一种食品安全型红曲色素的生产方法

摘要

本发明公开了一种食品安全型红曲色素的生产方法，包括将红曲霉菌进行斜面种子培养，液体种子培养，发酵培养，其中发酵培养过程中加入转化剂，所述的转化剂选自如下的一种或多种：胡萝卜素、维生素C、黄腐酸、EDTA-2Na。本发明方法制取的红曲色素中桔霉素含量大幅度降低，具有有安全性高，操作简便，简单易行，高效等优点。

权利要求

1.一种食品安全型红曲色素的生产方法，包括将红曲霉菌进行斜面种子培养，液体种子培养，发酵培养，其特征在于：发酵培养24h后，按100mg/L的比例在发酵液中分次加入转化剂，所述的转化剂为胡萝卜素。

2.根据权利要求1所述食品安全型红曲色素的生产方法，其特征在于所述斜面种子培养的步骤为：将红曲霉菌接种于固体斜面培养基，于32℃恒温培养5天，得到斜面一级种子；所述固体斜面培养基的配方为：葡萄糖6%，蛋白胨2%，琼脂3%，pH5.5~6。

3.根据权利要求1所述食品安全型红曲色素的生产方法，其特征在于所述液体种子培养的步骤为：取培养后的斜面种子管一支，用生理盐水将菌体及孢子洗脱至100mL生理盐水中，按10%的接种量接种到二级液体种子培养基，在250ml三角瓶，装液量为100ml，加20颗玻璃珠，于200rpm, 28℃- 32℃培养24h-48h，得液体二级种子；所述二级液体种子培养基的配方为：大米粉3%，硝酸钠0.5%，磷酸二氢钾0.25%，七水硫酸镁0.1%。

4.根据权利要求1所述食品安全型红曲色素的生产方法，其特征在于所述发酵培养的步骤为：将液体二级种子按6-10%的接种量接种到发酵培养基中，在250ml三角瓶，装液量为100ml，于32℃，200rpm培养6d-8d；在发酵培养24h - 96h后，按100mg/L的比例在发酵液中分次加入所述转化剂；所述发酵培养基的配方为：大米粉9%，硝酸钠0.5%，磷酸二氢钾

0.25%，七水硫酸镁0.1%。

说明书

一种食品安全型红曲色素的生产方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程与技术领域，具体涉及一种食品安全型红曲色素的生产方法。

背景技术

[0002] 红曲色素在中国有悠久的历史，色素有安全性高、对热稳定、对物质染色能力好、色调鲜红、质量稳定和价格低廉的优点，是人工合成色素和其它天然色素所不能比的。但是，红曲色素生产的过程中会有桔霉素伴随产生，桔霉素是一种真菌毒素，具有肾毒性，毒性比较明显，可引起实验动物的肾脏肿大、尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状。因此，产铜生产工艺显然降低了天然红曲色素的安全性。

[0003] 目前，降低桔霉素的方法主要集中在发酵工艺优化，菌种诱变筛选，基因工程三个层面。Blanc等首先研究了不同的氮源对桔霉素影响，但是降低桔霉素的同时也影响了色素的产生。Hassan等将红曲酶在不同的通气和搅拌条件下进行液态发酵, 发现随着通气量的增加或搅拌速度的提高，菌体的生物量和次级代谢产物的产量都有所增加, 而桔霉素的增加比例要大于红曲色素的增加比例。近年来, 科研人员逐步将重点放在对红曲桔霉素合成的相关基因和酶的研究上, 这样有利于深入理解红曲桔霉素的合成途径, 为从根本上控制红曲中桔霉素含量提供了基础理论和技术手段。但是，从基因的手段控制桔霉素不可避免的要对红曲的基因进行改造，这就使原本安全的天然色素变成了现在比较敏感的转基因色素。另外，还有部分研究人员利用化学方法脱去桔霉素，例如采用H2O2进行脱毒，虽然通过处理可以完全脱毒，但也会不同程度影响红曲色素的质量。如果找到能刺激红曲霉细胞释放活性氧，并在胞内活性氧清除系统中产生复合酶的转化剂，而又不影响色素红曲质量和安全性，从而可以从根本上解决色素红曲桔霉素污染的瓶颈问题。

