用于结直肠癌血浆中的微RNA表达谱分析的组合物和方法

摘要

本发明涉及用于结直肠癌血浆中微RNA(miRNA)表达谱分析的组合物和方法。特别地，本发明涉及用于诊断结直肠癌、监测癌症治疗、和/或治疗结直肠癌的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子均编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子中的一或多种的在结直肠癌血浆与在健康对照血浆中差异表达，且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达特征，所述特征是结直肠癌存在的指征。本发明还涉及相应的方法，其使用这种核酸表达特征来鉴别结直肠癌以及预防或治疗此病症。最后，本发明涉及用于预防和/或治疗结直肠癌的药物组合物。

权利要求

1.用于鉴别一或多种展现出结直肠癌的目标血浆的血液中分子标记物的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子的探针分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆中和在一或多种对照血浆中差异表达，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，所述核酸表达特征是结直肠癌存在的指征，其中所述核酸表达特征包括编码hsa-miR-409-3p/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-96、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-548c-5p、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-30c-1*、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-342-3p、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-96、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-301a、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-345、hsa-miR-409/hsa-miR-331-3p、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-331-3p、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-25、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-93和hsa-miR-671-3p/hsa-miR-93的任意一种或多种核酸分子组合。

2.权利要求1的试剂盒，其中所述核酸表达特征可包含至少35种核酸分子。

3.权利要求1的试剂盒，其中所述核酸表达特征可包含至少12种核酸分子。

4.权利要求1的试剂盒，其中所述核酸表达特征可包含至少6种核酸分子。

5.权利要求1的试剂盒，其中与一或多种健康对照相比，在所述一或多种目标血浆中：

编码hsa-miR-409-3p和hsa-mir-671-3p的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；而编码hsa-miR-25、hsa-miR-93、hsa-miR-96、hsa-miR-301a、hsa-miR-342-3p、hsa-mir-16-2*、hsa-miR-30c-1*、hsa-miR-548c-5p、has-miR-331-3p和hsa-miR-345的任意一种或多种核酸分子表达被下调。

6.权利要求1的试剂盒，进一步用于将结直肠癌与健康个体、肝细胞癌和肺癌区别开。

7.权利要求6的试剂盒，其中所述核酸表达特征可包括至少23种核酸分子。

8.权利要求6的试剂盒，其中所述核酸表达特征可包括至少18种核酸分子。

9.权利要求6的试剂盒，其中所述核酸表达特征可包括至少6种核酸分子。

10.权利要求6的试剂盒，其中所述核酸表达特征包含任意一种或多种编码：肿瘤相关特征hsa-miR-409-3p、hsa-miR-129-3p、hsa-miR-33b*、hsa-miR-7、hsa-miR-196b、hsa-miR-93、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-25、hsa-miR-92a、hsamiR-19b；血浆特异性特征 hsa-miR-671-3p 和 hsa-miR-16-2*、has-miR-92b、hsa-miR-129*、hsa-miR-563、hsa-miR-602、hsa-miR-1227、hsa-miR-196a 和 内 部 稳 定 对 照 hsa-miR-1238 和hsa-miR-1228的核酸分子。

11.权利要求10的试剂盒，其中与一种或多种健康个体、肝细胞癌和肺癌相比，在所述一或多种目标血浆中，编码hsa-miR-409-3p、hsa-mir-671-3p、hsa-miR-33b*、hsa-miR-92b、hsa-miR-149、hsa-miR-129*、hsa-miR-563、hsa-miR-129-3p、hsa-miR-634、hsa-let-7b*、hsa-miR-602和hsa-miR-1227的任意一种或多种核酸分子表达被上调；

而 编 码 hsa-miR-16-2*、hsa-miR-7、hsa-miR-196a、hsa-miR-196b、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-93、hsa-miR-25、hsa-miR-92a和hsa-miR-19b的任意一种或多种核酸分子表达被下调；hsa-miR-1238和hsa-miR-1228没有变化。

12.权利要求6-11任一项的试剂盒，其中所述核酸表达特征包括编码：hsa-miR-33b*/hsa-miR-196a、hsa-miR-92b/hsa-miR-196a、hsa-miR-563/hsa-miR-196a、hsa-miR-1227/hsa-miR-196a、hsa-miR-129-3p/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-129*/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-92b/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-129*/hsa-miR-196a、hsa-miR-1227/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-129-3p/hsa-miR-196a、hsa-miR-602/hsa-miR-196a、hsa-miR-33b*/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-563/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-129*/hsa-miR-7、hsa-miR-33b*/hsa-miR-7、hsa-miR-563/hsa-miR-7、hsa-miR-602/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-129-3p/hsa-miR-7、hsa-miR-92b/hsamiR-7、hsa-miR-1227/hsa-miR-7、hsa-miR-33b*/hsa-miR-196b、hsa-miR-1227/hsa-miR-196b、hsa-miR-92b/hsa-miR-196b和hsa-miR-602/hsa-miR-7的任意一种或多种核酸组合。

13.权利要求6-12任一项的试剂盒在制备用于通过如下方法鉴别展现出结直肠癌的一或多种目标血浆的组合物中的用途，所述方法包括：

(a)在所述一或多种目标血浆中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列；

(b)在一或多种健康对照血浆中确定所述多种核酸分子的表达水平；及

(c)通过对比在步骤(a)和(b)中获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴别出在所述目标血浆和对照血浆中差异表达的一或多种核酸分子，其中所述差异表达的一或多种核酸分子一起代表如权利要求1-12任一项所定义的核酸表达特征，所述核酸表达特征是结直肠癌存在的指征。

14.权利要求13的用途，其中所述方法进一步用于将结直肠癌与健康个体、肝细胞癌和肺癌区别开。

15.权利要求1-12任一项的试剂盒在制备用于通过如下方法监测结直肠癌治疗的组合物中的用途，所述方法包括：

(a)通过使用本文所定义的方法在一或多种目标血浆中鉴别核酸表达特征；及(b)在血液中监测所述核酸表达特征所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述监测以如下的方式进行，即其血浆中的表达在治疗前被上调的核酸分子的表达在治疗后被下调，而其血浆中的表达在治疗前被下调的核酸分子的表达在治疗后被上调。

16.权利要求1-12任一项的试剂盒在制备用于通过如下方法预防或治疗结直肠癌的试剂盒中的用途，所述方法包括：

(a)通过使用权利要求13或14中所述的方法在血液中鉴别核酸表达特征；及(b)在血液中改变所述核酸表达特征所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述改变以如下的方式进行，即其表达在血液中被上调的核酸分子的表达被下调，而其表达在血液中被下调的核酸分子的表达被上调。

说明书

用于结直肠癌血浆中的微RNA表达谱分析的组合物和方法

发明领域

[0001] 本发明涉及用于结直肠癌(colorectal cancer)血浆中的微RNA(microRNA)表达谱分析的组合物和方法。

[0002] 发明背景

[0003] 结直肠癌(CRC)是最重要的人类癌症，全世界在2008年就有～1041200个新病例。其是世界上第三大最常见癌症以及第四大引起癌症死亡的原因。(Gry.R.et al.(1997))Curr Probl Cancer 21,233-300；Petersen,G.M.et al.(1999)Cancer86,254002550)。如果能在早期阶段诊断，CRC是可以治愈的。在早期阶段，大部分病人是没有疾病的临床症状的，因此有必要进行早期CRC的筛查。证据表明早期结直肠癌的发现可以很大程度上降低疾病的发生率和死亡率(Anwar,R.(2006)Digestive and Liver Disease 34,279-282)。

[0004] 最初CRC的特征是结肠上皮的过度增生(异型性)，其先转变成炎症性的腺瘤性息肉，然后转变成结直肠粘膜的异常新生物腺瘤(即良性肿瘤)。通常情况下，只有小部分形成的腺瘤(60岁病人的发生率是60-70％)发展成恶性腺癌。超过95％的CRC病例表现为腺癌(Muto,T.et al.(1975)Cancer36,2251-2270；Fearon,E.R.and Vogelstein,B.(1990)Cell 61,759-767)。

[0005] 现有的CRC标准筛查方法包括结肠镜和粪便隐血测试。但是这两项测试都有严重的缺陷。结肠镜检查是有效的，但是多数人因为其高费用、带来的很大不适以及潜在的更多副作用而不愿意接受这项检查。另一方面，粪便隐血测试简单且花费低却相对不够准确。然而，目前还没有使得能够可靠地诊断CRC的特异性的分子标记，尤其是对于表现为腺癌的CRC和/或良性腺瘤所发展成的恶性肿瘤。

[0006] 因此，新的生物标记的发现具有最重要的临床效用，尤其是这些标记早期诊断肿瘤的发展，以便使癌症得到早期治疗并避免不必要的外科干预。理想情况下，这些标记应该使得能够发现处于原位技术或者活检或切除物显微镜分析不能发现恶性细胞时期的癌症。

[0007] 一些诊断方法也因为其分析基于单一分子标记而影响检测的可靠性和/或精确性而受限。此外，单一的标记通常不能详细预测相关潜伏期阶段、肿瘤进展和类似情况。因此，还有待于替代分子标记和检测方式的发现以便克服这些障碍。

[0008] 一个解决这个问题的方法可能基于小的调节性RNA分子尤其是微RNA(miRNA)，其组成了进化保守的内源性表达的小型非翻译性的长度为20-25核苷酸(nt)的RNA。从10年前发现以来，认为其可介导目标mRNA的表达并因此具有参与细胞发生、分化、增殖和凋亡的重要功能。(Bartel,D.P.(2004)Cell 116,281-297,Ambros,V.(2004)Nature
431,350-355；He.L.etal.(2004)Nat Rev Genet 5,522-531)。此外，作为25种癌症生物标记，miRNA由于在体外很稳定且在体内长寿而相较于mRNA更具有优势(Lu,J.etal.(2005)Nature 435,834-838；Lim,L.P.et al.(2005)Nature 433,769-773)。

