酸性重组蛋白药物的纯化方法

摘要

本发明提供一种酸性重组蛋白药物的纯化方法，以平均等电点（pI）小于7的酸性蛋白为目的蛋白，选用兼有阴离子交换作用以及疏水相互作用的混合模式层析，得到纯化的目的蛋白。本发明提供了一种新的纯化思路，有效地精细纯化酸性蛋白药物，缩短了工艺流程，提高了产率，降低了生产成本。

权利要求

1.一种酸性重组蛋白药物的纯化方法，以平均等电点pI小于7的酸性蛋白为目的蛋白，所述酸性蛋白为能够形成单体和多聚体的蛋白，所述蛋白药物预先经粗提纯处理，其特征在于，用提供阴离子交换作用及疏水相互作用的混合模式层析来进一步精细纯化，该层析过程包括：调节样品及平衡缓冲液pH值高于目的蛋白的平均pI1-3个pH单位，然后以过载方式进行上样，待目的蛋白吸附饱和继而开始流穿后，收集流穿液，得到纯化的目的蛋白，整个层析过程中杂质主要被吸附在层析柱上。

2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述蛋白药物由微生物细胞或哺乳动物细胞表达。

3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述蛋白药物为重组人血清白蛋白rHSA或TNFR-Fc融合蛋白。

4.如权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，蛋白药物为大肠杆菌或酵母菌表达的rHSA，或为CHO细胞表达、经包括Protein A亲和层析的粗纯化制得的TNFR-Fc融合蛋白。

5.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述蛋白药物为酵母菌表达的重组人血清白蛋白rHSA，上样前调节样品及平衡缓冲液的离子强度至1-5mS/cm。

6.如权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为20-70mM、pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液A，上样前用样品缓冲液将样品进行缓冲液交换，所述样品缓冲液为

20-70mM、pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液。

7.如权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述层析的上样量为300～550mg/ml介质。

8.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述蛋白药物为TNFR-Fc融合蛋白，上样前调节样品及平衡缓冲液的离子强度至18-30mS/cm。

9.如权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为20-50mM、pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液B，缓冲液B包含200-350mM NaCl；上样前用样品缓冲液将样品进行缓冲液交换，所述样品缓冲液包含200-350mM NaCl，为20-50mM、pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液。

10.如权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，所述层析的上样量为150～280mg/ml介质。

11.如权利要求1-10任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述的混合模式介质为以琼脂糖为基质的介质，或为以纤维素为基质的介质。

12.如权利要求11所述的纯化方法，其特征在于，所述混合模式介质为Capto Adhere、PPA HyperCel或HEA HyperCel。

13.如权利要求11所述的纯化方法，其特征在于，所述层析的流速为90-120cm/h。

说明书

酸性重组蛋白药物的纯化方法

技术领域

[0001] 本发明属于蛋白质分离技术领域，具体而言，本发明涉及一种酸性重组蛋白药物的纯化方法。该方法主要用于大规模细胞培养生产的治疗用蛋白质药物的生产制备。

背景技术

[0002] 近二十年来蛋白质药物发展迅速，目前有近百种重组蛋白药物上市，几千种处于研发状态。重组蛋白药物也称rDNA药物，重组蛋白药物虽然仅占全球处方药市场的7-8%左右，但是发展非常迅速，本世纪其发展更是进入黄金时节，2005年全球销售额即达到410亿美元，2009年仅美国市场蛋白质药物销售额已经达到了480亿美元，这其中抗体类药物占了约33%的份额。

[0003] 重组蛋白质药物通常采用大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞等表达系统进行表达，其中动物细胞大规模培养生产蛋白质药物已成为当今生物制药领域的主流。临床许多蛋白药物，特别是治疗用药，需用较高剂量或长期用药，市场需求量较大，因此该类生物制药的大规模生产对工艺质量要求较高，必须符合美国FDA标准。抗体类或者Fc融合蛋白类药物通常采用一步Protein A亲和层析即可达到90%以上纯度，其他污染性杂质如脱落的Protein A、宿主细胞蛋白（HCP）、聚集体（D/A）以及DNA等主要通过离子交换等层析方法去除。其他重组蛋白药物的HCP、聚集体及DNA等杂质则往往需要更多的纯化步骤进行去除。

