针对乏氧诱导因子-1α的纳米抗体及其编码序列

摘要

本发明公开了针对乏氧诱导因子-1α的纳米抗体及其编码序列，所述抗体是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明的一种针对乏氧诱导因子-1α的纳米抗体能与HIF-1α的PAS-B结构域发生良好地特异性结合。

权利要求

1.一种针对乏氧诱导因子-1α的纳米抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种能够编码根据权利要求1所述的纳米抗体的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有根据权利要求3所述的表达载体。

说明书

针对乏氧诱导因子-1α的纳米抗体及其编码序列

技术领域

[0001] 本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及针对乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)的纳米抗体、编码所述纳米抗体的核苷酸序列、能够表达所述纳米抗体的载体及宿主细胞。

背景技术

[0002] 乏氧是肿瘤普遍存在的现象，细胞乏氧会导致乏氧诱导因子-1α(HIF-1α，hypoxia-induciblefactor-1 alpha)的表达水平显著高于正常组织，HIF-1α与HIF-1β二聚化形成的HIF-1蛋白因子促进血管再生，从而促进肿瘤细胞的繁殖、侵袭、转移并抑制其凋亡。抑制HIF-1α可以促进肿瘤细胞的凋亡和抑制肿瘤细胞的发展转 移 (Semenza GL:Targeting HIF-1 for cancer therapy.Nature reviews Cancer2003,3(10):721-732)。通过阻断HIF-1α通路来治疗肿瘤细胞逐渐受到关注，HIF-1α的PAS-B结构域(Per-Arnt-Sim-B)主要负责HIF-1α与HIF-1β二聚化以及与下游靶基因的结合区（技术参考：To K K,Sedelnikova O A,The phosphorylation status of PAS-Bdistinguishes HIF-1alpha from HIF-2alpha in NBS1 repression.The EMBO journal,2006,25(20):4784-4794）（Lee K,Zhang H,Acriflavine inhibits HIF-1 dimerization,tumor growth,andvascularization.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2009,106(42):17910-17915），因此以HIF-1α的PAS-B结构域为靶标，减少HIF-1(HIF-1α与HIF-1β二聚化形成的及与靶基因结合后才具备调控活性)的含量，从而抑制肿瘤的增殖及转移，为其应用于肿瘤的诊断与治疗奠定基础。

[0003] 纳米抗体（variable domain of the heavy chain of HCAbs，VHH）最初是由比利时科学家在骆驼科动物体内发现的（C.Hamers-Casterman,Naturally occurring antibodies devoid of lightchains,1993,363:446-448）一种天然缺失轻链的重链抗体（heavy-chain antibody,HCAbs）的基础上运用分子生物学手段技术进行抗体工程革命，得到能与抗原结合的重链抗体可变区，而形成的纳米级的抗体分子，其晶体结构直径2.5纳米，长度为4纳米。早期诊断与靶向治疗一直是抗肿瘤研究的主要难题，关键是药物能在体内快速而准确地渗透到肿瘤病灶部位，且对正常组织的损伤降到最低，这就对抗体的亲和性及组织渗透性提出了更高的要求。纳米抗体具有独特的性质如分子量小、组织相容性好、稳定性强、抗原识别能力强、生产易于实现并生产成本低等。因此，在肿瘤的诊断与治疗方面比其他抗体更具优势。近几年，在肿瘤诊断与治疗的研究方面取得了较大的进展。

[0004] 目前，尚没有针对HIF-1α的PAS-B结构域为靶标的特异性纳米抗体的报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种针对乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）的纳米抗体。

[0006] 本发明的第二个目的是提供一种针对乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)的纳米抗体的编码序列。

[0007] 本发明的第三个目的是提供一种表达载体。

[0008] 本发明的第四个目的是提供一种宿主细胞。

[0009] 本发明的技术方案概述如下：

[0010] 一种针对乏氧诱导因子-1α的纳米抗体，所述抗体是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

