一种特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒

摘要

本发明所涉及的一种特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法，试剂盒包括：a)RNA裂解液、b)荧光定量反应液、c)鸭黄病毒强阳性质控品、d)阴性质控品，荧光定量反应液含有上游引物DFV-F和下游引物DFV-R以及荧光探针DFV-P，适用于临床及科研中对鸭黄病毒的快递定量检测。本发明具有以下优点：特异性好,通过引物高特异性扩增和荧光探针的高特异杂交双重控制,具有很高的准确性,假阳性低；灵敏度高；检测速度快，仅2小时，加上核酸的提取，共需3小时左右；没有后处理，不用杂交、电泳、拍照等过程，不产生污染。

权利要求

1.一种特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：a)RNA裂解液、b)荧光定量反应液、c)鸭黄病毒强阳性质控品、d)阴性质控品，荧光定量反应液含有上游引物DFV-F和下游引物DFV-R 以及荧光探针DFV-P，上游引物 DFV-F序列为: atgaataaggtggtgaaggtaatgc 25nt；下游引物DFV-R序列为： cagattcgtgaaagtgttgagagc 24nt；荧光探针DFV-P序列为： catgactgttttcccatcacgtcccgg 27nt，荧光探针DFV-P 5＇端标记的是荧光报告基团FAM，

3＇端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。

2.按权利要求1所述的特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒，其特征在于荧光定量反应液由1×PCR Buffer, MgCl2 4mM, dNTPs 0.5mM, M-MLV酶50U ,Taq酶2U，上游引物DFV-F和下游引物DFV-R为各0.2μM,荧光探针DFV-P 为0.2μM组成。

3.按权利要求1所述的特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒，其特征在于所述的鸭黄病毒强阳性质控品为高滴度的鸭黄病毒监利株，其在鸭胚上增殖，经

3.7

灭活后得到，经测量ELD50为10 /mL。

4.按权利要求1所述的特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒，其特征在于所述的阴性质控品是采集健康的且无病原的鸭组织，按体积比1:5加入PBS液，充分匀浆破碎，离心去除沉淀，上清保存备用。

说明书

一种特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断

试剂盒

技术领域

[0001] 本发明所涉及的一种特异检测鸭黄病毒野毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法，属于病毒核酸检测领域，适用于临床及科研中对鸭黄病毒的快速定性检测。

背景技术

[0002] 自2010年以来，我国上海、浙江和江苏等地首次出现了鸭黄病毒感染引起产蛋严重下降及蛋鸭的死亡。该病原造成的鸭疫情在世界范围也属首次。同年在湖北省一些养鸭场也出现不明原因的产蛋下降，临床表现为产蛋严重下降甚至停止，并有一定的致死率，剖检病鸭脾脏呈现明显肿大，卵巢肉变，卵泡严重充血，出血。该病的爆发给养殖户带来了巨大的经济损失。

[0003] 本课题组对该病进行了系统的流行病学调查、病原分离、动物回归试验、病毒部分基因的测序与分析。证实该疾病是由一种新的黄病毒引起，根据病毒命名的通行规则，参照病毒分离地点，将其命名为HBJL株。初步序列分析结果表明该病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属(Flavivirus)蚊媒病毒类的恩塔亚病毒群（Ntaya virus group, NTAV群）。

[0004] 鸭黄病毒的基因组为不分节段的单股正链RNA，约由11000个核苷酸组成。在2010年我省蛋鸭群首次爆发产蛋下降疫情时，本课题组进行了大量流行病学调查并进行了病原的分离鉴定工作，参照Tembusu virus NS5 基因序列自主设计了特异性检测引物，将检测出阳性的病料进行SPF鸡胚接种分离出鸭黄病毒湖北毒株HBJL。目前已完成了鸭黄病毒湖北毒株HBJL株部分基因NS5的测定，并提交至美国国家生物信息数据库（NCBI，登录号：JF423123），参考HBJL株的NS5基因设计了引物：

[0005] DFV-F: atgaataaggtggtgaaggtaatgc；

[0006] DFV-R： cagattcgtgaaagtgttgagagc；

[0007] DFV-P: catgactgttttcccatcacgtcccgg。产物长度为130bp。

[0008] 由于该病为动物新发疾病，现有的诊断方法非常有限，多是通过传统的病毒分离培养（Virus Isolation, VI）、聚合酶链扩增法（Polymerase Chain Reaction, PCR）来进行该病的确诊。因此建立一种快速诊断检测方法是个迫切需要解决的问题。 [0009] 荧光定量PCR（Fluorogenetic Quatitative PCR, FQ-PCR）方法是20世纪90年代中期发展起来的实时定量检测特定核酸的技术，是在普通PCR的基础上增加了一条具有高特异性的荧光标记DNA探针，通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现对核酸进行定量检测的。是目前国际上用在病毒检测上最先进的检测方法之一，与普通PCR扩增技术相比具有无法比拟的优点。该技术具有灵敏度高、耗时短、特异性强、无须凝胶电泳、可高通量高效率、定量检测等优点。

