一株大肠埃希氏菌LL016及其应用转让专利
申请号 : CN201210515218.1
文献号 : CN102936575B
文献日 : 2014-05-07
发明人 : 姜岷 , 梁丽亚 , 刘嵘明 , 万青 , 陈旭 , 任心怡 , 马江锋 , 陈可泉 , 韦萍 , 欧阳平凯
申请人 : 南京工业大学
摘要 :
本发明公开了一株大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）LL016，其保藏号为CCTCCNO：M2012429。本发明还公开了上述大肠埃希氏菌LL016在利用合成培养基纯厌氧发酵生产丁二酸中的应用以及方法。该菌株可以在厌氧条件下，利用无机氮源和葡萄糖生长，并大量积累丁二酸，菌株LL016生长速率较快，且产酸量较高，具有重大的社会意义和经济价值。
权利要求 :
1. 一株大肠埃希氏菌（Escherichia coli）LL016，其保藏号为CCTCC NO：M 2012429。
2. 权利要求1所述的大肠埃希氏菌LL016在利用合成培养基纯厌氧发酵生产丁二酸中的应用。
3. 权利要求1所述的大肠埃希氏菌LL016利用合成培养基纯厌氧发酵生产丁二酸的方法，包含如下步骤：（1）平板培养：将大肠埃希氏菌LL016接种在平板培养基上厌氧培养，培养温度为
37℃，培养时间为24 h；
（2）种子培养：将平板培养的大肠埃希氏菌LL016接种到种子培养基中，充二氧化碳2 min，培养温度为37℃，200 r/min，培养时间为48 h；
（3）发酵生产丁二酸：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量体积比为2%，充二氧化碳2 min，培养温度为30℃，170 r/min，培养时间为72 h。
说明书 :
一株大肠埃希氏菌LL016及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一株大肠埃希氏菌LL016及其应用，特别涉及一株能够利用合成培养基纯厌氧发酵生产丁二酸的大肠埃希氏菌LL016及其应用，属于工业微生物育种及其发酵技术领域。
背景技术
[0002] 丁二酸，又名琥珀酸，是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。丁二酸作为TCA 循环的中间产物以及厌氧代谢的终端还原产物之一，在生物代谢过程中占有非常重要的地位。近年来的研究结果表明丁二酸还可以作为C4平台化合物合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等大宗化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解聚酯。近年来，随着化石资源的日益枯竭和环境问题的日益严重，采用生物法制备丁二酸备受瞩目，美国能源部将丁二酸列为未来12种最有价值的生物炼制产品之一。
[0003] 相对于化学合成法，生物合成制备丁二酸的方法受到越来越多的关注。生物合成丁二酸，是利用细菌，真菌等各种微生物，以葡萄糖或其他各种水解液为碳源，经微生物发酵生产丁二酸，相对于化学合成的方法，其一大优势是原材料为廉价的生物质资源，利用生物法合成丁二酸成为近年来研究的热点。
[0004] 发酵菌株是丁二酸生物合成的关键点之一，多数细菌和真菌都能产生丁二酸，但是只有部分菌株可产生高浓度的丁二酸，丁二酸工业生产菌包括一些丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌。目前，丁二酸工业发酵菌株的研究主要集中在产丁二酸厌氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens），产丁二酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes），谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutam icum）和大肠杆菌（Escherichia coli）等。其中Escherichia coli 由于遗传背景清楚，基因操作简单，生长速度快，易调控以及所用培养基较为廉价，近年来成为生物法制备丁二酸的研究热点。
[0005] 提高丁二酸的发酵产酸能力有很多的方法，尤其在发酵调控的手段上，很多的科研工作者都进行了深入的研究。G. N. Vemuri等人报道利用大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸的方法，原理是有氧阶段使菌体得到快速积累，然后转为厌氧使菌体产生大量的丁二酸。由于两阶段发酵的局限性以及复杂性，最近一步厌氧发酵产丁二酸受到越来越多的关注。然而纯厌氧条件下，大肠杆菌利用合成培养基生长并积累丁二酸的研究却鲜有报道。可见，通过改良菌株，使其可以在纯厌氧条件下利用合成培养基快速生长并大量积累产酸，在今后的丁二酸生长工业中具有举足轻重的作用。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一株大肠埃希氏菌，能够在厌氧条件下利用合成培养基生长，并且可以积累丁二酸。
[0007] 本发明的另一目的是提供上述大肠埃希氏菌在利用合成培养基纯厌氧发酵生产丁二酸中的应用。
[0008] 本发明的第三个目的是提供上述大肠埃希氏菌利用合成培养基纯厌氧发酵生产丁二酸的方法。