[0011] 一种能够编码所述针对乏氧诱导因子-1α的纳米抗体的DNA分子，是用SEQ ID NO：2所示的序列。

[0012] 一种表达载体，它含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

[0013] 一种宿主细胞，它含有上述表达载体。

[0014] 本发明的一种针对乏氧诱导因子-1α的纳米抗体能与HIF-1α的PAS-B结构域发生良好地特异性结合。

附图说明

[0015] 图1表达载体pGEX-4T-1-HIF-1α-PAS-B构建流程图。

[0016] 图2是 含 有 构 建 的 重 组 质粒 pGEX-4T-1-HIF-1α-PAS-B的 菌 体 表 达的HIF-1α-PAS-B结构域纯化前后的SDS-PAGE电泳图：M为蛋白分子量标 准(14.4~116.0kDa)，1裂解沉淀，2裂解上清，3穿透峰，4洗脱峰。

[0017] 图3带有纯化标签his的纳米抗体蛋白VHH16的基因电泳图：Nco I和Not I双酶切验证重组载体pET-28-VHH16，M为Trans5K，1为pET-28-VHH16(Nco I和Not I双酶切后)，2为VHH16（VHH16基因全长为433bp：VHH为393bp，由于引入酶切位点及连接而增加的碱基约为40bp）。

[0018] 图4纳米抗体蛋白VHH16诱导表达的全菌SDS-PAGE电泳图：M为预染蛋白分子量标准(10~170kDa)，1为BL21(DE3)(pET-28a(+))诱导产物，2~8：分别是BL21(DE3)(pET-28-VHH16)在IPTG做诱导剂时诱导2h、4h、6h、8h、12h、16h、20h的诱导产物。

[0019] 图5抗体VHH16亲和层析纯化后的SDS-PAGE分析：M为预染蛋白分子量标准(10~170kDa)1为裂解液，2为裂解上清，3为裂解沉淀，4为穿透峰，5~6为洗脱峰（VHH16蛋白分子量约为15kDa）。

具体实施方式

[0020] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述。

[0021] 实施例1

[0022] HIF-1α-PAS-B结构域蛋白的制备过程，其中HIF-1α-PAS-B结构域蛋白为带有GST标签的重组蛋白：

[0023] (1)引物根据HIF-1α-PAS-B结构域在NCBI数据库中的编码基因序列(NCBI ReferenceSequence:NM_001530.3)设计，

[0024] 上游引物HIF-1α-PAS-B+:5’-CGCGGATCCATTCCTTTAGATAGCAAGACTTTC-3’（SEQID NO：3）

[0025] 下游引物HIF-1α-PAS-B-:5’-GCCCTCGAGCTACAAGTCGTGCTGAATAATACCACT-3’（SEQ ID NO：4）

[0026] 在下划线部分引入BamH I、Xho I的限制性酶切位点，以HIF-1α全序列克隆载体pF1KOF-HIF-1α（购买于Kazusa DNA Research Institute）为模板，PCR扩增HIF-1α-PAS-B基因（目的克隆基因序列见SEQ ID NO：5(348bp)，由SEQ ID NO：5序列表达的氨基酸序列见SEQ ID NO：6），连接至pGEX-4T-1（pGEX-4T-1购买于GE healthcare）表达载体，经过基因序列测定，以确定所获得的目的基因序列的正确性。(见图1)[0027] (2)构建成功的基因工程菌BL21(pGEX-4T-1-HIF-1α-PAS-B)及对照菌BL21(pGEX-4T-1)表达带有GST标签的HIF-1α-PAS-B结构域（见图2）和单独的GST蛋白，并将带有GST标签的HIF-1α-PAS-B结构域经过GST-tag亲和层析柱纯化，获得高纯度的目的蛋白。

