酵母中自组装的具有免疫原性的肠道病毒病毒样颗粒的制备方法及其应用

摘要

本发明涉及一种制备肠道病毒病毒样颗粒的方法，以及一种可展示外源抗原的重组肠道病毒病毒样颗粒的制备方法。本发明优点在于：本发明提供了一种新型的酵母来源的小RNA病毒科肠道病毒属病毒样颗粒的制备方法及其免疫原性检测的方法，以及以肠道病毒病毒样颗粒作为一种全新的多价免疫原展示平台的应用方法，免疫试验证明本发明制备的肠道病毒病毒样颗粒可产生保护性中和抗体。

权利要求

1.一种制备肠道病毒病毒样颗粒的方法，其特征在于，所述的肠道病毒为EV71病毒，包括以下步骤：

（a）构建表达EV71-P1蛋白的pYES2载体重组子：使用引物SEQ ID NO.3、引物SEQ ID NO.4，以基因合成产物SEQ ID NO.11作为模板，通过PCR的方法扩增得到密码子优化后的EV71-P1基因片段，并对该扩增片段及pYES2载体分别进行XhoI/XbaI双酶切处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达EV71-P1蛋白的pYES2载体重组子pYES2-EV71-P1；

（b）使用引物SEQ ID NO.1、引物SEQ ID NO.2，以pGBKT7质粒作为模板，通过PCR方法扩增色氨酸营养缺陷型基因表达盒，所述表达盒包涵启动子、阅读框和3'非编码序列，并对该扩增片段及pYES2载体分别进行ClaI/NcoI双酶切处理，对两者进行连接处理后，得到具有色氨酸缺陷互补基因且敲除Ura缺陷互补基因的改造载体pYES2-Trp，构建表达EV71-3CD蛋白的pYES2-Trp载体重组子：使用引物SEQ ID NO.5、引物SEQ ID NO.6以基因合成产物SEQ ID NO.12作为模板，通过PCR的方法扩增得到优化后的EV71-3CD基因片段，并对该扩增片段及pYES2-Trp载体分别进行BamHI/SphI双酶切处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达EV71-3CD蛋白的pYES2-Trp载体重组子pYES2-Trp-EV71-3CD；

（c）将步骤（a）和步骤（b）中得到的重组子pYES2-EV71-P1和pYES2-Trp-EV71-3CD共同转化进入酿酒酵母表达菌株，酵母培养发酵；

（d）将步骤（c）中培养的酵母进行破碎、纯化和鉴定，即得所述的病毒样颗粒。

2.一种制备肠道病毒病毒样颗粒的方法，其特征在于，所述的肠道病毒为CVA16病毒，所述的方法包括以下步骤：

（a）构建表达CVA16-P1蛋白的pYES2载体重组子：对基因合成产物SEQ ID NO.13及pYES2载体分别进行XhoI/XbaI双酶切处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达CVA16-P1蛋白的pYES2载体重组子pYES2-CVA16-P1；

（b）使用引物SEQ ID NO.1、引物SEQ ID NO.2，以pGBKT7质粒作为模板，通过PCR方法扩增色氨酸营养缺陷型基因表达盒，所述表达盒包涵启动子、阅读框和3'非编码序列，并对该扩增片段及pYES2载体分别进行ClaI/NcoI双酶切处理，对两者进行连接处理后，得到具有色氨酸缺陷互补基因且敲除Ura缺陷互补基因的改造载体pYES2-Trp，构建表达CVA16-3CD蛋白的pYES2-Trp载体重组子：使用引物SEQ ID NO.7、引物SEQ ID NO.8，以CVA16病毒cDNA作为模板，通过PCR的方法扩增得到CVA16-3CD基因片段，并对该扩增片段及pYES2-Trp载体分别进行BamHI/SphI双酶切处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达CVA16-3CD蛋白的pYES2-Trp载体重组子pYES2-Trp-CVA16-3CD；

（c）将步骤（a）和步骤（b）中得到的重组子pYES2-CVA16-P1和pYES2-Trp-CVA16-3CD共同转化进入酿酒酵母表达菌株，酵母培养发酵；

（d）将步骤（c）中培养的酵母进行破碎、纯化和鉴定，即得所述的病毒样颗粒。

3.根据权利要求1或2任一所述的方法制备得到的肠道病毒病毒样颗粒。

4.根据权利要求3所述的肠道病毒病毒样颗粒在制备预防肠道病毒感染疾病的疫苗中的应用。

5.一种具有免疫原性的组合物，其特征在于，包括权利要求4所述的病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

6.一种可展示外源抗原的重组肠道病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（a）使用引物SEQ ID NO.1、引物SEQ ID NO.2，以pGBKT7质粒作为模板，通过PCR方法扩增色氨酸营养缺陷型基因表达盒，所述表达盒包涵启动子、阅读框和3'非编码序列，并对该扩增片段及pYES2载体分别进行ClaI/NcoI双酶切处理，对两者进行连接处理后，得到具有色氨酸缺陷互补基因且敲除Ura缺陷互补基因的改造载体pYES2-Trp，构建载体重组子pYES2-EV71-SP70-CVA16，该重组子可以表达SP70抗原表位置换为CV16相对应表位的EV71-P1重组蛋白；所述的构建载体重组子pYES2-EV71-SP70-CVA16的方法：制备重组子pYES2-EV71-P1，分别使用引物SEQ ID NO.1、引物SEQ ID NO.9和引物SEQ ID NO.2、引物SEQ ID NO.10，以质粒pYES2-EV71-P1为模板PCR，回收两种PCR产物并将其作为模板，使用引物SEQ ID NO.1、引物SEQ ID NO.2进行Overlap-PCR，回收PCR扩增片段，并对该扩增片段及pYES2载体分别进行XhoI/XbaI双酶切处理，对两者进行连接及转化处理后，得到pYES2载体重组子pYES2-EV71-SP70-CVA16，该穿梭质粒可以表达SP70抗原表位置换为CV16相对应表位的EV71-P1重组蛋白；

