瓦特/凝胶下跑2小时分析样本。

[0544]

[0545] 所有的核苷间联接均为硫代磷酸酯，粗体核苷为修饰的核苷，下标R和S表示了6-CH3-BNA核苷在6位碳原子的构型，下标e表示2’-O-MOE核苷而下标1表示4’-CH2-O-2’
修饰核苷。

[0546]

[0547] 实施例40

[0548] 在三周、多剂量体内研究中靶向PTEN的6-(S)-CH3-BNA、4’-CH2-O-2-BNA和2’-O-MOE修饰的寡聚体

[0549] 在三周中每周两次向六周大的Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)注射剂量为3.2、1.0、0.32和0.1μmol/kg(以下仅显示了3.2和1μmol/kg的数据)
的靶向PTEN的6-(S)-CH3-BNA(2-10-2，14-聚体)、4’-CH2-O-2’-BNA(2-10-2，14-聚体)
和2’-O-MOE(5-10-5，20-聚体)修饰的寡聚体。在最后一次施用后48小时处死小鼠。将
肝组织匀浆化并按照此处所述通过实时PCR对mRNA水平定量，从而与未处理对照水平进行
比较(％UTC)。处死后测定血浆化学和肝重。

[0550]

[0551]

[0552] 所有的核苷间联接为硫代磷酸酯，粗体核苷为修饰的位置，下标s表示Me
6-(S)-CH3-BNA，下标1表示4’-CH2-O-2’BNA，下标e表示2’-O-MOE而 C表示5’-甲基
胞嘧啶核苷。

[0553] 在研 究 的 最高 点，含4’-CH2-O-2’BNA(392063，3.2μmol/Kg剂量 组) 的寡聚体的高剂量组动物显示肝重明显升高的(相对盐水为153％)。与之相对，含
6-(S)-CH3BNA(392749，3.2μmol/Kg剂量组)寡聚体的肝重为盐水组的117％。含
2’O-MOE(116847，1.0μmol/Kg剂量组)寡聚体的肝重为盐水组的116％。该实施例证明了
6-(S)-CH3-BNA修饰在允许设计的反义寡聚体保持4’-CH2-O-2’BNA所赋予的效力的同时，其ALT水平相对4’-CH2-O-2’BNA修饰的化合物有显著提升。

[0554] 实施例41

[0555] 靶向PTEN的6-(R或S)-CH3和6-(R或S)-CH2-OCH3、4’-CH2-O-2’BNA 2-10-2带间隙的寡聚体：体内研究

[0556] 向六周大的Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)注射一次剂量为2.5、5、10和20μmol/kg(以下仅显示了5和10μmol/kg的数据)的靶向PTEN的修饰的
6-(R或S)-CH3(分别为396568和396024)、6-(R或S)-CH2-OCH3(分别为396007和396008)、
4’-CH2-O-2’BNA 2-10-2带间隙的寡聚体(6-(S)或6-(R))。在施用后66小时处死小鼠。
将肝组织匀浆化。

[0557]

[0558] 所有的核苷间联接均为硫代磷酸酯，粗体的核苷为修饰的核苷，下标R和S表示所示的6-CH3-BNA(仅粗体)和6-CH2-O-CH3-BNA(粗体并带下划线)核苷在6位碳原子的构
Me
型，下标1表示4’-CH2-O-2’核苷而 C表示5’-甲基胞嘧啶核苷。

[0559] 上述寡核苷中，一个寡核苷(Isis No.392063)在6位碳原子处不含手性核苷，其中其它四个(Isis No.396024、396568、396008和396007)在6位碳原子处含手性的核苷。
特别地，这四个寡核苷在1、2、13和14位具有一个该种核苷。在肝中，在6位碳原子处不含手性核苷的寡核苷比包括在6位碳原子处含手性核苷的四个寡核苷具有相对更高的毒性。

[0560] 实施例42

[0561] 靶向PTEN的2-14-2带间隙的寡聚体：体内研究

[0562] 在向六周大的Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)注射一次剂量为2或10μmol/kg的靶向PTEN的6-CH3-BNA修饰的寡聚体。在施用后72小时处死小鼠。
将肝组织匀浆化并按照此处所述通过实时PCR对mRNA水平定量，从而与未处理对照水平进
行比较(％UTC)。

[0563]

[0564]

[0565] 所有的核苷间联接均为硫代磷酸酯，粗体的核苷为修饰的核苷，下标R和S表示所示的6-CH3-BNA和6-CH2-O-CH3-BNA核苷在6位碳原子的构型，下标e表示2’-O-MOE核苷
而MeC表示5’-甲基胞嘧啶核苷。

[0566] 此处所引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作为参考。尽管在前述的说明书中本发明通过某些优选实施方案进行了描述，且为了阐述的目的列举了众多具体内
容，本领域技术人员显然理解本发明可采用其它的实施方案，且此处所述的某些具体内容