[0004] Protein A亲和层析在反复使用过程中会产生一定程度的脱落，残留在产品中的Protein A会引起不良免疫应答反应，其和抗体的复合物在体内可激活携带Fc的白细胞和补体系统的免疫应答，产生氧化和过敏反应，一般采用离子交换层析可以去除（CN101120017A）。美国FDA建议产品中Protein A残留应低于10-12ppm。宿主细胞蛋白（HCP）是宿主细胞的蛋白成分，为异源蛋白，残留在产品中会引起机体的过敏反应，有研究显示，
100ppm的HCP能够引起患者的免疫反应。

[0005] 另外，聚集体在发酵、纯化以及制剂过程中因一些物理的和化学的因素而经常产生，比如培养的温度和时间、低pH值、剪切力以及表面吸附等。聚集体不但会使病人产生免疫反应，甚至会使人对药物产生免疫耐受性，从而大大降低了药物的药效（Subramanyam M. Immunogenicity of biotherapeutics-an overview. Journal of Immunotoxicology,2006, 3, 151-156.）。此外，聚集体还会影响蛋白质药物的生物活性、稳定性以及保存期等。聚集体的去除主要通过层析过程来实现，层析技术比如离子交换层析（US Patent
2008/0058507 A1；US Patent 6,177,548 B1）和疏水层析（US Patent 2010/0069617 A1），如果聚集体含量高于10%时，单步IEC或HIC的去除能力非常有限，往往需要多个层析步骤才能有效降低聚集体（Y.Yigzaw, P.Hinckley, A.Hewig and G.Vedantham. Ion Exchange Chromatography of Proteins and Clearance of Aggregates. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2009, 10, 421-426；Pete Gagnon. IgG Aggregate Removal by Charged-Hydrophobic Mixed Mode Chromatography. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2009, 10, 427-433.），这样会使蛋白收率降低，成本增加。Gagnon等人提出采用羟基磷灰石层析技术来去除聚集体（US Patent 2010/0145029 A1；US Patent
2005/0107594 A1），该方法去除聚集体的能力很高，可以将60%的聚集体去除到0.1%以下，但是，羟基磷灰石介质的使用寿命短，大规模装柱困难，且对缓冲液条件要求严格，因此并不适合在大规模生产中使用（McCue JT, Cecchini D, Hawkins K, Dolinski E. Use of an alternative scale-down approach to predict and extend hydroxyapatite column lifetimes. Journal of Chromatography A, 2007, 1165, 78-85.）。

[0006] 混合模式层析是近年发展的新型生物分离方法，不同于单一模式的离子交换层析或疏水相互作用层析，混合模式层析涉及疏水作用力、静电作用力以及氢键作用力等，多种作用力的协同作用可以促进蛋白质的吸附、分离以及洗脱（Guofeng Zhao, Xiao-Yan Dong, Yan Sun, Ligands for mixed-mode protein chromatography: Principles, characteristics and design, Journal of Biotechnology, 2009, 144, 3-11.）。对于该技术，目前国内外研究大都集中在其耐盐吸附特性，包括吸附载量、色谱行为以及蛋白质吸附的分子模拟等，目的是从高电导发酵液中直接捕获目标分子，并获得高的回收率（Beckley K. Nfor, Marc Noverraz, Sreekanth Chilamkurthi, et al. High-throughput isotherm determination and thermodynamic modeling of protein adsorption on mixed mode adsorbents, Journal of Chromatography A, 2010, 1217, 6829-6850；Lin Zhang, Shu Bai, Yan Sun, Molecular dynamics simulation of the effect of ligand homogeneity on protein behavior in hydrophobic charge induction chromatography, Journal of Molecular Graphics and Modelling, 2010, 28, 863-869.）。