发明内容

[0004] 鉴于现有技术的不足，本发明通过比较红曲霉菌细胞中活性氧释放和胞内活性氧清除系统中的SOD酶活性变化，研究活性氧的产生与色素、桔霉素合成的关系，得到转化剂抑制桔霉素生成或促进桔霉素无毒转化的机理，从而提供一种桔霉素含量低的食品安全型红曲色素的生产方法。

[0005] 本发明的目的是这样实现的：

[0006] 一种食品安全型红曲色素的生产方法，包括将红曲霉菌进行斜面种子培养，液体种子培养，发酵培养，其中发酵培养过程中加入转化剂，所述的转化剂选自如下的一种或多种：胡萝卜素、维生素C、黄腐酸、EDTA-2Na。

[0007] 优选地，所述食品安全型红曲色素的生产方法，其中在发酵培养24h - 96h后，按0.2-100mg/L的比例在发酵液中分次加入所述转化剂。

[0008] 进一步优选地，所述斜面种子培养的步骤为：将红曲霉菌接种于固体斜面培养基，于32℃恒温培养5天，得到斜面一级种子；所述固体斜面培养基的配方为：葡萄糖6%，蛋白胨2%，琼脂3%，pH5.5~6。

[0009] 进一步优选地，所述液体种子培养的步骤为：取培养后的斜面种子管一支，用生理盐水将菌体及孢子洗脱至100mL生理盐水中，按10%的接种量接种到二级液体种子培养基，在250ml三角瓶，装液量为100ml，加20颗玻璃珠，于200rpm, 28℃- 32℃培养24h-48h，得液体二级种子；所述二级液体种子培养基的配方为：大米粉3%，硝酸钠0.5%，磷酸二氢钾0.25%，七水硫酸镁0.1%。

[0010] 进一步优选地，所述发酵培养的步骤为：将液体二级种子按6-10%的接种量接种到发酵培养基中，在250ml三角瓶，装液量为100ml，于32℃，200rpm培养6d-8d；在发酵培养24h - 96h后，按0.2-100mg/L的比例在发酵液中分次加入所述转化剂；所述发酵培养基的配方为：大米粉9%，硝酸钠0.5%，磷酸二氢钾0.25%，七水硫酸镁0.1%。

[0011] 本发明首次进行了红曲菌株发酵过程中桔霉素定向转化及转化机理的研究，在发酵过程中分别分次添加转化剂，检测了不同发酵时间细胞产生次级代谢产物色素、桔霉素和细胞内超氧化物歧化酶及自由基的产生情况，阐明了这些转化因子引起细胞内酶活的变化及其细胞次级代谢产物桔霉素降低的原因。通过对比加入不同转化因子的发酵液色价及桔霉素的检测值，比较发现三种转化因子对色价都有不同程度的提高，其中加入转化因子B和C，色价分别提高了50%左右。几种转化因子对桔霉素含量的影响很明显，桔霉素分别下降了94.77%、94.26%、96.23%，达到了理想的效果，实现了食品安全型红曲色素的定向转化。经过对红曲霉细胞内SOD酶活性和产生的自由基的测定，比较发现添加了转化剂A、B和C的发酵液SOD酶活性相对较高，自由基大幅度的增加，这与桔霉素大幅度的降低现象相符，说明转化剂的添加，刺激红曲霉细胞释放活性氧，促进了细胞内部产生更多的自由基，起到了类似激发子的作用，改变了胞内的氧化还原酶系统，从而表现为培养过程中产生较多的SOD酶，促使了桔霉素的合成量减少，由于转化剂为食品添加剂，安全无毒，且不同程度提高了色素红曲的色价，保证了红曲色素的质量和安全性，从而从根本上了解决色素红曲桔霉素污染的瓶颈问题。

