本发明涉及一种蝙蝠蛾拟青霉胞外酸性糖蛋白的制备方法。该方法包括：通过蝙蝠蛾拟青霉菌株的一级种子培养，接种发酵，获得蝙蝠蛾拟青霉发酵液，所得的发酵液经过乙醇沉淀、去离子水复溶、脱蛋白、冷冻干燥、DEAE-52柱层析等工序分离出蝙蝠蛾拟青霉胞外酸性糖蛋白。本发明的工艺方法具有工艺简单、提取条件温和、成本低、对环境友好，易于工业化生产等优点，所得到的蝙蝠蛾拟青霉胞外酸性糖蛋白可用作药品和保健食品原料。
1.一种蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)HN1菌株胞外酸性糖蛋白的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：(1)从保存于土豆斜面培养基的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)HN1菌株的母种中挖取大小约为0.5cm×0.5cm菌丝体块，接种于装有100mL种子培养基的容量为250mL的三角瓶中，该种子培养基的组成为：蔗糖30.00g/L，酵母膏6.00g/L，磷酸二氢钾1.50g/L，硫酸镁0.50g/L，麦芽汁10.00g/L，土豆汁10.00g/L，pH6.5，然后于17℃下静止培养12小时后，再置于120转/分钟的摇床上振荡培养72小时，即可获得种子液；
(2)取步骤(1)中的种子液按发酵培养基体积的1％接种于装有200mL发酵培养基的容量为500mL的三角瓶中，该发酵培养基的组成为：蔗糖50.86g/L，酵母膏2.00g/L，硫酸铵
6.61g/L，磷酸二氢钾1.36g/L，硫酸镁0.05g/L，土豆汁15.00g/L，麦芽汁15.00g/L，pH6.5，然后于17℃下静止培养12小时后，再置于120转/分钟的摇床上振荡培养120小时，培养结束后将发酵产物于4000转/分钟条件下离心15min后，收集上清液即为蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)HN1菌株发酵液；
(3)将步骤(2)中获得的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)HN1菌株发酵液，50℃减压浓缩至原体积的1/2，加3倍体积的无水乙醇，沉淀12小时，用80％乙醇洗涤3次后，在4000转/分钟条件下离心15min收集沉淀即可获得胞外粗多糖；
(4)将步骤(3)制得的胞外粗多糖通风挥去乙醇，加少量去离子水复溶后，用氯仿和正丁醇体积比为4∶1的混合溶液脱蛋白3次后，将水相溶液冷冻干燥以获得粗多糖冷冻干粉；
(5)将步骤(4)所得粗多糖溶解后，上样于DEAE-52纤维素柱，并分别用去离子水、
0.1mol/LNaCl和0.3mol/L NaCl进行洗脱，将收集的0.3mol/L NaCl洗脱组分进行减压浓缩，去离子水透析72小时，浓缩后冷冻干燥，即可得到灰白色粉末的酸性糖蛋白组分，该组分中多糖含量为80.56％，蛋白质含量为18.76％；
(6)将步骤(5)所得酸性糖蛋白用分子排阻色谱检测其分子量分布情况，用红外光谱分析特征基团组成，用紫外光谱扫描确定其是否具有蛋白质组分。
2.根据专利要求1所述的一种蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)HN1菌株胞外酸性糖蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)的发酵培养基配方：蔗糖50.86g/L，酵母膏2.00g/L，硫酸铵6.61g/L，磷酸二氢钾1.36g/L，硫酸镁0.05g/L，土豆汁15.00g/L，麦芽汁15.00g/L，pH6.5。
一种蝙蝠蛾拟青霉胞外酸性糖蛋白的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及以蝙蝠蛾菌拟青霉菌株液体发酵并从其发酵液中分离得到胞外酸性糖蛋白的技术领域，具体涉及一种蝙蝠蛾拟青霉胞外酸性糖蛋白的制备方法。
背景技术
[0002] 冬虫夏草是我国传统的名贵的强壮、滋补药材，其对于人类生产和生活真正巨大的价值在于它们能产生多种在生物技术及医药保健上有重要价值的生理活性物质。它们的生理活性丰富多彩，可抗菌、抗肿瘤、抗血小板凝结、抗辐射、改善和提高记忆力、调节机体免疫能力、钙离子拮抗、对脑和心脏在常压缺氧下有保护作用、镇静和镇痛等。