[0007] 经对 现 有 技术 文 献 的检 索 发现，Gagnon 在《Current Pharmaceutical Biotechnology》上发表的关于混合模式层析技术去除聚集体等杂质的论文《IgG aggregate removal by charged-hydrophobic mixed mode chromatography》，该论文仅仅局限于对碱性抗体蛋白聚集体的去除。专利（CN 101318991 A）提到使用混合模式层析技术去除聚集体、HCP及Protein A残留等杂质，但也明确指出蛋白等电点≥6.5。酸性蛋白药物在重组蛋白药物中占有相当大的比例，目前酸性蛋白的纯化方法如阴离子交换层析，通常采用吸附-洗脱模式进行纯化，处理量有限，且去除HCP等杂质尤其是聚集体的能力也有限，因此，对于酸性蛋白药物，如何进行高效的精细纯化，并适用于大规模生产，是实现酸性蛋白药物高质量低成本的一个关键问题，为此，开发一种酸性蛋白药物的纯化方法具有重要的现实意义。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种酸性重组蛋白药物的纯化方法，使其能够快速、简便、低成本、大批量有效的纯化制备酸性蛋白药物。

[0009] 为了实现上述任务，本发明采取如下技术解决方案：

[0010] 一种酸性重组蛋白药物的纯化方法，以平均等电点（pI）小于7的酸性蛋白为目的蛋白，所述蛋白药物预先经粗提纯处理，用提供阴离子交换作用及疏水相互作用的混合模式层析来进一步精细纯化，该层析过程包括：

[0011] 调节样品及平衡缓冲液pH值高于目的蛋白的平均pI 1-3个pH单位，然后以过载方式进行上样，待目的蛋白吸附饱和继而开始流穿后，收集流穿液，得到纯化的目的蛋白，整个层析过程中杂质主要被吸附在层析柱上。

[0012] 可选地，之后通过0.1M柠檬酸溶液将结合在柱上的聚集体及其他杂质洗脱，最后通过1M NaOH溶液来清洗层析柱。

[0013] 本文中平均pI的定义为：重组蛋白在翻译后修饰过程中，如糖基化过程，可以引入带电荷部分，在通过等电聚焦（IEF）测定时会出现多个条带，即较宽的pI范围，本发明所述的平均pI即为该pI宽范围的一个平均值。

[0014] 所述的技术方案属于精细纯化（polishing purification）方法，意指一种方法，通过该方法至少一种不希望得到的成分，如聚集体、HCP、Protein A残留等杂质，相对于希望得到的目的蛋白减少了，其中所述的经粗提纯的蛋白药物仅含有少量的杂质，如聚集体，还通常含有微量杂质，如HCP等；所述粗纯化包括常规的亲和层析或疏水作用层析，而经ProteinA亲和层析得到的蛋白药物还会含有微量的Protein A残留杂质。

[0015] 进一步，所述蛋白药物由微生物或哺乳动物细胞细胞表达，如重组人血清白蛋白rHSA或TNFR-Fc融合蛋白，优选大肠杆菌或酵母菌表达的rHSA，或优选CHO细胞表达、经包括Protein A亲和层析的粗纯化制得的TNFR-Fc融合蛋白。

[0016] 当蛋白药物为酵母菌表达的重组人血清白蛋白rHSA时，上样前调节样品及平衡缓冲液的离子强度至1-5mS/cm：

[0017] 进一步，所述平衡缓冲液为20-70mM、pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液A，上样前用样品缓冲液将样品进行缓冲液交换，所述样品缓冲液为20-70mM、pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液。

[0018] 进一步，所述层析的上样量为300~550 mg/ml介质。

[0019] 当蛋白药物为TNFR-Fc融合蛋白时，上样前可调节样品及平衡缓冲液的离子强度至18-30mS/cm：

[0020] 进一步，所述平衡缓冲液为20-50mM、pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液B，缓冲液B包含200-350mM NaCl；上样前用样品缓冲液将样品进行缓冲液交换，所述样品缓冲液包含200-350mM NaCl，为20-50mM、pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液。

