Notch1基因突变的快速检测方法

摘要

本发明提供了一种Notch1基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤：在NOTCH1基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；分别设计了NOTCH1的NOTCH1-6的野生型引物和突变型，引物分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段；不同比例混合这两种片段，用HRM方法进行区分；与其它方法相比，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。

权利要求

1.一种NOTCH1基因突变的快速检测方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；

DNA提取：取200μL抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；

qPCR-HRM检测，包括：

1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验；包括野生型阴性对照和突变M/野生W＝1％阳性对照；对照和样本均采用复孔；

在NOTCH1基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；

所述野生型引物是NOT1F和NOT1R，所述突变型引物是NOT6MF和NOT6MR；

所述野生型引物NOT1F的核苷酸序列为：GAGCATGTACCCGAGAGGC，所述野生型引物NOT1R的核苷酸序列为：GAAGATCATCTGCTGGCCGT，所述突变型引物NOT6MF的核苷酸序列为：ACGTGGTCTCCAAGCGTGAC，所述突变型引物NOT6MR的核苷酸序列为：GTCACGCTTGGAGACCACGT；

所述野生型引物和突变型引物分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段；

所述野生型目的片段的获取：以已知未突变基因组为模板,NOT1F和NOT1R为引物进行实验，获得条带单一的特异性野生型目的片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为

10-20ng/μL，作为检测野生型阴性对照用；

所述突变型目的片段的获取包括：利用引物NOT1F和NOT6MR，以及引物NOT6MF和NOT1R获得突变位点前后两段突变片段；将这两段突变片段连接起来，构成突变型目的片段；

所述突变型目的片段的获取步骤包括：突变第一步PCR：以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以NOT1F,NOT6MR；以及NOT6MF,NOT1R两对引物进行两组实验，获得两个条带单一的片段；

突变第一步产物稀释：将突变第一步获得的两段PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度为

10-20ng/μL；

突变第二步PCR：以稀释后的第一步两段产物为模板，以NOT1F和NOT1R为引物进行第二步PCR，获得条带单一的片段；

突变第二步产物稀释：将突变第二步获得的PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度为

10-20ng/μL；

所述M/W＝1/100阳性对照的获取包括：混合99μL野生型目的片段和1μL突变型目的片段，配制100μL突变型/野生型＝1％的混合模板，作为检测用1％阳性对照；

2)10μL反应体系检测：在八连管中依照次序加入各试剂：25mM MgCl21.2μl,2μM NOT1F primer 1μl，2μM NOT1R primer 1μl，H2O 1.3μl，0.5μl模板DNA，5μl 2×HRM荧光master，混合均匀；所有样本混合完后，将八连管置于罗氏荧光定量PCR系统仪器中进行程序性检测；

结果分析及判定：在高分辨率溶解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述qPCR-HRM检测的程序包括：1)95℃变性10分钟；2)95℃变性10秒钟；3)退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10秒钟；4)72℃延伸30秒钟；5)重复第2步到第4)步45个循环；

6)95℃变性60秒钟；7)40℃变性60秒钟；8)设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s。

说明书

Notch1基因突变的快速检测方法

技术领域：

[0001] 本发明涉及生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。背景技术：

[0002] Notch基因最早发现于果蝇，其在哺乳动物中的同系基因编码单次跨膜的受体蛋白，分子量约300KD；而Notch信息途径除该受体外，尚有DSL/Jagged配体蛋白、以及具DNA结合活性的辅助因子CSL等成分(4)。当配体分子和相邻细胞膜上的Notch分子结合后，Notch被蛋白酶降解，释放出具有核定位信号的胞质区ICN(Intracellular domain of Notch)，进入细胞核与CLS结合而调节基因表达；该过程可概括如下：配体→Notch→酶切→ICN→进入细胞核→形成CLS-ICN复合体→促进基因转录。Notch信号的靶基因多为碱性螺旋-环-螺旋类转录因子(basic helix-loop-helix，bHLH)，它们又调节其它与细胞分化直接相关的基因的转录。Notch信息途径广泛存在于多种动物体内，在进化过程中高度保守，主要介导细胞的分化抑制信号,在胚胎发育、血细胞发育、肿瘤形成等生理病理过程中起重要作用。