[0003] 由于天然冬虫夏草严格的寄生性与特殊的生态环境要求，其资源极其有限，价格昂贵。近年来，随着冬虫夏草无性型研究的进展，有关虫草无性型多糖的研究才开展起来。冬虫夏草可以通过生物工程的方法进行发酵生产，对人工培养的冬虫夏草菌丝体，经化学、药理研究，证明与天然虫草基本一致，经过多年的临床应用，被医药界公认为可以作为冬虫夏草的替代品，中华人民共和国2000年版药典已有明确的规定。同时，虫草无性型发酵液中也富含蛋白质、维生素、锌、铜等微量元素以及虫草酸(D一甘露醇)、虫草素(3′-脱氧腺嘌呤核苷)、多糖类、生物碱类、环状肽类、SOD酶类等多种生物活性物质。其中，多糖类作为冬虫夏草所含的生理活性物质中最重要最丰富的类群之一，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂等多种生理功能，是冬虫夏草开发研究的一个重要突破口，具有良好的应用前景。
[0004] 蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)是虫草无性型的一种，本菌株于2002年分离自青海省玉树地区的天然虫草子实体中，并由中科院菌种保藏中心鉴定。由于虫草分布的广泛性和无性型菌株的多样性，不同科研机构对无性型虫草的研究有很大差异，而关于利用该菌株液体发酵并从发酵液中分离胞外酸性糖蛋白的研究尚未见报道。
发明内容
[0005] 本发明目的旨在提供一种制备蝙蝠蛾拟青霉胞外酸性糖蛋白的方法，实现本发明的具体方案如下：
[0006] (1)从保存于土豆斜面培养基上的母种中挖取菌丝体块(大小为0.5cm×0.5cm)，接种于种子培养基中(每只250mL三角瓶装种子培养基100mL)，于17℃下静止培养12小时后，120rpm下振荡培养培养72小时，即可获得种子液。种子培养基(g/L)：蔗糖30.00，酵母膏6.00，磷酸二氢钾1.50，硫酸镁0.50，麦芽汁10.00，土豆汁10.00，pH 6.5。
[0007] (2)取步骤(1)中的种子液接种到发酵培养基中(每只500mL三角瓶装发酵培养基200mL)，接种量为1％(V/V)，于17℃下静止培养12小时后，120rpm下振荡培养培养120小时后，将发酵产物离心分离(离心分离条件：4000rmp，15min)获得蝙蝠蛾拟青霉发酵液。发酵培养基配方(g/L)：蔗糖50.86，酵母膏2.00，硫酸铵6.61，磷酸二氢钾1.36，硫酸镁
0.05，土豆汁15.00，麦芽汁15.00，pH 6.5；
[0008] (3)将步骤(2)中获得的蝙蝠蛾拟青霉发酵液，50℃减压浓缩至原体积的1/2，加3倍体积的无水乙醇，沉淀12小时，用80％乙醇洗涤3次后，离心分离(离心分离条件：4000rmp，15min)，获得胞外粗多糖。
[0009] (4)将步骤(3)制得的胞外粗多糖通风挥去乙醇，加少量去离子水复溶后，用Sevag法(氯仿∶正丁醇＝4∶1)脱蛋白3次后，将水相溶液冷冻干燥获得粗多糖冷冻干粉。
[0010] (5)将步骤(4)所得粗多糖溶解后，上样于DEAE-52纤维素柱，并分别用去离子水、0.1mol/LNaCl和0.3mol/L NaCl进行洗脱，将收集的0.3mol/L NaCl洗脱组分进行减压浓缩，去离子水透析72小时，浓缩后冷冻干燥，即得到胞外酸性糖蛋白组分。制备的胞外酸性糖蛋白为灰白色粉末，其中多糖含量80.56％，蛋白质含量18.76％。
[0011] (6)将步骤(5)所得胞外酸性糖蛋白用分子排阻色谱检测其分子量分布情况，用红外光谱分析特征基团组成，用紫外光谱扫描确定其是否具有蛋白质组分。
[0012] 2、根据专利要求1所述的一种具有生物活性胞外酸性糖蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)的发酵培养基配方(g/L)：蔗糖50.86，酵母膏2.00，硫酸铵6.61，磷酸二氢钾1.36，硫酸镁0.05，土豆汁15.00，麦芽汁15.00，pH 6.5。
[0013] 制备的蝙蝠蛾拟青霉胞外酸性糖蛋白为灰白色粉末，其中多糖含量80.56％，蛋白含量18.76％，容易吸潮。该酸性糖蛋白的红外吸收光谱表明其具有多糖、羧基、硫酸基和氨基的特征吸收峰。该胞外酸性糖蛋白的紫外吸收扫描表明其含有蛋白的吸收峰。对该胞外糖蛋白的分子量进行测定，表明其分子量分布在20-80kD之间。
附图说明
[0014] 图1培养基组成对蝙蝠蛾拟青霉胞外酸性糖蛋白产量的影响
[0015] 图2蝙蝠蛾拟青霉胞外酸性糖蛋白的红外吸收图谱
[0016] 图3蝙蝠蛾拟青霉胞外酸性糖蛋白糖的紫外扫描图谱
具体实施方式
[0017] 下面通过实施例，对本发明作进一步描述。
[0018] 实施例1：