[0021] 进一步，所述层析的上样量为150~280 mg/ml介质。

[0022] 进一步，所用混合模式层析介质兼有正电荷基团和疏水基团，同时提供阴离子交换作用和疏水相互作用，可为以琼脂糖为基质的强阴离子交换、强疏水作用的介质，如Capto Adhere；也可为以纤维素为基质的弱阴离子交换、强疏水作用的介质，如PPA HyperCel，或弱阴离子交换、弱疏水作用的介质HEA HyperCel。

[0023] 进一步，所述层析的流速为90-120cm/h。

[0024] 本发明使用兼有阴离子交换作用及疏水相互作用的介质，在一定离子强度下，利用聚集体疏水性质强于单体的特点，使聚集体与单体目的蛋白分离；缓冲液pH值高于目的蛋白等电点的条件，使样品与介质表面存在静电吸引作用力，以去除聚集体、HCP及Protein A等杂质；另外，所述的操作方式不同于常规层析操作，是以过载方式进行操作，尽管开始上样时，由于目的蛋白与介质表面存在静电吸引作用力，目的蛋白也会吸附在层析介质上，但目的蛋白与杂质在层析柱上吸附饱和的载量不同，目的蛋白浓度远大于杂质而在层析柱上最先吸附饱和，目的蛋白吸附饱和后继续上样会大量流穿，样品中的微量杂质则不断被吸附至层析柱上，所以，收集整个流穿液即得到精细纯化的目的蛋白。

[0025] 本发明提供了一种新的纯化思路，以过载方式进行上样，能够有效的纯化酸性重组蛋白，去除产品中的聚集体、HCP及Protein A等污染性杂质，可提高终产物的质量，使其纯度达99%以上；本发明能一步有效的精细纯化酸性蛋白药物，缩短了工艺流程，提高了产率，降低了生产成本，同时具有稳定性好、过程控制指标明确、适合规模化生产等特点。

附图说明

[0026] 图1为重组人血清白蛋白rHSA的发酵液经过初步分离（实施例1），rHSA样品的SEC-HPLC色谱图，横坐标为蛋白质出峰时间，其中聚集体蛋白于15.9min出峰，目的蛋白于17.8min出峰，纵坐标为mAU表示A280紫外吸收值，目的蛋白与聚集体蛋白的峰面积比为
97.4% ：2.6%。

[0027] 图2为重组人血清白蛋白rHSA的发酵液经过初步分离及缓冲液交换后上样Capto Adhere混合模式层析柱的色谱图（实施例2），其中纵坐标mAU表示A280紫外吸收值，横坐标为单位体积介质的上样量，样品经过吸附饱和区后开始流穿，流穿峰为目的蛋白，清洗峰为聚集体等杂质成分。

[0028] 图3为实施例2中采用Capto Adhere纯化得到的rHSA样品的SEC-HPLC色谱图，横坐标为蛋白质出峰时间，目的蛋白于17.8min出峰，纵坐标为mAU表示A280紫外吸收值，目的蛋白与聚集体蛋白的峰面积比为99.6% ：0.4%。

[0029] 图4为重组人血清白蛋白rHSA的发酵液经过初步分离及缓冲液交换后上样PPA HyperCel混合模式层析柱的色谱图（实施例3），其中纵坐标mAU表示A280紫外吸收值，横坐标为单位体积介质的上样量，样品经过吸附饱和区后开始流穿，流穿峰为目的蛋白，清洗峰为聚集体等杂质成分。

[0030] 图5为实施例3中采用PPA HyperCel纯化得到的rHSA样品的SEC-HPLC色谱图，横坐标为蛋白质出峰时间，目的蛋白于17.8min出峰，纵坐标为mAU表示A280紫外吸收值，目的蛋白与聚集体蛋白的峰面积比为99.2% ：0.8%。