[0003] 人类具有的4个Notch基因产物中(Notch1-4)的Notch-1，在肿瘤发生过程中(如乳腺癌、胃癌、白血病等)的作用已为研究工作所证实。此外，Notch-1还与肿瘤耐药密切相关。Notch-1广泛表达于多种肿瘤细胞,通过促进上皮间质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)表型的发生和调节微小RNA(microRNAs,miRNA)等途径,导致肿瘤对多种化疗药物产生抗药性。因此,Notch-1是对抗肿瘤耐药的潜在靶点,特异性抑制肿瘤细胞Notch-1活性，联合化疗药物的应用有望成为有效的肿瘤治疗策略。

[0004] 更进一步地，Notch-1基因突变也与肿瘤发生相关，如约11％的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者含有Notch-1基因突变；而在超过50％的T细胞性-急性淋巴细胞白血病(T-ALL)患者体内的Notch-1基因发生突变。

[0005] 高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸:它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR与专门的分析算法。使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs,mutations)。

[0006] SYBRTM Green I对PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应扩增有毒性，因此必需使用低浓度的染料，又因为它是非饱和态结合，染料在熔解过程中可重新结合，使其无法适用于HRM。

[0007] 罗氏开发了一种新的适用于HRM的染料ResoLight或LCGreen，它有三个优点：饱和染料毒性低；高浓度可以使DNA达到饱和；降低了染料位置重组的可能。

[0008] 而PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应产物的高分辨率熔解曲线HRM的要求包括:

[0009] 仪器:高分辨率高均一性的仪器，确保结果差异仅受DNA模板的影响[0010] 试剂:稳定可靠的PCR与HRM染料，确保获取高分辨率熔解曲线

[0011] 软件:高分辨率熔解曲线分析专用软件

[0012] 罗氏荧光定量PCR系统LightCycler Nano System具有光源好、温控好、检测好、加热快的优点，完全能满足检测的要求，这台仪器也于近期通过了国家药监局的审批，适用于临床诊断检测。

[0013] LightCycler Nano System是LightCycler480System的缩小版，480在HRM领域发表的文献是当前发表文献最多的实时定量PCR系统：应用领域包括人类疾病、植物、微生物、病毒、药理、毒理、生理、诊断等；影响因子10分以上5篇，包括Nature,NatureMethods,Nature Genetics，影响因子5－10分10篇，5分以上文章占总数的18％逐年上升趋势明显，已经成为当前qPCR扩展应用的热点目前常常使用测序法来检测是否存在突变，但是总结下来，现有的测序法有三个缺点：

[0014] 第一：灵敏度不高，低比例突变(<20％)无法检测；

[0015] 第二：耗时长，一般需要2-3天；

[0016] 第三：成本高。

[0017] 鉴于以上的问题，一种灵敏度高、耗时短、成本低、可操作性能更高的实NOTCH1基因突变的快速检测方法的发明是势在必行的。发明内容：

[0018] 本发明要解决的技术问题主要是：现有的测序法有三个缺点：

[0019] 第一：灵敏度不高，低比例突变(<20％)无法检测；

[0020] 第二：耗时长，一般需要2-3天；

[0021] 第三：成本高。

[0022] 为了解决以上问题，本发明提供了一种Notch1基因突变的快速检测方法，本发明技术在突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物，两者分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型(Tm的不同)：PCR产物的Tm取决于GC含量.[0023] 高TmG:C>A:T>G:G>G:T＝G:A>T:T＝A:A>T:C>A:C>C:C低Tm

[0024] 将纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线分析，得到相似峰形的熔解曲线；当然，包括野生型纯合子或突变纯合子。

[0025] 将杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线分析，得到不同峰形的熔解曲线.[0026] 本发明分别设计了NOTCH1的NOTCH1-6的野生型引物和突变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/100，最后用HRM方法进行区分。

[0027] 本发明提供了一种NOTCH1基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤：

[0028] 在NOTCH1基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；

[0029] 分别设计了NOTCH1的NOTCH1-6的野生型引物和突变型，引物分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段；

