一种猪肺炎支原抗体检测试剂盒及其制备方法

摘要

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种猪肺炎支原抗体检测试剂盒及其制备方法，利用偶联的猪肺炎支原体特异多肽抗原包被固相载体，制备的猪肺炎支原体特异多肽抗原ELISA检测试剂盒用于猪肺炎支原体感染的临床检测，流行病学调查及免疫监测。本发明采用非蛋白多聚体定向偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原作为包被液，有效提高多肽与目标抗体的结合效率，从而显著提高可检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高，具有操作简单，诊断速度快，在进行大规模检测中经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。采用本发明的试剂盒检测样品，包被抗原用量可减至10ng/ml，降低了成本，有利于推广使用。

权利要求

1.一种猪肺炎支原抗体检测试剂盒，其特征在于：包括被非蛋白多聚体定向偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原作为包被液包被的固相载体；阳性血清和阴性血清各1管，其中阳性血清为Mhp标准阳性血清稀释液，阴性血清为Mhp标准阴性血清稀释液；用辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG的稀释液的酶标二抗1瓶；抗体稀释液1瓶；底物显色液1瓶；终止液

1瓶;所述的非蛋白多聚体定向偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原作为包被液是由偶联多肽抗原用包被液按照5μg/ml-10μg/ml的浓度稀释，其中偶联多肽抗原是通过以下方法制备得到的：

1）选取猪肺炎支原体特异反应原性多肽溶解，得到多肽溶液；

2）取非蛋白多聚体溶解，得到非蛋白多聚体溶液；

3）在猪肺炎支原体特异多肽溶液或非蛋白多聚体溶液中加入偶联剂，混合均匀；

4）将猪肺炎支原体特异多肽溶液与非蛋白多聚体溶液混合均匀，搅拌反应，使猪肺炎支原体特异多肽偶联到非蛋白多聚体上；

5）用透析袋去除未参与结合的偶联剂，纯化，冻干，得到偶联猪肺炎支原体特异多肽；

其中猪肺炎支原体特异反应原性多肽为SEQ ID NO:1。

2.根据权利要求1所述的猪肺炎支原抗体检测试剂盒，其特征在于：所述非蛋白多聚体定向偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原作为包被液包被的固相载体是将偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原用包被液稀释，然后将稀释的偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被至少8孔的酶标板，每孔100μL，4℃过夜包被，用PBST洗涤液250μl/孔洗涤2-4次后拍干，用封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250μl/孔洗涤2-4次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4℃保存；所述包被液为1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9.6，并定容至1000mL。

3.根据权利要求1所述的猪肺炎支原抗体检测试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG的稀释液是用HRP保护液按照辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG与HRP保护液体积比为1﹕2000-10000的比例稀释，酶标二抗每瓶量为12ml；所述HRP保护液为

0.1%BSA 1.0g，0.25%EDTA 2.5g，加PBS至 1000ml。

4.根据权利要求1所述的猪肺炎支原抗体检测试剂盒，其特征在于：所述Mhp标准阳性血清稀释液是用抗体稀释液按照体积比为1:2-128的比例将Mhp标准阳性血清稀释，每管量为1ml ；Mhp标准阴性血清稀释液用抗体稀释液按照体积比为1: 2-128的比例将Mhp标准阴性血清稀释，每管量为1ml。

5.根据权利要求1所述的猪肺炎支原抗体检测试剂盒，其特征在于：所述抗体稀释液为0.1%BSA 1.0g加入PBS至 1000ml；每瓶量为12ml。

6.根据权利要求1所述的猪肺炎支原抗体检测试剂盒，其特征在于：所述底物显色液为50mg TMB ，10mL DMSO，9.8g柠檬酸和1.2ml 30% H2O2 加蒸馏水定容至1000ml；每管量为12ml。