[0031] 图6为实施例5中亲和层析洗脱的TNFR-Fc融合蛋白样品的SEC-HPLC色谱图，横坐标为蛋白质出峰时间，其中聚集体蛋白于13.8min出峰，目的蛋白于15.9min出峰，纵坐标为mAU表示A280紫外吸收值，目的蛋白与聚集体蛋白的峰面积比为95.9% ：4.1%。

[0032] 图7为TNFR-Fc融合蛋白的发酵液经过亲和层析及缓冲液交换后上样Capto Adhere混合模式层析柱的色谱图（实施例6），其中纵坐标mAU表示A280紫外吸收值，横坐标为单位体积介质的上样量，样品经过吸附饱和区后开始流穿，流穿峰为目的蛋白，清洗峰为聚集体等杂质成分。

[0033] 图8为实施例6中采用Capto Adhere纯化TNFR-Fc融合蛋白后样品的SEC-HPLC色谱图，横坐标为蛋白质出峰时间，其中目的蛋白于15.9min出峰，纵坐标为mAU表示A280紫外吸收值，目的蛋白与聚集体蛋白的峰面积比为99.5% ：0.5%。

[0034] 图9为TNFR-Fc融合蛋白的发酵液经过亲和层析及缓冲液交换后上样PPA HyperCel混合模式层析色谱图（实施例7）；其中纵坐标mAU表示A280紫外吸收值，横坐标为单位体积介质的上样量，样品经过吸附饱和区后开始流穿，流穿峰为目的蛋白，清洗峰为聚集体等杂质成分。

[0035] 图10为实施例7中采用PPA HyperCel纯化TNFR-Fc融合蛋白聚集体后样品的SEC-HPLC色谱图，横坐标为蛋白质出峰时间，其中目的蛋白于15.9min出峰，纵坐标为mAU表示A280紫外吸收值，目的蛋白与聚集体蛋白的峰面积比为98.2% ：1.8%。

[0036] 图11为实施例8中采用HEA HyperCel纯化TNFR-Fc融合蛋白聚集体后样品的SEC-HPLC色谱图，横坐标为蛋白质出峰时间，其中目的蛋白于15.9min出峰，纵坐标为mAU表示A280紫外吸收值，目的蛋白与聚集体蛋白的峰面积比为99.1% ：0.9%。

具体实施方式

[0037] 实施例1 待纯化样品重组人血清白蛋白（rHSA）的制备

[0038] 重组人血清白蛋白rHSA等电点约为4.9，通过酵母细胞培养表达，通过离心和深o层过滤进行发酵液的澄清后，进行68C加热（含10mM辛酸钠，pH6.0，30分钟）处理以灭活在酵母发酵过程中产生的蛋白酶，样品冷却到室温后调节pH至4.5、电导处于4mS/cm后，通过SP Sepharose FF进行纯化，平衡缓冲液为50mM乙酸钠，pH4.5，洗脱缓冲液为50mM乙酸钠，
0.6M氯化钠，pH6.5。再将洗脱液直接上柱Phenyl Sepharose FF，平衡缓冲液为50mM乙酸钠，0.5M氯化钠，pH6.0，洗脱缓冲液为20mM乙酸钠，pH6.0。所得粗提纯蛋白的SEC-HPLC液相图谱如附图1所示。

[0039] 实施例2 混合模式层析介质Capto Adhere纯化rHSA

[0040] 配置磷酸盐缓冲液A1：70mM PBS，pH6.5，通过装有G25凝胶过滤介质的层析柱将实施例1的样品，即待纯化样品进行缓冲液交换。利用AKTA explorer 100层析系统，将1ml Capto Adhere混合模式介质装填于Tricorn5/50层析柱中，用8倍柱体积的磷酸盐缓冲液A1充分平衡层析柱后，开始上样，上样量控制为550mg/ml介质，流速为100cm/h。当样品上完后，继续用平衡缓冲液冲洗至基线，收集整个流穿峰，经过液相色谱检测（SEC-HPLC色谱图如附图3所示），即为目的蛋白。之后通过0.1M柠檬酸溶液进行洗脱，洗脱液即为结合在柱上的聚集体及其他杂质，最后通过1M NaOH溶液来清洗层析柱。整个过程的色谱图如附图2所示。

