用于前列腺癌早期诊断的引物对、探针和试剂盒

摘要

本发明属免疫学领域，涉及一种用于前列腺癌早期诊断的三组引物对、三个DNA探针和试剂盒。所述三组引物对分别具有SEQIDNO:1和SEQIDNO:4、SEQIDNO:2和SEQIDNO:5以及SEQIDNO:3和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。三个DNA探针在3’端均标记有生物素，并且分别具有SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9所示的核苷酸序列，序列中*位置上的氨基酸自由基上接有发光基团。所述前列腺癌早期诊断试剂盒含有上述三组引物对、逆转录酶和RNA聚合酶以及其上涂布有抗生蛋白链菌素，且该抗生蛋白链菌素上接有上述DNA探针的固相载体。本发明通过转录介导扩增技术检测人体TMPRSS2:ERG、PCA3、PSA基因的表达水平，以判断前列腺癌发生的风险。

权利要求

1.一种前列腺癌早期诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有容器a1，容器a1中装有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列、用于检测TMPRSS2:ERG基因表达水平的启动子引物；

容器a2，容器a2中装有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列、用于检测TMPRSS2:ERG基因表达水平的反向引物；

容器b1，容器b1中装有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列、用于检测PCA3基因表达水平的启动子引物；

容器b2，容器b2中装有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列、用于检测PCA3基因表达水平的反向引物；

容器c1，容器c1中装有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列、用于检测PSA基因表达水平的启动子引物；

容器c2，容器c2中装有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列、用于检测PSA基因表达水平的反向引物；

容器d，容器d中装有逆转录酶和RNA聚合酶的混合液；以及固相载体，所述固相载体上涂有抗生蛋白链菌素，所述抗生蛋白链菌素上接有如SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的DNA探针，所述SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列上的*位置接有氨基酸自由基，所述氨基酸自由基上接有发光基团，所述SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的

3’端标记有生物素，所述三组引物对及相应的探针通过转录介导扩增技术来检测人体体内TMPRSS2:ERG、PCA3、PSA基因的表达水平，以判断前列腺癌发生的风险。

2.如权利要求1所述的前列腺癌早期诊断试剂盒，其特征在于：所述固相载体为96孔板。

3.如权利要求1所述的前列腺癌早期诊断试剂盒，其特征在于：所述抗生蛋白链菌素上接有DNA探针的发光基团为吖啶酯。

4.如权利要求1所述的前列腺癌早期诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括：容器e，容器e中装有由已知拷贝数的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA的mRNA转录物组成的标准品；和容器f，容器f中装有由已知拷贝数的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA的mRNA转录物组成的对比品。

5.如权利要求1所述的前列腺癌早期诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括：容器g，容器g中装有mRNA提取液。

6.如权利要求1所述的前列腺癌早期诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括：容器h，容器h中装有杂交液；

容器i，容器i中装有选择液；

容器j，容器j中装有显色液。

说明书

用于前列腺癌早期诊断的引物对、探针和试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属免疫学领域，涉及一种用于前列腺癌早期诊断的引物对、探针和试剂盒。

背景技术

[0002] 前列腺癌是男性常见病和多发病。目前常用的前列腺癌早期诊断方法有：直肠指诊、超声引导前列腺穿刺活检和影像学诊断等，这些方法都存在一定的局限性，直肠指诊是一种非特异的检查方法，只能作为前列腺癌的一种筛查方法；部分穿刺活检准确性差，如组织用苏木精-伊红染色法检测结果提示肿瘤为阴性而被诊断为前列腺良性病变的患者，实际却患有前列腺癌；影像学诊断同样存在缺陷，如磁共振成像的相关检查技术费用昂贵难以普及应用，CT在前列腺癌的早期诊断上没有特别突出的优势等。

[0003] 生物指标的基因表达水平现已成为疾病诊断的新方向。临床上最常用的前列腺癌肿瘤标志物是血清前列腺特异抗原 （PSA），尽管血清 PSA 的检测可以发现早期的前列腺癌，但是检测血清PSA的方法特异性不高，特别是PSA值处于4~10ng/mL检测灰区的病人，活检阳性率仅有20.4%。