7.根据权利要求1所述的猪肺炎支原抗体检测试剂盒，其特征在于：所述终止液包括双蒸水178.3mL和98%的浓硫酸21.7mL，每管量为6ml。

8.根据权利要求1所述的猪肺炎支原抗体检测试剂盒，其特征在于：其还包括1瓶洗涤液，所述洗涤液为0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，8.0g NaCl，0.2g KCl，0.5mL Tween-20（0.05% V/V），加双蒸水定容至100ml，pH值为7.4。

9.一种如权利要求1所述的猪肺炎支原抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤

1）非蛋白多聚体定向偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被的固相载体的包被；

2）抗体稀释液配制；

3）底物液显色液配制；

4）终止液配制；

5）阴阳性血清稀释；

6）酶标二抗配制；

7）试剂盒的组装：将偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被至少8孔的酶标板1块、阴阳性血清各1管、抗体稀释液1瓶、酶标二抗1瓶、底物显色液1瓶、终止液1瓶、操作说明书一份组装成ELISA试剂盒。

说明书

一种猪肺炎支原抗体检测试剂盒及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种猪肺炎支原抗体检测试剂盒及其制备方法，利用猪肺炎支原体偶联的猪肺炎支原体特异多肽抗原包被固相载体，制备的猪肺炎支原体特异多肽抗原ELISA试剂盒用于猪肺炎支原体感染的临床检测，流行病学调查及免疫监测。

背景技术

[0002] 猪支原体肺炎（Mycoplasmal Pneumonia of Swine，MPS，又称“气喘病”）是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的一种慢性、接触性、高发病率、低死亡率为特点的传染病。猪肺炎支原体主要感染呼吸道，损伤纤毛和上皮细胞，其致病的一个重要因素是支原体与淋巴细胞的相互作用，支原体感染改变了肺泡巨噬细胞的吞噬功能使猪只产生免疫抑制，患猪易继发其它病原体的感染。猪支原体肺炎病广泛存在于养殖猪群中，是造成经济损失的最重要的疾病之一。

[0003] 猪肺炎支原体常与其他细菌和病毒混合感染，引起地方性肺炎（Enzootic Pneumoniae,EP）和猪呼吸道疾病综合征（Porcine Respiratory Disease Complex,PRDC），由于猪群感染MPS后难以治愈，且本病难以净化，避免接触Mhp是最有效的预防措施，早期快速地检测诊断十分必要。

[0004] 从病猪体内分离培养出Mhp被认为是猪感染MPS的判断标准，由于Mhp是世界上公认的最难分离和鉴定的病原体之一，生长缓慢且经常因猪鼻支原体（M.hyorhinis）过度生长而被掩盖，药物治疗后或康复的猪也很难再分离。因此，分离培养诊断在临床上的应用仍不可行。近年来对Mhp快速检测方法的研究有了一些进展，一些快速、敏感、准确的检测方法已被应用于Mhp的诊断，比如临床诊断（屠宰场监测）、分离培养法、染色电镜观察法、核酸探针技术、PCR诊断技术、血清学方法、免疫学诊断方法等。

[0005] 血清学方法是最常用的诊断工具，通常用来判定猪群中病原体，如猪肺炎支原体的存在与否。然而，随着大多数猪肺炎支原体诊断方法的出现，血清学结果的解释也被提出质疑。大量研究比较了多种用于病变肺脏检测和疾病抵御的测定法。最初，补体结合(CF)实验用于检测猪肺炎支原体的抗体。然而，一些比较性的研究发现，间接ELISA实验在检测抗体水平上比补体结合（CF）实验更为有效。当前，ELISA测定法最常用于病原菌抗体的测定。

[0006] 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)是一种将抗原、抗体反应的特异性和酶催化底物的专一性二者有机结合而形成的血清学方法，是以物理方法将抗体或抗原吸附在固相载体上，随后的一系列免疫学和酶促生化反应都在此固相载体上进行的免疫酶测定实验。包括间接ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA和斑点ELISA等类型。Bereiter M等(1990)对补体结合试验(CFT)、ELISA和放射免疫酶试验(RIDEA)的敏感性进行评价：在人工感染后13天，被感染猪开始咳嗽，ELISA在3周后检测到抗体。

