阻断H5N1禽流感病毒进入的L-亮氨酸衍生物及其制备方法

摘要

本发明公开了具有阻断H5N1禽流感病毒进入的L-亮氨酸衍生物，为3,4-二羟基苯甲酰亮氨酸甲酯和3,4-二羟基苯乙酰亮氨酸甲酯。3,4-二羟基苯甲酰亮氨酸甲酯由3,4-二羟基苯甲酸与L-亮氨酸甲酯经缩合制得；3,4-二羟基苯乙酰亮氨酸甲酯是以3,4-二羟基苯乙酸为起始原料，先后采用硫酸二甲酯、二氯亚砜处理后与L-亮氨酸甲酯缩合，再经去甲基化反应制得。本发明化合物3,4-二羟基苯甲酰亮氨酸甲酯和3,4-二羟基苯乙酰亮氨酸甲酯对InfluenzastrainA/VietNam/1194/2004禽流感病毒有较强的抑制活性，而且其机制是作用于H5N1病毒感染细胞的进入阶段，是一种新的抗禽流感病毒进入抑制剂，可作为药物预防或治疗H5N1禽流感。

权利要求

1.一种具有抗H5N1病毒活性的L-亮氨酸衍生物，为3,4-二羟基苯甲酰亮氨酸甲酯或

3,4-二羟基苯乙酰亮氨酸甲酯，结构式分别为：

2.权利要求1所述的3,4-二羟基苯甲酰亮氨酸甲酯的制备方法，其特征在于：（1）将乙基替-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺的无水二氯甲烷溶液和1-羟基苯并三氮唑的无水二氯甲烷溶液分别加入到3,4-二羟基苯甲酸的无水二氯甲烷溶液中，滴加三乙胺溶液，控制反应温度在0℃，搅拌反应半小时；

（2）另取L-亮氨酸甲酯盐酸盐溶于无水二氯甲烷中，滴加三乙胺溶液并抽滤，再将滤液L-亮氨酸甲酯的二氯甲烷溶液加入到步骤（1）反应液中，缓慢升温至30℃反应6小时；

（3）反应完成后，蒸去二氯甲烷，残余物用乙酸乙酯溶解，再先后用1wt%盐酸溶液、

4wt%碳酸氢钠水溶液和蒸馏水洗涤乙酸乙酯层至中性，干燥，并经柱层析得3,4-二羟基苯甲酰亮氨酸甲酯。

3.根据权利要求2所述的3,4-二羟基苯甲酰亮氨酸甲酯制备方法，其特征在于，

3,4-二羟基苯甲酸与乙基替-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺摩尔比为1：1～10；3,4-二羟基苯甲酸与1-羟基苯并三氮唑摩尔比为1：1～10；3,4-二羟基苯甲酸与三乙胺摩尔比为

1：1～10；3,4-二羟基苯甲酸与L-亮氨酸甲酯盐酸盐摩尔比为1：1～5。

4.权利要求1所述的3,4-二羟基苯乙酰亮氨酸甲酯的制备方法,其特征在于：步骤一，合成3,4-二甲氧基苯乙酸甲酯

向3,4-二羟基苯乙酸的无水丙酮溶液中加入适量碳酸钾固体，再缓慢滴加硫酸二甲酯无水丙酮溶液，加热回流6小时，反应结束后，抽滤除去碳酸钾颗粒，蒸去丙酮后，残余物用乙酸乙酯溶解，洗涤，干燥，柱层析得3,4-二甲氧基苯乙酸甲酯；

步骤二，合成3,4-二甲氧基苯乙酰亮氨酸甲酯

称取3,4-二甲氧基苯乙酸甲酯于三口瓶中，加入二氯甲烷及30wt%的氢氧化钠水溶液，室温剧烈搅拌40分钟，停止反应，分离得到水层，调节水层pH值为2-3，萃取，干燥，蒸去乙酸乙酯得到白色粉末状固体；将其加入到二氯亚砜中，并滴加1滴DMF，加热回流3小时制得3,4-二甲氧基苯乙酰氯，用无水二氯甲烷溶解待用；

向L-亮氨酸甲酯盐酸盐无水二氯甲烷溶液中，滴加三乙胺溶液，搅拌反应后抽滤除去不溶盐，得L-亮氨酸甲酯的二氯甲烷滤液，再加入三乙胺溶液，在-20℃条件下，滴加新制的3,4-二甲氧基苯乙酰氯的二氯甲烷溶液，搅拌反应8小时；反应结束后，抽滤除去盐酸盐固体，滤液洗涤，干燥，蒸发二氯甲烷得残余物，用乙醚与二氯甲烷重结晶，制得3,4-二甲氧基苯乙酰亮氨酸甲酯；