[0004] 目前，前列腺癌抗原3基因（PCA3）被认为是前列腺癌最特异的基因，它在正常前列腺组织中呈低表达，在前列腺肿瘤中表达量显著增高，在其他正常组织、肿瘤组织中均不表达。另外还有跨膜丝氨酸蛋白酶2基因和成红细胞特异性转化基因相关基因的融合基因（TMPRSS2:ERG）对诊断前列腺癌的特异性也很高，只是灵敏度偏低。当前，对于前列腺癌生物指标的基因表达水平的检测正由对特异性不高的PSA基因表达水平的检测转向对特异性较高的PCA3、TMPRSS2:ERG等基因表达水平的检测。但是最常用的仍是实时聚合酶链式反应技术（RT-PCR），虽然RT-PCR的检测灵敏度高，但对设备和诊断试剂要求比较苛刻，试剂成本比较高，而且需要具有专业技能的人员去操作并且解读结果，普及性差。而且一般仅以单个生物指标的表达水平作为前列腺癌诊断依据。这种单指标诊断存在容易漏诊或者误判以及准确度不高的问题。

发明内容

[0005] 本发明的第一个目的是提供一种用于前列腺癌早期诊断的三组引物对，该三组引物对用于采用转录介导扩增技术检测人体跨膜丝氨酸蛋白酶2基因和成红细胞特异性转化基因相关基因的融合（TMPRSS2:ERG）、前列腺癌抗原3（PCA3）、血清前列腺特异抗原（PSA）基因的表达水平。该三个生物指标联合，可以提高前列腺癌早期诊断的准确率，能克服仅检测单个生物指标的基因表达水平容易出现漏诊或者误判以及准确率低的问题。

[0006] 本发明解决以上技术问题采取的技术方案是：所述用于前列腺癌早期诊断的三组引物对，其第一组引物对具有SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；第二组引物对具有SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；第三组引物对具有SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，所述三组引物对通过转录介导扩增技术来检测人体体内TMPRSS2:ERG、PCA3、PSA基因的表达水平，以判断前列腺癌发生的风险。

[0007] 本发明的第二个目的是提供用于前列腺癌早期诊断的三个DNA探针，用于采用固定化杂交保护法定量检测TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA基因的表达水平，以提高前列腺癌早期诊断中生物指标表达水平检测的准确性和操作的方便性。

[0008] 解决以上技术问题采取的技术方案是：所述前列腺癌早期诊断的三个DNA探针，在3’端均标记有生物素，并且分别具有SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，且该SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列中*位置接有氨基酸自由基，并且该氨基酸自由基上接有发光基团。

[0009] 上述发光基团是吖啶酯。

[0010] 本发明的第三个目的是提供上述用于前列腺癌早期诊断的DNA探针的制备方法。

[0011] 解决以上技术问题采取的技术方案是：在3’端标记有生物素、且具有SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的DNA探针中*位置的氨基酸自由基上接上发光基团——吖啶酯，具体步骤如下：

[0012] 第一步，将吖啶酯溶于二甲基亚砜；

[0013] 第二步，在水的参与下，溶有二甲基亚砜的吖啶酯与干燥的上述3’端标记有生物素、且具有SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的DNA探针在20~45 °C、pH6~9条件下反应20~60 min，再用赖氨酸中止反应。

[0014] 第三步，加入醋酸钠和糖原，混匀后加入无水乙醇，并在0°C以下反应5 min~10 h，离心除去上清，保留沉淀物。

[0015] 第四步，沉淀物用水溶解后，用反相高效液相色谱纯化。

[0016] 本发明的第四个目的是提供一种前列腺癌早期诊断试剂盒，该试剂盒能够用转录介导扩增技术和固定化杂交保护法快速地定量检测人体体内TMPRSS2:ERG和PCA3基因表达水平。由于TMPRSS2:ERG和PCA3基因均是前列腺癌特异性高的基因，因此利用该双指标联合诊断早期前列腺癌能提高前列腺癌早期的诊断准确率，而利用转录介导扩增技术和固定化杂交保护法检测TMPRSS2:ERG和PCA3基因的表达水平，需要以PSA基因的表达水平为基准值，因此本试剂盒中也包括检测人体体内PSA基因表达水平的诊断试剂。