[0009] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0010] 一、一株大肠埃希氏菌（Escherichia coli）LL016，其保藏号为CCTCC NO：M2012429。
[0011] 本发明的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）LL016是将大肠杆菌的出发菌株大肠埃希氏菌（Escherichia coli） BA016（CCTCC NO：M 2012350）经等离子体诱变后，利用合成培养基平板筛选得到能够在厌氧条件下生长的菌株，在经过厌氧摇瓶发酵筛选获得可以高产丁二酸的菌株为目标菌株。
[0012] 其具体步骤如下：
[0013] （1）等离子诱变：将大肠杆菌原始菌株在试管中活化，37℃，200 r/min，过夜培养。得到的菌液用无菌生理盐水稀释至OD600=1.0，滴加在无菌载片上，用无菌风吹干；以氦气为放电气体，以80 ~120 W为射频功率，以10 ~30 SLM作为气体流量，以10~30 s为辐照时间，对菌株进行等离子体诱变；
[0014] （2）合成培养基平板初筛：将诱变后的载片置于装有1mL 的生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌液洗脱，稀释成不同的浓度涂布于合成培养基平板上，37℃厌氧培养24 h。挑选生长较大，较为饱满的菌落；
[0015] （3）合成培养基平板复筛：将步骤（2）中筛选到的菌株在合成培养基上反复转点培养，37℃厌氧培养24 h，挑选生长较大，较为饱满的菌落；
[0016] （4）厌氧摇瓶发酵筛选：将步骤（3）中筛选出的菌株接种到种子培养基中扩大培养，37℃，200 r/min，培养48 h，然后在发酵培养基中发酵，接种量为2%（v/v），30℃，170 r/min，培养72 h；考察步骤3）中筛选出的菌落中筛选出生长速度快，产酸量高的菌株。
[0017] 在上述筛选方法中，步骤（1）中所述的等离子体诱变方法中，选择100 W为射频功率，20 SLM为气体流量，15 s为辐照时间。
[0018] 在上述筛选方法中，
[0019] 种子培养基为：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L。
[0020] 发酵培养基为：柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，-1 -1 -1 -1(NH4)2HPO4 8 g·L ，NH4Cl 0.2 g·L ，(NH4)2SO4 0.75 g·L ，MgSO4·7H2O 1 g·L ，-1 -1 -1
CaCl2·2H2O 10.0 mg·L ，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L ，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L ，MnSO4·H2O -1 -1 -1 -1
2.5 mg·L ，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L ，H3BO3 0.12 mg·L ，Al2(SO4)3 1.77 mg·L ，-1 -1 -1 -1
Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L ，柠檬酸铁 16.1 mg·L ，维生素B1 20 mg·L ，生物素2 mg·L ，碱式碳酸镁 16 g/L，葡萄糖20 g/L。
CaCl2·2H2O 10.0 mg·L ，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L ，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L ，MnSO4·H2O -1 -1 -1 -1
2.5 mg·L ，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L ，H3BO3 0.12 mg·L ，Al2(SO4)3 1.77 mg·L ，-1 -1 -1 -1
Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L ，柠檬酸铁 16.1 mg·L ，维生素B1 20 mg·L ，生物素2 mg·L ，碱式碳酸镁 16 g/L，葡萄糖20 g/L。
[0021] 固体平板培养基为：柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，-1 -1 -1 -1(NH4)2HPO4 8 g·L ，NH4Cl 0.2 g·L ，(NH4)2SO4 0.75 g·L ，MgSO4·7H2O 1 g·L ，-1 -1 -1
CaCl2·2H2O 10.0 mg·L ，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L ，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L ，MnSO4·H2O -1 -1 -1 -1
2.5 mg·L ，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L ，H3BO3 0.12 mg·L ，Al2(SO4)3 1.77 mg·L ，-1 -1 -1 -1
Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L ，柠檬酸铁 16.1 mg·L ，维生素B1 20 mg·L ，生物素2 mg·L ，琼脂20 g/L，葡萄糖10 g/L。
CaCl2·2H2O 10.0 mg·L ，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L ，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L ，MnSO4·H2O -1 -1 -1 -1
2.5 mg·L ，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L ，H3BO3 0.12 mg·L ，Al2(SO4)3 1.77 mg·L ，-1 -1 -1 -1
Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L ，柠檬酸铁 16.1 mg·L ，维生素B1 20 mg·L ，生物素2 mg·L ，琼脂20 g/L，葡萄糖10 g/L。
[0022] 二、上述的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）LL016在利用合成培养基纯厌氧发酵生产丁二酸中的应用。
[0023] 三、上述的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）LL016利用合成培养基纯厌氧发酵生产丁二酸的方法，包含如下步骤：
[0024] （1）平板培养：将大肠埃希氏菌LL016接种在平板培养基上厌氧培养，培养温度为37℃，培养时间为24 h；
[0025] （2）种子培养：将平板培养的大肠埃希氏菌LL016接种到种子培养基中，充二氧化碳2 min，培养温度为37℃，200 r/min，培养时间为48 h；
[0026] （3）发酵生产丁二酸：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量体积比为2%，充二氧化碳2 min，培养温度为30℃，170 r/min，培养时间为72 h。
[0027] 其中，平板培养基：柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，-1 -1 -1 -1(NH4)2HPO4 8 g·L ，NH4Cl 0.2 g·L ，(NH4)2SO4 0.75 g·L ，MgSO4·7H2O 1 g·L ，-1 -1 -1
CaCl2·2H2O 10.0 mg·L ，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L ，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L ，MnSO4·H2O -1 -1 -1 -1
2.5 mg·L ，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L ，H3BO3 0.12 mg·L ，Al2(SO4)3 1.77 mg·L ，-1 -1 -1 -1
Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L ，柠檬酸铁 16.1 mg·L ，维生素B1 20 mg·L ，生物素2 mg·L ，琼脂20 g/L，葡萄糖10 g/L。
CaCl2·2H2O 10.0 mg·L ，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L ，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L ，MnSO4·H2O -1 -1 -1 -1
2.5 mg·L ，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L ，H3BO3 0.12 mg·L ，Al2(SO4)3 1.77 mg·L ，-1 -1 -1 -1
Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L ，柠檬酸铁 16.1 mg·L ，维生素B1 20 mg·L ，生物素2 mg·L ，琼脂20 g/L，葡萄糖10 g/L。
[0028] 种子培养基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 5 g/L。
[0029] 发酵培养基：柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 -1 -1 -1 -18 g·L ，NH4Cl 0.2 g·L ，(NH4)2SO4 0.75 g·L ，MgSO4·7H2O 1 g·L ，CaCl2·2H2O 10.0 -1 -1 -1 -1
mg·L ，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L ，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L ，MnSO4·H2O 2.5 mg·L ，-1 -1 -1