[0041] 实施例3 混合模式层析介质PPA HyperCel纯化rHSA

[0042] 配置磷酸盐缓冲液A2：20mM PBS，pH7.5，通过装有G25凝胶过滤介质的层析柱将实施例1的样品，即待纯化样品进行缓冲液交换。利用AKTA explorer 100层析系统，将1ml PPA HyperCel混合模式介质装填于Tricorn5/50层析柱中，用8倍柱体积的磷酸盐缓冲液A2充分平衡层析柱后，开始上样，上样量控制为380mg/ml介质，流速为100cm/h。当样品上完后，继续用平衡缓冲液冲洗至基线，收集整个流穿峰，经过液相色谱检测（SEC-HPLC如附图5所示），即为目的蛋白。之后通过0.1M柠檬酸溶液进行洗脱，洗脱液即为结合在柱上的聚集体及其他杂质，最后通过1M NaOH溶液来清洗层析柱。整个过程的色谱图如附图4所示。

[0043] 实施例4 rHSA纯化后杂质含量的测定

[0044] 实施例2、3纯化后所得rHSA的聚集体含量通过液相色谱柱TSKgel G3000SWXL（30×7.8）来分析检测，使用系统为Agilent HPLC系统。流动相为50mM PB，300mM NaCl，pH7.0，检测波长为280nm。充分平衡液相柱至基线稳定后，进样，进样体积为50微升，流速为0.5ml/min。HCP含量采用标准Elisa方法测定。实施例2、3纯化后所得样品的测定结果如表1所示。

[0045] 实施例5 待纯化样品重组肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白（TNFR-Fc融合蛋白）的制备

[0046] TNFR-Fc融合蛋白的平均等电点约为4.8，通过中国仓鼠卵巢细胞（CHO）培养表达，采用离心和深层过滤进行发酵液的澄清处理。利用AKTA explorer 100层析系统，将80 ml MabSelect SuRe亲和介质装填于XK26/20层析柱中，用5倍柱体积的平衡缓冲液（20mM Tris，150mM NaCl，pH7.4）充分平衡层析柱后，以150cm/h的线速度和25mg/ml的动态载量开始上含有TNFR-Fc融合蛋白的澄清料液，上样结束后，继续用上述平衡缓冲液冲洗，待280nm紫外吸收回到基线后，用5倍体积的高盐缓冲液（20mM Tris，1.0 M NaCl，pH7.4）清洗，然后用3倍体积的平衡缓冲液洗涤，最后用洗脱缓冲液（50mM柠檬酸盐缓冲液，pH3.5）洗脱TNFR-Fc融合蛋白，并收集洗脱液。蛋白样品的SEC-HPLC色谱如附图6所示，横坐标为蛋白质出峰时间，其中聚集体蛋白于13.8min出峰，目的蛋白于15.9min出峰。将洗脱液保持在pH3.6下、2小时做病毒灭活，接着用pH8.0的2M Tris缓冲液中和至pH7.0，以防止蛋白的酸不稳定降解。

[0047] 实施例6 混合模式层析介质Capto Adhere纯化TNFR-Fc融合蛋白[0048] 配置磷酸盐缓冲液B1：50mM PBS，350mM NaCl，pH7.5，通过装有G25凝胶过滤介质的层析柱将实施例5的洗脱液，即待纯化样品进行缓冲液交换。利用AKTA explorer 100层析系统，将1ml Capto Adhere混合模式介质装填于Tricorn5/50层析柱中，用8倍柱体积的磷酸盐缓冲液B1充分平衡层析柱后，开始上样，上样量控制为280mg/ml介质，流速为100cm/h。当样品上完后，继续用平衡缓冲液冲洗至基线，收集整个流穿峰，经过液相色谱检测（SEC-HPLC如附图8所示），即为目的蛋白。之后通过0.1M柠檬酸溶液进行洗脱，洗脱液即为结合在柱上的聚集体及其他杂质，最后通过1M NaOH溶液来清洗层析柱。整个过程的色谱图如附图7所示。