[0007] Okada M等(2005)利用猪肺炎支原体P46外膜蛋白的单克隆抗体和在大肠杆菌中的表达产物建立了检测猪肺炎支原体抗体的双夹心ELISA方法。在实验感染猪肺炎支原体的猪只中，该ELISA方法和CFT法几乎同一时间检测到猪肺炎支原体，且两种方法有很好的相关性。然而在临床检测中，两种方法没有什么相关性，而CFT法特异性较差。

[0008] 目前，对该病的抗体早期诊断，市场上的主要有美国IDEXX公司生产的Mycoplasma hyopneumoniae antibody test k it检测试剂盒、丹麦Dako公司生产的Mycoplasma hyopneumoniae ELISA检测试剂盒和中国兽医药品监察所生产的猪肺炎支原体抗体IHA检测试剂盒。虽然使用国外进口的ELISA检测试剂盒所获的检测结果较均一、但国外的试剂盒使用的是猪肺炎支原体全菌蛋白，或是基因工程表达蛋白作为包被抗原，故该类试剂盒检测的特异性不高，有待于使用我国国内的大量的临床样本作进一步验证，另外，进口试剂盒价格普遍昂贵；中国兽医药品监察所的IHA检测试剂盒结果判断需要一定的经验，且灵敏度低，市场占有量不大。另外，实验证明，在许多血清学测定法中，由于猪絮状支原体抗体与猪肺炎支原体发生交叉反应，使猪肺炎支原体的血清学诊断变得非常复杂，准确检测判定特异猪肺炎支原体较困难。因此，建立一种猪肺炎支原体特异的诊断方法，对研究其致病机理，有效预防和控制该病的传播具有十分重要的意义。

发明内容

[0009] 为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供猪肺炎支原抗体检测试剂盒，本发明利用非蛋白多聚体定向偶联猪肺炎支原体多肽抗原作为包被液包被固相载体，可有效提高多肽与目标抗体的结合效率，从而显著提高可检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高，操作简单，诊断速度快，在进行大规模检测中经济方便等优点。

[0010] 本发明的另一目的在于提供猪肺炎支原抗体检测试剂盒的制备方法。

[0011] 为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下：

[0012] 一种猪肺炎支原抗体检测试剂盒，包括被偶联的猪肺炎支原体特异多肽抗原包被液包被的固相载体；阳性血清和阴性血清各1管，其中阳性血清为Mhp标准阳性血清稀释液，阴性血清为Mhp标准阴性血清稀释液；用辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG的稀释液的酶标二抗1瓶；抗体稀释液1瓶；底物显色液1瓶；终止液1瓶。

[0013] 所述偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被液是偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原用包被液按照5μg/ml-10μg/ml的浓度稀释；其中偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原是通过以下方法制备得到的：

[0014] 1）选取猪肺炎支原体特异反应原性多肽溶解，得到猪肺炎支原体特异多肽溶液；

[0015] 2）取非蛋白多聚体溶解，得到非蛋白多聚体溶液；

[0016] 3）在猪肺炎支原体特异多肽溶液或非蛋白多聚体溶液中加入偶联剂，混合均匀；

[0017] 4）将猪肺炎支原体特异多肽溶液与非蛋白多聚体溶液混合均匀，搅拌反应，使猪肺炎支原体特异多肽偶联到非蛋白多聚体上；

[0018] 5）用透析袋去除未参与结合的偶联剂，纯化，冻干，得到偶联猪肺炎支原体特异多肽；

[0019] 其中猪肺炎支原体特异反应原性多肽为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5系列多肽中的一种。