CoCl2·6H2O 1.75 mg·L ，H3BO3 0.12 mg·L ，Al2(SO4)3 1.77 mg·L ，Na2MoO4·2H2O 0.5 -1 -1 -1 -1
mg·L ，柠檬酸铁 16.1 mg·L ，维生素B1 20 mg·L ，生物素2 mg·L ，碱式碳酸镁 16 g/L，葡萄糖20 g/L。
mg·L ，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L ，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L ，MnSO4·H2O 2.5 mg·L ，-1 -1 -1
CoCl2·6H2O 1.75 mg·L ，H3BO3 0.12 mg·L ，Al2(SO4)3 1.77 mg·L ，Na2MoO4·2H2O 0.5 -1 -1 -1 -1
mg·L ，柠檬酸铁 16.1 mg·L ，维生素B1 20 mg·L ，生物素2 mg·L ，碱式碳酸镁 16 g/L，葡萄糖20 g/L。
[0030] 本发明的有益效果在于：本发明采用等离子体诱变重组大肠杆菌，利用合成培养基平板，筛选出在厌氧条件下能够利用合成培养基生长，并高产丁二酸的大肠埃希氏菌LL016，该菌株可以以无机氮为氮源，葡萄糖为碳源在厌氧条件下快速生长，并大量积累丁二酸；在厌氧摇瓶中，可以利用合成培养基和葡萄糖生长和产酸，72 h菌体密度达到了OD600=5.6，丁二酸产量为11.64 g/L，而原始出发菌株无法在该条件下生长及产酸，因此该菌株具有重大的社会意义和经济价值。
附图说明
[0031] 图1为大肠杆菌的等离子体诱变存活率曲线。
[0032] 本发明的生物材料分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）LL016，保藏日期为2012年10月25日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为 CCTCC，保藏单位地址：中国. 武汉. 武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M 2012429。
[0033] 本发明所使用的出发菌株大肠埃希氏菌（Escherichia coli） BA016的来源：在中国专利局或国际专利组织承认的中国典型培养物保藏中心进行了专利程序保藏（保藏编号：CCTCC NO: M 2012350）的，并已经提交了中国专利申请（截止本申请的申请日还未公开），涉及该菌株的专利申请号为201210392834.2，专利申请日为2012年10月16日。 [0034] 出发菌株大肠埃希氏菌（Escherichia coli） BA016，其保藏日期为2012年09月14日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，地址为：中国. 武汉. 武汉大学，保藏编号：CCTCC NO： M 2012350。
具体实施方式
[0035] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，根据以下实施例，可以更好的理解本发明。实施案例中所描述的具体的物料配比，工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权力要求书中所详细描述的本发明。
[0036] 实施例1
[0037] 本实施例说明将大肠杆菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法。
[0038] 大肠杆菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法如下：
[0039] 将大肠杆菌BA016原始菌株在LB试管中活化，37℃，200 r/min过夜培养；取新鲜培养的细胞稀释至细胞浓度OD600=1.0，滴加在无菌载片上，用无菌风吹干；以氦气为放电气体，以80 ~120 W为射频功率，以10 ~30 SLM作为气体流量，以10~30 s为辐照时间，对菌株进行等离子体诱变；诱变后，将载片上的菌膜用1mL的无菌生理盐水洗脱下来，涂布在合成培养基平板上，在厌氧箱中培养。实验结果如附图1所示，其中，横坐标为辐照时间，纵坐标为存活率。
[0040] 实施例2
[0041] 本实施例说明筛选优良大肠杆菌的方法。
[0042] 其中，所使用的培养基配方如下：
[0043] （1）固体合成培养基平板：柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 -1 -1 -1 -18 g·L ，(NH4)2HPO4 8 g·L ，NH4Cl 0.2 g·L ，(NH4)2SO4 0.75 g·L ，MgSO4·7H2O 1 -1 -1 -1 -1
g·L ，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L ，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L ，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L ，-1 -1 -1