[0030] 不同比例混合这两种片段，用HRM方法进行区分。

[0031] 所述PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的Tm取决于GC含量。

[0032] 所述纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线.[0033] 所述不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/100最后用HRM方法进行区分。

[0034] 所述的一种NOTCH1基因突变的快速检测方法，其包括如下步骤：

[0035] 样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；

[0036] DNA提取：取200μL抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；

[0037] qPCR-HRM检测，包括：对照孔的设立和检测重复孔；10μL反应体系构成；在八连管中依照次序加入各试剂，混合均匀；所有样本混合完后，将八连管置于罗氏荧光定量PCR系统仪器中进行程序性检测；

[0038] 结果分析及判定：在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。

[0039] 所述qPCR-HRM检测的程序包括：95℃变性10分钟；95℃变性10秒钟；退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10秒钟；72℃延伸30秒钟；重复第2步到第四步45个循环；95℃变性60秒钟；40℃变性60秒钟；设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s)。所述NOTCH1-6_L1601P突变型目的片段的获取：
突变型目的片段的获取分为两步，第一步利用带有突变位点的突变引物(NOT1F,NOT6MR；
和NOT6MF,NOT1R两对引物)获得突变位点前后两段突变片段；第二步将这两段突变片段连接起来，构成NOTCH1-6_L1601P突变型目的片段。

[0040] 所述NOTCH1-6_L1601P突变型目的片段的获取包括：

[0041] 突变第一步PCR：以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以NOT1F,NOT6MR；以及NOT6MF,NOT1R两对引物进行两组实验，获得两个条带单一的片段；

[0042] 突变第一步产物稀释：将突变第一步获得的两段PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL；

[0043] 突变第二步PCR：以稀释后的第一步两段产物为模板，以NOT1F+NOT1R为引物进行第二步PCR，获得条带单一的片段；

[0044] 突变第二步产物稀释：将突变第二步获得的PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL。

[0045] 所述M/W＝1/100阳性对照模板的获取包括：混合99μL野生型模板和1μL突变型模板，配制100μL突变型/野生型(M/W)＝1％的混合模板，作为检测用1％阳性对照模板。

[0046] 所述NOTCH1-6_L1601野生型目的片段的获取：以已知未突变基因组为模板、NOT1F+NOT1R为引物进行实验，获得条带单一的特异性NOTCH1-6_L1601野生型目的片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL，作为检测野生型阴性对照模板用。

[0047] 本发明的有益效果是：本发明分别设计了NOTCH1的NOTCH1-6野生型引物和突变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/100，最后用HRM方法进行区分，采用了高分辨率熔解曲线法(HRM法)；与其它方法相比，本发明的HRM法能检出0.1％的突变、检测时间只需要1小时、每样品试剂耗材成本<￥7.00，即，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。附图说明：

[0048] 图1为本发明NOTCH1基因HRM检测分析结果示意图。具体实施方式：

[0049] 本发明应用于生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。

[0050] 如图1所示，设计一对引物将包括待突变位点在内的基因序列扩增出来作为野生型模板(wt)；再设计引物在将待突变位点改变成所需碱基的同时，将上述DNA片段在待突变分为两段，且在待突变位点附近有少量重复序列；最后利用部分重复的两个DNA片段混合起来作为模板，而利用最开始的那对引物将两个小片段连接起来，其产物尽管与wt大小完全相同，但却含有所期望的突变点。

[0051] 下面以NOT1F和NOT1R为例，说明具体的操作。

[0052] 1样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存。

[0053] 2DNA提取：取200μL抗凝血用QIAmpDNABloodMiniKit试剂盒提取DNA。采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测。

[0054] 3、qPCR-HRM检测的体系

[0055] 1)对照的设立和检测重复孔

[0056] 每个样本的检测必须同时设有对照实验，包括野生型阴性对照和m/w(突变/野生＝1％)阳性对照。对照和样本均采用复孔。

[0057] 2)10μL反应体系构成(引物序列见附表)如下(以4管反应为例)：

[0058] A先按下表配制MasterMix,混匀后短暂离心，然后吸取4.5μL加至每管8联管中，计4管：

[0059]MasterMix组成： (1x) (5x)
25mMMgCl2 1.2μl 6μl
2μMNOT1Fprimer 1μl 5μl
2μMNOT1Rprimer 1μl 5μl
H2O 1.3μl 6.5μl
Σ＝ 4.5μl 22.5μl