[0017] 解决以上技术问题采取的技术方案是：所述前列腺癌早期诊断试剂盒含有，[0018] 容器a1，容器a1中装有用于检测TMPRSS2:ERG基因表达水平的启动子引物，该启动子引物具有SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列；

[0019] 容器a2，容器a2中装有用于检测TMPRSS2:ERG基因表达水平的反向引物，该反向引物具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

[0020] 容器b1，容器b1中装有用于检测PCA3基因表达水平的启动子引物，该启动子引物具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

[0021] 容器b2，容器b2中装有用于检测PCA3基因表达水平的反向引物，该反向引物具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

[0022] 容器c1，容器c1中装有用于检测PSA基因表达水平的启动子引物，该启动子引物具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

[0023] 容器c2，容器c2中装有用于检测PSA基因表达水平的反向引物，该反向引物具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

[0024] 容器d，容器d中装有逆转录酶和RNA聚合酶的混合液；以及

[0025] 固相载体，该固相载体上涂有抗生蛋白链菌素，该抗生蛋白链菌素上接有上述标记有吖啶酯和生物素的DNA探针。

[0026] 上述固相载体可以是96孔板。

[0027] 上述试剂盒中还包括容器e，容器e中装有由已知拷贝数的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA的mRNA转录物组成的标准品。

[0028] 上述试剂盒中还包括容器f，容器f中装有由已知拷贝数的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA的mRNA转录物组成的对比品。

[0029] 上述试剂盒中还包括容器g，容器g中装有mRNA提取液。

[0030] 上述试剂盒中还包括容器h，容器h中装有杂交液。

[0031] 上述试剂盒中还包括容器i，容器i中装有选择液。

[0032] 上述试剂盒中还包括容器j，容器j中装有显色液。

[0033] 该前列腺癌早期诊断试剂盒，利用的是转录介导扩增技术以及固定化杂交保护法。相比RT-PCR，转录介导扩增技术可以在低温下和一个试管内进行高拷贝地扩增TMPRSS2:ERG、PCA3和PSA的mRNA。扩增出的TMPRSS2:ERG、PCA3和PSA的mRNA可以又作为下一轮扩增的自身模板，这样在15~30 min内可将TMPRSS2:ERG、PCA3和PSA的mRNA扩10
增10 倍左右，从而有利于提高TMPRSS2:ERG和PCA3基因表达水平的灵敏度。转录介导扩增后的mRNA通过杂交到标记有吖啶酯和生物素的DNA探针上，这样后续便非常方便。当标记有吖啶酯和生物素的DNA探针和病人体内的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA基因结合形成双链以后，吖啶酯发光基团被保护；而没有进行杂交的单链记有吖啶酯和生物素的DNA探针上的吖啶酯发光基团被水解，无法再发光。而且双链上吖啶酯发光基团的光信号可以被普通光检测仪检测到，通过发光信号强弱的检测，以PSA基因表达水平作为基准值，可以方便、灵敏、低成本地检测病人体内的TMPRSS2:ERG和PCA3的基因表达水平。由于该试剂盒可以同时诊断PCA3和TMPRSS2:ERG两个基因的表达水平，从而极大提高了前列腺癌的诊断准确性。

具体实施方式

[0034] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

[0035] 本发明是通过转录介导扩增技术对人体内的PCA3和TMPRSS2:ERG两个基因的表达水平进行定量检测，并以PSA基因的表达水平为基准值，为前列腺癌的早期筛查、预后和制定治疗方案提供依据。