[0020] 所述偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被液包被的固相载体是将偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原用包被液稀释，然后将稀释的偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被至少8孔的酶标板，每孔100μL，4℃过夜包被，用PBST洗涤液250μl/孔洗涤2-4次后拍干，用封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250μl/孔洗涤2-4次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4℃保存；所述包被液为1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9.6，并定容至1000mL。

[0021] 所述辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG的稀释液是用HRP保护液按照辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG与HRP保护液体积比为1﹕2000-10000的比例稀释，酶标二抗每瓶量为12ml；所述HRP保护液为0.1%BSA 1.0g，0.25%EDTA2.5g，加PBS至1000ml。

[0022] 所述Mhp标准阳性血清稀释液是用抗体稀释液按照体积比为1:2-128的比例将Mhp标准阳性血清稀释，每管量为1ml；Mhp标准阴性血清稀释液用抗体稀释液按照体积比为1:2-128的比例将Mhp标准阴性血清稀释，每管量为1ml。作为优选的Mhp标准阳/阴性血清用抗体稀释液按照1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128稀释。

[0023] 所述抗体稀释液为0.1%BSA1.0g加入PBS至1000ml；每瓶量为12ml。

[0024] 所述底物显色液为50mg TMB，10mL DMSO，9.8g柠檬酸和1.2ml 30%H2O2加蒸馏水定容至1000ml；每管量为12ml。

[0025] 所述终止液包括双蒸水178.3mL和98%的浓硫酸21.7mL，每管量为6ml。

[0026] 本发明所述的猪肺炎支原抗体检测试剂盒还包括1瓶洗涤液，所述洗涤液为0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，8.0g NaCl，0.2g KCl，0.5mL Tween-20（0.05%V/V），加双蒸水定容至100ml，pH值为7.4。

[0027] 一种猪肺炎支原抗体检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

[0028] 1）非蛋白多聚体定向偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被的固相载体的包被；

[0029] 2）抗体稀释液（AD）配制；

[0030] 3）底物液显色液配制；

[0031] 4）终止液配制；

[0032] 5）阴阳性血清稀释；

[0033] 6）酶标二抗配制；

[0034] 7）试剂盒的组装：将偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被至少8孔的酶标板1块、阴阳性血清各1管、抗体稀释液1瓶、酶标二抗1瓶、底物显色液1瓶、终止液1瓶、操作说明书一份组装成ELISA试剂盒。

[0035] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明采用偶联的猪肺炎支原体特异多肽抗原作为包被液，能够有效提高猪肺炎支原体特异多肽与目标抗体的结合率，从而显著提高检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高，具有操作简单，诊断速度快，在进行大规模检测中经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。本发明的检测方法，包被抗原用量可减至10ng/ml，降低了成本，有利于推广使用。

[0036] 下面结合具体的实施方式对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

[0037] 本发明中所采用的偶联猪肺炎支原体特异多肽的制备方法如下：

[0038] 1）猪肺炎支原体特异Mhp多肽的筛选

[0039] 有效多肽段的选择和确定，是根据参考文献（Hopp & Woods，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.78,p.3824-3828,Chou & Fassman，1978,Advances in Enzymology,vol.47,p.45-148)提供的方法，对猪肺炎支原体膜蛋白的抗原表位进行预测，确定天然抗原的氨基酸序列，然后寻找该肽段所针对的抗原决定簇（epitopes）。使用ELISA检测不同多肽与猪肺炎支原体抗血清的反应，最后选出具有良好反应原性的猪肺炎支原体特异多肽。

[0040] 本实施例根据猪肺炎支原体膜蛋白序列，筛选出5条具有良好反应原性的猪肺炎支原体特异多肽，序列如下所示：

[0041] P1：Glu Thr Asp Ser Asp Tyr Lys Ile Val Lys Arg Trp Leu Val Asp Ser Asn AsnAsn Ile Arg Asn

[0042] P2：Ile Tyr Glu Gln Thr Val Ala Phe Ala Lys Gln Ser Asn Leu Leu Val Ala GluPhe Asn Phe Ser Leu Lys Lys