[0009] miRNA来源于初级转录过程中由RNase III Drosha加工成的茎环结构前体(pre-miRNA)。运输到胞浆以后，另一种称为Dicer的RNaseIII将pre-miRNA发夹环切成短的双链RAN(dsRNA),其中一条链成为miRNA蛋白(miRNP)中的成熟miRNA。miRNA引导miRNP到其能发挥功能的目标mRNA(Bartel,D.P.(2004)Cell 23,281-292；He,L.and Hannon,G.J.(2004)Nat Rev Genet 5,522-531)。

[0010] 根据miRNA和目标的互补程度，miRNA可引导不同的调控过程。与miRNA高度互补的目标mRNA被与干扰RNA(RNAi)相同的结构特异性地切割。因此，在这种情形下，miRNA的作为小干扰RNA(siRNA)发挥功能。与miRNA互补程度较低的目标mRNA同样被引导到细胞退化通路或者在不影响mRNA水平的的情况下被翻译抑制。但是，miRNA抑制目标mRNA的翻译的机制仍然具有争议。现有数据表明miRNA可作为肿瘤基因或者肿瘤抑制基因而在癌症中发挥作用，例如癌症中过度表达的mir-17-92可能作为肿瘤基因发挥功能并通过下调肿瘤抑制基因和/或控制细胞分化或凋亡的基因从而促进癌症的发展。同样，let-7a的低表达，其发挥肿瘤抑制基因功能，可能通过调控肿瘤基因和/或控制细胞分化或凋亡的基因从而抑制癌症(Zhang,B.(2007)Dev Biol 302,1-12)。表明它们在癌症发生和发展中发挥作用。

[0011] 高通量miRNA定量技术例如miRNA微阵列，基于实时RT-PCR的TaqMan miRNA测定等等为研究整个癌基因组的整体miRNA谱提供了有力手段。越来越多的证据表明多种miRNA在人类癌症包括白血病、淋巴瘤、胶质母细胞瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌和卵巢癌中表现异常，且在正常组织和癌组织中表达情况不同。(Zhang,L.25(2008)Adv Exp Med Biol 622,69-78)。因此，miRNA谱被用作发现多种癌症的标志，表明其将有助于进一步确定分子诊断、预后和治疗。人类癌症中异常的miRNA表达表明这些miRNA作为生物标记和分子治疗目标的潜力。

[0012] 在多种可能类型的样本中，血液被认为是筛查高风险个体的理想样本，由于其可以通过最小侵入方式收集到，可以早期发现、诊断、监测和有效治疗癌症。已经表明肿瘤来源的miRNA可通过内源性RNase的作用保护下以非常稳定的形式存在于人类血浆或者血清中。这些血浆或血清中肿瘤来源的miRNA可作为发现癌症的生物标记并达到可测的水平。此外，血浆和血清的miRNA水平相关性大，表明血浆或者血清样本都可以用来作为临床以miRNA作为癌症预后的生物标记的样本选择类型(Mitchell,P.S.et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105,10513-10518；Gilad,S.et al.(2008)PLoSONE 3,e3148；Chen,X.et al.(2008)Cell Res 18,997-101006)。

[0013] 一些研究报导了人类结直肠癌病例的血浆或血清中的miRNA表达谱(Chen,X.(2008)Cell Res 18,997-1006；Ng,E.K.O.(2009)Gut 58,1375-1381；Huang,Z.2009,Int J Cancer，published on line)。在健康个体中发现超过100种循环miRNA(Mitchell,P.S.(2008)Proc Natl Acad Sci USA105,10513-10518)，并且此谱与具有多种肿瘤特异性miRNA的结直肠癌病人的miRNA谱有很大不同。Chen等人证明了存在于结直肠癌病人血清中而不存在于正常对照组血清中的69种miRNA(Chen,X.(2008)Cell Res18,997-1006)。此外，他们发现了存在于结直肠癌而不存在于另外的癌症组(肺癌)血清中的14种miRNA的独特表达谱。Ng等人的研究表明miR-92在CRC病例的血浆中显著升高，并且具有作为CRC筛查的非侵入性分子标记的潜力(E.K.O.(2009)Gut 58,1375-1381)。此外，Huang等人发现血浆miR-29a具有作为早期发现CRC的新的非侵入性生物标记的很大潜力(Huang,Z.2009,Int J Cancer.published on line)。但是，另一项研究发现has-miR-92a在急性白血病病人血浆中显著下降，并且血浆中miR-92a/miR-638比例具有作为检测白血病的新生物标记的很大潜力(Tanaka,M.et al.(2009)PLoS ONE 4,e5532)。但是，由于缺乏足够的敏感性和特异性，单一的miRNA不适于作为准确的诊断生物标记用于临床应用。

[0014] 因此，仍然有必要发现一组结直肠癌病人血浆中或者血清中诊断miRNA标记。结合多种miRNA生物标记的基于血液的miRNA谱(特征)的确定会使非侵入性、快速的、精确的且经济的确定结直肠癌病人的方法成为可能。此外，还一直需要在高风险个体中针对早期阶段的相应方法即结直肠癌筛查、癌症复发的早期检测、和/或监测癌症治疗。

[0015] 发明目的和概述

[0016] 本发明的目的是提供用于诊断结直肠癌、监测癌治疗、和/或治疗结直肠癌的新方法，其中通过测定血中的多种核酸分子，每种核酸分子均编码微RNA(miRNA)序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在结直肠癌的血浆中经分析与健康对照相比和/或与健康个体、肝细胞癌和肺癌相比差异表达，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，该核酸表达特征是结直肠癌存在的指征，其中所述核酸表达特征包括肿瘤相关特征(tumor-related signature)和血浆特异性特征(plasma-specific signature)。

[0017] 此外，本发明的目的是提供用于在展现结直肠癌的血液中鉴别一或多种核酸表达特征的相应方法。更具体地，本发明的目的是提供用于与健康对照、和/或健康个体、肝细胞癌和肺癌相比较来区分结直肠癌的方法。

[0018] 这些及其它目的从以下描述将变得清楚，其通过独立权利要求的主题来达成。本发明的一些优选实施方案则通过从属权利要求的主题来限定。

[0019] 在第一方面，本发明涉及用于鉴别一或多种展现出结直肠癌的目标血浆的血液中分子标记物的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆中和在一或多种对照血浆中差异表达，其中所述一或多种差异表达的核酸分子源于肿瘤相关或血浆特异性特征，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，所述核酸表达特征是结直肠癌存在的指征。

[0020] 本文限定的核酸表达特征可包括至少35种核酸分子，优选至少12种核酸分子，特别优选至少6种核酸分子。

[0021] 在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照相比被上调；及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照相比被下调。

[0022] 在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包含编码肿瘤相关特征hsa-miR-409-3p、hsa-miR-25、hsa-miR-93、hsa-miR-96、hsamiR-301a、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-19b、hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsamiR-187*、hsa-miR-92a、hsa-miR-19a、hsa-miR-20b、hsa-miR-20a、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-107、hsa-miR-17、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-30e、hsa-miR-185；及 血 浆 特 异 性特 征 hsa-mir-671-3p、hsa-mir-16-2*、hsa-miR-30c-1*、hsa-miR-548c-5p、hsa-miR-16、hsa-miR-15a、hsa-miR-425、hsa-let-7i、hsamiR-363、hsa-miR-15b、hsa-miR-101、hsa-miR-190b、hsa-miR-130a、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-345；和内部稳定对照hsa-miR-1238和hsa-miR-1228的任意一种或多种核酸分子。

[0023] 特别优选地，与一或多种健康对照相比，在所述一或多种目标血浆中：编码hsa-miR-409-3p和hsa-mir-671-3p的的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；而编码hsa-miR-25、hsa-miR-93、hsa-miR-96、hsa-miR-301a、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-19b、hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-187*、hsa-miR-92a、hsa-miR-19a、hsa-miR-20b、hsa-miR-20a、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-107、hsamiR-17、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-30e、hsa-miR-185’hsa-mir-16-2*、hsa-miR-30c-1*、hsa-miR-548c-5p、hsa-miR-16、hsa-miR-15a、hsa-miR-425、hsa-let-7i、hsa-miR-363、hsa-miR-15b、hsa-miR-101、hsa-miR-190b、hsa-miR-130a、has-miR-331-3p和hsa-miR-345的任意一种或多种核酸分子表达被下调；hsa-miR-1238和hsa-miR-1228没有变化。

[0024] 在更优选的实施方案中，核酸表达特征包括编码肿瘤相关特征hsamiR-409-3p、hsa-miR-25、hsa-miR-93、hsa-miR-96、hsa-miR-301a、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-19b、hsa-miR-451和编码血浆特异性特征hsa-mir-671-3p、hsa-mir-16-2*、hsa-miR-30c-1*、hsa-miR-548c-5p的任意一种或多种核酸分子。

[0025] 特别优选地，与一种或多种健康对照相比，在一种或多种目标血浆中：编码hsa-miR-409-3p和hsa-mir-671-3p的任意一或多种核酸分子表达被上调；而编码hsa-miR-25、hsamiR-93、hsa-miR-96、hsa-miR-301a、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-19b、hsa-miR-451、hsamir-16-2*、hsa-miR-30c-1*和hsa-miR-548c-5p的任意一种或多种核酸分子表达被下调。

[0026] 在另一优选的实施方案中，核酸表达特征包含编码肿瘤相关特征hsa-miR-409-3p、hsa-miR-25、hsa-miR-93、hsa-miR-96 和 血 浆 特 异 性 特 征hsa-mir-671-3p、hsa-mir-16-2*的任意一种或多种核酸分子。

[0027] 特别优选地，与一种或多种健康对照相比，在一种或多种目标血浆中：编码hsa-miR-409-3p和hsa-mir-671-3p的任意一种或多种核酸分子的表达被上调，而编码hsa-miR-25、hsamiR-93、hsa-miR-96和and hsa-mir-16-2*的任意一种或多种核酸分子的表达被下调。