步骤三，合成3,4-二羟基苯乙酰亮氨酸甲酯

在-30℃氮气保护条件下，向3，4-二甲氧基苯乙酰亮氨酸甲酯的无水二氯甲烷溶液中，缓慢滴加三溴化硼的二氯甲烷溶液，搅拌反应4小时；反应结束后，将溶液倒入冰水混合物中，剧烈搅拌，静置，用乙酸乙酯萃取，洗涤，干燥，柱层析得3,4-二羟基苯乙酰亮氨酸甲酯。

5.根据权利要求4所述的3,4-二羟基苯乙酰亮氨酸甲酯制备方法，其特征在于：步骤一中，所述的3,4-二羟基苯甲酸与所述硫酸二甲酯的摩尔比为1：1～10；

步骤二中，每克3,4-二甲氧基苯乙酸甲酯采用10ml30%氢氧化钠水溶液；每克3,4-二甲氧基苯乙酸甲酯采用2毫升二氯亚砜；3,4-二甲氧基苯乙酸甲酯与L-亮氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为1：1～5；

步骤三中，3，4-二甲氧基苯乙酰亮氨酸甲酯与三溴化硼的摩尔比为1：1～10。

6.权利要求1所述的L-亮氨酸衍生物在制备预防或治疗H5N1禽流感药物中的应用。

说明书

阻断H5N1禽流感病毒进入的L-亮氨酸衍生物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于药物化学领域，涉及可阻断H5N1禽流感病毒进入的L-亮氨酸衍生物及其制备方法。

背景技术

[0002] 自人类第一例禽流感感染H5N1死亡病例于1997年中国香港报道以来，至2006年3月该病毒已在中国、越南、泰国等7个国家流行，176例感染H5N1型禽流感病毒患者中至少
97人死亡，死亡率为55%，具有高致病性和高死亡率的特点。目前在我国流行的A型高致病禽流感病毒为H5N1亚型。如今，全世界正面临着禽流感大流行的危险。要警惕禽流感病毒可能发生抗原性变异，或它与当前人群中流行的A型流感病毒发生基因重配，形成重配株，而造成人间流感暴发，甚至大流行，引起严重的公共卫生问题。

[0003] 疫苗接种一直占据着流感预防的首要地位，但由于流感病毒的抗原变异能力强，个体免疫力的差异，疫苗的保护率并不高，而且疫苗只对已知的流感病毒亚型有预防作用，由于抗原性漂移或抗原性转换产生后对新型流感病毒无效，生产的疫苗难以与将要流行的病毒株抗原型一致。禽流感大面积发生，而抗流感病毒药物发展缓慢，有效药物品种较少。过去曾对A型高致病禽流感病有效的金刚烷胺已产生耐药性，而进口的达菲是目前国内外唯一有效的药物，国内外也有耐药性报道，因此寻找结构新颖，新靶点和高效低毒的抗禽流感病毒药物是摆在药物工作者面前的重大课题。

[0004] 在抗病毒筛选实验中，我们发现3,4-二羟基苯甲酸和3,4-二羟基苯乙酸无明显抗H5N1活性，但分别用L-亮氨酸甲酯修饰后，具有一定的抗H5N1作用，而且Time-of-addition assay实验结果表明新化合物作用于H5N1病毒对细胞感染的进入阶段；血凝素抑制实验则进一步表明新化合物并非作用于血凝蛋白HA1亚基上，而有可能作用于HA2亚基，这些结果表明新化合物可能是一种新的抗H5N1进入抑制剂，可作为先导化合物开展进一步研究，目前还无相关研究报道。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的及技术问题是提供一种具有抗H5N1病毒活性且毒性小的L-亮氨酸衍生物及其制备方法。

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案。

[0007] 首先，本发明提供了一种具有抗H5N1病毒活性的L-亮氨酸衍生物，为3,4-二羟基苯甲酰 亮氨酸甲酯或3,4-二羟基苯乙酰亮氨酸甲酯，结构式分别为：

[0008]

[0009] 其次，本发明还提供了上述具有抗H5N1病毒活性的L-亮氨酸衍生物制备方法。 [0010] 一、3,4-二羟基苯甲酰亮氨酸甲酯的制备方法：

[0011] （1）将乙基替-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDCI）的无水二氯甲烷溶液和1-羟基苯并三氮唑（HOBT）的无水二氯甲烷溶液分别加入到3,4-二羟基苯甲酸的无水二氯甲烷溶液中，滴加三乙胺溶液，控制反应温度在0℃，搅拌反应半小时；

