一种姬松茸提取物及其制备方法

摘要

本发明涉及一种从姬松茸中提取得到的多糖提取物及其制备方法，其分子量在50万至150万之间，制备方法为，用浓度为95％乙醇提取后，弃去提取液，残渣加水温浸，期间超声波辅助提取，水提液醇沉，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白，然后用sephadex凝胶柱层析分离，其具有显著的药理活性，具有显著的抗肿瘤和增强免疫作用，其较现有技术中提及的其他多糖作用有显著增强。

权利要求

1.一种姬松茸多糖提取物，其特征在于是姬松茸水溶性多糖，是从姬松茸子实体或人工培养的菌丝体中提取得到，分子量在50万～150万之间的多种多糖复合物，是采用如下方法制备得到的：取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至100目，用5倍量浓度为

95％乙醇提取后，弃去提取液，残渣加4倍量水60℃温浸，期间每次超声波30min辅助提取，重复提取3次，水提液合并后，加乙醇至浓度为75％，沉淀20小时；其中5％姬松茸粗提物溶液，按多糖浓度的2％加入中性蛋白酶，调节pH值为5.0，40℃下酶解60min，升温至80℃灭活酶活性，然后以Sevag法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag除去蛋白，重复2次；

然后用sephadex G200凝胶柱层析分离，以0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集平均分子量在

50万和150万之间的组分。

2.一种权利要求1所述姬松茸多糖提取物的制备方法，其特征在于是，取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至100目，用5倍量浓度为95％乙醇提取后，弃去提取液，残渣加4倍量水60℃温浸，期间每次超声波30min辅助提取，重复提取3次，水提液合并后，加乙醇至浓度为75％，沉淀20小时；其中5％姬松茸粗提物溶液，按多糖浓度的2％加入中性蛋白酶，调节pH值为5.0，40℃下酶解60min，升温至80℃灭活酶活性，然后以Sevag法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag除去蛋白，重复2次；然后用sephadex G200凝胶柱层析分离，以0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集平均分子量在50万和150万之间的组分。

说明书

一种姬松茸提取物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药领域，具体涉及一种姬松茸提取物，更具体地本发明涉及一种姬松茸多糖提取物及其制备方法。

背景技术

[0002] 姬松茸又名小松菇、巴西蘑菇、柏拉氏蘑菇，“Agaricus Blazei Murill”、 “Agaricus”、“ABM”或“Himematsutake”。属担子菌亚门层菌纲伞菌目蘑菇（黑伞）科蘑菇（黑伞）属。该菌原产于巴西，1965年日本引入，成功进行了人工栽培，并于1975年开始商业化生产。1992年我国由福建省农科院首次从日本引进姬松茸并栽培成功，目前在福建、江西等省份有大面积的种植。姬松茸含有丰富的蛋白质和多糖，具有极高的营养价值和药用价值，在医药领域和保健食品行业中具有很高的开发应用前景。

[0003] 姬松茸具有浓郁的杏仁香味，美味可口，含有丰富的蛋白质和多糖，营养价值很高。姬松茸菌盖嫩，菌柄脆，口感极好，味纯鲜香，食用价值颇高。新鲜子实体含水分85%～87%；可食部分每100g干品中含粗蛋白40～45g、可溶性糖类38～45g、粗纤维6～8g、脂肪3～4g、灰分5～7g；已测定的17种氨基酸总量为干重的19.22％，其中50.18％为人体必需氨基酸，高于其它食用菌，还含有多种维生素和麦角甾醇。姬松茸营养极其丰富，而且组配合乎人体健康要求，尤其引人注目的是医药保健价值。