[0028] 在特别优选的实施方案中，核酸表达特征包括编码hsa-miR-409-3p/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-96、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-548c-5p、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-30c-1*、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-342-3p、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-96、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-301a、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-345、hsa-miR-409/hsa-miR-331-3p、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-331-3p、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-25、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-93和hsa-miR-671-3p/hsa-miR-93的任意一种或多种核酸分子组合。

[0029] 在第二方面，本发明涉及用于将结直肠癌与健康个体、肝细胞癌和肺癌的区别开的诊断试剂盒。所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆中和在一或多种健康个体、肝细胞癌和肺癌中差异表达，而其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，所述核酸表达特征是结直肠癌存在的指征。

[0030] 本文限定的核酸表达特征可包括至少23种核酸分子，优选至少18种核酸分子，以及更优选至少6种核酸分子。

[0031] 在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康个体、肝细胞癌和肺癌相比被上调；以及包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康个体、肝细胞癌和肺癌相比被下调。

[0032] 在更优选实施方案中，核酸表达特征包含编码：肿瘤相关特征hsa25miR-409-3p、hsa-miR-129-3p、hsa-miR-33b*、hsa-miR-7、hsa-miR-196b、hsa-miR-93、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-25、hsa-miR-92a、hsa-miR-19b；血 浆 特 异 性 特 征 hsa-miR-671-3p 和hsa-miR-16-2*、hsa-miR-92b、hsa-miR-129*、hsa-miR-563、hsamiR-602、hsa-miR-1227、hsa-miR-196a和内部稳定对照:hsa-miR-1238和hsa-miR-1228的任意一种或多种核酸分子。

[0033] 特别优选地，与健康个体、肝细胞癌和肺癌相比，一或多种目标血浆中编码 hsa-miR-409-3p、hsa-mir-671-3p、hsa-miR-33b*、hsa-miR-92b、hsa-miR-149、hsa-miR-129*、hsa-miR-563、hsa-miR-129-3p、hsa-miR-634、hsa-let-7b*、hsa-miR-602和hsa-miR-1227的任意一种或多种核酸分子表达被上调，而编码hsa-miR-16-2*、hsa-miR-7、hsa-miR-196a、hsamiR-196b、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-93、hsa-miR-25、hsa-miR-92a和hsa-miR-19b的任意一种或多种核酸分子表达被下调；hsa-miR-1238和hsa-miR-1228没有变化。

[0034] 在更优选的实施方案中，核酸表达特征包括编码肿瘤相关特征has-10miR-409-3p、hsa-miR-129-3p、hsa-miR-33b*、hsa-miR-7和血 浆 特异 性特 征hsa-miR-671-3p和hsa-miR-16-2*的任意一种或多种核酸分子。

[0035] 特别优选地，与健康个体、结直肠癌和肺癌相比，一种或多种目标血浆中编码hsa-miR-409-3p、hsa-miR-129-3p、hsa-miR-33b*、hsa-miR-671-3p的任意一种或多种核酸分子表达被上调；而编码hsa-miR-16-2*和hsa-miR-7的任意一种或多种核酸分子表达被下调。

[0036] 在特别优选的方案中，核酸表达特征包括编码hsa-miR-33b*/hsa20-miR-196a、hsa-miR-92b/hsa-miR-196a、hsa-miR-563/hsa-miR-196a、hsa-miR-1227/hsa-miR-196a、hsa-miR-129-3p/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-129*/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-92b/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-129*/hsa-miR-196a、hsa-miR-1227/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-129-3p/hsa-miR-196a、hsa-miR-602/hsa-miR-196a、hsa-miR-33b*/hsamiR-16-2*、hsa-miR-563/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-129*/hsa-miR-7、hsa-miR-33b*/hsa25-miR-7、hsa-miR-563/hsa-miR-7、hsa-miR-602/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-129-3p/hsamiR-7、hsa-miR-92b/hsa-miR-7、hsa-miR-1227/hsa-miR-7、hsa-miR-33b*/hsa-miR-196b、hsa-miR-1227/hsa-miR-196b、hsa-miR-92b/hsa-miR-196b和hsa-miR-602/has-miR-7的任意一种或多种核酸组合。

[0037] 第三方面，本发明涉及用于鉴别一或多种展现出结直肠癌的血浆的方法，所述方法包括：(a)在所述一或多种目标血浆中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列；(b)在一或多种健康对照血浆中确定所述多种核酸分子的表达水平；(c)通过对比在步骤(a)和(b)中获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴别出在所述目标血浆和对照血浆中差异表达的一或多种核酸分子，其中所述差异表达的一或多种核酸分子一起代表本文所定义的特征(signature)，其是结直肠癌存在的指征。

[0038] 在本发明的优选实施方案中，所述方法包括(a)在一或多种目标血浆中确定核酸分子组合的表达水平，每种核酸分子均编码微RNA序列，并用特定的公式计算；(b)在一或多种健康对照血浆中确定所述核酸分子组合的表达水平，并用特定的公式计算；以及(c)通过比较在(a)和(b)步骤中所获得的各自的表达水平来鉴别所述组合在所述一或多种目标血浆中的差异,其中一或多种差异表达的组合一切代表特征，其表明结直肠癌的存在。

[0039] 在更优选的实施方案中，本方法进一步用于将结直肠癌与健康个体、肝细胞癌和肺癌区别开。

[0040] 第四方面，本发明涉及用于监测结直肠癌治疗的方法，所述方法包括：(a)通过使用本文所定义的方法在一或多种目标血浆中鉴别核酸表达特征；和(b)在血液中监测所述核酸表达特征所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述监测以如下的方式进行，即其血浆中的表达在治疗前被上调的核酸分子的表达在治疗后被下调，而其血浆中的表达在治疗前被下调的核酸分子的表达在治疗后被上调。

[0041] 第五方面，本发明涉及用于预防或治疗结直肠癌的方法，所述方法包括：(a)用本文限定的方法在血浆中鉴别核酸表达特征；和(b)在血液中改变所述核酸表达特征所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述改变以如下的方式进行，即其表达在血液中被上调的核酸分子的表达被下调，而其表达在血液中被下调的核酸分子的表达被上调。

[0042] 第六方面，本发明涉及用于预防和/或治疗血液中的结直肠癌的药物组合物，所述组合物包含一或多种核酸分子，每种核酸分子均编码序列，所述序列与如本文所定义的在来自结直肠癌患者的血浆中其表达被上调的核酸分子所编码的微RNA序列至少部分互补，和/或所述序列对应于如本文所定义的在来自结直肠癌患者的血浆中其表达被下调的核酸分子所编码的微RNA序列。

[0043] 最后，第七方面，本发明涉及所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝细胞癌的药物中的用途。

[0044] 本发明的其它实施方案从以下详细描述中将变得明了。

[0045] 附图简述

[0046] 图1：示出流程图，其系统地阐明了参照本发明的方法来确定表达特征的基本方法步骤，用于鉴别一或多种展现出结直肠癌的目标血浆。

[0047] 图2：描述了根据本发明确定结直肠癌中一个或多个目标血浆，包含在第一个方面中特别优选表达特征中的人类miRNA。也说明了结直肠癌患者与健康对照相比，这些miRNA的表达水平和准确性(RUC)(即上调或下调)。

[0048] 图3：描述了结直肠癌进展中两个上调(hsa-miR-409-3p和has-miR-671-3p)的miRNA的各自表达水平和ROC曲线分析，这些病例从Dukes′A、B、C和D癌症分组中挑选得到。数据分别从微阵列获得，并已与内部稳定对照has-miR-1238标准化后得到。数据表明可通过本发明发现的miRNA特征检测到Dukes′A阶段的结直肠癌。

[0049] 图4：说明了依据本发明的第二个方面中特别优选表达特征中包含的人类miRNA,目的是为了进一步区分结直肠癌和健康对照、肝细胞癌和肺癌。同样表明结直肠癌与健康对照、肝细胞癌和肺癌相比，病人的这些miRNA的表达水平和准确性(AUC)(即上调或下调)。第一位的组合(hsa20-miR-33b*/hsa-miR-196a)表明其作为区分CRC和健康个体、肝细胞癌和肺癌的诊断生物标记的准确性为85％(AUC=0.860)。

[0050] 图5：描述两个肿瘤相关miRNA的ROC曲线分析示例(hsa-miR-93和hsa-miR-25)，这两个miRNA通过定量RT-PCR方法测定结直肠癌和健康对照血浆获得(0：健康个体；1：结直肠癌)。结果表明这些miRNA作为诊断生物标记的高敏感性和特异性。

[0051] 发明详述

[0052] 本发明基于如下出乎意料的发现，即结直肠癌能可靠地通过血浆中特定miRNA表达特征以高准确性和灵敏性来鉴定，其中所述表达特征如本文定义典型地包括被上调和下调的人类miRNA。更特别地，所述miRNA表达特征—通过分析血浆中整体miRNA表达模式和/或各个miRNA表达水平—使得能检测早期疾病状态下的HCC以及鉴别健康个体、肝细胞癌和肺癌。

[0053] 以下例证的本发明可以合适地在不存在未在本文中具体揭示的任何一或多个元件、一或多种限制的条件下实施。

[0054] 本发明将根据特定的实施方案并参照附图加以描述，但是本发明不受其限制，仅受权利要求书限制。所描述的附图仅是示意性的，被认为是非限制性的。

[0055] 当术语“包含”被用于本发明说明书和权利要求书中时，其不排除其它元件或步骤。为本发明目的，术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中组被限定为包含至少一定数目的实施方案，这也被理解为揭示了优选地仅由这些实施方案组成的组。

[0056] 当指代单数形式名词使用不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”时，包括该名词的复数形式，除非特别指出。

[0057] 术语“大约”在本发明中是指本领域技术人员理解仍能保证目的特征的技术效果的准确性区间。该术语通常表示偏离指示值的±10％，优选±5％。

[0058] 另外，术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等在说明书和权利要求书中用于区分类似的元件，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解如此应用的术语在合适情况下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本文所述或例证的其它顺序操作。