[0036] 转录介导扩增技术原理如下：

[0037] 转录介导扩增技术是利用RNA聚合酶和逆转录酶在42等温反应条件下扩增RNA，该技术要针对靶序列设计一对特异性引物―启动子引物和反向引物，其中启动子引物上具有T7RNA聚合酶识别的启动子序列，启动子引物与靶序列结合后，在反转录酶的作用下进行反转录反应，形成RNA-DNA杂交分子。反转录酶所具有的核糖核酸酶H活性可以水解RNA-DNA杂交分子，形成单链DNA，该单链DNA含有T7RNA聚合酶识别的启动子序列。然后反向引物与单链DNA结合，通过反转录合成双链DNA。T7RNA聚合酶结合在启动子上，以DNA为模板进行转录，由一分子DNA模板可以得到100~1000拷贝转录本，这些转录本又进入反应，作为转录介导扩增的起始模板，重复上述步骤。在转录介导扩增反应中，产物RNA呈指10
数增长，在15~30min内可将靶序列扩增10 倍左右。反应完成后，可用杂交保护试验对RNA产物进行检测。检测方法是先用吖啶酯标记的DNA探针与产物进行杂交，如探针不能和产物杂交，则会被选择性除去，所以用光度计检测为阴性，如果探针与产物中的靶序列杂交，则探针上的吖啶酯为DNA双螺旋所保护而不被水解，所以光度计检测为阳性，而且杂交探针的化学发光强度与靶核酸的量成正比，由此可以对RNA进行定量。
实施例

[0038] 一、引物对

[0039] 根据上述转录介导扩增技术原理，及美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的基因的参考序列，分别设计检测设计的分别用于检测TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA基因的表达水平的引物对，均具有启动子引物和反向引物，其中：

[0040] 用于检测TMPRSS2:ERG基因表达水平的引物对为：

[0041] 启动子引物（SEQ ID NO：1）

[0042] AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACGAGCGCGGCAGGAAGCCTTATCAGTT

[0043] 反向引物（SEQ ID NO：4）

[0044] AGCCAGGTGTGGCGTTCCGTA

[0045] 用于检测PCA3基因表达水平的引物对：

[0046] 启动子引物（SEQ ID NO：2）

[0047] AAA TTAA TACGACTCACTAT AGGGAGACTCCACACACACAGGAAGCACAA

[0048] 反向引物（SEQ ID NO：5）：

[0049] TCTAATGTCCTTCCCTCACAAGCG

[0050] 用于检测PSA基因表达水平的引物对：

[0051] 启动子引物（SEQ ID NO：3）

[0052] AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGCCCACTGCATCAGGAACAAA

[0053] 反向引物（SEQ ID NO：6）：

[0054] AGCTGTGGCTGACCTGAAATACCT

[0055] 二、标记有吖啶酯和生物素的DNA探针

[0056] 发明人根据上述转录介导扩增技术原理和固定化杂交保护法，设计了分别用于检测TMPRSS2:ERG、PCA3、PSA基因的表达水平的标记有吖啶酯和生物素的DNA探针，分别如下：

[0057] 用于检测TMPRSS2:ERG基因表达水平的标记有吖啶酯和生物素的DNA探针（SEQ ID NO：7）：

[0058] GGCAGGAAG*CCTTATCAGTTGTGAGTaaaaaaaaaaaaaaa/iUniAmM//3Bio/[0059] 用于检测PCA3基因表达水平的标记有AE和生物素的DNA探针（SEQ ID NO：8）：

[0060] AAGGAAGCACAG*AGATCCCTGGGAGAAAaaaaaaaaaaaaaaa/iUniAmM//3Bio/[0061] 用于检测PSA基因表达水平的标记有AE和生物素的DNA探针（SEQ ID NO：9）：

[0062] AGCTGCCCACT*GCATCAGGAACAAAAaaaaaaaaaaaaaaa/iUniAmM//3Bio/[0063] 上述三个标记有吖啶酯和生物素的DNA探针中的iUiAmM的意思是该核苷酸序列经过内部氨基酸改性，在序列中*位置接有氨基酸自由基，该自由基上结合有吖啶酯发光基团。上述三个标记有吖啶酯和生物素的DNA探针中的3Bio意思是在上述DNA探针的核苷酸序列的3’端标记有生物素（Biotin），该生物素可以与涂布在96-孔板上的抗生蛋白链菌素结合。