发明内容

[0010] 本发明的目的在于提供一种利用应该荧光定量PCR技术的特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法，该试剂盒能够特异灵敏地检测出鸭黄病毒抗原，从而达到快速诊断的目的。

[0011] 本发明为解决上述技术问题采用的技术方案是：一种特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：a)RNA裂解液、b)荧光定量反应液、c)鸭黄病毒强阳性质控品、d)阴性质控品，荧光定量反应液含有上游引物DFV-F和下游引物DFV-R 以及荧光探针DFV-P，上游引物 DFV-F序列为: atgaataaggtggtgaaggtaatgc25nt；下游引物DFV-R序列为： cagattcgtgaaagtgttgagagc 24nt；荧光探针DFV-P序列为: catgactgttttcccatcacgtcccgg 27nt，荧光探针DFV-P 5＇端标记的是荧光报告基团FAM，3＇端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。

[0012] 按上述方案，荧光定量反应液由1×PCR Buffer, MgCl2 4mM, dNTPs 0.5mM, M-MLV酶50U ,Taq酶2U，所述的上游引物DFV-F和下游引物DFV-R为各0.2μM,所述的荧光探针DFV-P 为0.2μM。

[0013] 按上述方案，所述的鸭黄病毒强阳性质控品为高滴度的鸭黄病毒监利株，其在鸭3.7
胚上增殖，经灭活后得到，经测量ELD50为10 /mL。

[0014] 按上述方案，所述的阴性质控品是采集健康的且无病原的鸭组织，按体积比1:5加入PBS液，充分匀浆破碎，离心去除沉淀，上清保存备用。

[0015] 一种特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒的应用方法，其特征在于包括以下步骤：

[0016] 1）鸭黄病毒基因组RNA的提取：分别向200μl待检测标本、鸭黄病毒强阳性质控品和阴性质控品中加入1mlRNA裂解液，静置5min后，加入200μl氯仿，高速离心后吸取上清，上清中加入等体积的异丙醇，再进行冰浴并高速离心沉淀，所得沉淀用75%乙醇洗涤后，用20μl灭菌水溶解，所得溶液即为RNA模板；

[0017] 2）分别取步骤1）得到的RNA模板加入到荧光定量反应液中，用荧光定量检测仪进行PCR反应并实时检测反应过程中释放的荧光强度，PCR反应得到鸭黄病毒特异性扩增目的基因，所述的鸭黄病毒特异性扩增目的基因序列为：atg aataaggtgg tgaaggtaat gcgaccggga cgtgatggga aaacagtcat ggatgtcatc tcgcgggaag accagagggg aagtggacag gttgtgactt atgctctcaa cactttcacg aatctgt。

[0018] 按上述方案，荧光定量反应液由1×PCR Buffer, MgCl2 4mM, dNTPs 0.5mM, M-MLV酶50U ,Taq酶2U，所述的上游引物DFV-F和下游引物DFV-R为各0.2μM,所述的荧光探针DFV-P 为0.2μM。

[0019] 按上述方案，用于荧光定量RT-PCR检测仪进行PCR反应的反应条件为: [0020] 42℃ 反转录20min

[0021] 94℃ 预变性5min

[0022] 94℃变性10s ←→60℃退火、延伸 50s, 50 个循环。

[0023] 本发明与现有技术相比具有以下优点：

[0024] 1特异性好，通过特异性引物高特异性扩增和荧光探针的高特异杂交双重控制，具有很高的准确性，假阳性低；

[0025] 2 灵敏度高，反应过程由荧光检测系统实时监控，荧光检测系统对荧光信号具有很高的检测灵敏度；

[0026] 3 检测速度快，不需要另外制备cDNA，为一步法，仅需2个小时，加上核酸的提取，共需3小时；

[0027] 4 没有后期处理，不用杂交、电泳、拍照等过程，所有试剂均是一次扩增，毋需开盖，不产生污染。

附图说明

[0028] 图1 是标准品10倍梯度稀释进行荧光定量PCR所得到的扩增曲线，横坐标代表循环数，纵坐标代表荧光强度，图中平行原理横坐标的直线代表荧光阀值，其中，① ~⑦依次为10倍稀释的标准品；

[0029] 图2是根据标准品10倍稀释进行荧光定量结果所制作的标准曲线，横坐标代表样品稀释倍数，纵坐标代表荧光ct值。

具体实施方式

[0030] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。

[0031] 实施例1

[0032] 特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒

[0033] 1.试剂组成：

[0034] Trizol RNA裂解液为Invitrogen公司产品；Taq酶（5U/μL）、dNTPs（10mM）、MgCI2（25mM）、M-MLV酶（50U/μL）均购自Promega公司；PCR引物对DFV-F和DFV-R由上海生工生物工程公司合成；荧光探针由上海基康生物工程公司合成；鸭黄病毒监利株由本实验室保存；