[0004] 姬松茸富含多种活性成分，可作为免疫调节剂、抗癌剂、抗突变剂和抗菌物质的来源，因而引起全世界的极大关注，具有广泛的应用价值和前景。多糖类物质是姬松茸众多药理作用组分中的重要一种，作为姬松茸提高免疫力、抗肿瘤活性的成分，与姬松茸的药用功能密切相关。在实际应用中，由于姬松茸经过水煮提取的粗多糖中含有游离的杂蛋白质、色素以及其他一些低分子物质（包括寡糖、一些单糖、盐分等），其中蛋白质含量较高，在药品开发过程中必须将其有效去除方能保证药品的稳定性并防止出现不良反应。因此在姬松茸相关药品开发的实际过程中粗多糖的分离纯化是一个必不可少的步骤。

[0005] 随着姬松茸多糖功能的深入探索，越来越多人对多糖的提取方法进行了研究。目前对多糖的提取方法主要有热水浸提法、溶剂提取法、酶提取法等。这些方法在姬松茸多糖的提取率和粗多糖纯化方面存在问题。

[0006] 目前，现有技术中提取得到的姬松茸多糖主要有两个主要的类型，即分子量为50000的多糖和分子量为2000000的多糖。申请人在研究中发现，上述两种多糖并不是姬松茸中活性最强的多糖。

[0007] 申请人经过大量的研究，发现了姬松茸中活性更强的多糖部分，其具有独特的药理活性。

发明内容

[0008] 本发明涉及一种姬松茸多糖提取物。

[0009] 进一步的，本发明涉及一种姬松茸多糖提取物的制备方法。

[0010] 本发明所述的姬松茸多糖提取物是姬松茸水溶性多糖，是从姬松茸子实体或人工培养的菌丝体中提取得到，分子量在50万～150万之间的多种多糖复合物。

[0011] 进一步的，本发明涉及的姬松茸多糖提取物是分子量在70万～110万之间的多种多糖复合物。

[0012] 更进一步的，本发明涉及的姬松茸多糖提取物是分子量在90万的多糖。

[0013] 更进一步的，本发明涉及的姬松茸多糖提取物是主要以β-（1-3）-D葡聚糖为主链，并有部分β-（1-6）苷键的多糖。

[0014] 更进一步的，所述部分β-（1-6）苷键是分布在主链上，支链上无β-（1-6）苷键的分布。

[0015] 进一步的，本发明所述的姬松茸多糖提取物的制备方法是，取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎，用浓度为95％乙醇提取后，弃去提取液，残渣加水温浸，期间超声波辅助提取，水提液醇沉，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白，然后用sephadex凝胶柱层析分离，收集平均分子量在50万和150万之间的组分。

[0016] 更进一步的，所述姬松茸多糖提取物的制备方法是，取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至60～120目，用2～7倍量浓度为95％乙醇提取后，弃去提取液，残渣加3～6倍量水温浸3次，期间每次超声波30min辅助提取，水提液合并后，加乙醇至浓度为
75％，沉淀20小时，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白，然后用sephadex凝胶柱层析分离，收集平均分子量在50万和150万之间的组分。

[0017] 更进一步的，所述姬松茸多糖提取物的制备方法是，取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至100目，用5倍量浓度为95％乙醇提取后，弃去提取液，残渣加4倍量水60℃温浸，期间每次超声波30min辅助提取，重复提取3次，水提液合并后，加乙醇至浓度为75％，沉淀20小时，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白（5% 姬松茸粗提物溶液，按多糖浓度的2%加入中性蛋白酶，调节pH 值为5.0，40℃下酶解60min，升温至80℃灭活酶活性，然后以Sevag 法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag 除去蛋白，重复2 次），然后用sephadex G200凝胶柱层析分离，以0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集平均分子量在50万和
150万之间的组分。

[0018] 本发明中，采用苯酚—硫酸法测定多糖含量，具体测量方法可参考“曲秀梅,樊英丽. 姬松茸多糖的含量测定[J]. 局解手术学杂志,2004,13(2):141”，在此引入作为参考，经测量，本发明的姬松茸多糖提取物含量达到95％～100％。