（b）采用权利要求1的方法构建重组子pYES2-Trp-EV71-3CD；

（c）将 步 骤（a）和 步 骤（b）中 得 到 的 重 组 子pYES2-EV71--SP70-CVA16 和pYES2-Trp-EV71-3CD共同转化进入酿酒酵母表达菌株，酵母培养发酵；

（d）将步骤（c）中培养的酵母进行破碎、纯化和鉴定，即得所述的病毒样颗粒。

7.一种采用权利要求6所述的方法制备得到的可展示外源抗原的重组肠道病毒病毒样颗粒。

8.根据权利要求7所述的可展示外源抗原的重组肠道病毒病毒样颗粒在制备预防手足口病的多价疫苗中的应用。

9.一种具有免疫原性的组合物，其特征在于，包括权利要求7所述的病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

说明书

酵母中自组装的具有免疫原性的肠道病毒病毒样颗粒的制

备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说，是酵母来源的小RNA病毒科肠道病毒属病毒样颗粒的生产、纯化、免疫原性检测及其应用等相关技术。

背景技术

[0002] 病毒样颗粒与多价免疫原展示平台

[0003] 病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）是由病毒的结构蛋白自发包装形成的空心颗粒，不含病毒核酸，不能自主复制，无感染性，在形态和结构上与真正病毒颗粒相同或相似，免疫原性与病毒颗粒效价相当。与病毒的这种相似性使得病毒样颗粒成为了一种新兴的安全的结构病毒学和疫苗学研究载体。另外，作为新型异源免疫原展示载体，重组病毒样颗粒免疫原展示平台的研究近年来发展迅速。所谓重组病毒样颗粒免疫原展示平台，即通过基因重组技术，在病毒样颗粒暴露于表面的肽段中插入或置换异源的免疫原，使该免疫原展现在颗粒的最外层空间，以达到展示异源免疫原的目的。病毒样颗粒及重组病毒样颗粒免疫原展示平台的研究主要依赖于基因工程、发酵工程等技术手段及结构学和免疫学等领域的研究方法。目前从原核表达系统到哺乳动物表达系统都有病毒样颗粒成功表达的案例，较为成熟的且有代表性的重组病毒样颗粒免疫原展示平台有噬菌体衣壳蛋白颗粒、乙型肝炎核心蛋白颗粒（HBcAg）和兽棚病毒（flock house virus, FHV）病毒样颗粒。根据结构病毒学分析，肠道病毒病毒样颗粒具有潜在的外源免疫原插入或置换位点。

[0004] 小RNA病毒科肠道病毒概览

[0005] 小RNA病毒科的成员都具有长度从6000-9000bp不等的单链RNA基因组，其无包膜的正二十面体病毒颗粒直径在22-30nm之间，通常通过粪口途径传播，其家族病毒成员庞杂，且感染哺乳动物群类广泛，最新的病毒分类学定义该科共分为五个属，即鼻病毒属、口蹄疫病毒属、肠道病毒属、心病毒属和甲肝病毒属。

[0006] 肠道病毒属主要包括脊髓灰质炎病毒、人肠道病毒68-71型、埃柯病毒和柯萨奇病毒等感染人类的几类病毒。著名的脊髓灰质炎病毒可引发小儿麻痹症，人肠道病毒70型可引起急性结膜炎，而人肠道病毒71型、柯萨奇病毒和埃柯病毒可引起成人腹泻及婴幼儿手足口病或心肌炎。目前除脊髓灰质炎病毒外，其他病毒均无投产疫苗。

[0007] 当今在发展中国家通用的脊髓灰质炎萨宾口服疫苗是病毒减活疫苗，存在一定致病风险，WHO分析报告指出，目前脊髓灰质炎II型病毒已经从自然界消失，而萨宾疫苗包含脊髓灰质炎全部三型的病毒，所以目前感染脊髓灰质炎II型病毒的病例全部是由于使用疫苗后减活病毒活性增强而引发的。萨宾疫苗的另一大潜在风险不易觉察，但可能影响将是长期的和不可控的，由于使用的是减活病毒，病毒可以随粪便排出，可能与自然界野生的各类肠道病毒发生基因交换，产生新型肠道病毒。

[0008] 手足口病的致病病毒及其疫苗研究现状

[0009] 手足口病（hand-foot-and-mouth disease, HFMD）是近年来引起全球高度重视的一种急性病毒性传染病，主要易感人群为五岁以下婴幼儿。患儿手、足、口腔等表皮部位可产生分散性疱疹，对少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症，重症患儿甚至可能死亡。自2007年来，这种疾病在我国华北、华中等地区持续性流行，且每年的病例数有递增趋势，严重危害我国儿童身体健康。人肠道病毒71型病毒和柯萨奇A16型病毒是在我国流行的手足口病主要的致病病毒。