[0012] 现有的降低桔霉素的方法有基因敲除，酸碱处理等，与这些方法相比，本发明及的红曲色素生产方法制取的红曲色素中桔霉素含量大幅度降低，具有有安全性高，操作简便，简单易行，高效等优点。

附图说明

[0013] 图1．红曲霉菌细胞内SOD、自由基对桔霉素的影响曲线图。

[0014] 图2．实施例1中转化剂A对红曲细胞内SOD、自由基及桔霉素的影响曲线图。

[0015] 图3．实施例2中转化剂B对红曲细胞内SOD、自由基及桔霉素的影响曲线图。

[0016] 图4．实施例3中转化剂C对红曲细胞内SOD、自由基及桔霉素的影响曲线图。

[0017] 图5．实施例4 中转化剂D对红曲细胞内SOD、自由基及桔霉素的影响曲线图。

[0018] 具体实施实例

[0019] 本发明所用原料大米为早籼稻，菌种为实验室从红曲米中筛选出的菌种，转化剂A为胡萝卜素，转化剂B为维生素C，转化剂C为黄腐酸，转化剂D为EDTA-2Na。以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

[0020] 实施例1

[0021] （1）将红曲霉菌接种于固体斜面培养基，于32℃恒温培养5天，得到斜面一级种子，固体斜面培养基：葡萄糖6%，蛋白胨2%，琼脂3%，pH5.5~6；

[0022] （2） 取培养后的斜面种子一支，用生理盐水将菌体及孢子洗脱至100ml生理盐水中，按10%的接种量接种到二级液体种子培养基，在250ml三角瓶，装液量为100ml，加20颗玻璃珠，于200rpm，32℃培养24h-48小时，二级种子培养基为：大米粉3%，硝酸钠0.5%，磷酸二氢钾0.25%，七水硫酸镁0.1%，乳酸调pH5.5~6；

[0023] （3）将培养48 h 后的二级液体种子按6-10%的接种量接种到发酵培养基中，在300ml三角瓶，装液量为100ml，于32℃，200rpm培养6d，发酵培养基为：大米粉9%，硝酸钠
0.5%，磷酸二氢钾0.25%，七水硫酸镁0.1%，乳酸调pH5.5~6；

[0024] （4）将培养24h后的发酵液中分次加入100µL 100mg/ml的转化剂A；

[0025] （5）在发酵过程中，分别在12h、36h、60h、84h、108h、132h、144h、156h、168h、192h取出样品测定色价、桔霉素、超氧化物歧化酶（SOD）和自由基。结果参见图2。

[0026] 实施例2

[0027] 步骤（1）-（3）与实施例1的方法中（1）-（3）相同。

[0028] （4）将培养24h后的发酵液中分次加入100µl 2mg/ml的转化剂B；

[0029] （5）在发酵过程中，分别在12h、36h、60h、84h、108h、132h、144h、156h、168h、192h取出样品测定色价、桔霉素、超氧化物歧化酶（SOD）和自由基。结果参见图3。

[0030] 实施例3

[0031] 步骤（1）-（3）与实施例1的方法中（1）-（3）相同。结果参见图4。

[0032] （4）将培养 24h后的发酵液中分次加入100ul 5mg/ml转化剂C。

[0033] （5）在发酵过程中，分别在12h、36h、60h、84h、108h、132h、144h、156h、168h、192h各取出一瓶测定色价、桔霉素、超氧化物歧化酶（SOD）和自由基。结果参见图4。

[0034] 实施例4

[0035] 步骤（1）-（3）与实施例1的方法中（1）-（3）相同。

[0036] （4）将培养 24h后的发酵液中分次加入100ul 3.72mg/ml转化剂D。

[0037] （5）在发酵过程中，分别在12h、36h、60h、84h、108h、132h、144h、156h、168h、192h各取出一瓶测定色价、桔霉素、超氧化物歧化酶（SOD）和自由基。结果参见图5。