[0059] 术语的进一步定义在以下使用术语时给出。

[0060] 以下术语或定义仅为了理解本发明而提供。这些定义不应被认为具有小于本领域技术人员理解的范围。

[0061] 本发明的一个目的是通过测定血液中多种核酸分子，为诊断结直肠癌、监测癌症治疗、和/或治疗结直肠癌提供新的方法，每种核酸分子均编码微RNA(miRNA)序列，其中所述多种核酸分子中的一种或多种在结直肠癌血浆与健康个体、肝细胞癌和肺癌血浆中差异表达，其中所述一种或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，该核酸表达特征是结直肠癌存在的指征，其中的核酸表达特征包括肿瘤相关特征和血浆特异性特征。

[0062] 本文的术语“结直肠”指的是结肠、直肠和/或阑尾，即整个大肠。

[0063] 本文术语“癌症”(也称为癌)通常指任何类型的恶性新生物，即与未受影响的(健康)野生型对照细胞相比显示或具有发生癌特征倾向的靶细胞的任何形态学和/或生理学改变(基于遗传重编程(genetic re-programming))。这种改变的例子可涉及细胞大小和形状(变大或变小)、细胞增殖(细胞数增加)、细胞分化(生理学状态变化)、凋亡(程序性细胞死亡)或细胞存活。因此，术语“结直肠癌”指的是结肠、直肠和阑尾的癌性生长。

[0064] 最常见的结直肠癌(CRC)细胞类型是腺癌，大约占95％。其他类型的CRC包括尤其是淋巴瘤和鳞癌。

[0065] 结 直 肠 癌 可 根 据 Dukes 系 统 分 类 (Dukes，C.E.(1932)J.Pathol.Bacteriol.35,323-325)。包括以下分期：Dukes A-肿瘤局限于肠壁；Dukes B-肿瘤侵犯穿过肠壁；Dukes C-肿瘤涉入淋巴结；Dukes D-肿瘤有远处转移。

[0066] 本文术语“血浆”指的是血液的黄色液体成分，其中全血的血细胞通常会悬浮。大约占整个血液体积的55％。绝大部分是水(90％体积)并含有溶解的蛋白、葡萄糖、凝集因子、矿物质离子、激素和二氧化碳(血浆是分泌产物运输的主要介质)。血浆通过将新鲜血液在离心机中离心直到血细胞沉降到离心管底部而制备。然后血浆被纯化和转移。血浆的密度大约是1025kg/m3,或1.025kg/l。现今的研究表明miRNA在血浆中是稳定的。术语“血浆样本”指的是从被检测的个体或者健康对照获得的血浆。

[0067] 本文所用术语“患者”，是指至少应该被认为是患有肝细胞癌的人；本文所用术语“目标血浆”是指从患者获取的血浆；术语“健康个体”或“健康对照”特指不具有任一癌症表现的健康个体。并且这里“对照血浆”是指从这些健康个体获取的血浆。但是，在一些应用里，例如，当比较不同的癌症类型时，这些个人有其他的癌症类型，这些从这些个体中获取的血浆也被特指为“对照”。

[0068] 通常，所用的血浆样本来源于被诊断为结直肠癌的研究对象的生物学样本。另外，为了更确定从“对比样本”获得数据，可从已知疾病状态的研究对象中收集。生物学样本可包括身体组织和液体，例如结直肠组织、血清、血细胞、痰液和尿液。此外，生物学样本可从具有结直肠癌特征或者疑似病例中获得。此外，如有有必要，样本可从得到的身体组织和液体中纯化得到，然和作为生物学样本。根据本发明，核酸分子标记的表达水平通过研究对象来源的生物学样本测定得到。

[0069] 在本发明的体外方法中用于检测的样品通常应以临床可接受的方式收集，优选以保护核酸(特别是RNA)或蛋白质的方式收集。待分析的样品典型地是血液。另外，肝组织及其它类型样品也可以使用。样品特别在最初加工之后可以合并。但是也可以使用未合并的样品。

[0070] 本文所用术语“微RNA”(或“miRNA”)是其在本领域的普通含义(Bartel,D.P.(2004)Cell 23,281-292；He,L.and Hannon,G.J.(2004)Nat.Rev.Genet.5,522-531)。因此，“微RNA”是指衍生自基因组基因座的RNA分子，其从可以形成局部RNA前体miRNA结构的转录物加工而来。成熟miRNA通常长度为20、21、22、23、24或25个核苷酸，其它数目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27个核苷酸。

[0071] miRNA编码序列具有与侧翼基因组序列配对的潜力，使成熟miRNA放置在非完全配对的RNA双链体之内(本文也称作茎-环或发夹结构或pre-miRNA)，所述双链体作为从更长的前体转录物进行miRNA加工的中间体。这一加工典型地通过分别称为Drosha和Dicer的两种特异的内切核酸酶的连续作用而发生。Drosha从初级转录物(本文也称作“pri-miRNA”)产生典型地折叠成发夹或茎-环结构的miRNA前体(本文也称作“pre-miRNA”)。从这个miRNA前体，通过Dicer切割miRNA双链体，其在发夹或茎-环结构的一条臂包含成熟miRNA，在另一条臂包含类似大小的节段(通常称为miRNA*)。miRNA然后被导向其靶mRNA以发挥其功能，而miRNA*被降解。另外，miRNA典型地衍生自与预测的蛋白质编码区不同的基因组节段。

[0072] 本文所用术语“miRNA前体”(或“前体miRNA”或“pre-miRNA”)是指从其加工成熟miRNA的miRNA初级转录物的部分。典型地，pre-miRNA折叠成稳定的发夹(即双链体)或茎-环结构。发夹结构典型地长度为50-80个核苷酸，优选60-70个核苷酸(计数miRNA残基，与miRNA配对的残基，及任何间插节段，但排除更远端的序列)。

[0073] 本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”是指编码微RNA(miRNA)的任何核酸分子。因此，该术语不仅指成熟miRNA，也指相应的如上所述的前体miRNA及初级miRNA转录物。另外，本发明不限于RNA分子，也包括相应的编码微RNA的DNA分子，例如通过逆转录miRNA序列产生的DNA分子。编码本发明的微RNA序列的核酸分子典型地编码单个miRNA序列(即个体miRNA)。但是，也可能这种核酸分子编码两个或多个miRNA序列(即两个或多个miRNA)，例如一个转录单位包含在常用调节序列如启动子或转录终止子控制下的两个或多个miRNA序列。

[0074] 本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”也被理解为包括“有义核酸分子”(即核酸序列(5′→3′)匹配或相应于所编码的miRNA(5′→3′)序列的分子)及“反义核酸分子”(即核酸序列互补于所编码的miRNA(5′→3′)序列或者换句话说匹配所编码的miRNA序列的反向互补序列(3′→5′)的分子)。本文所用术语“互补”是指“反义”核酸分子序列与相应的“有义”核酸分子序列(具有互补于反义序列的序列)形成碱基对、优选Watson-Crick碱基对的能力。

[0075] 在本发明范围内，两个核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以完全互补，即它们不含有任何碱基错配和/或额外的或缺失的核苷酸。或者，两个分子包含一或多个碱基错配或者在它们的核苷酸总数上不同(由于添加或缺失导致)。优选地，“互补”核酸分子包含与包含在相应的“有义”核酸分子中的序列显示完全互补性的至少10个连续核苷酸。

[0076] 因此，包含在本发明的诊断试剂盒中的编码miRNA序列的多种核酸分子可包括一或多种“有义核酸分子”和/或一或多种“反义核酸分子”。有时，诊断试剂盒包括一或多种“有义核酸分子”(即miRNA序列本身)，所述分子被认为组成了差异表达的miRNA(即分子标记)的全体或至少亚集合，所述差异表达的miRNA是存在或发生特定病症倾向的指征，本文是结直肠癌。另一方面，当诊断试剂盒包括一或多种“反义核酸分子”(即与miRNA序列互补的序列)时，所述分子可包含适合用于检测和/或定量给定样品中的一或多种特定(互补)miRNA序列的探针分子(用于进行杂交测定)和/或寡核苷酸引物(例如用于逆转录或PCR应用)。

[0077] 在本发明中定义的多种核酸分子可以包含至少2种、至少10种、至少50种、至少100种、至少200种、至少500种、至少1000种、至少10000种或至少100000种核酸分子，每种分子编码miRNA序列。

[0078] 本文所用术语“差异表达”是指特定miRNA在目标血浆中的表达水平相比于健康对照血浆是改变的，其可以是上调(即在目标血浆中miRNA浓度增加)或下调(即在目标血浆中miRNA浓度降低或消失)。换句话说，核酸分子在目标血浆中被激活至比在对照血浆中更高或更低的水平。

[0079] 本发明范围内，核酸分子被认为是差异表达的，如果该核酸分子在靶细胞和对照细胞中的相应表达水平典型地相差至少5％或至少10％，优选地至少20％或至少25％，最优选地至少30％或至少50％。因此，后者的值相应于给定核酸分子在靶细胞中的表达水平相比于野生型对照细胞分别上调至少1.3倍或至少1.5倍，或者反之在靶细胞中的表达水平下调至少0.7倍或至少0.5倍。

[0080] 本文所用术语“表达水平”是指特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度，即miRNA在一或多种被分析血浆中的浓度。

[0081] 如上所述，术语“对照血浆”典型地是指不具有HCC表型特征的(健康)血浆。但是，在一些应用中，例如当比较显示不同的癌或癌前状态的血浆时，具有较不严重疾病特征的血浆典型地被认为是“对照血浆”。

[0082] 表达水平的确定典型地遵循本领域熟知的已建立的标准程序(Sambrook,J.et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel,F.M.et al.(2001)Current Pro-cols in Molecular Biology.Wiley & Sons,Hoboken,NJ)。确定可以在RNA水平进行，例如使用miRNA特异性探针进行Northern印迹分析，或者在逆转录(及克隆)RNA群后例如通过定量PCR或实时PCR技术在DNA水平进行。本文所用术语“确定”包括分析编码上述微RNA序列的任何核酸分子。但是，由于pri-miRNA及re-mRNA半衰期短，典型地仅测量成熟miRNA的浓度。