[0010] 人 肠 道 病 毒71 型 病 毒（Enterovirus 71, EV71）隶 属 小RNA病 毒 科（Picornaviriade），肠道病毒属A类，是一种通过粪口及粘膜途径传播的病毒。该病毒由一条基因组单链RNA和正二十面体的衣壳构成，不含包膜，其中衣壳由VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白构成。在EV71病毒的生活周期中，病毒衣壳的包装是一个自发的并且具有多级步骤的过程。首先，病毒基因组RNA翻译出一个包括病毒所有结构蛋白和非结构蛋白的长的肽链（polyprotein），在病毒蛋白酶剪切作用下，产生出结构蛋白前体P1和病毒蛋白酶3CD；P1通过3CD的剪切作用生成结构蛋白VP1、VP3和结构蛋白VP2、VP4的前体蛋白VP0；
VP0、VP1和VP3可以自组装形成完整的正二十面体的不含基因组核酸的空衣壳颗粒（empty capsid）；若形成的空衣壳包裹了基因组RNA，则VP0剪切为VP2、VP4蛋白，并形成成熟的含有病毒基因组的病毒颗粒。柯萨奇A16型病毒（Coxsackievirus A16, CVA16）与EV71病毒在生活周期、病毒蛋白的结构和功能等方面有极高的相似度。

[0011] 病毒和免疫学界已经针对手足口病疫苗制备进行了一系列的基础研究，提出并尝试了多种形式的备选疫苗，包括病毒减活疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗、合成肽疫苗、亚单位疫苗，这些疫苗形式各具特色但也存在局限。其中以减活疫苗的免疫原性和保护性最高，且成本低，但由于其制备过程是模仿脊髓灰质炎病毒萨宾疫苗，所以存在一定的致病风险。DNA疫苗可以产生体液免疫和细胞免疫反应，但DNA疫苗这种疫苗形式本身的安全性争议一直是制约其发展最重要的因素。EV71病毒的两段合成肽，即SP55（VP1 163-177aa）和SP70（VP1 208-222aa），可诱导小鼠产生针对EV71病毒的中和性抗体，但由于效价问题尚未应用于疫苗开发。亚单位疫苗包括结构蛋白单体（如VP1）和病毒样颗粒两种形式，结构蛋白单体由于其较低的免疫原性而保护性较差，而病毒样颗粒很好的模拟了完整的病毒结构因而具有与减活病毒疫苗相当的免疫原性和保护性。平衡疫苗安全性和保护性这两项要素，病毒样颗粒是理想的备选疫苗。

[0012] EV71病毒样颗粒的研究已经有近十年的历史，根据文献报道，使用昆虫杆状病毒表达系统可以成功制备出EV71病毒样颗粒，其原理是，通过杆状病毒载体在体外培养的昆虫细胞中共表达人肠道病毒71型病毒蛋白P1和3CD，利用蛋白酶3CD特异性剪切P1蛋白为VP0、VP1、VP3三种蛋白，这三种蛋白在昆虫细胞中自组装成为病毒样颗粒。CVA16病毒也可以使用相同的方法制备病毒样颗粒。昆虫杆状病毒制备的病毒样颗粒的免疫原性已经得到证明。

发明内容

[0013] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种制备肠道病毒病毒样颗粒的方法。

[0014] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种制备肠道病毒病毒样颗粒的方法，包括以下步骤：

[0015] （a）优化P1基因，构建表达P1蛋白的pYES2载体重组子；

[0016] （b）构建具有色氨酸缺陷互补基因且敲除Ura缺陷互补基因的改造载体pYES2-Trp，优化3CD基因，构建表达3CD蛋白的pYES2-Trp载体重组子；

[0017] （c）将步骤（a）和步骤（b）中构建的载体重组子共同转化进入酿酒酵母表达菌株，酵母培养发酵；

[0018] （d）将步骤（c）中培养的酵母进行破碎、纯化和鉴定，即得肠道病毒病毒样颗粒，所述的肠道病毒病毒样颗粒由VP0、VP1、VP3三种蛋白单体组成。

[0019] 优选的，所述的步骤（c）中酵母发酵诱导培养基为YPG培养基，诱导表达的菌液初始浓度为1OD，收菌浓度为5OD。

[0020] 另一优选的实施例中，所述的肠道病毒为EV71病毒，包括以下步骤：

[0021] （a）构建表达EV71-P1蛋白的pYES2载体重组子：使用引物SEQ ID NO.3、引物SEQ ID NO.4，以基因合成产物SEQ ID NO.11作为模板，通过PCR的方法扩增得到密码子优化后的EV71-P1基因片段，并对该扩增片段及pYES2载体分别进行XhoI/XbaI双酶切处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达EV71-P1蛋白的pYES2载体重组子pYES2-EV71-P1；

[0022] （b）构建具有色氨酸缺陷互补基因且敲除Ura缺陷互补基因的改造载体pYES2-Trp，构建表达EV71-3CD蛋白的pYES2-Trp载体重组子：使用引物SEQ ID NO.5、引物SEQ ID NO.6以基因合成产物SEQ ID NO.12作为模板，通过PCR的方法扩增得到优化后的EV71-3CD基因片段，并对该扩增片段及pYES2-Trp载体分别进行BamHI/SphI双酶切处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达EV71-3CD蛋白的pYES2-Trp载体重组子pYES2-Trp-EV71-3CD；

[0023] （c）将步骤（a）和步骤（b）中得到的重组子pYES2-EV71-P1和pYES2-Trp-EV71-3CD共同转化进入酿酒酵母表达菌株，酵母培养发酵；

[0024] （d）将步骤（c）中培养的酵母进行破碎、纯化和鉴定，即得所述的病毒样颗粒。

[0025] 另一优选的实施例中，所述的肠道病毒为CVA16病毒，所述的方法包括以下步骤：

[0026] （a）构建表达CVA16-P1蛋白的pYES2载体重组子：对基因合成产物SEQ ID NO.13及pYES2载体分别进行XhoI/XbaI双酶切处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达CVA16-P1蛋白的pYES2载体重组子pYES2-CVA16-P1；