[0028] 实施例2

[0029] 针对HIF-1α的PAS-B结构域的纳米抗体筛选过程：

[0030] (1)包被抗原：用包被缓冲液（0.05M碳酸盐缓冲液pH 9.6）配制100μg/mL的GST_HIF-1α-PAS-B溶液，用包被缓冲液（0.05M碳酸盐缓冲液pH 9.6）配制100μg/mL的GST溶液；用上述两种溶液分别包被免疫管，静置过夜；GST_HIF-1α-PAS-B溶液包被的免疫管称A管，GST溶液包被的免疫管称B管；

[0031] (2)封闭：弃去上清，用pH为7.4的PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤A管和B管各三次。加入含2%（g/ml）脱脂奶的PBS溶液，37℃静置3h，弃去上清，用PBST(磷酸盐缓冲液，含
0.05％的Tween-20)洗涤A管和B管各三次，再用PBS洗涤A管和B管各三次；

[0032] (3)纳米抗体噬菌体文库的预处理：取300μL 2%（g/ml）脱脂奶的pH为7.4的PBS溶液并向其中加入非免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库（其中非免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库的构建参考文献：Monegal A,Ami D,Martinelli C,Huang H,Aliprandi M,Capasso P，Francavilla C,Ossolengo G,de Marco A:Immunological applications of single-domain llamarecombinant antibodies isolated from a naive library.Protein engineering,design & selection:PEDS 2009,22(4):273-280），保证纳米抗体的12
量为5×10 pfu左右，将上述溶液加入B管中，共孵育1h，得到预处理后的纳米抗体噬菌体文库；

[0033] (4)将B管中的液体转移到A管中，弃B管，A管37℃静置2h；

[0034] (5)洗涤：A管弃去上清，用PBST洗涤三次后用PBS洗涤三次；

[0035] (6)洗脱：向A管中加入1mL 0.1M三乙胺溶液，常温振荡5min。1M Tris-HCl将溶液pH调至7.5，加入6μL质量浓度为0.25%胰蛋白酶水溶液，振荡15min，置于冰上；

[0036] (7)侵染：用A管溶液侵染大肠杆菌TG1（购自New England Biolabs），37℃孵育45min；

[0037] (8)加入辅助噬菌体M13K07（购买于New England Biolabs）浸染TG1，37C孵育45min，产生并纯化噬菌体用于下一轮筛选。

[0038] (9)将经（8）筛选收集到的噬菌体纳米抗体文库按实施例2的步骤再进行2轮的筛选。

[0039] 实施例3

[0040] 用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选HIF-1α-PAS-B特异性单个阳性克隆：

[0041] (1)噬菌体纳米抗体的制备：在进行到第3轮步骤（7）得到的大肠杆菌TG1（购自New EnglandBiolabs）涂平板，挑取96个含噬菌体的单克隆细菌分别接种到96孔板中，37℃培养过夜，以M13K07:TG1=20:1的比例加入辅助噬菌体M13K07，37℃孵育45min，离心，弃上清，重悬菌体，培养过夜。离心，将所得上清待用；

[0042] (2)包被：包被100μg/mL GST_HIF-1α-PAS-B，每孔100μL于新96孔板，4℃静置过夜。同样包被GST作为阴性对照；

[0043] (3)封闭：弃包被液，用pH为7.4的PBS洗三次。每孔加入含有质量浓度为2%的脱脂奶的PBS（pH为7.4）溶液，静置2h；

[0044] (4)弃去封闭液，用PBST洗三次后再用PBS各洗三次。按照反应孔的标号对应加入本实施例步骤（1）制备的噬菌体上清，孵育2h；

[0045] (5)加入酶标二抗：弃去(4）中的溶液，用PBST洗三次和PBS各洗三次。向各反应孔中加入辣根过氧化物酶标记鼠抗M13K07单克隆抗体（二抗），孵育1h；

[0046] (6)加底物显色液：弃去(5）中的溶液，用PBST洗三次后再用PBS各洗三次。向各个反应孔中加入新鲜配制的TMB (2mg/mL TMB乙醇溶液0.5mL；pH为5.5底物缓冲液（0.2MNa2HPO4，0.1M柠檬酸）10mL；0.75%H2O232μL)底物溶液100μL，孵育15min；