[0012] （2）另取L-亮氨酸甲酯盐酸盐溶于无水二氯甲烷中，滴加三乙胺溶液并抽滤，再将滤液L-亮氨酸甲酯的二氯甲烷溶液加入到步骤（1）反应液中，缓慢升温至30℃反应6小时；

[0013] （3）反应完成后，蒸去二氯甲烷，残余物用乙酸乙酯溶解，再先后用1wt%盐酸溶液、4wt%碳酸氢钠水溶液和蒸馏水洗涤乙酸乙酯层至中性，干燥，并经柱层析得3,4-二羟基苯甲酰亮氨酸甲酯。

[0014] 上述方案中，3,4-二羟基苯甲酸与乙基替-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺摩尔比为1：1～10；3,4-二羟基苯甲酸与1-羟基苯并三氮唑摩尔比为1：1～10；3,4-二羟基苯甲酸与三乙胺摩尔比为1：1～10；3,4-二羟基苯甲酸与L-亮氨酸甲酯盐酸盐摩尔比为1：1~5。

[0015] 二、3,4-二羟基苯乙酰亮氨酸甲酯的制备方法：

[0016] 步骤一，合成3,4-二甲氧基苯乙酸甲酯：

[0017] 向3,4-二羟基苯乙酸的无水丙酮溶液中加入适量碳酸钾固体，再缓慢滴加硫酸二甲酯无水丙酮溶液，加热回流6小时，反应结束后，抽滤除去碳酸钾颗粒，蒸去丙酮后，残余物用乙酸乙酯溶解，洗涤，干燥，柱层析得3,4-二甲氧基苯乙酸甲酯；

[0018] 步骤二，合成3,4-二甲氧基苯乙酰亮氨酸甲酯

[0019] 称取3,4-二甲氧基苯乙酸甲酯于三口瓶中，加入二氯甲烷及30wt%的氢氧化钠水溶液，室温剧烈搅拌40分钟，停止反应，分离得到水层，调节水层pH值为2-3，萃取，干燥，蒸去乙酸乙酯得到白色粉末状固体；将其加入到二氯亚砜中，并滴加1滴DMF，加热回流3小时制得3,4-二甲氧基苯乙酰氯，用无水二氯甲烷溶解待用；

[0020] 向L-亮氨酸甲酯盐酸盐无水二氯甲烷溶液中，滴加三乙胺溶液，搅拌反应后抽滤除去不溶盐，得L-亮氨酸甲酯的二氯甲烷滤液，再加入三乙胺溶液，在-20℃条件下，滴加新制的 3,4-二甲氧基苯乙酰氯的二氯甲烷溶液，搅拌反应8小时；反应结束后，抽滤除去盐酸盐固体，滤液洗涤，干燥，蒸发二氯甲烷得残余物，用乙醚与二氯甲烷重结晶，制得3,4-二甲氧基苯乙酰亮氨酸甲酯；

[0021] 步骤三，合成3,4-二羟基苯乙酰亮氨酸甲酯

[0022] 在-30℃氮气保护条件下，向3，4-二甲氧基苯乙酰亮氨酸甲酯无水二氯甲烷溶液中，缓慢滴加三溴化硼的二氯甲烷溶液，搅拌反应4小时；反应结束后，将溶液倒入冰水混合物中，剧烈搅拌，静置，用乙酸乙酯萃取，洗涤，干燥，柱层析得3,4-二羟基苯乙酰亮氨酸甲酯。

[0023] 上述方案，

[0024] 步骤一中，所述的3,4-二羟基苯甲酸与所述硫酸二甲酯的摩尔比为1：1～10； [0025] 步骤二中，每克3,4-二甲氧基苯乙酸甲酯采用10ml 30%氢氧化钠水溶液；每克3,4-二甲氧基苯乙酸甲酯采用2毫升二氯亚砜；3,4-二甲氧基苯乙酸甲酯与L-亮氨酸甲酯的摩尔比为1：1~5；

[0026] 步骤三中，3，4-二甲氧基苯乙酰亮氨酸甲酯与三溴化硼的摩尔比为1：1～10。 [0027] 制备方法的反应式如下。

[0028] 1、3,4-二羟基苯甲酰亮氨酸甲酯反应式：

[0029]