[0027] （b）构建具有色氨酸缺陷互补基因且敲除Ura缺陷互补基因的改造载体pYES2-Trp，构建表达CVA16-3CD蛋白的pYES2-Trp载体重组子：使用引物SEQ ID NO.7、引物SEQ ID NO.8，以CVA16病毒cDNA作为模板，通过PCR的方法扩增得到CVA16-3CD基因片段，并对该扩增片段及pYES2-Trp载体分别进行BamHI/SphI双酶切处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达CVA16-3CD蛋白的pYES2-Trp载体重组子pYES2-Trp-CVA16-3CD；

[0028] （c）将 步 骤（a）和 步 骤（b）中 得 到 的 重 组 子 pYES2-CVA16-P1 和pYES2-Trp-CVA16-3CD共同转化进入酿酒酵母表达菌株，酵母培养发酵；

[0029] （d）将步骤（c）中培养的酵母进行破碎、纯化和鉴定，即得所述的病毒样颗粒。

[0030] 本发明的另一个目的在于，提供以上任一所述的方法制备得到的肠道病毒病毒样颗粒。

[0031] 本发明的第三个目的在于，提供以上所述的肠道病毒病毒样颗粒在制备预防肠道病毒感染疾病的疫苗中的应用。

[0032] 本发明的第四个目的在于，提供一种具有免疫原性的组合物，包括以上所述的病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

[0033] 本发明的第五个目的在于，提供一种可展示外源抗原的重组肠道病毒病毒样颗粒的制备方法。

[0034] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种可展示外源抗原的重组肠道病毒病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

[0035] （a）构建具有色氨酸缺陷互补基因且敲除Ura缺陷互补基因的改造载体pYES2-Trp，构建载体重组子pYES2-EV71-SP70-CVA16，该重组子可以表达SP70抗原表位置换为CV16相对应表位的EV71-P1重组蛋白；

[0036] （b）采用权利要求3的方法构建重组子pYES2-Trp-EV71-3CD；

[0037] （c）将步骤（a）和步骤（b）中得到的重组子pYES2-EV71--SP70-CVA16和pYES2-Trp-EV71-3CD共同转化进入酿酒酵母表达菌株，酵母培养发酵；

[0038] （d）将步骤（c）中培养的酵母进行破碎、纯化和鉴定，即得所述的病毒样颗粒。

[0039] 另一优选的实施例中，所述的构建载体重组子pYES2-EV71-SP70-CVA16的方法：制备重组子pYES2-EV71-P1，分别使用引物SEQ ID NO.1、引物SEQ ID NO.9和引物SEQ ID NO.2、引物SEQ ID NO.10，以质粒pYES2-EV71-P1为模板PCR，回收两种PCR产物并将其作为模板，使用引物SEQ ID NO.1、引物SEQ ID NO.2进行Overlap-PCR，回收PCR扩增片段，并对该扩增片段及pYES2载体分别进行XhoI/XbaI双酶切处理，对两者进行连接及转化处理后，得到pYES2载体重组子pYES2-EV71-SP70-CVA16，该穿梭质粒可以表达SP70抗原表位置换为CV16相对应表位的EV71-P1重组蛋白。

[0040] 本发明的第六个目的在于，提供以上任一所述的方法制备得到的可展示外源抗原的重组肠道病毒病毒样颗粒。

[0041] 本发明的第七个目的在于，提供以上所述的可展示外源抗原的重组肠道病毒病毒样颗粒在制备预防手足口病的多价疫苗中的应用。

[0042] 本发明的第八个目的在于，提供一种具有免疫原性的组合物，包括以上所述的病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

[0043] 本发明优点在于：

[0044] 本发明提供了一种新型的酵母来源的小RNA病毒科肠道病毒属病毒样颗粒的制备方法及其免疫原性检测的方法，以及以肠道病毒病毒样颗粒作为一种全新的多价免疫原展示平台的应用方法，免疫试验证明本发明制备的肠道病毒病毒样颗粒可产生保护性中和抗体。

附图说明

[0045] 附图1是EV71-VLP纯化及检测流程。

[0046] 附图2是pYES2-EV71-P1和pYES2-EV71-3CD载体构建图示。

[0047] 附图3是含有pYES2-EV71-P1和pYES2-EV71-3CD表达质粒的INVSc1酵母单克隆菌落。

[0048] 附图4是EV71-VLP蔗糖密度梯度离心蛋白质免疫印迹实验结果，图中三列印迹分别指示 VP0（38KDa）和VP1（36KDa），VP3(27KDa)。（注：资料中给出的图四中没有箭头，请确认，相应更正附图说明或图片）