[0019] 本发明中，姬松茸多糖经sepharose CL-6B测定分子量分布和纯度，使用葡聚糖制备标准曲线。取5mg溶于1ml蒸馏水中，充分混匀，离心除去杂质，上sepharose CL-6B凝胶柱层析（1.5×90cm），0.9％NaCl溶液洗脱，用苯酚—硫酸法测定糖分布，结果再次显示，提取物的分子量分布于50万～150万之间，或70万～110万之间，或90万。

[0020] 本发明中采用如下方法分析多糖中的单糖组成，样品10mg经2mol/L三氟乙酸120℃封管水解3h，蒸干去除三氟乙酸，加1mg肌醇和0.1mol/L的Na2CO3 1ml，30℃保温
50min，加KBH4 50mg，室温放置1.5h，用25%乙酸中和KBH4，并用阳离子交换树脂除盐，加甲醇干燥，重复3次，将干燥物85℃真空加热2h，加1ml正丙胺和1ml无水吡啶，55℃保温
30min，N2吹干，加0.5ml无水吡啶和0.5ml乙酸酐，90℃保温1h，N2吹干，加1ml无水二氯甲烷，离心，取上清用气相色谱测定。气相色谱法（GC）：仪器：Vavian 3400气相色谱仪附FID检测器，HP3365化学工作站；色谱柱：SE-30 50mm×0.20mm×0.25μm；气化：280℃；检测：280℃；柱温：从130℃（2min），升温10℃/min，至250℃（20min）；载气：高纯氮气。

[0021] 结果显示，单糖主要为葡萄糖、半乳糖和甘露糖。

[0022] 本发明中测定多糖的结构采用如下方法，C13NMR；仪器：INOVA-500；工作频率：125 MHz；测试温度：20℃；累积时间：16h；溶剂：重水。以及红外光谱分析，样品经溴化钾压片，4000～400㎝-1区间扫描红外吸收，用Nicolet360型傅立叶变换红外光谱仪记录红外光谱。结果显示，本发明的姬松茸多糖提取物主链中主要为β-（1-3）-D葡聚糖为主链，并有部分β-（1-6）苷键。并且进一步的，部分β-（1-6）苷键是分布在主链上，支链上无β-（1-6）苷键的分布。

[0023] 本发明经过实验证实，上述姬松茸多糖具有显著的抗肿瘤，增强免疫，降血糖作用，其较现有技术中提取的其他多糖作用有显著增强。更加值得关注的是，本发明的多糖具有非常显著的降血脂作用，而现有技术中的多糖没有降血脂作用（段县平,等.姬松茸多糖降血糖、降血脂作用的研究. 四川畜牧兽医[J]，2005,6:34-35）。

[0024] 进一步的，本发明的提取物还可以作为活性成分与药学上可接受的载体制备成具有治疗肿瘤、糖尿病、高血脂的药物。该药物可以是各种剂型如片剂、颗粒剂、口服液、胶囊剂、丸剂、注射液等。

[0025] 实施例1 取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至100目，用5倍量浓度为95％乙醇提取后，弃去提取液，残渣加4倍量水60℃温浸，期间每次超声波30min辅助提取，重复提取3次，水提液合并后，加乙醇至浓度为75％，沉淀20小时，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白（5% 姬松茸粗提物溶液，按多糖浓度的2%加入中性蛋白酶，调节pH 值为
5.0，40℃下酶解60min，升温至80℃灭活酶活性，然后以Sevag 法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag 除去蛋白，重复2 次），然后用sephadex G200凝胶柱层析分离，以0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集平均分子量在50万和150万之间的部分，浓缩、干燥，即得姬松茸多糖提取物。经测定，其多糖含量为100％；主链中主要为β-（1-3）-D葡聚糖为主链，并有部分β-（1-6）苷键。