[0049] 实施例7 混合模式层析介质PPA HyperCel纯化TNFR-Fc融合蛋白[0050] 配置磷酸盐缓冲液B2：20mM PBS，200mM NaCl，pH6.5，通过装有G25凝胶过滤介质的层析柱将实施例5的洗脱液，即待纯化样品进行缓冲液交换。利用AKTA explorer 100层析系统，将1ml PPA HyperCel混合模式介质装填于Tricorn5/50层析柱中，用8倍柱体积的磷酸盐缓冲液B2充分平衡层析柱后，开始上样，上样量控制为200mg/ml介质，流速为100cm/h。当样品上完后，继续用平衡缓冲液冲洗至基线，收集整个流穿峰，经过液相色谱检测（SEC-HPLC如附图10所示），即为目的蛋白。之后通过0.1M柠檬酸溶液进行洗脱，洗脱液即为结合在柱上的聚集体及其他杂质，最后通过1M NaOH溶液来清洗层析柱。整个过程的色谱图如附图9所示。

[0051] 实施例8 混合模式层析介质HEA HyperCel纯化TNFR-Fc融合蛋白[0052] 配置磷酸盐缓冲液B3：50mM PBS，300mM NaCl，pH6.5，通过装有G25凝胶过滤介质的层析柱将实施例5的洗脱液，即待纯化样品进行缓冲液交换。利用AKTA explorer 100层析系统，将1ml HEA HyperCel混合模式介质装填于Tricorn5/50层析柱中，用8倍柱体积的磷酸盐缓冲液B3充分平衡层析柱后，开始上样，上样量控制为150mg/ml介质，流速为100cm/h。当样品上完后，继续用平衡缓冲液冲洗至基线，收集整个流穿峰，经过液相色谱检测（SEC-HPLC如附图11所示），即为目的蛋白。之后通过0.1M柠檬酸溶液进行洗脱，洗脱液即为结合在柱上的聚集体及其他杂质，最后通过1M NaOH溶液来清洗层析柱。

[0053] 实施例9 TNFR-Fc融合蛋白纯化后杂质含量的测定

[0054] 实施例5-8纯化后所得的TNFR-Fc融合蛋白的聚集体含量通过液相色谱柱TSKgel G3000SWXL（30×7.8）来分析检测，使用系统为Agilent HPLC系统。流动相为50mM PB，200mM NaCl，pH7.0，检测波长为280nm。充分平衡液相柱至基线稳定后，进样，进样体积为
50微升，流速为0.5ml/min。HCP含量及Protein A含量采用标准Elisa方法测定。实施例
5-8所得样品的测定结果如表2所示。

[0055] 表1 混合模式层析法以过载方式纯化rHSA结果

[0056]介质 回收率（%） SEC-HPLC纯度（%） HCP含量（ppm）
粗分离样品 --- 97.4% 15.4
Capto Adhere 96% 99.6% 1.2
PPA HyperCel 94% 99.2% 0.9

[0057] 表2 混合模式层析法以过载方式纯化TNFR-Fc融合蛋白结果

[0058]

[0059] 表1、2结果表明，利用混合模式层析技术，采用过载方式，能够有效的纯化酸性蛋白药物，降低产品的聚集体、HCP及Protein A残留等污染性杂质，提高终产物的质量，纯度可达99%以上，回收率90%以上；本发明能一步有效的纯化酸性重组蛋白药物，缩短了工艺流程，提高产率，降低生产成本，同时具有稳定性好、过程控制指标明确、适合规模化生产等特点。