[0047] (7)终止反应：向各个反应孔中加入50μL 2M稀硫酸；

[0048] (8)结果判定：用酶标仪于450nm下测各孔OD值。实验组读数大于0.30且大于阴性对照读数1倍以上的噬菌体可以判定为阳性克隆。

[0049] (9)选取Phage ELISA检测结果较为理想的6个(VHH5、VHH6、VHH7、VHH8、VHH16、VHH20)阳性克隆进行了测序分析，获取的片段序列(即纳米抗体的DNA序列)翻译成氨基酸序列分析，结果发现这6个氨基酸序列基本一致，特别是CDR-3区的序列完全一致，只有框架区存在个别氨基酸的差别。将CDR1，CDR2，CDR3序列相同的氨基酸序列视为同一抗体。

[0050] (10)我们选择VHH16（SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，能够表达SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的DNA序列是用SEQ ID NO：2所示的序列）用于后续Anti-HIF-1α纳米抗体的表达、纯化及其检测实验。

[0051] 实施例4

[0052] 特异性纳米抗体重组表达载体质粒pET-28-VHH16的构建：

[0053] (1)提取阳性克隆TG1重组质粒，限制性内切酶Nco I和Not I处理提取VHH16基因；

[0054] (2)将提取的质粒pET-28a(+)（购买于Novagen）用Nco I和Not I双酶切，重组连接形成可表达带his纯化标签的pET-28a_VHH16质粒。酶切验证见图4。

[0055] 实施例5

[0056] 纳米抗体蛋白在大肠杆菌中表达纯化：

[0057] (1)将实施例4所述的含his纯化标签的pET-28a_VHH16质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)（购于TransGen）。

[0058] (2)菌体活化至OD600为0.7时，加入IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）至0.3mM，继续在20℃诱导培养20h（培养时间的条件筛选见图4）。

[0059] (3)离心，收集菌体-20℃冷冻待用。

[0060] (4)加溶菌酶裂解细菌，离心，收上清中可溶性蛋白，经His-tag亲和柱亲和纯化获得纯度较高的抗体蛋白。(见图5)

[0061] 实施例6

[0062] 抗体VHH16生物活性的ELISA鉴定：

[0063] (1)包被抗原：用包被缓冲液将GST_HIF-1α-PAS-B融合蛋白稀释至终浓度为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL(每个浓度做3个平行)，每孔加入100μL，
4℃静置过夜。用同样的方法包被GST和包被缓冲液分别作为阴性对照和空白对照。

[0064] (2)封闭：去包被液，用PBS洗涤三次。每孔加入含有2%（g/ml）脱脂奶的PBS（pH7.4）溶液，静置2h。

[0065] (3)加入实施例5得到的抗体VHH16：弃去封闭液，用PBST洗三次后再用PBS洗涤三次。按照反应孔的标号对应加入VHH16抗体(3~4μg/mL)，孵育2h。

[0066] (4)加入anti-his单抗：弃去VHH16蛋白，用PBST洗三次后再用PBS洗涤三次。向各反应孔中加入稀释的anti-his单抗，孵育1h。

[0067] (5)加入酶标二抗：弃去anti-his单抗，用PBST洗三次后再用PBS洗涤三次。向各反应孔中加入稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗属抗血清，孵育1h。

[0068] (6)加底物显色液：弃去上清，用PBST洗三次后再用PBS洗涤三次。向各个反应孔中加入新鲜配制的TMB底物溶液，孵育15min。

[0069] (7)终止反应：向各个反应孔中加入2M稀硫酸终止液。

[0070] (8)结果判定：在450nm下用酶标仪测各孔OD值。实验组读数大于0.30且大于阴性对照读数1倍以上的噬菌体可以判定为阳性克隆。

[0071] (9)实验数据

[0072]

[0073] 实验数据表明：实验组/阴性对照组的读数在2倍以上，说明抗体VHH16与HIF-1α的结构域PAS-B之间有特异性的结合。