[0060] B向每管中加入0.5μL(约5-10ng)模板DNA。

[0061] C向每管中加入5μL2xHRM荧光Master(罗氏Cat#04909631001)；Σ＝10μL。

[0062] 3)混合均匀，盖上8联管盖。

[0063] 4)将8联管置于LightCycler Nano仪器中，注意仪器中A组与D组平衡，合上仪器盖子。

[0064] 4、qPCR-HRM检测的程序：

[0065] 1)95℃变性10分钟；

[0066] 2)95℃变性10秒钟；

[0067] 3)退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10秒钟；

[0068] 4)72℃延伸30秒钟；

[0069] 5)重复第2步到第四步45个循环；

[0070] 6)95℃变性60秒钟；

[0071] 7)40℃变性60秒钟；

[0072] 8)设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s)。

[0073] 5、结果分析：

[0074] 1)设置好样本名称、检测靶点和所使用的荧光染料。

[0075] 2)通过各孔的熔解曲线图可以查看各孔PCR条带特异性；以野生型样品孔为基线，通过高分辨率熔解曲线，可以查看阳性对照孔与样本孔图谱。

[0076] 3)结果判定

[0077] 在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。

[0078] 4)获取结果图。

[0079] 6、NOTCH1-6_L1601野生型目的片段的获取：

[0080] 以已知未突变基因组为模板、NOT1F+NOT1R为引物进行实验，参照步骤2及步骤3的反应体系及程序，获得条带单一的特异性NOTCH1-6_L1601野生型目的片段。

[0081] 将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL，作为检测野生型阴性对照模板用。

[0082] 7、NOTCH1-6_L1601P突变型目的片段的获取

[0083] 突变型目的片段的获取分为两步，第一步利用带有突变位点的突变引物(NOT1F,NOT6MR；和NOT6MF,NOT1R两对引物)获得突变位点前后两段突变片段；第二步将这两段突变片段连接起来，构成NOTCH1-6_L1601P突变型目的片段。

[0084] 突变第一步PCR

[0085] 以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以NOT1F,NOT6MR；以及NOT6MF,NOT1R两对引物进行两组实验，实验体系及程序参照步骤2及步骤3，获得两个条带单一的片段。

[0086] 突变第一步产物稀释

[0087] 将突变第一步获得的两段PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL。

[0088] 突变第二步PCR

[0089] 以稀释后的第一步两段产物为模板，以NOT1F+NOT1R为引物进行第二步PCR，实验体系及程序参照步骤2及步骤3，获得条带单一的片段。

[0090] 突变第二步产物稀释

[0091] 将突变第二步获得的PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL。

[0092] M/W＝1％阳性对照模板的获取

[0093] 混合99μL野生型模板和1μL突变型模板，配制100μL突变型/野生型(M/W)＝1％的混合模板，作为检测用1％阳性对照模板。

[0094] 8、结果分析

[0095] 通过HRM方法，我们能区分含1/100突变型的模板，证明了这个方法的高特异性和高灵敏度，而且，整个操作时间只需要1小时。

[0096] 附表：NOTCH1-6_L1601P_4802T>CHRM检测引物序列：

[0097]引物名称 引物序列(5’-3’)
NOT1F GAGCATGTACCCGAGAGGC
NOT1R GAAGATCATCTGCTGGCCGT
NOT6MF ACGTGGTCTCCAAGCGTGAC
NOT6MR GTCACGCTTGGAGACCACGT

[0098] 与其它方法相比，本发明技术具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低！

[0099] 上述优选实施例的描述使本领域的技术人员能制造或使用本发明。这些实施例的各种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的，这里定义的一般原理可以被应用于其它实施例中而不背离本发明的精神或范围。因此，本发明并不限于这里示出的实施例，而要符合与这里揭示的原理和新颖特征一致的最宽泛的范围。