[0043] P3:Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Thr Thr LysPro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala

[0044] P4:Gln Ala Lys Leu Asp Tyr Gly Asn Ile Leu Asn Pro Tyr Asn Thr Gln LeuAla Lys Val Glu Val Glu Ala Leu Phe Lys Lys Gly Asn Lys

[0045] P5:Gln Ile Pro Ser Leu Phe Leu Lys Ala Asp Leu Ser Gln Ser Ala Arg Glu IleLeu Ala Ser Pro。

[0046] 2）偶联猪肺炎支原体特异多肽的制备

[0047] 称取10mg的上述任一种猪肺炎支原体特异反应原性多肽，加50μL DMSO溶解，然后加入10ml双蒸水，称取1mg的多糖葡糖胺，加1ml PBS溶解，在多糖溶液内加10mg偶联剂EDC混匀，然后与多肽溶液混合，室温搅拌反应3小时。使用透析袋（孔径MWCO10000-12000）去除未参与结合的偶联剂（EDC），纯化、冻干，得到偶联猪肺炎支原体特异多肽。

[0048] 实施例1

[0049] 一种猪肺炎支原抗体检测试剂盒，通过以下方法制备：

[0050] 1）选择上述任一种偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原用包被液按照（包被液为1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9.6，并定容至1000mL）5μg/ml的比例稀释，然后将稀释的偶联多肽抗原包被8孔板，每孔100μL，4℃过夜包被，次日用PBST洗涤液250μl/孔洗涤3次后拍干，用封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST
250μl/孔洗涤3次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4℃保存；

[0051] 2）抗体稀释液（AD）配制：称取1.0g BSA（0.1%），加PBS至1000ml，4℃保存；

[0052] 3）底物液显色液配制：4ml TMB（50mg TMB溶于10mL DMSO中），9.8g柠檬酸，1.2ml30%H2O2加蒸馏水定容至1000ml，4℃避光保存；

[0053] 4）终止液配制（2mol/L H2SO4）：双蒸水178.3mL，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7mL；

[0054] 5）阴阳性血清稀释：用抗体稀释液按阳性血清/阴性血清与抗体稀释剂按体积比为1:2稀释，1ml/管分装，4℃保存；

[0055] 6）酶标二抗配制：用HRP保护液按HRP保护液与辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG体积比为1:2000的比例稀释辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG，4℃保存；

[0056] 7）试剂盒的组装：将偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被的8孔酶标板1块、1ml/管的阴阳性血清各1管、12ml/瓶的抗体稀释液1瓶、12ml/瓶的酶标二抗1瓶、12ml/瓶的底物显色液1瓶、6ml/瓶的终止液1瓶、操作说明书一份组装成ELISA试剂盒。

[0057] 实施例2

[0058] 一种猪肺炎支原抗体检测试剂盒，通过以下方法制备：

[0059] 1）选择上述任一种偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原用包被液（包被液为1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9.6，并定容至1000mL）按照10μg/ml的比例稀释，然后将稀释的偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被48孔板，每孔100μL，4℃过夜包被，次日用PBST洗涤液250μl/孔洗涤3次后拍干，用封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250μl/孔洗涤4次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4℃保存；

[0060] 2）抗体稀释液（AD）配制：称取1.0g BSA（0.1%），加PBS至1000ml，4℃保存；

[0061] 3）底物液显色液配制：4ml TMB（50mg TMB溶于10mL DMSO中），9.8g柠檬酸，1.2ml30%H2O2加蒸馏水定容至1000ml，4℃避光保存；

[0062] 4）终止液配制：双蒸水178.3mL，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7mL；

[0063] 5）阴阳性血清稀释：用抗体稀释液按阳性血清/阴性血清与抗体稀释剂按体积比为1:64稀释，1ml/管分装，4℃保存；

[0064] 6）酶标二抗配制：用HRP保护液按HRP保护液与辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG体积比为1:4000的比例稀释辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG，4℃保存；