[0019] (1)从保存于土豆斜面培养基上的母种中挖取出菌丝体块(大小为0.5cm×0.5cm)，接种于种子培养基中(每只250mL三角瓶装种子培养基100mL)，于17℃下静止培养12小时后，120rpm下振荡培养培养72小时，即可获得种子液。种子培养基(g/L)：蔗糖30.00，酵母膏6.00，磷酸二氢钾1.50，硫酸镁0.50，麦芽汁10.00，土豆汁10.00，pH 6.5，。
[0020] (2)取步骤(1)中的种子液接种到发酵培养基中(每只500mL三角瓶装发酵培养基200mL)，接种量为1％(V/V)，于17℃下静止培养12小时后，120rpm下振荡培养培养120小时后，将发酵产物离心分离(离心分离条件：4000rmp，15min)获得蝙蝠蛾拟青霉发酵液。发酵培养基配方(g/L)：蔗糖50.86，酵母膏2.00，硫酸铵6.61，磷酸二氢钾1.36，硫酸镁
0.05，土豆汁15.00，麦芽汁15.00，pH 6.5；
[0021] (3)将步骤(2)中获得的蝙蝠蛾拟青霉发酵液，50℃减压浓缩至原体积的1/2，加3倍体积的无水乙醇，沉淀12小时，用80％乙醇洗涤3次后，离心分离(离心分离条件：4000rmp，15min)，获得胞外粗多糖。
[0022] (4)将步骤(3)制得的胞外粗多糖通风挥去乙醇，加少量去离子水复溶后，用Sevag法(氯仿∶正丁醇＝4∶1)脱蛋白3次后，将水相溶液冷冻干燥获得粗多糖冷冻干粉。
[0023] (5)将步骤(4)所得粗多糖溶解后，上样于DEAE-52纤维素柱，并分别用去离子水、0.1mol/LNaCl和0.3mol/L NaCl进行洗脱，将收集的0.3mol/L NaCl洗脱组分进行减压浓缩，去离子水透析72小时，浓缩后冷冻干燥，即得到胞外酸性糖蛋白组分。制备的胞外酸性糖蛋白为灰白色粉末，其中多糖含量80.56％，蛋白质含量18.76％。
[0024] (6)将步骤(5)所得胞外酸性糖蛋白用分子排阻色谱检测其分子量分布情况，用红外光谱分析特征基团组成，用紫外光谱扫描确定其是否具有蛋白质组分。
[0025] 实施例2：
[0026] 蝙蝠蛾拟青霉胞外酸性糖蛋白的发酵条件优化实验
[0027] (1)蝙蝠蛾拟青霉胞外酸性糖蛋白的发酵条件优化单因素筛选试验
[0028] ①部分因素设计对发酵条件显著因素的筛选。
[0029] 蝙蝠蛾拟青霉胞外酸性糖蛋白发酵条件因素以及代码为：葡萄糖(X1)，玉米粉(X2)，酵母膏(X3)，硫酸铵(X4)，KH2PO4(X5)，MgSO4(X6)，土豆汁(X7)，麦芽汁(X8)的中心点(0)分别为(g/L)：30，10，2，6，1，0.5，10，10，步长分别为：10，5，1，1，0.5，0.2，5，5。20组试验的蝙蝠蛾拟青霉胞外酸性糖蛋白的产量见表1。
[0030] 表1发酵培养基显著性条件筛选
[0031]
[0032] 经过Design-Expert 7.0软件进行方差分析，得到表2：
[0033] 表2部分因子设计的方差分析
[0034]
[0035] 由表2可以看出，蔗糖(X1)，酵母膏(X3)、硫酸铵(X4)和磷酸二氢钾(X5)是蝙蝠蛾拟青霉胞外酸性糖蛋白产量的显著性影响因素。
[0036] 但是从表中无法判断蔗糖(X1)，酵母膏(X3)与硫酸铵(X4)和磷酸二氢钾(X5)对蝙蝠蛾拟青霉胞外酸性糖蛋白得率的显著性影响的浓度中心点。为了进一步优化蔗糖(X1)，酵母膏(X3)与硫酸铵(X4)和磷酸二氢钾(X5)最佳浓度以及交互作用，本发明采用响应面法进一步试验了蔗糖(X1)，酵母膏(X3)与硫酸铵(X4)和磷酸二氢钾(X5)最佳浓度。
[0037] ②响应面法优化蝙蝠蛾拟青霉高产胞外酸性糖蛋白发酵条件结果
[0038] 蔗糖(X1)，酵母膏(X3)与硫酸铵(X4)和磷酸二氢钾(X5)的中心点分别为(g/L)：50，3，6和1.0。响应面试验设计以及结果见表3。根据表3结果，用Design EXpert7.0软件分析得到多元回归方程为：
[0039] Y＝-37.99+1.84X1-0.14X3+1.19X4+3.53X5-0.014X12-0.97X32-0.04X42-0.79X52+0.085X1X3-0.093X1X4-0.018X1X5
[0040] 根据方程计算得到最佳发酵条件为：蝙蝠蛾拟青霉高产胞外酸性糖蛋白发酵培养基配方(g/L)：蔗糖50.86，酵母膏2.00，硫酸铵6.61，磷酸二氢钾1.36，硫酸镁0.05，土豆汁15.00，麦芽汁15.00，pH 6.5，胞外酸性糖蛋白最高产量可达5.33g/L。
[0041] 表3响应面试验与发酵条件优化结果
[0042]