[0049] 附图5是EV71-VLP样品考马斯亮蓝染色结果，VP0 (38KDa)，VP1(36KDa)，VP3(27KDa)条带如图所示。

[0050] 附图6是EV71-VLP醋酸铀负染色样品透射电子显微镜成像照片。

[0051] 附图7是EV71-VLP小鼠免疫总IgG滴度测定（n=3）。

[0052] 附图8是EV71-VLP中和性抗体滴度测定（n=6）。

[0053] 附图9是CVA16-VLP蔗糖密度梯度离心蛋白质免疫印迹实验结果（Anti-VP0），泳道1-13依次显示10-40%蔗糖密度梯度各密度组分。

[0054] 附图10是CVA16-VLP样品考马斯亮蓝染色结果，VP0 (38KDa)，VP1(36KDa)，VP3(28KDa)条带如图所示。

[0055] 附图11是重组多价VLP蔗糖密度梯度离心蛋白质免疫印迹实验结果（Anti-VP0），泳道1-12依次显示10-40%蔗糖密度梯度各密度组分。

[0056] 附图12是重组多价VLP醋酸铀负染色样品透射电子显微镜成像照片。

具体实施方式

[0057] 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

[0058] 实验材料：

[0059] 1.菌株

[0060] 大肠杆菌 DH5α（Novagen）

[0061] 酿酒酵母 INVSc1（Invitrogen）

[0062] 2.质粒

[0063] pYES2（Invitrogen）、pGBKT7（Clontech）

[0064] 3.培养基

[0065] Luria-Bertani（LB）液体培养基：1%(w/v)胰蛋白胨（OXIOD），0.5%(w/v)酵母抽提物（安琪酵母公司），1%(w/v) 氯化钠（Genebase），pH7.0，121℃灭菌20min；对于其固体培养基，在液体培养基的基础成分中再加入1.5%琼脂粉（Genebase）。

[0066] YPD液体培养基：1%(w/v)酵母抽提物（Angelyeast），2%(w/v)蛋白胨（BD），2%(w/v)D-葡萄糖（Genebase），121℃灭菌20min；对于其固体培养基，在液体培养基的基础成分中再加入1.5%琼脂粉（Genebase）。

[0067] YPG液体培养基：1%(w/v)酵母抽提物（Angel yeast），2%(w/v)蛋白胨（BD），2%(w/v)半乳糖（J&K Scientific），121℃灭菌20min。

[0068] Trp/Ura营养缺陷型液体酵母培养基：0.67%(w/v)酵母氮源（Genebase），0.07%(w/v) -Trp -Ura Do Supplement（Shanghaigenomics），2%(w/v)D- 葡 萄 糖（Genebase），115℃灭菌15min；对于其固体培养基，在液体培养基的基础成分中再加入
1.5%琼脂粉（Genebase）。

[0069] 分子生物学试剂及材料

[0070] 限制性内切酶：KpnI、SphI、XhoI、XbaI、NcoI、ClaI (New England Biolabs)[0071] DNA聚合酶：Prime STAR HS DNA Polymerase（TAKARA）

[0072] 载体 去磷 酸 化酶：Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) (New England Biolabs)

[0073] DNA连接酶：DNA Ligation Kit Ver.2.0（TAKARA）

[0074] 琼脂糖：G-10（Biowest）

[0075] DNA引物：生工生物工程（上海）股份有限公司

[0076] DNA序列合成：上海捷瑞生物工程有限公司

[0077] 5.酵母转化相关试剂

[0078] PEG3350（Sigma）

[0079] LiAc（Sigma）

[0080] Tris base（Genebase）

[0081] 6.病毒样颗粒纯化相关试剂与材料

[0082] D-PBS Buffer Quick Solution Powder（Decent Biotech）

[0083] PEG8000（鼎国昌盛）

[0084] 蔗糖（AMRESCO）

[0085] 蛋白酶抑制剂：PMSF（AMRESCO）、β巯基乙醇(Genebase)

[0086] 超滤管：截留量100KDa（Millipore）

[0087] 蛋白质浓度测定试剂盒（BIO-RAD）

[0088] 7.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质免疫印迹实验相关试剂

[0089] 丙烯酰胺（Genebase）、过硫酸铵（AMRESCO）、Tris base（Genebase）、盐酸（国药集团）、TEMED（Genebase）、甘氨酸（Genebase）、电泳缓冲液、膜转移缓冲液、TBST溶液、脱脂奶粉（光明）、Western Blue AP酶显色底物（Promega）、考马斯亮蓝R-250（鼎国昌盛）[0090] 抗体：抗EV71-VP1兔多抗（Abnova）、抗EV71-VP2鼠单抗（Chemicon）、山羊抗鼠AP酶交联单抗（Promega）、山羊抗兔AP酶交联单抗（Promega）

[0091] 8.小鼠免疫相关材料和试剂

[0092] 实验动物：BALB/c雌性小鼠

[0093] 佐剂：Freund's adjuvant （Sigma）

[0094] 哺乳动物细胞系：RD细胞

[0095] 抗体：山羊抗鼠HRP标记单抗（Sigma）

[0096] 病毒：EV71中国安徽株

[0097] DMEM培 养 基（Thermo Scientific HyClone）、胎 牛 血 清（Thermo Scientific HyClone）、TMB底物（Sigma）、1M硫酸（国药）、PBS溶液、PBST+1%BSA溶液

[0098] 9.实验仪器

[0099] 场发射低温冷冻透射电镜（FEI Tecnai F20）

[0100] 紫外分光光度计： SmartSpecTM Plus（BIO-RAD）

[0101] PCR仪：C1000TM Thermo Cycle（BIO-RAD）

[0102] 恒温培养箱：DNP-9162（上海精宏实验设备有限公司）

[0103] GHP-9050（上海一恒科学仪器有限公司）

[0104] 恒温水浴锅：DK-8D（上海一恒科学仪器有限公司）

[0105] 冰箱：4℃、-20℃（Haier）

[0106] 低温冰箱：-80℃ MDFU53V（SANYO）

[0107] 细胞破碎仪：JN3000 Plus（JNBIO）

[0108] 摇床：THZ-03MZR（SHENERGY BIOCOLOR）

[0109] THZ-C（培英）

[0110] ZHWY-211C（ZHCHENG）

[0111] 常温台式离心机：5415D（Eppendorf）

[0112] 冷冻台式离心机：CT15RE（HITACHI）

[0113] 冷冻落地式离心机：5810R（Eppendorf）

[0114] 超速离心机：Optima L-80 XP（Beckman）

[0115] 超净台：AIRTECH

[0116] 生物安全柜：HR40-IIA2（Haier）

[0117] 电泳仪：ESP300（TANON）

[0118] 酶标仪：IMark microplate reader（BIO-RAD）

[0119] 实施例1 对pYES2载体营养缺陷型类型的改造

[0120] 使用引物1（SEQ ID NO.1）、引物2（SEQ ID NO.2），以pGBKT7质粒作为模板，通过PCR方法扩增色氨酸营养缺陷型基因表达盒（包涵启动子、阅读框和3'非编码序列），并对该扩增片段及pYES2载体分别进行双酶切（ClaI/NcoI）处理，对两者进行连接处理后，得到具有色氨酸缺陷互补基因且敲除Ura缺陷互补基因的改造载体pYES2-Trp。