[0026] 实施例2 取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至100目，用5倍量浓度为95％乙醇提取后，弃去提取液，残渣加4倍量水60℃温浸，期间每次超声波30min辅助提取，重复提取3次，水提液合并后，加乙醇至浓度为75％，沉淀20小时，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白（5% 姬松茸粗提物溶液，按多糖浓度的2%加入中性蛋白酶，调节pH 值为
5.0，40℃下酶解60min，升温至80℃灭活酶活性，然后以Sevag 法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag 除去蛋白，重复2 次），然后用sephadex G200凝胶柱层析分离，以0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集平均分子量在70万和110万之间的部分，浓缩、干燥，即得姬松茸多糖提取物。经测定，其多糖含量为100％；主链中主要为β-（1-3）-D葡聚糖为主链，并有部分β-（1-6）苷键。

[0027] 实施例3 取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至100目，用5倍量浓度为95％乙醇提取后，弃去提取液，残渣加4倍量水60℃温浸，期间每次超声波30min辅助提取，重复提取3次，水提液合并后，加乙醇至浓度为75％，沉淀20小时，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白（5% 姬松茸粗提物溶液，按多糖浓度的2%加入中性蛋白酶，调节pH 值为
5.0，40℃下酶解60min，升温至80℃灭活酶活性，然后以Sevag 法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag 除去蛋白，重复2 次），然后用sephadex G200凝胶柱层析分离，以0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集平均分子量在90万的部分，浓缩、干燥，即得姬松茸多糖提取物。经测定，其多糖含量为100％；主链中主要为β-（1-3）-D葡聚糖为主链，并有部分β-（1-6）苷键。

[0028] 实施例4 取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至60目，用7倍量浓度为95％乙醇提取后，弃去提取液，残渣加3倍量水60℃温浸，期间每次超声波30min辅助提取，重复提取3次，水提液合并后，加乙醇至浓度为80％，沉淀15小时，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白（5% 姬松茸粗提物溶液，按多糖浓度的2%加入中性蛋白酶，调节pH 值为
5.0，40℃下酶解60min，升温至80℃灭活酶活性，然后以Sevag 法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag 除去蛋白，重复2 次），然后用sephadex G200凝胶柱层析分离，以0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集平均分子量在50万和150万之间的部分，浓缩、干燥，即得姬松茸多糖提取物。经测定，其多糖含量为99％；主链中主要为β-（1-3）-D葡聚糖为主链，并有部分β-（1-6）苷键。

[0029] 实施例5 取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至120目，用2倍量浓度为95％乙醇提取后，弃去提取液，残渣加6倍量水60℃温浸，期间每次超声波30min辅助提取，重复提取2次，水提液合并后，加乙醇至浓度为60％，沉淀20小时，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白（5% 姬松茸粗提物溶液，按多糖浓度的2%加入中性蛋白酶，调节pH 值为
5.0，40℃下酶解60min，升温至80℃灭活酶活性，然后以Sevag 法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag 除去蛋白，重复2 次），然后用sephadex G200凝胶柱层析分离，以0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集平均分子量在50万和150万之间的部分，浓缩、干燥，即得姬松茸多糖提取物。经测定，其多糖含量为959％；主链中主要为β-（1-3）-D葡聚糖为主链，并有部分β-（1-6）苷键。

[0030] 实施例6 取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至70目，用5倍量浓度为95％乙醇提取后，弃去提取液，残渣加5倍量水60℃温浸，期间每次超声波30min辅助提取，重复提取3次，水提液合并后，加乙醇至浓度为75％，沉淀20小时，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白（5% 姬松茸粗提物溶液，按多糖浓度的2%加入中性蛋白酶，调节pH 值为
5.0，40℃下酶解60min，升温至80℃灭活酶活性，然后以Sevag 法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag 除去蛋白，重复2 次），然后用sephadex G200凝胶柱层析分离，以0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集平均分子量在50万和150万之间的部分，浓缩、干燥，即得姬松茸多糖提取物。经测定，其多糖含量为99％；主链中主要为β-（1-3）-D葡聚糖为主链，并有部分β-（1-6）苷键。