[0030] 2、3,4-二羟基苯乙酰亮氨酸甲酯反应式：

[0031]

[0032] 本发明对制备的L-亮氨酸衍生物进行抗H5N1研究。结果表明本发明所提供的L-亮氨酸衍生物具有较强抗H5N1活性且毒性小的特点，其作用机制是作用于病毒感染细胞的进入阶段，是一种新型小分子抗H5N1病毒进入抑制剂，这些研究结果为寻找新型抗H5N1病毒药物提供了思路，可作为先导化合物开展进一步研究。本发明提供了上述L-亮氨酸衍生物在制备预防或治疗H5N1禽流感药物中的应用。同时本发明也提供了上述L-亮氨酸衍生物作为H5N1病毒进入抑制剂上的用途。

具体实施方式

[0033] 为了更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步的说明： [0034] 实施例13,4-二羟基苯甲酰亮氨酸甲酯的合成

[0035] 取1.00g（6.494×10-3mol）3,4-二羟基苯甲酸于100ml三口瓶中，用10ml无水二-2氯甲烷溶解。另分别称取2.50g（1.300×10 mol）乙基替-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺-2
（EDCI）和1.750g（1.300×10 mol）1-羟基苯并三氮唑（HOBT）于10ml二氯甲烷溶液中，-2
并加入到上述100ml三口瓶，滴加1.8ml(1300×10 mol)三乙胺溶液，控制反应温度在0℃，搅拌反应约半小时。

[0036] 取L-亮氨酸甲酯盐酸盐3g（1.65×10-2mol）于30ml无水二氯甲烷中，滴加2.3ml-2（1.65×10 mol）三乙胺溶液并抽滤。将滤液L-亮氨酸甲酯二氯甲烷溶液加于到上述反应瓶中，缓慢升温至30℃反应6小时。

[0037] 反应完成后，蒸去溶剂，残余物用乙酸乙酯溶解，先后用1%盐酸溶液、4%的碳酸氢钠水溶液和蒸馏水洗涤乙酸乙酯层三次至中性，最后用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯。过滤除去硫酸钠，乙酸乙酯萃取液经浓缩后上硅胶柱，乙酸乙酯：石油醚（1:2）为流动相，收集洗-2脱液，蒸去溶剂后，真空干燥得1.402g（4.988×10 mol）无色油状产物3,4-二羟基苯甲
1
酰亮氨酸甲酯，收率为76.80%。HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.48(s,1H),7.41–6.76(m,3H)，
13
4.23(s,1H),3.68(s,3H),1.68(s,2H),1.37(s 1H),1.18(s,6H)。 C NMR(101MHz,CDCl3)δ
174.02,167.86,148.46,144.28,130.97,128.86,119.85,114.76,65.63,52.51,51.40,41.3+
5,30.57,29.72。ESI-MS,m/z calcd.for C14H19NO5：281.1，Found：304.6[M+Na]。 [0038] 实施例23,4-二羟基苯乙酰亮氨酸甲酯

[0039] 步骤13,4-二甲氧基苯乙酸甲酯的制备方法

[0040] 取3g（17.856×10-3mol）3,4-二羟基苯乙酸固体于100ml三口瓶中，用50ml无-2 -3水丙酮溶解，加入10.8g（7.815×10 mol）碳酸钾固体。另取7.5ml（77.328×10 mol）硫酸二甲酯溶液以无水丙酮稀释，将其缓慢滴加入三口瓶中加热回流6小时。抽滤除去碳酸钾颗粒，蒸去溶剂后，残余物用乙酸乙酯溶解，用饱和食盐水溶液洗涤乙酸乙酯层三次，用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯溶液。过滤除去硫酸钠，乙酸乙酯萃取液经浓缩后上硅胶柱，乙酸乙酯：石油醚 （1:2）为流动相。收集洗脱液，蒸去溶剂后，真空干燥过夜，称量得2.958g-3
（14.079×10 mol）白色固体3,4-二甲氧基苯乙酸甲酯，收率为78.84%。m.p.145-146℃。
-1
IR(KBr,cm )：2925.90，2850.60，1736.15，1590.84，1513.10，1502.39，1460.72，1440.24，
1
1261.14,1140.03，1024.26。H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.81(s,3H),3.87(s,3H),3.86(s,3H
13
),3.69(s,3H),3.56(s,2H)。 C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.27,148.95,148.20,126.45,12
1.41,112.45,111.27,55.88,55.84,51.99,40.69。ESI-MS,m/z calcd.for C11H14O4：210.0，+
Found：232.8[M+Na]。