[0083] 在具体的实施方案中，在给定样品的若干独立测量(例如两个、三个、五个或十个测量)和/或在一群目标血浆或对照血浆内的若干测量中获得的表达水平的标准值被用于分析。标准值可以用本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2SD(标准差)或平均值±3SD的范围可被用作标准值。

[0084] 所获得的疾病或对照血浆表达水平之间的差异可以归一化至进一步的对照核酸例如管家基因的表达水平，管家基因的表达水平已知不根据获得样本的个体的疾病状态而不同。举例的管家基因包括β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1等。在优选的实施方案中，对照核酸是已知在收集样本的不同非癌和癌(前)状态中稳定表达的另一种miRNA。

[0085] 但是，代替在任何实验中测定血浆样本表达水平，也可以基于实验证据和/或现有技术数据定义针对特定疾病表型(即疾病状态)的一或多个截断值。在这种情况中，血浆样本的格子表达水平可以用用于归一化的稳定表达的对照miRNA测定。如果计算的“归一化”的表达水平高于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达上调的指征。反之，如果计算的“归一化”的表达水平低于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达下调的指征。

[0086] 在本发明的背景下中，术语“鉴定结直肠癌和/或区分其他类型癌”也包括预测和可能性分析(“诊断”意义上)。本文公开的组合物和方法意在临床应用，以决定治疗形式，包括治疗性干预，诊断标准如疾病阶段，和疾病监控和疾病监视。根据本发明，可提供用于检查对象状态的中间结果。这种中间结果可与额外信息组合以帮助医生、护士或其它从业人员诊断出该对象患有该疾病。或者，本发明可用于检测对象衍生组织中的癌细胞，并提供有用信息给医生以进行诊断。另外，本发明还用于区分结直肠癌和其他类型癌包括肝细胞癌和肺癌。

[0087] 在本发明中，所鉴定的一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达特征，该核酸表达特征是通过血浆样本鉴定结直肠癌存在的指征。本文所用术语“表达特征”是指一组核酸分子(例如miRNA)，其中各个核酸分子的表达水平在结直肠癌血浆和健康对照之间不同。本文中，核酸表达特征也指一组标记并代表最低数目的(不同)核酸分子，每种核酸分子编码能鉴定个体的表型状态的miRNA序列。

[0088] 在一个方面，本发明涉及为确定结直肠癌的血液分子标记的诊断试剂盒，此试剂盒包括多种核酸分子，每种核酸分子编码一种microRNA序列。其中所述一中或多种核酸分子在目标血浆和健康对照组中差异表达，并且其中差异表达的标记来源于肿瘤相关的或者血浆特异性标记，并且这其中一个或者多个差异表达的核苷酸分子一起代表一个核酸表达特征表明了结直肠癌的存在。

[0089] 本文限定的核酸表达特征可包括至少35中核酸分子，优选地至少12种核酸分子，且特别优选地至少6中核酸分子。

[0090] 在优选的实施方案中，核酸分子表达特征包括至少一种编码miRNA序列的核酸分子，其表达在一个或多个血浆中相比一个或多个对照组而言有上调，并且至少一种编码microRNA的核酸分子，其表达在一个或多个血浆中相比一个或多个健康对照而言有下调。

[0091] 本文所用的术语“来源于肿瘤”或“肿瘤来源的”指的是结直肠癌病人和对照血浆中差异表达的特征，并且在结直肠癌组织细胞核非癌组织细胞中也差异表达。

[0092] 本文所用的结直肠癌组织细胞，指的是从诊断为结直肠癌研究对象中切出收集到结直肠癌细胞。本文所用的非癌组织细胞通常是指没有癌表型特征的一个(健康)野生型细胞。

[0093] 本文所用术语“血浆特异性的”指的是结直肠癌病人和对照血浆中差异表达，并在结肠癌组织细胞和非癌组织细胞没有显著差异。

[0094] 通常，包含在核酸表达特征中的核酸分子是人类序列(以后称为“has”(智人(Homo sapiens)))。

[0095] 在本发明的优选实施方案中，核酸表达特征包括编码肿瘤相关的hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:1)，hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)，hsa-miR-93(SEQ ID NO:3)，hsa-miR-96(SEQ ID NO:4)，hsa-miR-301a(SEQ ID NO:5)，hsa-miR-342-3p(SEQ ID NO:6)，hsa-miR-19b(SEQ ID NO:7)，hsa-miR-451(SEQ ID NO:8)，hsa-miR-486-5p(SEQ ID NO:9)，hsa-miR-187*(SEQ IDNO:10)，hsa-miR-92a(SEQ ID NO:11)，hsa-miR-19a(SEQ ID NO:12)，hsa-miR-20b(SEQ ID NO:13)，hsa-miR-20a(SEQ ID NO:14)，hsa-miR-139-3p(SEQ ID NO:15)，hsamiR-107(SEQ ID NO:16)，hsa-miR-17(SEQ ID NO:17)，hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:18)，hsa-miR-30e(SEQ ID NO:19)，hsa-miR-185(SEQ ID NO:20)的任意一种或多种核酸分子的表达；编码血浆特异性的hsa-mir-671-3p(SEQ ID NO:21)，hsa-mir-16-2*(SEQ ID NO:22)，hsa-miR-30c-1*(SEQ ID NO:23)，hsa-miR-548c-5p(SEQ ID NO:24)，hsa-miR-16(SEQ ID NO:25)，hsa-miR-15a(SEQ ID NO:26)，hsa-miR-425(SEQ ID NO:27)，hsa-let-7i(SEQ ID NO:28)，hsa-miR-363(SEQ ID NO:29)，hsa-miR-15b(SEQ ID NO:30)，hsa-miR-101(SEQ ID NO:31)，hsa-miR-190b(SEQ ID NO:32) 和 hsa-miR-130a(SEQ ID NO:33)，hsa-miR-331-3p(SEQ ID NO:46)，hsa-miR-345(SEQ ID NO:47)任意一 种或多种核酸分子的表达；编码稳定内部稳定对照的hsa-miR-1238(SEQ ID NO:36)和hsa-miR-1228(SEQ ID NO:37)的核酸分子。

[0096] 为了将血浆中核酸分子(即在核酸表达特征中所包含的编码微RNA序列的核酸分子)的表达水平归一化，可优选使用miRNAhsa-miR-1238(SEQ ID NO:44)和hsa-miR-1228(SEQ ID NO:45)，其在结直肠癌血浆中稳定表达。

[0097] 上述miRNA的核酸序列列于表1。

[0098] 表1

[0099]

[0100]

[0101] 本文公开的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也 可 参 见 Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36,D154-D158)。

[0102] 特别优选地，与在一或多种对照血浆中相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-409-3p和hsa-mir-671-3p的任意一种或多种核酸分子的表达被上调、而编码hsa-miR-25、hsa-miR-93、hsa-miR-96、hsa-miR-301a、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-19b、hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-187*、hsa-miR-92a、hsa-miR-19a,hsa-miR-20b、hsa-miR-20a、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-107、hsa-miR-17、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-30e、hsa-miR-185’hsa-mir-16-2*、hsa-miR-30c-1*、hsamiR-548c-5p、hsa-miR-16、hsa-miR-15a、hsa-miR-425、hsa-let-7i、hsa-miR-363、hsa-miR-15b、hsa-miR-101、hsa-miR-190b、hsa-miR-130a、hsa-miR-331-3p和hsa-miR-345的任意一种或多种核酸分子的表达被下调；hsa-miR-1238和hsa-miR-1228无变化。

[0103] 如本文所用，术语“所述多种核酸分子的一或多种”及“任意一种或多种人靶细胞衍生的核酸分子”可涉及所述多种核酸分子的任何亚群，例如任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种、任七种、任八种、任九种、任十种等核酸分子，每种核酸分子均编码包含于所述核酸表达特征内的微RNA序列。

[0104] 在特别优选的实施方案中，核算表达特征包括编码hsa-miR-409-3p/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-96、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-548c-5p、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-30c-1*、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-342-3p、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-96、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-301a、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-345、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-345、hsa-miR-409/hsa-miR-331-3p、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-331-3p、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-25、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-93和hsa-miR-671-3p/hsa-miR-93的任意一种或多种核酸分子表达的组合。

[0105] 本文所用术语“核酸组合”指的是整体上应用至少两种核酸表达水平。优选地可整体通过一个公式利用相对变化或计算结果。

[0106] 在第二方面，本发明涉及用于将结直肠癌与健康个体、肝细胞癌和肺癌的区别开的诊断试剂盒。所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆中和在一或多种健康个体、肝细胞癌和肺癌中差异表达，而其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，所述核酸表达特征是结直肠癌存在的指征。

[0107] 本文限定的核酸表达特征可包括至少23种核酸分子，优选至少18种核酸分子，以及更优选至少6种核酸分子。

[0108] 在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康个体、肝细胞癌和肺癌相比被上调；以及包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康个体、肝细胞癌和肺癌相比被下调。

[0109] 在优选实施方案中，核酸表达特征包括编码：肿瘤相关特征hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:1)，hsa-miR-129-3p(SEQ ID NO:34)，hsa-miR-33b*(SEQ ID NO:35)，hsa-miR-7(SEQ ID NO:36)，hsa-miR-196b(SEQ ID NO:37)，hsa-miR-93(SEQ ID NO:3)，hsa-miR-486-5p(SEQ ID NO:9)，hsamiR-25(SEQ ID NO:2)，hsa-miR-92a(SEQ ID NO:11)，hsa-miR-19b(SEQ ID NO:7)；血浆特异性特征hsa-miR-671-3p(SEQ ID NO:21)，hsa-miR-16-2*(SEQ ID NO:22)，hsa-miR-92b(SEQ ID NO:38)，hsa-miR-129*(SEQ ID NO:39)，hsa-miR-563(SEQ ID NO:40)，hsa-miR-602(SEQ ID NO:41)，hsamiR-1227(SEQ ID NO:42)，hsa-miR-196a(SEQ ID NO:43)和内部稳定对照hsa-miR-1238(SEQ ID NO:44)和hsa-miR-1228(SEQ ID NO:45)的任意一种或多种核酸分子。