[0031] 效果试验例1 本发明提取物对小鼠NK细胞杀伤活性的影响。

[0032] 将细胞浓度为1×107·ml-1S180瘤株，给6周龄BALB/c雄性小鼠每只右后侧腋窝6
皮下接种0.2ml（2×10cell）复制动物模型，从模型复制后第2天，实施例1低剂量组按
50mg·kg-1·d-1、中剂量组按100 mg·kg-1·d-1和高剂量组按200mg·kg-1·d-1腹腔注射给药，模型对照组和空白对照组腹腔注射等体积的生理盐水。另外，按实施例1的制备方法，分别制备包含从0～220万分子量的全多糖、分子量5～30万的低分子量多糖和分子量从180～220万的高分子量多糖，分别按100 mg·kg-1·d-1给药。给药共7天。给药结束后24h， 脱颈椎处死小鼠。75％酒精浸泡消毒后，在无菌条件下取出脾脏并制成单个脾细胞悬液，0.83％Tris-NH4Cl破坏红细胞，洗涤脾细胞后，用RPMI-1640完全培养液调脾细胞浓度为1×106·ml-1。将1×106cell·ml-1脾细胞加入96孔细胞培养板中，将Yac-1细胞（调细胞浓度为1×105·ml-1）取50μl分别加于测试孔内，使效靶比为10∶1，加
1640培养液100μl。另外3孔为效应细胞对照孔，每孔加入脾细胞为50μl，1640培养液
150μl。同时另设3孔为靶细胞对照孔，浓度为1×105·ml-1Yac-1细胞悬液50μl/孔，完全RPMI-1640培养液150μl/孔。混匀，在 5％CO2、37℃条件下培养20h后，每孔加入浓度为5mg·ml-1MTT 10μl，在5％、37℃中继续培养4h。培养结束后，离心，弃上清，每孔加入二甲亚砜100μl， 微型振荡器震荡数分钟，使颗粒完全溶解。酶联免疫检测仪在570nm波长处检测各孔吸光度。

[0033] 自然杀伤率％＝[1-（实验孔OD570-效应细胞孔OD570）/靶细胞OD570]×100％，NK细胞活性实验数据经Tamhane检验结果见表1。

[0034] 表1对NK细胞活性的影响( x±s)

[0035]组别 剂量mg·kg-1·d-1 例数（只） NK细胞活性（％）
正常对照组 0 12 36.5±5.6
模型对照组 0 12 22.1±2.6
实施例1低剂量 50 12 32.3±2.9
实施例1中剂量 100 12 36.3±5.1
实施例1高剂量 200 12 37.2±6.4
姬松茸全多糖 100 12 28.4±3.8
姬松茸多糖5万～30万部分 100 12 31.8±3.9
姬松茸多糖180～220万部分 100 12 30.7±4.1

[0036] 结果表明，与正常对照组相比较，模型对照组NK细胞活性明显降低（P＜0.01），差异具有统计学意义。与模型对照组比较，实施例1低剂量组、中剂量组和高剂量组NK活性明显升 高，且具有显著性差异（P＜0.01）。NK细胞活性和低分子姬松茸多糖呈剂量依赖性。同时，在相同剂量下，实施例1的姬松茸多糖提取物明显优于姬松茸多糖5万～30万部分和180～220万部分，同时也优于全多糖。结果提示，低分子姬松茸多糖能增强NK细胞杀伤靶细胞的能力，进而通过免疫调节作用提高机体的抗肿瘤转移能力。

[0037] 效果试验例2 对小鼠S180肉瘤的抑制作用。

[0038] （1）试验目的

[0039] 测试本发明姬松茸多糖对小鼠S180肉瘤生长的抑制作用。

[0040] （2）受试药物

[0041] 名称：实施例3制备的姬松茸多糖，以及按实施例3的制备方法分别制备包含从0～220万分子量的姬松茸全多糖、分子量5～30万的低分子量多糖和分子量从180～220万的高分子量多糖