[0038] 对比实施例

[0039] 除了在发酵培养过程中不加入任何转化剂，其他步骤均同于实施例1。

[0040] 红曲发酵液色价的测定采用分光光度计法；桔霉素含量测定依据国家标准红曲类产品中桔青霉素的测定标准（GB/T 5009.222 - 2008），采用反相高效液相HPLC-荧光检测器（RP-HPLC-FLD）检测。超氧化物歧化酶的测定采用氮蓝四唑还原法；自由基的测定采用羟胺氧化的方法。

[0041] 不同的转化剂对红曲发酵过程影响不同，通过对比加入不同转化剂的发酵液色价及桔霉素的检测值（见表1），可以很明显的看到四种转化剂对红曲色素都有所提高，其中加入转化剂A，B，C的效果都很好，色价提高了将近50%左右，但加入D的色价却降了一点。另外，几种转化剂对桔霉素含量的影响都很明显，分别下降了82.1%、95.32%、93.36%、91.69%。综合考虑桔霉素及色价，确定转化剂B为最优转化剂。

[0042] 表1. 色价及桔霉素测定结果（发酵144h）

[0043]

[0044] 经过对SOD酶活性及自由基的测定（见图1），我们可以清晰的看到没有加入转化剂的发酵液，自由基的含量在0-84h之间，缓慢增加，到84h达到一个峰值，而SOD酶活性在0-60h却成下降趋势，之后缓慢上升，这说明自由基的产生诱导了SOD酶活性的升高。再看桔霉素的变化趋势，在0-108h之间非常的平缓，几乎没有什么桔霉素的产生，但当自由基出现高峰之后，桔霉素在108h以后迅速增加，144h达到峰值，此时自由基亦再一次达到峰值，SOD却处于低谷，168h降到开始时水平，这说明如果在不加入转化剂的条件下，如过我们延长培养时间到168h以后，SOD酶活性会有小幅度升高，桔霉素会在红曲自身的作用下下降，所以在生产色素的时候，桔霉素的含量不稳定，主要是因为发酵周期问题。在平时的液态发酵过程中，一般的发酵时间在144h左右，桔霉素正值高峰所以以往的红曲色素的桔霉素均较高。而加入转化剂后我们可以在任何时候停止发酵而不影响桔霉素的含量。由上所述，充分的说明了桔霉素的产生，自由基起着非常重要的激发子作用。

[0045] 通过图1，对比其余几幅加了转化剂的检测图，我们发现图2中也在桔霉素产生之前自由基达到了一个峰值，但在产生桔霉素的时候，SOD酶活性达到了峰值，自由基却处在低谷，经检测桔霉素要远远低于对照组桔霉素的含量。而通过图3、图4，我们进一步验证了桔霉素产生要靠自由基的激发这个结论，因为我们看到，在这两幅图中，在0-108h自由基均没有产生峰值，所以缺少了产生桔霉素的激发子，经检测桔霉素确实产量非常的少。而在图5中，转化剂D是一种SOD酶活性抑制剂，D的加入极大地抑制了SOD酶活性，从而失去了清除自由基的能力，使自由基在84-156h之间基本保持恒定，没有波动，维持在一个较高的水平，这说明当在发酵过程中，如果SOD如果一直处于一个很低的活性，同样可以降低桔霉素的产生，但同时也影响色素的积累。

[0046] 因此，我们证实了在红曲液态发酵过程中桔霉素的产生与自由基的含量及SOD酶活性有密切的关联，要想控制桔霉素，一定要控制自由基的含量，保持SOD酶活性。转化剂的加入保证了红曲色素的质量和安全性，从而从根本上了解决色素红曲桔霉素污染的瓶颈问题。