[0110] 上述miRNA的核酸序列列于表2。

[0111] 表2

[0112]

[0113] 本文公开的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也 可 参 见 Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36,D154-D158)。

[0114] 在更优选的实施方案中，与健康个体、肝细胞癌和肺癌相比，一或多种目标血浆中 编 码 hsa-miR-409-3p、hsa-mir-671-3p、hsa-miR-33b*、hsa-miR-92b、hsa-miR-149、hsa-miR-129*、hsa-miR-563、hsa-miR-129-3p、hsa-miR-634、hsa-let-7b*、hsa-miR-602和hsa-miR-1227的任意一种或多种核酸分子表达被上调，而编码hsa-miR-16-2*、hsa-miR-7、hsa-miR-196a、hsamiR-196b、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-93、hsa-miR-25、hsa-miR-92a和hsa-miR-19b的任意一种或多种核酸分子表达被下调；hsa-miR-1238和hsa-miR-1228没有变化。

[0115] 在更优选的实施方案中，核酸表达特征包括编码hsa-miR-33b*/hsa20-miR-196a、hsa-miR-92b/hsa-miR-196a、hsa-miR-563/hsa-miR-196a、hsa-miR-1227/hsa-miR-196a、hsa-miR-129-3p/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-129*/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-92b/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-129*/hsa-miR-196a、hsa-miR-1227/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-129-3p/hsa-miR-196a、hsa-miR-602/hsa-miR-196a、hsa-miR-33b*/hsamiR-16-2*、hsa-miR-563/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-129*/hsa-miR-7、hsa-miR-33b*/hsa25-miR-7、hsa-miR-563/hsa-miR-7、hsa-miR-602/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-129-3p/hsamiR-7、hsa-miR-92b/hsa-miR-7、hsa-miR-1227/hsa-miR-7、hsa-miR-33b*/hsa-miR-196b、hsa-miR-1227/hsa-miR-196b、hsa-miR-92b/hsa-miR-196b和hsa-miR-602/has-miR-7的任意一种或多种核酸组合。

[0116] 第三方面，本发明涉及用于鉴别一或多种展现出结直肠癌的血浆的方法，所述方法包括：(a)在所述一或多种目标血浆中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列；(b)在一或多种健康对照血浆中确定所述多种核酸分子的表达水平；(c)通过对比在步骤(a)和(b)中获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴别出在所述目标血浆和对照血浆中差异表达的一或多种核酸分子，其中所述差异表达的一或多种核酸分子一起代表本文所定义的特征(signature)，其是结直肠癌存在的指征。

[0117] 在本发明的优选实施方案中，所述方法包括(a)在一或多种目标血浆中确定核酸分子组合的表达水平，每种核酸分子均编码微RNA序列，并用特定的公式计算；(b)在一或多种健康对照血浆中确定所述核酸分子组合的表达水平，并用特定的公式计算；以及(c)通过比较在(a)和(b)步骤中所获得的各自的表达水平来鉴别所述组合在所述一或多种目标血浆中的差异,其中一或多种差异表达的组合一切代表特征，其表明结直肠癌的存在。

[0118] 在更优选的实施方案中，本方法进一步用于将结直肠癌与健康个体、肝细胞癌和肺癌区别开。

[0119] 第四方面，本发明涉及用于监测结直肠癌治疗的方法，所述方法包括：(a)通过使用本文所定义的方法在一或多种目标血浆中鉴别核酸表达特征；和(b)在血液中监测所述核酸表达特征所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述监测以如下的方式进行，即其血浆中的表达在治疗前被上调的核酸分子的表达在治疗后被下调，而其血浆中的表达在治疗前被下调的核酸分子的表达在治疗后被上调。

[0120] 如本文所用，术语“改变编码miRNA序列的核酸分子的表达”是指对特定核酸分子的任何操纵以导致所述分子的表达水平改变，即与“野生型”(即未改变的对照)的表达相比产生不同量的相应miRNA。如本文所用，术语“不同量”既包括与未改变的对照相比较高的量，也包括较低的量。换句话说，如本文所定义的操纵可以是上调(即激活)或下调(即抑制)核酸分子的表达(即特别是转录)

[0121] 第五方面，本发明涉及用于预防或治疗结直肠癌的方法，所述方法包括：(a)用本文限定的方法在血浆中鉴别核酸表达特征；和(b)在血液中改变所述核酸表达特征所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述改变以如下的方式进行，即其表达在血液中被上调的核酸分子的表达被下调，而其表达在血液中被下调的核酸分子的表达被上调。

[0122] 在本发明中，核酸表达特征中所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达以这样的方式被修饰，由此其表达在所述一或多种目标血浆中被上调的核酸分子的表达被下调且其表达在所述一或多种目标血浆中被下调的核酸分子的表达被上调。换句话说，编码miRNA序列的特定核酸分子的表达的修饰以与所述分子在所述一或多种癌目标血浆中的调节作用的反方式(anti-cyclical)的发生，以在所述一或多种目标血浆中干扰被上调的分子的“过度活性”和/或恢复被下调的分子的“缺陷活性”。

[0123] 在本发明方法的一个优选实施方案中，下调核酸分子的表达包括将编码与被下调的核酸分子编码的微RNA序列互补的序列的核酸分子导入病人体内。

[0124] 如本文所用术语“导入血液中”是指使得一或多种核酸分子转移进入血液中的任何操纵。这种技术的例子包括本领域熟知的注射、消化和其他技术。

[0125] 如本文所用术语“互补序列”是指导入一或多种细胞中的“互补”核酸分子(本文也称作“反义核酸分子”)能与上调的内源“有义”核酸分子形成碱基对，优选Watson-Crick碱基对。

[0126] 两种核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以是完全互补的，即其不含有任何碱基错配和/或添加或缺失核苷酸。在其它实施方案中，这两种分子包含一或多个碱基错配或者其核苷酸总数不同(由于添加或缺失所致)。在另外的实施方案中，“互补”核酸分子包含一段与上调的“有义”核酸分子中包含的序列完全互补的至少十个连续核苷酸。

[0127] “互补”核酸分子(即编码与下调的核酸分子编码的微RNA序列互补的核酸序列的核酸分子)可以是天然发生的DNA-或RNA分子或者在其序列中包含一或多个相同类型或一或多种不同类型的修饰核苷酸的合成的核酸分子。

[0128] 例如，可能这种核酸分子包含至少一个核糖核苷酸主链单位及至少一个脱氧核糖核苷酸主链单位。此外，所述核酸分子可含有一或多个RNA主链修饰为2′-O-甲基基团或者2′-O-甲氧基基团(也称作2′-O-甲基化)，其防止在培养基中核酸酶降解，并且重要地是也防止RNA诱导性沉默复合物核酸酶的内核分离，导致miRNA的不可逆抑制。另一可能的修饰(其功能等价于2′-O-甲基化)包含锁定核酸(LNA)，代表含有一或多个LNA核苷酸单体的核酸类似物，所述单体在RNA模拟糖构象中具有锁定双环呋喃糖单位(Orom,U.A.et al.(2006)Gene 372,137-141)。

[0129] 最近开发了另一类的miRNA表达沉默基因。这些称作“antagomirs”的化学工程化寡核苷酸是与胆固醇缀合的单链23个核苷酸的RNA分子(Krutzfeldt,J.et al.(2005)Nature 438,685-689)。作为这种化学修饰寡核苷酸的另一选择，产生了作为RNA从转基因中产生的可以在细胞中表达的微RNA抑制剂。称作“微RNA海绵(microRNA sponges)”的这些竞争性抑制剂是从强启动子表达的转录物，含有感兴趣的微RNA的多个串联结合位点(Ebert,M.S.et al.(2007)Nat.Methods 4,721-726)。

[0130] 在本发明方法的特别优选的实施方案中，其表达相对于表达特征而被下调的一或多种核酸分子编码选自如下一组的微RNA序列：hsa-miR-25，hsa-miR-93，hsa-miR-96，hsa-miR-301a，hsa-miR-342-3p，hsa-miR-19b，hsa-miR-451，hsamiR-486-5p，hsa-miR-187*，hsa-miR-92a，hsa-miR-19a，hsa-miR-20b，hsa-miR-20a，hsa-miR-139-3p，hsa-miR-107，hsa-miR-17，hsa-miR-140-3p，hsa-miR-30e，hsa-miR-185，hsa-miR-16-2*，hsa-miR-30c-1*，hsa-miR-548c-5p，hsa-miR-16，hsa-miR-15a，hsa-miR-425，hsa-let-7i，hsa-miR-363，hsa-miR-15b，hsa-miR-101，hsa-miR-190b，hsa-miR-130a，hsa-miR-7，hsa-miR-196b和hsa-miR-196a，如上所述可能是结直肠癌的指征。

[0131] 在本发明方法的另一优选的实施方案中，上调核酸分子表达包括将编码被上调的核酸分子编码的微RNA序列的核酸分子导入血液中。换句话说，编码miRNA序列的核酸分子的表达的上调通过将所述miRNA序列的另一拷贝(即另外的“有义”核酸分子)导入所述一或多种细胞中而实现。导入一或多种靶细胞中的所述“有义”核酸分子可包含与上述“反义”核酸分子相同的修饰。

[0132] 在本发明方法的特别优选的实施方案中，其表达相对于表达特征而被上调的一或多种核酸分子编码选自如下一组的微RNA序列：hsa-miR-409-3p，hsa-miR-671-3p,hsa-miR-129-3p,hsa-miR-33b*,hsa-miR-92b,hsa-miR-129*,hsa-miR-563,hsa-miR-602 和hsa-miR-1227，如上所述可能是结直肠癌的指征。

[0133] 导入血液中以修饰一或多种编码核酸表达特征中所包含的微RNA序列的核酸分子的表达的“有义”和/或“反义”核酸分子可以与调节序列可操纵地连接以使得所述核苷酸序列表达。