[0042] 配制：用蒸馏水配成溶液。

[0043] （3）对照样品

[0044] 云芝糖肽胶囊，上海新康制药厂生产，批号：990801，规格：每粒0.34g。

[0045] （4）动物

[0046] 昆明种小鼠，雄性，体重：18～22g，每组10只，由中科院上海实验动物中心提供。

[0047] （5）移植性肿瘤：小鼠S180肉瘤，购自中科院上海细胞所。

[0048] （6）试验方法

[0049] 取生长良好的小鼠S180肉瘤腹水，用生理盐水以1∶4稀释，每只小鼠右腋皮下接种 0.2ml，随机分组。实施例3姬松茸多糖提取物、姬松茸全多糖、低分子量多糖和高分子量多糖的剂量均为0.5g/kg剂量组，云芝糖肽对照组0.5g/Kg，接种后次日起给药，给药体积为0.5ml/20g体重，连续灌胃7天。接种后10日脱颈处死动物，称体重，解剖取瘤块，称瘤重。结果判定根据以下公式：

[0050] 肿瘤抑制率％＝（对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100％。

[0051] （7）试验结果

[0052] 实施例3姬松茸多糖提取物、姬松茸全多糖、低分子量多糖和高分子量多糖，对小鼠S180肉瘤均有抑制作用，与对照组比较具有显著性差异。试验结果见表2。

[0053] 表2对小鼠S180肉瘤的抑制作用。

[0054]组别 剂量（g/kg） 给药方案 动物数（只） 动物体重（g） 抑瘤率％
空白对照 po×7 10 25.1±1.2
云芝糖肽 0.5 po×7 10 26.1±1.5 52
实施例3 0.5 po×7 10 25.6±0.9 67
全多糖 0.5 po×7 10 25.4±1.7 56
低分子 0.5 po×7 10 26.3±2.1 62
高分子 0.5 po×7 10 24.6±1.8 59

[0055] （8）试验结论

[0056] 实施例3姬松茸多糖提取物、姬松茸全多糖、低分子量多糖和高分子量多糖对小鼠S180肉瘤的生长有明显的抑制作用，其中实施例3姬松茸多糖提取物明显优于姬松茸全多糖、低分子量多糖和高分子量多糖，具有显著意义。

[0057] 效果试验例3 降血脂试验。

[0058] （1）试验材料

[0059] 雄性昆明种小鼠，体重18±2g， 购于天津医科大学实验动物中心，姬松茸多糖（实施例2制备的姬松茸多糖，以及按实施例2的制备方法分别制备包含从0～220万分子量的姬松茸全多糖、分子量5～30万的低分子量多糖和分子量从180～220万的高分子量多糖），生理盐水分别配4％的灭菌溶液

[0060] 75％蛋黄乳剂：75mL蛋黄加25mL灭菌生理盐水，用电动混匀器混匀成乳状。

[0061] （2）试验方法：将60只健康小鼠随机分为6组，每组10只，健康对照组按常规饲喂。高血脂模型共5组。对照组，每天皮下注射灭菌生理盐水0.15mL/只。实施例2多糖组，每天皮下注射2％多糖灭菌溶液0.15mL/只。全多糖组，每天皮下注射2％多糖灭菌溶液0.15mL/只。低分子量多糖组，每天皮下注射2％多糖灭菌溶液0.15mL/只。高分子量多糖组，每天皮下注射2％多糖灭菌溶液0.15mL/只。共给药10天。于末次给药2小时后，除健康对照组腹腔注射灭菌生理盐水外（0.5mL/只），其它各组均一次性腹腔注射75％蛋黄乳剂0.5mL/只，禁食（不禁水）12小时，摘眼球取血，分离血清检测甘油三脂和胆固醇。结果见表3。

[0062] 表3 降血脂作用。

[0063]