[0065] 7）试剂盒的组装：将偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被的48孔酶标板1块、1ml/管的阴阳性血清各1管、12ml/瓶的抗体稀释液1瓶、12ml/瓶的酶标二抗1瓶、12ml/瓶的底物显色液1瓶、6ml/瓶的终止液1瓶、操作说明书一份组装成ELISA试剂盒。

[0066] 实施例3

[0067] 一种猪肺炎支原抗体检测试剂盒，通过以下方法制备：

[0068] 1）选择上述任一种偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原用包被液（包被液为1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9.6，并定容至1000mL）按照2.5μg/ml的比例稀释，然后将稀释的偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被96孔板，每孔
100μL，4℃过夜包被，包被浓度为8μg/ml，次日用PBST洗涤液250μl/孔洗涤3次后拍干，用封闭液150μl/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250μl/孔洗涤4次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4℃保存；

[0069] 2）抗体稀释液（AD）配制：称取1.0g BSA（0.1%），加PBS至1000ml，4℃保存；

[0070] 3）底物液显色液配制：4ml TMB（50mg TMB溶于10mL DMSO中），9.8g柠檬酸，1.2ml30%H2O2加蒸馏水定容至1000ml，4℃避光保存；

[0071] 4）终止液配制：双蒸水178.3mL，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7mL；

[0072] 5）阴阳性血清稀释：用抗体稀释液按阳性血清/阴性血清与抗体稀释剂按体积比为1:128稀释，1ml/管分装，4℃保存；

[0073] 6）酶标二抗配制：用HRP保护液按HRP保护液与辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG体积比为1:8000的比例稀释辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG，4℃保存；

[0074] 7）试剂盒的组装：将偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被的96孔酶标板1块、1ml/管的阴阳性血清各1管、12ml/瓶的抗体稀释液1瓶、12ml/瓶的酶标二抗1瓶、12ml/瓶的底物显色液1瓶、6ml/瓶的终止液1瓶、操作说明书一份组装成ELISA试剂盒。

[0075] 利用本发明的猪肺炎支原抗体检测试剂盒检测抗体的使用方法如下：

[0076] 1）偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被液包被的酶标板中每孔内加入100μL已经稀释好的各样本，每个样品必须使用一个独立的枪头，每块板中阴阳性对照血清各设两孔室温下孵育30分钟，再将各孔的液体弃入废液缸内；

[0077] 2）用微量移液器取洗涤液，洗涤酶标板，约250μL/孔，洗涤6次，最后一次加入洗涤液后浸泡洗涤5min，再将板中残留的洗涤液弃入废液缸内，然后用力扣拍到吸水材料上，注意应避免包被板孔干燥；

[0078] 3）然后在每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗猪抗体，室温下孵育30分钟，并重复该步骤；

[0079] 4）每孔加入100μL TMB底物液，避光显色10分钟，每孔加入50μL终止液，使反应终止，轻震酶标板，使板内液体混匀；

[0080] 5）使用酶标仪测定并记录样本和对照样本的A450吸收值，10min完成测定；

[0081] 本实验结果应符合下列条件：

[0082] Mhp阳性对照的平均值（P）减去阴性对照的平均值（N）必须大于0.15。阴性对照平均值（N）必须小于或等于0.15。如果试验无效应重做。Mhp抗体的阳性/阴性通过计算样品与阳性对照（S/P）的比值进行判定。具体计算方法如下:

[0083] ①如果S/P值小于0.20，样品应判定为Mhp抗体阴性（-）。

[0084] ②如果S/P值在0.20-0.25之间判定为样品Mhp可疑（+/-），如果S/P值大于0.25，则判定为样品Mhp抗体阳性（+）。

[0085] 应用实施例1：猪肺炎支原体特异Mhp P97抗原表位特异性间接ELISA试验[0086] 1）材料

[0087] 待测血清：猪伪狂犬病毒阳性血清1份、猪瘟病毒（CSFV）阳性血清1份、猪呼吸与繁殖综合征病毒（PRRSV）阳性血清1份、猪圆环病毒（PCV）阳性血清1份、猪链球菌的阳性血清1份、Mhp阳性血清2份、Mhp阴性血清2份，空白对照2份。

[0088] 其他：包被好的酶标板、多道移液器、灭菌吸头、酶标仪（OD450nm）；HRP标记羊抗猪抗体；TMB；终止液：2M H2SO4；洗涤液：PBST。

[0089] 2）方法

[0090] ①将包被好的酶标板加入1:40阴阳性血清或被检样品100μL，室温30min；

[0091] ②洗涤PBST，250μL/孔，洗涤6次，每次5min；

[0092] ③每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗猪抗体（1:3000），室温30min；

[0093] ④重复②洗涤步骤；

[0094] ⑤底物：每孔加入100μLTMB，避光显色10min；

[0095] ⑥终止液：2M H2SO4，50μL/孔；

[0096] ⑦酶标仪测定OD450nm读取结果。

[0097] 表2为特异性检测结果，表2的结果表明：伪狂犬病毒、猪瘟病毒、PCV检测为阴性，PRRSV和猪链球菌为弱阳性。

[0098] 表1

[0099]

[0100] 应用实施例2：猪肺炎支原体特异Mhp P97多肽抗原表位包被浓度间接[0101] ELISA试验

[0102] 材料与方法：

[0103] 1）材料

[0104] 待测血清Mhp阴阳性血清经IDEXX和IDVET检测过的阴性血清2份，阳性血清7份；包被好的ELISA板、多道移液器、灭菌吸头、酶标仪（OD450nm）；HRP标记羊抗猪抗体；TMB；终止液：2M H2SO4；洗涤液：PBST。

[0105] 2）方法

[0106] ①将包被好的酶标板中加入1:40阴阳性血清或被检样品（经IDEXX和IHA检测过的阴性血清2份，阳性血清7份，100μL，室温30min；

[0107] ②洗涤PBST，250μL/孔，洗涤6次，每次5min；

[0108] ③每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗猪抗体（1:3000），室温30min。

[0109] ④重复②洗涤步骤；

[0110] ⑤底物：每孔加入100μL TMB，避光显色10min；

[0111] ⑥终止液：2M H2SO4，50μL/孔；

[0112] ⑦酶标仪测定OD450nm

[0113] 3）实验结果

[0114] 表2是上述9份血清的OD450nm结果，每份样品分别测试两次。

[0115] 表2

[0116]

[0117] 应用实施案例3：猪肺炎支原体特异Mhp P97多肽抗原表位间接ELISA猪[0118] 血清样本检测试验

[0119] 材料与方法：

[0120] 1）材料

[0121] 待测血清：Mhp阴阳性血清18份，两份空白对照组；包被好的酶标板、多道移液器、灭菌吸头、酶标仪（OD450nm）；HRP标记羊抗猪抗体；TMB；终止液：2M H2SO4；洗涤液：PBST。

[0122] 2）方法

[0123] ①将包被好的板子加入1:40阴阳性血清或被检样品，100μL，室温30min。

[0124] ②洗涤PBST，250μL/孔，洗涤6次，每次5min。

[0125] ③每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗猪抗体（1:3000），室温30min[0126] ④重复②洗涤步骤

[0127] ⑤底物：每孔加入100μL TMB，避光显色10min。

[0128] ⑥终止液：2M H2SO4，50μL/孔；

[0129] ⑦酶标仪测定OD450nm

[0130] 3）实验结果

[0131] 表3是上述18份血清及两份空白对照试剂的OD450nm的结果，每份样品测试分别测试两次。

[0132] 表3

[0133]

[0134] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。