MnSO4·H2O 2.5 mg·L ，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L ，H3BO3 0.12 mg·L ，Al2(SO4)3 1.77 -1 -1 -1 -1
mg·L ，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L ，柠檬酸铁 16.1 mg·L ，维生素B1 20 mg·L ，生物素-1
2 mg·L ，琼脂20 g/L，葡萄糖10 g/L。
g·L ，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L ，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L ，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L ，-1 -1 -1
MnSO4·H2O 2.5 mg·L ，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L ，H3BO3 0.12 mg·L ，Al2(SO4)3 1.77 -1 -1 -1 -1
mg·L ，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L ，柠檬酸铁 16.1 mg·L ，维生素B1 20 mg·L ，生物素-1
2 mg·L ，琼脂20 g/L，葡萄糖10 g/L。
[0044] （2）种子培养基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 5 g/L。
[0045] （3）摇瓶发酵培养基：柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，-1 -1 -1 -1(NH4)2HPO4 8 g·L ，NH4Cl 0.2 g·L ，(NH4)2SO4 0.75 g·L ，MgSO4·7H2O 1 g·L ，-1 -1 -1
CaCl2·2H2O 10.0 mg·L ，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L ，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L ，MnSO4·H2O -1 -1 -1 -1
2.5 mg·L ，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L ，H3BO3 0.12 mg·L ，Al2(SO4)3 1.77 mg·L ，-1 -1 -1 -1
Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L ，柠檬酸铁 16.1 mg·L ，维生素B1 20 mg·L ，生物素2 mg·L ，碱式碳酸镁 16 g/L，葡萄糖20 g/L。
CaCl2·2H2O 10.0 mg·L ，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L ，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L ，MnSO4·H2O -1 -1 -1 -1
2.5 mg·L ，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L ，H3BO3 0.12 mg·L ，Al2(SO4)3 1.77 mg·L ，-1 -1 -1 -1
Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L ，柠檬酸铁 16.1 mg·L ，维生素B1 20 mg·L ，生物素2 mg·L ，碱式碳酸镁 16 g/L，葡萄糖20 g/L。
[0046] 筛选步骤如下：
[0047] （1）合成培养基平板初筛
[0048] 将诱变后的载片置于装有1mL生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌体完全洗脱下来，稀释成不同的浓度涂布于合成培养基平板上，37℃厌氧培养24 h，挑选出生长速度快，较为饱满的菌落。
[0049] （2）合成培养基平板复筛
[0050] 将筛选到的菌株在平板上反复转点培养，最终得到了菌株LL010、LL012、LL014和LL016显示了较强的生长速率和生长稳定性。
[0051] （3）摇瓶发酵筛选
[0052] （4）将菌株LL010、LL012、LL014和LL016接入种子培养基中扩大培养，充二氧化碳2 min，37℃，200 r/min，培养48 h。然后接种到发酵培养基中，100 mL厌氧血清瓶装液量30 mL，接种量2%（v/v），充二氧化碳2 min，30℃，170 r/min，培养72 h。检测各个菌株菌体密度和丁二酸产量如表1所示：
[0053] 表1 突变菌株和出发菌株的生长及产酸比较
[0054]菌株 OD600 丁二酸产量(g/L) 丙酮酸产量(g/L)
BA016 0.23 0.00 0.00
LL010 3.2 5.55 2.01
LL012 3.4 6.45 3.21
LL014 3.8 7.02 3.24
LL016 5.6 11.64 5.67
BA016 0.23 0.00 0.00
LL010 3.2 5.55 2.01
LL012 3.4 6.45 3.21
LL014 3.8 7.02 3.24