[0041] 步骤23,4-二甲氧基苯乙酰亮氨酸甲酯的制备

[0042] 称取2.958g（14.079×10-3mol）3,4-二甲氧基苯乙酸甲酯于250ml三口瓶中，加入约50ml的二氯甲烷及30%的氢氧化钠的水溶液30ml，室温剧烈搅拌40分钟，停止反应，分离得到水层，用1%的盐酸溶液调节水层pH值为2-3。乙酸乙酯溶液萃取酸性溶液三次，合并酯层，用无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，并蒸去乙酸乙酯得到白色粉末状固体。将其置于100ml茄形瓶中，加入6ml二氯亚砜，滴加1滴DMF，加热回流3小时，用无水二氯甲烷10ml溶解待用。

[0043] 取6g（3.3×10-2mol）L-亮氨酸甲酯盐酸盐固体，用40ml无水二氯甲烷溶解，滴-2加4.6ml（3.3×10 mol）三乙胺溶液，搅拌反应后抽滤除去不溶盐。将L-亮氨酸甲酯二氯甲烷滤液倒入100ml三口瓶中，加入2ml三乙胺溶液，在-20℃下，滴加新制的3,4-二甲氧基苯乙酰氯的二氯甲烷溶液，搅拌反应8小时。

[0044] 反应结束后，抽滤除去盐酸盐固体，二氯甲烷滤液用1%盐酸溶液洗涤三次，再用蒸馏水洗涤三次至中性，用无水硫酸钠干燥二氯甲烷有机层。过滤除去硫酸钠，蒸去二氯甲烷得残余物，残余物用乙醚与二氯甲烷混合溶剂（1：8）重结晶，得到1.482g-3 1（4.586×10 mol）白色固体3,4-二甲氧基苯乙酰亮氨酸甲酯，收率为48.20%。H NMR(400MHz,DMSO)δ8.48(d,J=8Hz,1H),6.90-6.76(m,3H),4.27(d,J=4Hz,1H),3.73(s,
3H),3.72(s,3H),3.53(s,3H),3.39(s,2H),2.52(s,2H),1.69-1.45(m,1H),0.85(dd,J ＝
13
4Hz,J＝4Hz,6H)。 C NMR(101MHz,CDCl3)δ178.35,175.88,153.61,152.62,133.73,126.13,117.81,116.81,60.67,60.48,57.03,55.42,46.61,29.48,27.91,26.35。ESI-MS,m/z +
calcd.for C17H25NO5：323.2，Found：346.0[M+Na]。

[0045] 步骤33,4-二羟基苯乙酰亮氨酸甲酯的制备

[0046] 取1.00g（3.094×10-3mol）3，4-二甲氧基苯乙酰亮氨酸甲酯化合物于100ml三口烧瓶中，加入30ml无水二氯甲烷使其溶解。在-30℃氮气保护条件下，向反应瓶中缓慢滴加溶于三溴化硼的二氯甲烷溶液1ml，保持反应4小时。

[0047] 反应结束后倒入50ml冰水混合物中，剧烈搅拌。静置分液，水层以60ml乙酸乙酯分3 次萃取，合并有机层，用蒸馏水洗涤三次至中性，用无水硫酸钠干燥二氯甲烷有机层。过滤除去硫酸钠，二氯甲烷溶液经浓缩后上硅胶柱，以乙酸乙酯：石油醚（2:1）为流动相，-3
收集洗脱液，蒸去溶剂，真空干燥过夜，称得0.451g（1.528×10 mol）黄色油状产物3,4-二
1
羟基苯乙酰亮氨酸甲酯，产率49.39%。HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.50（s，1H）,7.06–6.64(m,3H),4.58(s,1H),3.86(s,3H),3.84(s,2H),1.64(s,2H),1.19(s,1H),0.89(dd,J＝ 4Hz,J
13
＝ 4Hz,6H)。 CNMR(101MHz,CDCl3)δ173.68,172.45,147.02,145.16,125.21,122.33,1
14.87,112.33,56.37,52.74,51.78,40.52,24.95,22.84,21.72。ESI-MS,m/z calcd.for +
C15H21NO5：295.1，Found：318.9[M+Na]。

[0048] 实施例3L-亮氨酸衍生物抗禽流感病毒H5N1活性

[0049] 1.实验材料

[0050] （1）病毒：H5N1毒株是Influenza strain A/VietNam/1194/2004，前期测得其效价9
为5×10PFU/ml，感染时用培养基稀释，即80PFU/孔，由武汉大学病毒学国家重点实验室提供。