[0134] 为了阐明癌性或癌前样品中鉴别的miRNA的任何潜在关联，可以进行关于所述miRNA可以结合的mRNA靶序列的鉴别的预备功能分析。基于发现miRNA既可以参与肿瘤阻抑也可以参与肿瘤发生(Esquela-Kerscher,A.and Slack,F.J(2006)如前文；Calin,G.A.and Croce,C.M.(2007)如前文；Blenkiron,C.and Miska,E.A.(2007)如前文)，可以推测这种miRNA的mRNA靶位点包括肿瘤阻抑基因以及癌基因。

[0135] 如果核酸分子包含含有关于转录和/或翻译调节信息的序列元件，且这种序列“可操纵地连接”于编码多肽的核苷酸序列，则称该核酸分子为“能表达核酸分子”或者能“使得核苷酸序列表达”。可操纵地连接是其中所述调节序列元件与被表达的序列(和/或互相表达的序列)以能使得基因表达的方式进行连接的连接。

[0136] 为基因表达必需的调节区的确切性质在不同物种中可以不同，但是通常这些区域均包含启动子，在原核生物中其含有两个启动子，即指导转录起始的DNA元件以及当转录为RNA时发出翻译起始信号的DNA元件。这种启动子区域通常包括参与转录和翻译起始的5′非编码区，如在原核生物中的-35/-10盒和Shine-Dalgarno元件或者在真核细胞中的TATA盒、CAAT序列和5′-加帽元件。这些区域也可以包括增强子或阻抑子元件以及翻译信号和前导序列以将天然多肽靶向于宿主细胞的特定区室。另外，3′非编码序列可含有参与转录终止、聚腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定的宿主细胞中的功能不令人满意，则可以用在该细胞中发挥功能的信号取代。

[0137] 此外，如本文定义的核酸分子的表达也可以通过例如存在修饰的核苷酸而影响(如上所述)。例如，锁定核酸(LNA)单体被认为通过增强对降解的抗性及通过稳定对于沉默活性关键的miRNA-靶双链体结构而增加体内miRNA的功能性半衰期(见例如Naguibneva,I.et al.(2006)Biomed.Pharmacother 60,633-638)。

[0138] 因此，被导入提供的血液中的本发明的核酸分子可包括调节序列，优选启动子序列，任选还包括转录终止序列。所述启动子可以允许组成型或者可诱导的基因表达。合适启动子包括大肠杆菌(E.coli)lacUV5和tet(四环素应答)启动子、T7启动子以及SV40启动子或者CMV启动子。

[0139] 本发明的核酸分子也可以包含在载体或者其它克隆载体如质粒、噬菌粒、噬菌体、粘粒或人工染色体中。在优选的实施方案中，所述核酸分子包含在载体中，特别是包含在表达载体中。这种表达载体除了上述调节序列及编码如本发明定义的遗传构建体的核酸序列以外可包括衍生自与用于表达的宿主相容的物种的复制和控制序列以及赋予转染的细胞可选择表型的选择标记。本领域已知且可商购许多合适的载体如pSUPER和pSUPERIOR。

[0140] 第六方面，本发明涉及用于预防和/或治疗血液中的结直肠癌的药物组合物，所述组合物包含一或多种核酸分子，每种核酸分子均编码序列，所述序列与如本文所定义的在来自结直肠癌患者的血浆中其表达被上调的核酸分子所编码的微RNA序列至少部分互补，和/或所述序列对应于如本文所定义的在来自结直肠癌患者的血浆中其表达被下调的核酸分子所编码的微RNA序列。

[0141] 最后，第七方面，本发明涉及所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝细胞癌的药物中的用途。

[0142] 在本发明范围内，合适的药物成分包括适用于口腔、直肠、鼻腔、整体的(包括颊、和下颚)、腹膜的和胃肠外的(包括肌内、皮下和静脉)操作，或者通过吸入或吹入实施。操作可以是局部的或者系统的。优选地，操作通过口腔或者静脉注射途径实现。配方可包装成不同的剂量单位。

[0143] 本发明的药物组合物包括本领域确定的任何药物剂量形式，例如胶囊、微囊、扁囊剂、丸剂、片剂、粉末、小丸剂(pellet)、多颗粒制剂(例如珠、颗粒或晶体)、气雾剂、喷雾剂、泡沫、溶液、分散剂、酊剂、糖浆、酏剂、悬浮液、油包水乳状液如软膏，及水包油乳状液如乳剂、洗剂和香脂。

[0144] 使用药理学可接受的成分以及已建立的制备方法可以将上述(“有义”和“反义”)核酸分子配制为药物组合物(Gennaro,A.L.and Gennaro,A.R.(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.,Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,PA；Crowder,T.M.et al.(2003)A Guide to Pharmaceutical Particulate Science.Interpharm/CRC,Boca Raton,FL；Niazi,S.K.(2004)Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations,CRC Press,Boca Raton,FL)。

[0145] 为了制备药物组合物，可以使用药学惰性的无机或有机赋形剂(即载体)。为了制备例如丸剂、片剂、胶囊或颗粒，可以使用例如乳糖、滑石、硬脂酸及其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然油或硬化油。用于生产溶液、悬浮液、乳状液、气雾剂混合物或在使用之前重配为溶液或气雾剂混合物的粉末的合适赋形剂包括水、醇、甘油、多元醇及其合适的混合物以及植物油。

[0146] 所述药物成分也可以含有添加剂，如充填剂、结合剂、增湿剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂，及另外的溶剂或者增溶剂或者实现储存效应的物质。后者可理解为可以将核酸分子掺入缓释或持续释放或靶向输送系统中如脂质体、纳米颗粒和微囊中。

[0147] 为了靶向体内的大多数组织，需要临床可行的无创策略以将如本文定义的这种药物组合物定向于细胞。在过去，一些方法通过将合理剂量的siRNA经静脉内注射入小鼠和灵长类动物体内已经获得重大的治疗益处，而无明显的限制毒性。

[0148] 一种方法包括将miRNA的过客链(miRNA*链)与胆固醇或其衍生物/缀合物共价偶联以促进通过遍在表达的细胞表面LDL受体的吸收(Soutschek,J.et al.(2004)Nature432,173-178)。或者，未缀合的PBS-配制的锁定核酸修饰的寡核苷酸(LNA-antimiR)可以用于全身性输送(Elmen,J.et al.(2008)Nature 452,896-899)。另一种输送miRNA的方法包括使用聚乙二醇使miRNA包囊化成为特定的脂质体以降低清除细胞的吸收并增强循环时间。这些特定的核酸颗粒(稳定的核酸-脂质颗粒或者SNALP)有效地将miRNA输送至肝脏(且不到达其它器官(Zimmermann,T.S.et al.(2006)Nature 441,111-114所述))。
近年来，描述了一类称作lipidoids的新型脂质样输送分子(基于烷基丙烯酸酯或者烷基-丙烯酰胺与伯胺或仲胺的缀合加成而合成)作为RNAi治疗剂的输送剂(Akinc,A.et al.(2008)Nat.Biotechnol.26,561-569)。

[0149] 进一步的细胞特异性靶向策略包括将miRNA与一种融合蛋白混合，该融合蛋白由与鱼精蛋白连接的靶向抗体片段组成，所述鱼精蛋白是使精子中的DNA成核并通过电荷结合miRNA的碱性蛋白(Song,E.et al.(2005)Nat.Biotechnol.23,709-717)。近来已经开发了对上述基本输送方法进行的多种修改和改变。这些技术为本领域所已知，并综述在例如de Fougerolles,A.et al.(2007)Nat.Rev.Drug Discov.6,443-453；Kim,D.H.and Rossi,J.J.(2007)Nat.Genet.8,173-184)中。

[0150] 本发明通过附图和如下实施例进一步描述，所述附图和实施例只是为了例证本发明的特异的实施方案的目的，不应理解为以任何方式限制本发明范围之意。实施例

[0151] 实施例1：样品收集与制备

[0152] 69例结直肠癌组织和69例匹配的正常结直肠癌组织样本从手术中获得。手术样本在收集时或收集后很快在液氮中快速冰冻，样本保存在-80°C。

[0153] 病人信息(年龄、性别、影像资料、治疗、其他药物治疗情况、家族史及类似信息)来源于医院资料库，以使收集到的不同样本匹配。病理学随访(例如通过苏木素和伊红染色(H&E)的组织学分析)被用来显著确定所给样本疾病状态(即对照、癌前期(例如结直肠腺瘤)、早期恶性病变(例如结直肠癌))，以及确保样本的一致分类。

[0154] 对每个癌样品任选进行激光捕获显微切割以特异性分离肿瘤细胞群(大约200000个细胞)。简而言之，将透明的转移膜应用于组织切片或样本的表面。在显微镜下，观察置于载玻片上的薄组织切片，并鉴别细胞群以进行分离。当选择的细胞位于观察视野的中心时，激活近红外激光二极管集成显微镜光学器件(near IR laser diode integral with the microscope optics)。脉冲激光束激活转移膜上的斑点(spot)，使该膜与下面的选择的细胞融合。然后将具有结合的细胞的转移膜从所述薄组织切片中剥离(综述参见例如Emmert-Buck,M.R.et al.(1996).Science 274,998-1001；Espina,V.et al.(2007)Expert Rev.Mol.Diagn.7,647-657)。基本如厂商指导制备冷冻切片并使用激光捕获显TM
微 镜 (Arcturus Veritas Laser Capture Microdissection Instrument(Molecular Devices,Inc.,Sunnyvale,CA,USA)进行捕获步骤。

[0155] 使用mirVanaTM miRNA分 离试 剂盒(Ambion,Inc.,Austin,TX,USA) 根据 厂商指导分离miRNA群。浓度通过NanoDrop 1000分光光度计定量测得。(NanoDrop Technologies,Waltham,MA)。RNA的质量控制通过2100Bioanalyzer使用RNA 6000Pico LabChip试剂盒实现(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)。