LL016 5.6 11.64 5.67
[0055] 在纯厌氧条件下，出发菌株无法利用合成培养基生长及产酸，但是经ARTP诱变后得到可以在纯厌氧条件下利用合成培养基快速生长的菌株。经摇瓶发酵筛选，菌株LL016生长速率较快，且产酸较高。
[0056] 实施例3
[0057] 本实施例说明突变株LL016的传代稳定性
[0058] 在合成培养基平板上，将突变株LL016多次转点培养，并将得到菌株分别进行发酵验证，实验结果如表2所示：
[0059] 表2 突变株LL016传代稳定性分析
[0060]
[0061] 从实验结果可知，经过8次连续传代，突变株LL016的丁二酸产量和丁二酸转化率都较为稳定，具有很好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌种。
[0062] 实施例4
[0063] 本实施例说明大肠埃希氏菌（Escherichia coli）LL016发酵生产丁二酸的方法[0064] 本实施例所述的培养基配方：
[0065] 平板培养基：柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 -1 -1 -1 -18 g·L ，NH4Cl 0.2 g·L ，(NH4)2SO4 0.75 g·L ，MgSO4·7H2O 1 g·L ，CaCl2·2H2O 10.0 -1 -1 -1 -1
mg·L ，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L ，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L ，MnSO4·H2O 2.5 mg·L ，-1 -1 -1
CoCl2·6H2O 1.75 mg·L ，H3BO3 0.12 mg·L ，Al2(SO4)3 1.77 mg·L ，Na2MoO4·2H2O 0.5 -1 -1 -1 -1
mg·L ，柠檬酸铁 16.1 mg·L ，维生素B1 20 mg·L ，生物素2 mg·L ，琼脂20 g/L，葡萄糖10 g/L。
mg·L ，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L ，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L ，MnSO4·H2O 2.5 mg·L ，-1 -1 -1
CoCl2·6H2O 1.75 mg·L ，H3BO3 0.12 mg·L ，Al2(SO4)3 1.77 mg·L ，Na2MoO4·2H2O 0.5 -1 -1 -1 -1
mg·L ，柠檬酸铁 16.1 mg·L ，维生素B1 20 mg·L ，生物素2 mg·L ，琼脂20 g/L，葡萄糖10 g/L。
[0066] 种子培养基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 5 g/L。
[0067] 发酵培养基：柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 -1 -1 -1 -18 g·L ，NH4Cl 0.2 g·L ，(NH4)2SO4 0.75 g·L ，MgSO4·7H2O 1 g·L ，CaCl2·2H2O 10.0 -1 -1 -1 -1
mg·L ，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L ，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L ，MnSO4·H2O 2.5 mg·L ，-1 -1 -1
CoCl2·6H2O 1.75 mg·L ，H3BO3 0.12 mg·L ，Al2(SO4)3 1.77 mg·L ，Na2MoO4·2H2O 0.5 -1 -1 -1 -1
mg·L ，柠檬酸铁 16.1 mg·L ，维生素B1 20 mg·L ，生物素2 mg·L ，碱式碳酸镁 16 g/L，葡萄糖20 g/L。
mg·L ，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L ，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L ，MnSO4·H2O 2.5 mg·L ，-1 -1 -1
CoCl2·6H2O 1.75 mg·L ，H3BO3 0.12 mg·L ，Al2(SO4)3 1.77 mg·L ，Na2MoO4·2H2O 0.5 -1 -1 -1 -1
mg·L ，柠檬酸铁 16.1 mg·L ，维生素B1 20 mg·L ，生物素2 mg·L ，碱式碳酸镁 16 g/L，葡萄糖20 g/L。
[0068] 将大肠埃希氏菌Escherichia coli LL016接种至平板培养基，在厌氧箱中培养，培养温度37℃，培养时间24 h。将平板培养的LL016接种到种子培养基中，100 mL血清瓶装液量30 mL，充二氧化碳2 min，培养温度37℃，200 r/min，培养时间48 h。将种子接种到发酵培养基中，接种量2%（v/v），100 mL血清瓶装液量30 mL，充二氧化碳2 min，培养温度为30℃，170 r/min，发酵培养72 h后检测丁二酸的产量为11.64 g/L，OD600为5.6。