[0064] 三、标记有吖啶酯和生物素的DNA探针的制备方法

[0065] 所述标记有吖啶酯和生物素的DNA探针的制备方法，是分别在上述3’端标记有生物素、且具有SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序的DNA分子探针中*位置的氨基酸自由基上接上发光基团吖啶酯，具体步骤如下：

[0066] 第一步，吖啶酯标记反应

[0067] 将干燥的3’端标记有生物素的DNA探针与3 µL 双蒸水、1 µL 1mol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 （pH 8.0）溶液、4 µL 二甲基亚砜、2 µL 25mmol/L 吖啶酯二甲基亚砜溶液一起混匀后，离心2 min，收集的上清液于37 °C 下反应20 min后，依次加入3.0 µL25mmol/L 吖啶酯二甲基亚砜溶液、1.5 µL 双蒸水、0.5 µL 1mol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 （pH 8.0），混匀并离心2 min，收集的上清液在37�C下反应20 min后，加入5倍于上述反应液体积的赖氨酸溶液，在室温反应5 min以中止吖啶酯标记反应。

[0068] 上述赖氨酸溶液的配制方法是：将赖氨酸用 0.1 mol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（pH 8.0）配制成0.125 mol/L的赖氨酸4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液，再与等体积的二甲基亚砜混合。

[0069] 第二步，乙醇初步纯化

[0070] 在上述第一步中用赖氨酸溶液中止反应后的终反应液中加入30µL 3 mol/L醋酸钠（pH 5.0）、245 µL纯净水、5 µL糖原，振荡后再加入640 µL无水乙醇，置冰上反应5~10 min，或者在-20�C放置12 h，再15,000 rpm离心5 min，舍弃上清，加入200 µL纯净水溶解沉淀物，得到用乙醇初步纯化的标记有吖啶酯和生物素的DNA探针样品。

[0071] 第三步，反相高效液相色谱纯化

[0072] 将第二步收集的初步纯化的标记有吖啶酯和生物素的DNA探针样品用反相高效液相色谱纯化，使用的反相高效液相色谱柱为Vydac C4 反相柱，即Vydac公司生产的300A TP系列色谱柱中的C4键合硅胶色谱柱，洗脱缓冲液为0.1 mol/L醋酸三乙胺和乙腈，洗脱梯度为10~15%（质量百分比浓度）的乙腈以1 mL/min的流速洗脱25 min，洗脱液在260 nm检测。

[0073] 将上述制备好的标记有吖啶酯和生物素的DNA探针固定在涂有抗生蛋白链菌素的96孔板上，其方法是：将从反相高效液相色谱柱上收集到的标记有吖啶酯和生物素的DNA探针样品用杂交液稀释1000~2000倍，然后按每孔1~5µL的添加量添加到涂有抗生蛋白链菌素的96孔板上，在4�C轻微振荡40 min，然后再用杂交液冲洗两次，风干即可。

[0074] 上述杂交液为：230 mmol/L 氢氧化锂、10 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸、20 mmol/L乙二胺四乙酸、100 mmol/L丁二酸、1.2 mol/L氯化锂、2%二烷基硫酸锂、15 mmol/L二硫二吡啶（pH 4.7）。

[0075] 四、试剂盒

[0076] 试剂盒能够用转录介导扩增技术和固定化杂交保护法快速地定量检测人体体内TMPRSS2:ERG和PCA3基因的表达水平。

[0077] 该试剂盒包括：

[0078] 容器a1，容器a1中装有用于检测TMPRSS2:ERG基因表达水平的启动子引物，该启动子引物具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

[0079] 容器a2，容器a2中装有用于检测TMPRSS2:ERG基因表达水平的反向引物，该反向引物具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