[0051] （2）细胞：MDCK细胞(中国典型培养物保藏中心来源，MDCK细胞是流感病毒噬斑实验的经典细胞)，武汉大学病毒学国家重点实验室提供。

[0052] （3）阳性对照药：金刚烷胺，武汉大学病毒学国家重点实验室提供。 [0053] （4）样品处理:金刚烷胺和本发明化合物用DMSO配成10mg/ml的母液，使用时用DMSO稀释成相应梯度。

[0054] 2.实验方法

[0055] 2.1细胞毒性实验（MTT分析法）

[0056] MTT分析法以活细胞代谢物还原剂MTT为基础。MTT全称为3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide；汉语化学名为3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑;商品名为噻唑蓝。

[0057] 5mg/ml MTT的配制：称取0.5g MTT粉末，溶于100ml磷酸盐缓冲液(PBS)或者无酚红培养基中，用0.22um滤膜过滤除菌，4℃避光保存。MTT最好现配现用，4℃避光保存两周内有效。或者于-20℃长期冻存，分装成小管，避免反复冻融。

[0058] 三联甲臜溶解液的配制：25g十二烷基磺酸钠(SDS)、250ul浓度为11.6mol/l的盐酸和12.5ml异丁醇，加去离子水定容至250ml即得到三联甲臜溶解液，该溶解液中十二烷基磺酸钠(SDS)的质量百分比为10%、盐酸摩尔浓度为0.012mol/l、丁醇的质量百分比为5%。

[0059] 本细胞毒性实验步骤依次如下：

[0060] （1）将MDCK细胞株消化后用DMEM完全培养基稀释成2×105个/ml，铺入96孔板，100μl/孔,置37℃5%CO2细胞培养箱培养4小时，使细胞充分贴壁；

[0061] （2）将受试本发明化合物母液（10mg/ml）用DMSO梯度稀释，终浓度分别为66.66μg/ml，33.33μg/ml、6.66μg/ml、3.33μg/ml、0.33μg/ml和0.03μg/ml，加入96孔版中，每孔1μl。每个浓度设三个平行孔。对照孔同样设三个平行孔，每孔加1μlDMSO。
另将阳性对照药做同样处理作为对照；

[0062] （3）培养48小时后，去除上清液，单细胞层用灭菌的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗三次；

[0063] （4）每孔加入100μl的MTT与新鲜培养基混合液（MTT终浓度0.5mg/ml），在37℃孵育4小时，使MTT还原为甲臢；

[0064] （5）除去上清液，每孔加100μl三联甲臜溶解液，37℃孵育4小时，使甲臢全部溶解；

[0065] （6）以655nm处的光吸收值为背景，在570nm处测定光吸收值。

[0066] 完成上述实验后，按照以下公式计算细胞死亡率：

[0067] 细胞死亡率（%）＝[1-（加化合物细胞OD值／对照细胞OD值）]×100； [0068] 本发明化合物、阳性对照药的半数毒性浓度（CC50)的计算方法为：以化合物浓度为横坐标，细胞死亡率为纵坐标作图，然后得到50％死亡率时候的化合物浓度，就是CC50，计算结果如表1所示。

[0069] 2.2抗H5N1活性实验

[0070] 将MDCK细胞培养于24孔板中，待细胞长到100％满时，用PBS洗涤2次，按照以下不同方式处理病毒和细胞，每组4个复孔：1.阳性对照孔：将阳性对照药与病毒混匀后直接加入细胞中；2.病毒感染对照：将病毒悬液加入细胞中；3.细胞对照：用DMEM与细胞孵育；4.新化合物处理孔：用本发明化合物和病毒在300μl培养基中混匀后直接加入细胞中。所用培养基不含血清，加入终浓度10μg/ml的胰酶催进感染。本发明化合物用DMSO配成10mg/ml的母液，使用时用DMSO梯度稀释，本发明化合物终浓度分别为33.33μg/ml、6.66μg/ml、3.33μg/ml、0.33μg/ml和0.03μg/ml，每孔加1μl。另将阳性对照药做同样处理作为对照。

[0071] 37℃感染2h后弃上清，用PBS洗涤2次，加入无酚红DMEM培养基和1％琼脂糖的（混合液（预先融化且于37℃保温以避免凝固），该混合液中DMEM和琼脂糖的体积比为1：1，再加入终浓度10μg/ml的胰酶促进感染。正面向上室温放置20-40min，待凝固后倒置于37℃、5％CO2培养箱培养2-4天。待噬斑大而清晰时，用0.5%的结晶紫染色，130μl／孔，避光染色6-8h后用肉眼计数噬斑，每孔计数2遍，结果相同时计数有效，不同时重复计数，直至两遍完全相同时记为有效。每组的噬斑数为3个孔的平均值。