[0121] 实施例2 EV71-VLP制备和免疫原性检测

[0122] 实验方法：

[0123] 2.1载体构建

[0124] 2.1.1对pYES2载体营养缺陷型类型的改造

[0125] 与实施例1实验方法相同。

[0126] EV71的P1和3CD基因的导入

[0127] 使用引物3（SEQ ID NO.3）、引物4（SEQ ID NO.4），以基因合成产物1（SEQ ID NO.11）作为模板，通过PCR的方法扩增得到密码子优化后的EV71-P1基因片段，并对该扩增片段及pYES2载体分别进行双酶切（XhoI/XbaI）处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达EV71-P1蛋白的pYES2载体重组子；使用引物5（SEQ ID NO.5）、引物6（SEQ ID NO.6），以基因合成产物2（SEQ ID NO.12）作为模板，通过PCR的方法扩增得到EV71-3CD基因片段，并对该扩增片段及pYES2-Trp载体分别进行双酶切（BamHI/SphI）处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达EV71-3CD蛋白的pYES2-Trp载体重组子。

[0128] 酿酒酵母转化实验

[0129] 依照pYES2 user manual小量酵母转化操作方法，将重组子pYES2-EV71-P1和pYES2-Trp-EV71-3CD共转入酿酒酵母INVSc1菌株，使用Trp/Ura营养缺陷型固体培养基筛选得到具有以上两种重组子的酵母单克隆菌落，使用Trp/Ura营养缺陷型液体培养基对单克隆菌落进行培养，去少量菌液保藏于-80℃冰箱，余下用于发酵培养。

[0130] 酿酒酵母发酵培养和VLP诱导表达

[0131] 取上一实验步骤中酵母菌液100ul，接种于10ml Trp/Ura营养缺陷型液体培养基，30℃ 250rpm条件过夜培养；将此10ml菌液接种于1L Trp/Ura营养缺陷型液体培养基，30℃ 250rpm条件过夜培养后25℃ 1000g离心10min，弃上清，使用YPG液体培养基重悬菌体，以OD=1的接种密度接种于YPG培养基，30℃ 250rpm培养至密度为OD=5时，4℃ 3000g离心30min，弃上清，使用预冷的D-PBS溶液清洗菌体，4℃ 3000g离心30min，弃上清，菌体冷藏于-80℃冰箱。

[0132] 的纯化

[0133] 将上述菌体以1g/ml的浓度重悬于预冷的D-PBS（含1mM PMSF、2mM 2-ME）溶液中，使用细胞破碎仪在4℃ 1600Bar的条件下破碎重悬菌液3个循环，将破碎菌液于8000g 4℃条件下离心20min，取上清液加入PEG8000至终浓度为12%，4℃搅拌过夜，1000g 4℃条件下离心60min，沉淀重悬于2ml D-PBS溶液中，此即EV71-VLP粗提液；将粗提液置于10-50%（w/v）蔗糖D-PBS密度梯度上，Beckman SW28 转子27000rpm 4℃离心1hour（无刹车），依照密度梯度分层收集样品，取少量进行蛋白质免疫印迹检测，确定含有EV71-VLP的组分，使用100KDa孔径蛋白质超滤管进行溶液置换和浓缩，得到终浓度1mg/ml溶于D-PBS溶液中的EV71-VLP样品（图1）。

[0134] 纯度和颗粒形态的检测

[0135] 取上述EV71-VLP样品进行聚丙烯酰胺还原性变性电泳，使用考马斯亮蓝R-250染色液染色，观察样品纯度；取EV71-VLP样品进行醋酸铀负染色制样，使用透射电子显微镜观察样品并拍照（图1）。

[0136] 免疫原性检测

[0137] 2.6.1小鼠免疫：

[0138] 将纯化得到的EV71-VLP溶于PBS溶液(200ug/ml)，伴以等体积的佐剂。

[0139] 随机取6周龄雌性BALB/c小鼠若干，每10只分为一组（n=10），共三组，第一、二组分别接种EV71-VLP 10ug/只、50ug/只，第三组（阴性对照）注射PBS溶液0.5ml/只。每周取血制备血清样本冻存，每隔14天强化免疫一次。

[0140] IgG效价检测：

[0141] 在96孔板上包被灭火的EV71病毒50ug/孔，4℃过夜，使用PBST+1%BSA溶液37℃封闭1小时，使用PBST溶液清洗3次，加入上述三组血清样本（使用10被稀释度梯度稀释，n=3），37℃孵育1小时，使用PBST溶液清洗3次，加入山羊抗鼠HRP标记单抗（稀释度1:5000），37℃孵育1小时，使用PBST溶液清洗7次，加入TMB底物反应，10分钟后使用1M硫酸终止反应，使用酶标仪在OD450处运用终点计量法检测数值。