[0035] 2.试剂配制：

[0036] A）荧 光 定 量 反 应 液：1×PCR Buffer, MgCl2 4mM, dNTPs 0.5mM, M-MLV酶50U，Taq酶2U，上游引物DFV-F和下游引物DFV-R各0.2μM和荧光探针DFV-P0.2μM组成；其中上游引物 DFV-F序列为: atgaataaggtggtgaaggtaatgc 25nt；下游引物DFV-R序列为： cagattcgtgaaagtgttgagagc 24nt；荧光探针DFV-P序列为: catgactgttttcccatcacgtcccgg 27nt，荧光探针DFV-P 5＇端标记的是荧光报告基团FAM，
3＇端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。

[0037] B）鸭黄病毒强阳性质控品为高滴度的鸭黄病毒监利株，其在鸭胚上增殖，经灭活3.7
后得到，经测量ELD50为10 /mL。

[0038] C）阴性质控品：采集健康的且无病原的鸭各组织，按体积比1:5加入PBS液，充分匀浆破碎，离心去除沉淀，上清保存备用。

[0039] D）自备试剂：氯仿、异丙醇、DEPC处理的灭菌双蒸水配制的75%乙醇。 [0040] 实施例2

[0041] 特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒的使用方法[0042] 1、样本的处理

[0043] A）被检样本为组织样品：取待检样本50-100mg于洁净、灭菌并烘干的匀浆器中，以1：5体积比加入PBS液，充分匀浆，4000rpm离心10min，取100μL上清液（每一个反应）转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用；

[0044] B）被检样本为液体样本（如：全血、血清、鼻拭子等），直接取100μL转入无菌的1.5mI离心管中，编号备用。

[0045] 2、被检样本RNA的提取

[0046] 取n个灭菌的1.5ml离心管，其中n为被检样品数与鸭黄病毒监利株强阳性对照及阴性质控品对照的和；每管分别加入被检样本、鸭黄病毒监利株阳性对照及阴性质控品对照各100μL，再分别加入500μL RNA裂解液，充分混匀，静置5min；再加入100μL氯仿，振荡混匀，4℃ 12000rpm离心15min；吸取上清至另一离心管，加入等体积的异丙醇，冰浴15min，4℃ 12000rpm离心10min；弃尽上清，加入1ml 75%乙醇，混匀，4℃ 12000rpm离心
10min；彻底弃上清。沉淀常温干燥5min后，溶解于20μL DEPC处理过的灭菌双蒸水，即得RNA模板；

[0047] 3、荧光定量PCR反应

[0048] 分别取荧光定量反应液各19μL，取第3步所得的RNA模板各1μL，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量PCR反应仪上进行PCR检测。循环条件为：42℃ 20min 94℃5min 94℃ 10s ←→ 60℃ 50s 扩增50个循环。把荧光检测的程序设定在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为530nm；

[0049] PCR反应得到鸭黄病毒特异性扩增目的基因，所述的鸭黄病毒特异性扩增目的基因序列为：atg aataaggtgg tgaaggtaat gcgaccggga cgtgatggga aaacagtcat ggatgtcatc tcgcgggaag accagagggg aagtggacag gttgtgactt atgctctcaa cactttcacg aatctgt。

[0050] 4、结果判断

[0051] A）结果分析条件设定

[0052] 循环结束后，运用仪器自带软件分析检测结果。循环域值（Threshold Cycle，Ct）设定原则根据仪器噪声情况调整，以Ct值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准；

[0053] B）质控标准

[0054] 阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；

[0055] 阳性对照的Ct值应在20左右并出现典型的扩增曲线；

[0056] C）结果判定

[0057] 阴性结果判定：无Ct值，且无典型的扩增曲线；

[0058] 阳性结果判定：Ct值小于30，且出现典型的扩增曲线；

[0059] 实验灰区：Ct值大于35，且出现典型的扩增曲线的样本建议重做。重做结果出现Ct值和典型的扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

[0060] 实验例3

[0061] 特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒的应用

[0062] 1、灵敏度试验

[0063] 用标准品进行10倍梯度稀释的 (103.7~10-7.7 ELD50/mL)做为模板,在荧光定量PCR仪上检测,得到实时PCR扩增曲线和标准曲线分别见附图1和附图2。检测出最低病毒量-2.7为10 ELD50/mL。

[0064] 2、特异性试验

[0065] 采用特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒对禽流感、禽白血病、禽大肠杆菌、沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、新城疫、减蛋综合症等进行特异性试验，对上述7种病毒的检测结果均为阴性。另外，对水及鸭的各种组织检测结果均为阴性。以上结果充分证明该试剂盒在临床样品的检测中具有很好的特异性。

[0066] 3、重复性试验

[0067] 取3份不同病毒水平的鸭黄病毒样品进行组间重复性检测，得到表1，算得重复性检测的组间变异系数β值分别为4.4%、4.8%、3.7%，均小于5%，证明该检测方法具有很好的特异性。

[0068] 表1 样品的组间重复性检测病毒滴度结果

[0069]

[0070] a: 循环域值

[0071] b: 平均CT值。