[0072] 完成上述实验后，采用以下公式计算本发明化合物、阳性对照药对病毒感染的抑制率： 抑制率（％）＝［（病毒感染对照组的噬斑数－加化合物组的噬斑数）／病毒感染对照组的噬斑数］×100。

[0073] 本发明化合物、阳性对照药的半数抑制浓度（IC50）的计算方法为：以化合物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，得到50％抑制率时候的化合物浓度，就是IC50,SI为选择性指数，其值为CC50/IC50。上述计算结果见表1。

[0074] 表1L-亮氨酸衍生物抗病毒活性数据

[0075]

[0076] NA:无活性;—:未计算

[0077] 实施例4L-亮氨酸衍生物加药时间与加药顺序对H5N1病毒抑制实验影响（Time-of-Addition Assay）

[0078] 考察L-亮氨酸衍生物作用于病毒感染细胞的阶段，我们采用时间与加药顺序对病毒抑制实验（Time-of-AdditionAssay）进行考察，具体实验如下：

[0079] 首先将MDCK细胞加入至24孔板中，置于37℃5%CO2的细胞培养箱中培养24小时，直至培养至长满单层后，弃除DMEM的生长液，并用PBS洗两次。本实验将各个样品试验组按照病毒感染顺序分为抑制吸附组和抑制复制组。

[0080] 对于抑制吸附组，我们将样品溶液先加入到孔板中，按照随后在加入Influenza strain A/VietNam/1194/2004(H5N1)病毒前4h和2h加入终浓度为20μg/ml的样品溶液500μL。然后将孔板置于5%CO2的37℃细胞培养箱中孵育4h和2h，随后用样品溶液洗3次，再向24孔板中每孔加入500μL的Influenza strain A/VietNam/1194/2004(H5N1)病毒悬浊液（病毒量约80PFU/孔），将24孔板至于37℃恒温箱中孵育2h后，用样品溶液洗3次，最后加入DMEM维持液并至于37℃恒温箱中孵育观察。

[0081] 对于抑制复制组，我们将加入样品溶液的时间不同分为3组。在24孔板中首先向各孔中加入500μl Influenza strain A/VietNam/1194/2004病毒的悬浊液（病毒量约80PFU/孔），静置于37℃恒温箱中使病毒与细胞相互作用2h后，用PBS洗3次，最后以DMEM维持液培养。当病毒与细胞吸附完成后的0h、2h和4h后分别更换为相同浓度的样品溶液各500μL， 将24孔板再静置于37℃恒温箱中继续培养观察。

[0082] 对于每组的实验样品溶液都设一个病毒对照，即不加样品溶液，让病毒与细胞充分作用。保持观察，通过噬斑法来统计个数从而来计算各个样品对细胞病变的抑制率。通过噬斑法我们根据公式抑制率（％）＝［（病毒感染组的噬斑数－样品组的噬斑数）／病毒感染对照组的噬斑数］×100%得到化合物在不同加样时间点对病毒的抑制率。

[0083] 从表2，我们可以看到，在Influenza strain A/VietNam/1194/2004(H5N1)病毒感染MDCK细胞的不同时间阶段分别加入L-亮氨酸衍生物时，发现病毒感染细胞前2小时和4小时时加入L-亮氨酸衍生物无明显抑制活性，而当在病毒感染细胞0时加入其抑制率最强；病毒感染细胞2小时后加入，其抑制活性开始下降；而在4小时后加入，则几乎没有抑制活性，表明L-亮氨酸衍生物作用于病毒感染细胞的进入阶段。即一旦病毒进入靶细胞，L-亮氨酸衍生物不能抑制病毒感染的后续过程。

[0084] 表2.L-亮氨酸衍生物加药时间与加药顺序对H5N1病毒抑制影响

[0085]

[0086] 实施例5L-亮氨酸衍生物对禽流感病毒H5亚型血凝影响实验

[0087] 1试剂配制

[0088] 1.125倍PBS溶液

[0089] 称量2.76g Na2HPO4·12H2O与0.79g NaH2PO4·2H2O固体颗粒于烧杯中，分次加入蒸馏水溶解混匀至100ml定容，即得到25倍PBS溶剂。