[0142] 中和保护试验：

[0143] 使用DMEM+2%FBS培养基稀释上述三组血清样本（23到215的稀释倍数），与等体积的EV71病毒液（100 TCID50）混合，37℃孵育1小时。将RD细胞铺于96孔板过夜培养，待其生长交会度约为80%时，使用上述血清病毒混合液孵育RD细胞100ul/孔（n=6）。中和抗体保护性滴度定义为，产生CPE的孔数小于50%时的最大稀释倍数。

[0144] 实验结果：

[0145] 1.载体的构建

[0146] 成功获得了具有Trp营养缺陷互补基因而敲除了Ura营养缺陷互补基因的酿酒酵母表达载体pYES2-Trp。

[0147] 在pYES2和pYES2-Trp载体的多克隆位点处分别成功导入了密码子优化后的EV71-P1和EV71-3CD蛋白质的基因（图2）。

[0148] 酵母转化和含有双质粒酵母单克隆菌落的获得

[0149] 成功共转化表达质粒pYES2-EV71-P1和pYES2-EV71-3CD进入INVSc1酵母菌株，在Trp/Ura营养缺陷型固体酵母培养基上获得酵母单克隆菌落（图3）。

[0150] 的纯化和检测

[0151] 通过对EV71-VLP蔗糖密度梯度实验的各密度组分进行蛋白质免疫印迹实验，发现组成EV71-VLP的两种蛋白质VP0和VP1主要集中在30%的蔗糖密度区间（图4），再结合文献数据，提示EV71-VLP集中分布于30%蔗糖密度区间。

[0152] 取上述密度区间样品置于100KDa截留大小超滤管中进行浓缩和换液，浓缩和蛋白定量后的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果（图5）显示，主要包括三条蛋白条带，位置与组成EV71-VLP的三种蛋白单体VP0 (38KDa)，VP1(36KDa)，VP3(28KDa)分子量大小吻合。该样品的醋酸铀负染色透射电子显微镜成像结果可以清晰的看到EV71-VLP样品颗粒（图6）。

[0153] 免疫原性检测

[0154] 体液免疫实验测定结果显示，接种EV71-VLP的小鼠，无论免疫剂量是10ug/只还是50ug/只，都在接种后产生了IgG总量的显著提升，且在在初次免疫5到6周后达到峰值5
（0.6×10），而接种PBS溶液的小鼠的IgG总量没有明显变化，提示，EV71-VLP可有效激活体液免疫系统（图7）。

[0155] 细胞水平的中和抗体保护实验显示，EV71-VLP可诱导小鼠产生具有中和EV71病10
毒的保护性中和抗体，中和抗体滴度在初次免疫5到6周达到峰值，50ug免疫组（2 ）略高
9
于10ug免疫组（2），而PBS阴性对照组，则不能产生有效保护性的抗体（图8）。

[0156] 综上所述，EV71-VLP可使小鼠产生体液免疫，并产生针对EV71病毒具有相当效价的的保护性中和抗体，说明EV71-VLP具有EV71病毒免疫原性。

[0157] 实施例3 CVA16-VLP的制备

[0158] 实验方法：

[0159] 3.1载体构建

[0160] 3.1.1对pYES2载体营养缺陷型类型的改造

[0161] 与实施例1实验方法相同。

[0162] CVA16的P1和3CD基因的导入

[0163] 对基因合成产物3（SEQ ID NO.13，密码子优化后的CVA16-P1基因片段）及pYES2载体分别进行双酶切（XhoI/XbaI）处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达CVA16-P1蛋白的pYES2载体重组子；使用引物7（SEQ ID NO.7）、引物8（SEQ ID NO.8），以CVA16病毒cDNA作为模板，通过PCR的方法扩增得到CVA16-3CD基因片段，并对该扩增片段及pYES2-Trp载体分别进行双酶切（BamHI/SphI）处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达CVA16-3CD蛋白的pYES2-Trp载体重组子。

[0164] 酿酒酵母转化实验

[0165] 依照pYES2 user manual小量酵母转化操作方法，将重组子pYES2-CVA16-P1和pYES2-Trp-CVA16-3CD共转入酿酒酵母INVSc1菌株，使用Trp/Ura营养缺陷型固体培养基筛选得到具有以上两种重组子的酵母单克隆菌落，使用Trp/Ura营养缺陷型液体培养基对单克隆菌落进行培养，去少量菌液保藏于-80℃冰箱，余下用于发酵培养。

[0166] 酿酒酵母发酵培养和CVA16-VLP诱导表达

[0167] 与实施例2实验方法2.3相同。

[0168] 的纯化

[0169] 与实施例2实验方法2.4相同。

[0170] 纯度和颗粒形态的检测

[0171] 与实施例2实验方法2.5相同。

[0172] 实验结果：

[0173] 1.CVA16-VLP相关载体构建和酵母表达菌株的获得

[0174] 与EV71-VLP载体构建相类似，在pYES2和pYES2-Trp载体的多克隆位点处分别成功导入了的CVA16-P1和CVA16-3CD蛋白质的基因。载体共转酵母后成功得到CVA16-VLP表达菌株。

[0175] 的纯化和检测

[0176] 通过对CVA16-VLP蔗糖密度梯度实验的各密度组分进行蛋白质免疫印迹实验，发现CVA16-VLP组份之一的VP0蛋白主要集中在30%的蔗糖密度区间（图9），结合CVA16与EV71的相似性，提示CVA16-VLP同样集中分布于约30%蔗糖密度区间。

[0177] 取上述密度区间样品置于100KDa截留大小超滤管中进行浓缩和换液，浓缩和蛋白定量后的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果（图10）与EV71-VLP纯化结果相似，同样主要包括三条蛋白条带，位置与组成CVA16-VLP的三种蛋白单体VP0 (39KDa), VP1(36KDa),VP3(28KDa)分子量大小吻合。