[0080] 容器b1，容器b1中装有用于检测PCA3基因表达水平的启动子引物，该启动子引物具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

[0081] 容器b2，容器b2中装有用于检测PCA3基因表达水平的反向引物，该反向引物具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

[0082] 容器c1，容器c1中装有用于检测PSA基因表达水平的启动子引物，该启动子引物具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

[0083] 容器c2，容器c2中装有用于检测PSA基因表达水平的反向引物，该反向引物具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

[0084] 其中启动子引物以200 nmol/L 的浓度混合于TMA混合物I中，该TMA混合物I包括40 mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH7.5）、20 mmol/L 氯化镁、17.5 mmol/L 氯化钾、2 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸、 50 g/L 聚维酮。反向引物以1.2 mmol/L的浓度混合于TMA混合物Ⅱ中，该TMA混合物Ⅱ包括80 mmol/L 羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH 7.5）、32mmol/L氯化镁、14.8 mmol/L氯化钾、16 mmol/L核糖核苷三磷酸、100 g/L 聚维酮。

[0085] 容器d，容器d中装有逆转录酶和RNA聚合酶的混合液，其中逆转录酶为1000单位的莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶，RNA聚合酶为600单位的T7RNA聚合酶；以及[0086] 96孔板，该96孔板上涂布有抗生蛋白菌素，该抗生蛋白菌素与标记有吖啶酯和生物素的DNA探针相连接。

[0087] 容器e，容器e中装有由已知拷贝数的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA的mRNA转录物组成的标准品。

[0088] 容器f，容器f中装有由已知拷贝数的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA的mRNA转录物组成的对比品。

[0089] 容器g，容器g中装有mRNA提取液。该mRNA提取液包括Trizol LS液、氯仿、异丙醇、乙醇、DEPC水。其中Trizol LS液为本领域技术人员公知的试剂，由苯酚、异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、醋酸钠、柠檬酸钠配制而成；

[0090] DEPC水是本领域公知识试，“DEPC”即二乙基焦碳酸酯，DEPC水是指含0.1%DEPC的水，即在1000mL双蒸水中加入DEPC原液1mL，摇匀过夜。

[0091] 容器h，容器h中装有杂交液，该杂交液为230 mmol/L 氢氧化锂、10 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸、20 mmol/L乙二胺四乙酸、100 mmol/L丁二酸、1.2 mol/L氯化锂、2%二烷基硫酸锂、15 mmol/L二硫二吡啶（pH 4.7）。

[0092] 容器i，容器i中装有选择液，选择液为600 mmol/L 硼酸、182 mmol/L 氢氧化钠、1%聚乙二醇辛基苯基醚。

[0093] 容器j，容器j中装有显色液，显色液为0.1%双氧水、0.001 mol/L硝酸、1mol/L氢氧化钠。

[0094] 使用该试剂盒检测人体内TMPRSS2:ERG、PCA3基因的表达水平时，检测样是尿液，每次检验均设阴性和阳性对照。具体的检测方法是：

[0095] 第一步，病人尿液中mRNA的提取

[0096] 在1.5mL微量离心管中加入病人尿液100 µL~500 µL，再加入Trizol LS液500 μL，充分混匀，室温放置10 min，加入200 μL氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管使溶液充分乳化，室温放置10 min，在4°C、以13000 r/min的速度离心15min，将上层液移入另一干净的微量离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管以充分混匀，室温放置10 min，再在4℃、以13000 r/min的速度离心15min，弃去上清，沉淀即为mRNA提取物，该沉淀加1 mL 75%乙醇，冻存于-70°C，可保存一年，或者在加1 mL 75%乙醇后，继续在4°C以8000r/min的速度离心10 min，弃去上清，沉淀在超净台中干燥 5min，加入1 mL DEPC处理水，于-20℃保存，可保存1个月左右。

[0097] 上述DEPC处理水也是本领域公知试剂，DEPC处理水指在1L蒸馏水中加入DEPC 1 mL，配制成含0.1% DEPC的水，猛烈振摇后，在室温静置4小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC，DEPC可分解为CO2和乙醇。