[0090] 1.21倍PBS溶液

[0091] 量取上述25倍PBS溶液40ml于烧杯中，再加入8.5g氯化钠颗粒，分次倒入蒸馏水定容至1000ml，再用氢氧化钠稀溶液或盐酸稀溶液调节pH值至7.0-7.2；最后在69kpa的条件下，高压灭菌约二十分钟后，取出溶液冷却待用。

[0092] 1.3阿氏液

[0093] 分别称取葡萄糖固体颗粒2.05g、柠檬酸钠固体颗粒0.8g、柠檬酸固体颗粒0.055g以及氯化钠固体粉末0.42g于烧杯中，加入蒸馏水使其各组分溶解后，将溶液定容至100ml并且调节pH值至6.1，然后在69Kpa 15min高压灭菌，2～8℃保存备用。 [0094] 1.41%鸡红细胞悬液

[0095] 采集健康公鸡的血液30ml并且与等体积阿氏液混合，用pH值为7.2的上述一倍PBS溶液洗涤后，将其以1500rpm/min的转速离心5min，然后弃掉上清液，重复此操作三次，最后将洗涤后的鸡血红细胞用PBS配成1%（V/V）红细胞悬液，2～8℃保存备用。 [0096] 1.5抗原

[0097] 禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原与阳性血清，购自北京康农兴牧科技发展中心。将抗原和血清的冻干粉末加入一倍的PBS溶液2毫升溶解均匀后-20℃保存备用。 [0098] 2血凝试验

[0099] 首先在V型微量反应板中选择第一排孔标记为1-12，在1-12孔的每孔中加入0.025mlPBS，在第l孔中加入0.025ml的抗原溶液，反复抽打3～5次使其混和均匀。然后从第1孔中吸取0.025ml的抗原溶液加入至第2孔中，反复抽打3～5次使其混和均匀。
从第二孔中吸取0.025ml加入至第3孔中，反复抽打3～5次使其混和均匀。如此依次进行对倍稀释至第11孔，最后从第11孔中吸取0.025ml弃去。向1-12孔中的每孔依次加入
0.025ml的PBS溶液，震荡混合均匀后，再依次向每孔中加入0.025ml 1%的鸡红细胞悬液。
最后将V型微量反应板在振荡器上震荡1～2分钟，使反应体系充分混合均匀，最后在室温（20～25℃）下静置30分钟在对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果。其中1-11孔作为抗原实验组，第12孔则为鸡红细胞对照孔。当孵育反应完成后，将V型微量反应板倾斜约
60度，将1-11孔与第12孔对照观察，当红细胞完全无泪珠样流淌(100%凝集)的现象时，此时所对应的抗原最高稀释倍数则为血凝效价。结果判断方法和结果分别见表3和表4。 [0100] 根据上面的血凝HA试验步骤所观察得到的效价为28，故通过HA实验所得效价256
6
除以4即为含4HAU抗原的稀释倍数，即2 倍。

[0101] 表3血凝试验判断方法

[0102]

[0103] 表4血凝实验结果

[0104]

[0105] 3对血凝试验影响

[0106] 首先在V型微量反应板1-12个孔中每个孔中加入0.025ml一倍的PBS溶液。向每列的第1孔中加入新配置的100μg/ml样品溶液各0.025ml，充分鼓吹混匀后，依次吸取0.025ml一号孔中的溶液加入至第2号孔中，轻轻鼓吹混和均匀后，按照同样的操作过程，对各个样品孔依次对倍稀释至第11孔，最后均从每个样品行的第11孔中吸取0.025ml弃去。然后，依次向每个样品行的第1～11孔中加入0.025ml新配置4HAU抗原的PBS溶液，轻轻震荡混合均匀后，在室温（20～25℃）下静置30分钟使样品与抗原充分混合均匀。孵育完成后，向各样品行的第1-12孔中每孔加入1%（V/V）鸡红细胞悬液0.025ml，待轻轻震荡混和均匀后，将V型微量反应板静置于室温（20～25℃）下孵育20～30分钟。其中1-11孔为L-亮氨酸衍生物实验组，12孔为鸡红细胞对照孔。实验结果见表5.

[0107] 从表4和表5中看出，该H5阳性抗原的血凝价为1:256，则1:256为1个血凝单位，1:64为4个血凝单位，即1:64稀释的病毒液为4个血凝单位。加入不同浓度L-亮氨酸衍生物后，对该H5阳性抗原的血凝试验没有影响，说明L-亮氨酸衍生物不是作用于HA的HA1亚基，而可能作用于HA的HA2亚基。