[0178] 实施例4

[0179] 中国专利公开号CN101831410A公开了重组肠病毒71型病毒样颗粒的制备方法，通过将优化的肠道病毒71型病毒样颗粒P1基因及3CD基因克隆到质粒中，并转化酵母细胞制备肠道病毒71型病毒颗粒。中国专利公开号CN102533797A公开了重组柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒的制备方法，通过将CVA16病毒样颗粒P1基因及3CD基因克隆到质粒中，并转化酵母细胞制备肠道病毒CVA16病毒颗粒。

[0180] 以上两个在先申请中，制备得到的病毒样颗粒由VP1、VP2、VP3、VP4四种蛋白质组成，而本发明的病毒样颗粒由VP0、VP1、VP3三种蛋白质组成，由此可见，本发明的病毒样颗粒与前述在先申请在结构和功能上有较大的不同。并且，本发明还通过体液免疫实验和中和抗体保护实验验证了EV71病毒样颗粒的免疫原性，证实通过本发明的方法制备得到的重组病毒样颗粒具有病毒免疫原性，可以用来制备预防手足口病的疫苗等产品。而以上两个在先申请都没有通过实验验证，不能确定获得的病毒样颗粒是否具有病毒免疫原性。

[0181] 其次，这两个在先申请中虽然也采用酿酒酵母作为宿主细胞，但制备重组质粒时，是将P1基因及3CD基因克隆到同一个质粒中，使用单一载体表达两种蛋白，而本发明是使用两种载体分别表达两种蛋白，其中一个载体为pYES2，另一个载体为经过改造的具有Trp营养缺陷型互补基因标记的pYES2-Trp。且本发明的EV71的P1、3CD优化人工合成基因和CVA16的P1优化人工合成基因序列与前述在先申请也有不同。另外，酵母发酵方面：1）诱导培养基：前述在先申请使用缺陷型培养基，而本发明使用完全培养基YPG，2）诱导条件：本发明使用诱导表达的菌液初始浓度为1OD，收菌浓度为5OD，而前述在先申请使用初始浓度0.4OD，收菌使用的是时间单位，并未规定收菌浓度。以上三点区别给本发明带来了显著的有益效果，通过本发明的实验结果图可以看出，本发明的制备方法显著提高了病毒样颗粒的产量和纯度。

[0182] 实施例5 嵌入CVA16抗原表位的重组EV71病毒样颗粒的制备

[0183] 实验方法：

[0184] 5.1载体构建

[0185] 5.1.1对pYES2载体营养缺陷型类型的改造

[0186] 与实施例1实验方法相同。

[0187] EV71的P1基因的改造

[0188] 分别使用引物1（SEQ ID NO.1）、引物9（SEQ ID NO.9）和引物2（SEQ ID NO.2）、引物10（SEQ ID NO.10），以质粒pYES2-EV71-P1为模板PCR，回收两种PCR产物并将其作为模板使用引物1（SEQ ID NO.1）、引物2（SEQ ID NO.2）进行Overlap-PCR，回收PCR扩增片段，并对该扩增片段及pYES2载体分别进行双酶切（XhoI/XbaI）处理，对两者进行连接及转化处理后，得到pYES2载体重组子pYES2-EV71，该穿梭质粒可以表达SP70抗原表位置换为CV16相对应表位的EV71-P1重组蛋白。

[0189] 酿酒酵母转化实验

[0190] 依 照 pYES2 user manual 小 量 酵 母 转 化 操 作 方 法，将 重 组 子pYES2-EV71--SP70-CVA16和pYES2-Trp-EV71-3CD共转入酿酒酵母INVSc1菌株，使用Trp/Ura营养缺陷型固体培养基筛选得到具有以上两种重组子的酵母单克隆菌落，使用Trp/Ura营养缺陷型液体培养基对单克隆菌落进行培养，去少量菌液保藏于-80℃冰箱，余下用于发酵培养。

[0191] 酿酒酵母发酵培养和重组VLP诱导表达

[0192] 与实施例2实验方法2.3相同。

[0193] 重组多价VLP的纯化

[0194] 与实施例2实验方法2.4相同。

[0195] 重组多价VLP纯度和颗粒形态的检测

[0196] 与实施例2实验方法2.5相同。

[0197] 实验结果：

[0198] 1.EV71-CVA16表位置换重组VLP载体构建和酵母表达菌株的获得

[0199] 通过Overlap PCR方法成功得到了具有CVA16表位核酸序列的重组EV71-P1基因产物，在pYES2载体的多克隆位插入该重组基因产物得到表达质粒
pYES2-EV71--SP70-CVA16，将该质粒与pYES2-Trp-EV71-3CD质粒共转酵母后成功筛选得到重组VLP表达菌株。

[0200] 重组多价VLP的纯化和检测

[0201] 通过对重组多价VLP蔗糖密度梯度实验的各密度组分进行蛋白质免疫印迹实验，发现重组多价VLP组份之一的EV71-VP0蛋白主要集中在30%的蔗糖密度区间（图11），提示重组多价VLP同样集中分布于约30%蔗糖密度区间。

[0202] 取上述密度区间样品置于100KDa截留大小超滤管中进行浓缩和换液，浓缩后进行蛋白定量。样品的醋酸铀负染色透射电子显微镜成像结果可以观察到重组多价VLP样品颗粒（图12）。显示通过本发明的方法可用于制备可展示外源抗原的重组肠道病毒病毒样颗粒。

[0203] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。