[0098] 第二步，转录介导扩增mRNA

[0099] 取第一步中mRNA提取物 2 µL~10 µL和48 µl上述TMA混合物I，TMA混合物I中混合有200 nmol/L TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA基因的启动子引物，然后在20 °C 反应30 min；加入25 µL 上述TMA 混合物 II，TMA 混合物 II中混合有1.2 mmol/L TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA基因的反向引物，在94 °C 反应5 min，冷却到室温，静置5 min后，加入 25 µL 1000单位莫洛尼（氏）鼠白血病病毒逆转录酶和600单位T7 RNA聚合酶混合液，在40°C扩展反应75 min。

[0100] 第三步，杂交反应

[0101] 用10 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH 7.0）按照100 µl/孔的量清洗以上固定有标记有吖啶酯和生物素的DNA探针的96孔板，并重复三次。然后将第二步中扩增物和15µl上述杂交液混合，在60�C静置15min，然后每个样品加入75 µl选择液，在60�C静置10 min，最后在每个样品中加入100 µl显色液，显色的信号通过光度计记录。

[0102] 第四步，结果计算

[0103] 标准品和对比品由已知拷贝数的TMPRSS2:ERG、PCA3以及PSA的mRNA的转录物组成。为建立标准曲线，每个浓度的PCA3/PSA，或者TMPRSS2:ERG/PSA都有三个点，然后取平均。

[0104] 标准曲线为: y=a+bX

[0105] 其中：y为光度计读数；X为mRNA的拷贝数；a和b为常数，通过标准品确定。

[0106] 通过该标准曲线可以得到样品中的PCA3和TMPRSS2:ERG以及PSA相对于的mRNA的拷贝数。再分别用PCA3和TMPRSS2:ERG的mRNA拷贝数值除于PSA的mRNA拷贝数值，其比值再乘以1000，即为相应的PCA3和TMPRSS2:ERG诊断指标，通过这两个诊断指标的数值可以判断病人得前列腺癌风险的高低，即

[0107] PCA3评分=

[0108] TMPRSS2:ERG评分=

[0109] 其中PCA3mRNA、TMPRSS2:ERGmRNA、PSAmRNA分别表示PCA3、TMPRSS2:ERG、PSA的mRNA拷贝数。

[0110] 如果PCA3评分的正常范围为：25~35；TMPRSS2/ERG评分的正常范围为：27~40。如果PCA3评分高于25~35和TMPRSS2/ERG评分高于27~40，则病人的样品为阳性，患有前列腺癌的可能性非常高；否则为阴性，患有前列腺癌的可能性低。

[0111] 发明的优点是：该前列腺癌早期诊断试剂盒，利用的是转录介导扩增技术对病体内的生物指标的基因表达水平进行迅速扩增，以提高检测灵敏度。与RT-PCR相比，转录介导扩增技术操作更简单，条件更温和，可以在低温下进行高拷贝地扩增，扩增效率高，可以10
在15~30 min内可将待检生物指标扩增10 倍左右，因此提高了后续检测的灵敏度。

[0112] 另外本发明还通过固定化杂交保护法检测病人体内TMPRSS2:ERG、PCA3基因的表达水平，并以PSA基因的表达水平为基准值。这种固定化杂交保护法是将扩增后的mRNA杂交到标记有吖啶酯和生物素的DNA探针上，该DNA探针是固定在96孔板上的，这使后续检测只需在96孔板中进行即可，非常方便。当标记有吖啶酯和生物素的DNA探针和病人体内的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA基因结合形成双链以后，吖啶酯发光基团被保护；而没有进行杂交的单链记有吖啶酯和生物素的DNA探针上的吖啶酯发光基团被水解，无法再发光。而且双链上吖啶酯发光基团的光信号可以被普通光检测仪检测到，通过发光信号强弱的检测，以PSA基因表达水平作为基准值，可以方便、灵敏、低成本地检测病人体内的TMPRSS2:ERG和PCA3的基因表达水平。