[0156] 实施例2：组织样品中miRNA表达谱的分析

[0157] 使用Agilent miRNA微阵列平台(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)任选对特定样品中(差异)表达的miRNA进行定性分析。微阵列包括从Sanger数据库v.10.1获得的723个人类miRNA探针。总体RNA(100ng)来源于每一个138LCM-选择的结直肠癌样本，被用来通过Cy3总体作为标记集合。微阵列影像结果通过XDR扫描得到(PMT100,PMT5)。标记和杂交依据Agilent miRNA微阵列系统步骤实现。

[0158] 通过应用Quantile方法及使用本领域已知的GeneSpringGX10软件将针对单色(CY3)杂交获得的原始数据归一化(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)。不配对的t-测试(p值<0.01)在经过Fisher测定(F-test)后被用来确定结直肠癌和匹配正常对照组织中差异表达的miRNA。

[0159] 为了每个测量值实施了针对138个组织样本的独立实验，并且测定miRNA表达水平代表获得的个体资料的平均值。

[0160] 实施例3：血浆样本的收集和制备

[0161] 确定结直肠癌目标血浆中一个或者多个核酸表达特征的主要方法步骤见图1。

[0162] 从癌症病人和健康个体中获得的114个血液样本于2008年和2009年从上海中山和华山医院收集得到。本发明中用到的血液样本的基本特征示图3。从病人获得的所以样本通过手术得到。病人资料(年龄、性别、影像资料、治疗方法、其它医疗状况、家族史等)来源于医院资料库。肿瘤的组织病理学分类是根据WHO肿瘤分类系统并由三位病理学家独立完成得到。

[0163] 表3：血液标本的基本特征

[0164]全基因组miRNA分析 人数
对照
正常 23
肝细胞肝癌 24
肺癌 36
肠癌
Dukes′A癌 6
Dukes′B癌 9
Dukes′C癌 9
Dukes′D癌 7
定量RT-PCR分析
正常 54
肠癌 54
总数 222

[0165] 外周血(2ml)转移到EDTA管。在两个小时内，EDTA管进行820g10min离心。然后1-ml等分量血浆转移到1.5-ml小管并离心16,000g10min，以沉淀所以残留的细胞碎片。然后上清转移到新的小管并保存于-80℃。

[0166] 总体RNA从血浆中通过使用mirVana PARIS miRNA抽提试剂盒并依据商家指导提取得到(Ambion，Austin，TX)。浓度通过NanoDrop 1000分光光度计定量得到(NanoDrop Technologies，Waltham，MA)。RNA质量控制通过2100 Bioanalyzer并使用RNA 6000 Pico LabChip试剂盒得以实现(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)。

[0167] 实施例4：血浆样本中miRNA表达谱分析

[0168] 在特定血浆样本中miRNAf差异)的定性分析可选择性地运用Agilent miRNA微阵列平台(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)。微阵列包括从Sanger数据库v.10.1获得的723个人类miRNA的探针。总体RNA(100ng)来源于每一个114个血浆样本，被用来通过Cy3总体作为标记集合。微阵列影响结果通过XDR扫描得到(PMT100，PMT5)。标记和杂交依据Agilent miRNA微阵列系统步骤实现。

[0169] 为数据分析，单色(CY3)杂交得到的原始数据通过运用一个稳定的内部miRNA对照(has-miR-1238)归一化。不配对的t-测试在经过Fisher测定(F-test)后被用来确定结直肠癌和健康个体和/或结直肠癌和对照(健康个体、肝细胞癌和肺癌)中差异表达的miRNA。

[0170] 为确定个体miRNA作为诊断生物标记的特异性和敏感性，MedCalc软件被用来完成个体miRNA相对健康个体和/或对照(健康个体、肝细胞癌和肺癌)接受操作特征(ROC)曲线分析。95％的可信区间被用来确定其意义。

[0171] 为了评估一个特定的miRNA在早期肝癌或转移肝癌中与健康个体或对照相比有差异表达，用到以下标准：

[0172] i)p值(可能性值)<=0.01的倍数改变>2

[0173] ii)AUC (作为诊断生物标记的准确性)AUC>0.700

[0174] 在实现了两种标准的情况下，miRNA被认为在结直肠癌相对于健康个体和/或对照中差异表达。

[0175] 为了获得各个测量结果对于114个血浆样本实施独立实验，并且miRNA表达水平代表获得的各个数据的平均值。

[0176] CRC相对健康对照得到的差异表达miRNA实验数据总结示以下的表4-6。表4列举CRC相对于对照组织和健康对照血浆表现出的在组织中和血浆中明显差异表达的miRNA。表5总结了结直肠癌病人相对于健康个体而言只存在于血浆中差异表达的miRNA。表6列举了CRC病例血浆中最佳miRNA特征组合。栏″t″指的是结直肠癌组织，″n″指的是匹配的正常对照组织，″p″指的是病人，″h″指的是健康对照。特别优选的miRNA(SEQ IDNO:对SEQ ID NO:8示于表4；SEQ ID NO:21对SEQ ID NO:24示于表5)为加黑部分。

[0177] 表4：结直肠癌血浆中的肿瘤相关miRNA特征

[0178]

[0179]

[0180] 表5：结直肠癌血浆中的血浆特异性miRNA特征

[0181]

[0182] 表6：结直肠癌血浆中的组合miRNA特征

[0183]

[0184]

[0185] 第二个方面中用于区分结直肠癌和健康个体、肝细胞癌和肺癌的优选表达特征数据列于以下表7-9。表7列举结直肠癌肿瘤相关miRNA特征；表8示血浆特异性miRNA特征；表9示结直肠癌miRNA特征的最佳组合，最佳组合(hsa-miR-33b*/hsa-miR-196a)作为区分CRC和健康个体、肝细胞癌和肺癌的诊断生物标记的准确性为85％。″t″栏是结直肠癌组织，″n″栏是匹配正常对照组织，″CRC″栏是结直肠癌血浆，″对照″栏是从健康个体、肝细胞癌和肺癌病人得到的血浆。优选miRNA(SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:34-37；SEQ ID NO:3示于表7,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:38-42示与表8,SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:43示于表9)为加黑部分。

[0186] 表7：区分结直肠癌和健康对照、肝细胞癌和肺癌的肿瘤相关miRNA特征[0187]

[0188] 表8：区分结直肠癌和健康对照、肝细胞癌和肺癌的血浆特异性miRNA特征[0189]

[0190] 表9：区分结直肠癌和健康对照、肝细胞癌和肺癌的组合miRNA特征

[0191]

[0192] 实施例5：微阵列数据的核实

[0193] 为验证(和/或定量)获得的miRNA表达数据，根据厂商指导使用已建立的实时定量RT-PCR，其采用TaqMan MicroRNA测定法(Applied Biosystems,Foster City，CA,USA)。简言之，逆转录(RT)使用Taqman微RNART试剂盒并依据使用的生物系统说明指导以实现。
10ng总RNA逆转录溶液混合物为15ul，包含1X逆转录缓冲，1X RT引物,1nM dNTP，4U RNase抑制剂和50U MultiScribe逆转录酶。然后RT溶液在PCR仪器中通过热程序16°C,30min；
42°C,30min；85°C,5min操作(Thermal cycler alpha engine,Bio-rad)。定量PCR通过TaqMan通用PCR Master Mix试剂盒以及TaqmanmicroRNA测定试剂盒并依据使用的生物系统指导说明完成。2ulRT产物PCR扩增条件为：1XTaqMan通用PCR Master Mix，不含AmpErase UNG，1X TaqMan MicroRNA测定mix。每一步翻译经历三个循环。实时PCR的操作条件为Roch Light Cycling 480仪器，程序是开始加热96°C,5min；然后95°C，15s经历
45或50个循环；60°C,60s。Cp值通过LC480软件的第二个衍生方法据算得到。然后miRNA通过标准样本CP值绝对定量，每一个miRNA的CP值归一化到内部稳定对照has-miR-1228。

[0194] 8个miRNA组合与7个从54例健康个体和54例结直肠癌血浆样本得到的miRNAS的平台比较实验数据列于表10。整体而言，病人和健康对照的阵列倍数差异大于定量RTPCR的结果。阵列结果得到的调控(即上调或下调)与定量RT-PCR结果相关性大。结果表明通过Agilent miRNA微阵列发现的miRNA特征可靠性大。

[0195] 表10：结直肠癌病人血浆和健康个体血浆表达谱的平台比较

[0196]

[0197]

[0198] 获得的结果表明结直肠癌miRNA表达整体高特异性调控。因此，此处具体的miRNA子集分别代表独特的miRNA表达特征，因为结直肠表达谱不仅可确定癌状态也可与肝细胞癌和肺癌区分。

[0199] 本发明miRNA表达特征的确定为血液筛查、检测和诊断结直肠癌提供一个独特的分子标记。另外，表达特征可被用来监测结直肠癌病人的治疗反应以及指导治疗策略。此外，表达特征也可被用来发展抗结直肠癌药物。

[0200] 在此举例描述的的本发明可以适当地在不存在本文特别揭示的任何元件、限制的条件下进行。因此，例如术语“包含”、“包括”“含有”等应具有广泛含义且无限制。另外，本文应用的术语和表达用于描述本发明而无限制之意，且没有使用这些术语和表达排除任何其所示特征和描述或其一部分的等价物之意，但是应意识到在请求保护的本发明范围内可以进行各种修改。因此，应理解尽管通过实施方案和任选的特征对本发明进行的特别揭示，但是本领域技术人员可以对本发明进行修改和改变，这种修改和改变认为在本发明的范围内。

[0201] 本文广泛及上位地描述了本发明。落入上位描述范围内的每个较窄的下位概念和亚上位集合也组成了本发明的一部分。这包括用条件或从上位中除去任何主题的否定限制对本发明的上位描述，而无论所除去的主题是否在本文中特别引述。

[0202] 其它实施方案在如下权利要求范围内。另外，当本发明的特征或各个方面用马库什组方式描述时，本领域技术人员能意识到本发明也以马库什组的任何各个成员或成员亚组方式被描述。