基于已知E1查找特异性介导靶蛋白泛素反应E2-E3的方法

摘要

本发明涉及生物化学与分子生物学领域。具体而言，特指一种从人体细胞众多E3中查找出特异性识别靶蛋白泛素连接酶E3和调控靶蛋白泛素化反应的E2/E3系统的方法。该方法是先建立体外泛素化分析系统，通过已知的泛素活化酶E1和以HelaS100馏分作为E3源，筛选出介导靶蛋白泛素反应的结合酶E2；再采用多重层析柱组合，结合质谱分析，从人体细胞中查找特异性识别靶蛋白的泛素连接酶E3和调控靶蛋白泛素化修饰的E2/E3系统。通过这种方法，可以方便、准确地查找出识别靶蛋白的底物识别因子－泛素连接酶E3；建立介导靶蛋白泛素化修饰的E2/E3调控系统。

权利要求

1.基于已知泛素活化酶E1查找特异性介导靶蛋白泛素反应结合酶E2和连接酶E3的方法，包括以下步骤：（1）建立泛素化修饰反应的体外分析系统和结合酶E2的确定：泛素反应的体外分析系统是以经纯化的GST融合靶蛋白作为基质，GST为对照，还包括：泛素，一种已知的泛素活化酶E1，结合酶E2，未知的连接酶E3，Ubiquitin aldehyde，ATP能量再生系统；结合酶0

E2的确定过程是将以上反应混合物于反应缓冲液中30C下反应60分钟；反应完成后，用Glutathione珠回收GST融合蛋白或GST的耦合物，SDS-PAGE电泳并转膜后，以抗泛素的抗体Western Blot检测靶蛋白-泛素耦合物，从待选的多种结合酶E2中筛选出在已知泛素活化酶E1情况下介导靶蛋白多泛素化反应最强的、与未知连接酶E3配对的结合酶E2；

（2）对特异性识别靶蛋白的连接酶E3进行查找：人体细胞抽提液经过免疫亲和层析柱、Phenyl Sepharose疏水层析柱、Mono Q离子交换层析柱和Superdex 200分子筛层析柱

4个不同性质的层析柱，每一步层析后，运用上述所建立的泛素反应体外分析系统，对各洗脱馏分检测连接酶E3的活性，合并含连接酶E3活性的洗脱馏分峰，再通过下一个层析柱，在最后一步层析后，对含连接酶E3活性馏分峰进行质谱鉴定，确定出特异性识别靶蛋白的连接酶E3。

2.按照权利要求1所述方法，其特征在于：在建立的泛素化反应体外分析系统中所述的泛素活化酶E1为商业化人源重组UBE1，未知的连接酶E3源为Hela细胞S100馏分。

3.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述的用于筛选特异性介导靶蛋白泛素反应的结合酶E2是UbcH5c、UbcH2、UbcH3-Cdc34和UbcH13/Uev1a 复合物。

4.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述的靶蛋白为人源DNA 聚合酶δ小亚基p12，并将其制备成带GST标签的融合蛋白用作泛素化反应体外分析系统中的基质。

说明书

基于已知E1查找特异性介导靶蛋白泛素反应E2-E3的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物化学与分子生物学领域。具体而言，特指一种从人体细胞众多E3中查找出特异性识别靶蛋白泛素连接酶E3和调控靶蛋白泛素化反应的E2/E3系统的方法。技术背景

[0002] 在各种形式的蛋白质翻译后修饰过程中，泛素化修饰近年来引起了越来越广泛的关注。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它通过调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况，在细胞生命活动的许多进程中发挥着至关重要的作用。

[0003] 被多聚泛素化修饰(Poly-ubiquitination)的靶蛋白一般会被蛋白酶体识别进而被降解，此过程主要涉及三种关键的酶：活化酶E1，结合酶E2和连接酶E3。蛋白质被泛素化修饰的作用机制为：首先由E1在ATP能量作用下通过其活性中心的Cys残基与泛素的C端形成硫酯键活化单个游离的泛素，然后E1将活化的泛素递交给E2，最后由E3募集特异的底物和E2，并介导泛素从E2转移到靶蛋白。由于蛋白酶体识别泛素化的蛋白并将其降解是一个非特异性的进程，因此，E3在整个蛋白质的降解过程中发挥了至关重要的作用，它决定了反应的特异性。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50多种E2酶、600多种E3酶(Bhoj, V. G. & Chen, Z. J., Nature, 2009, 458:430-437)。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶(Zheng, N., Structure,2003, 11: 5-6)和其它含有RING结构域或类似RING结构域的E3酶(Petroski, M. D., et al., Nat Rev Mol Cell Biol, 2005, 6: 9-20)。

[0004] 几乎所有主要的DNA修复途径、损伤避免机制和细胞周期检查点响应等过程都或多或少地受到泛素化和（或）类泛素化修饰SUMO修饰途径的调控。泛素化和SUMO参与多种DNA的修复过程，如跨损伤修复(Translesion synthesis)，核苷酸切除修复(Nucleotide excision)，同源重组(Homologous recombination)等。作为一种最主要的聚合酶，DNA聚合酶δ（Pol δ）在各种形DNA修复过程中通过重新合成 DNA（Re-synthesis of DNA）和缺口填补（Gap-filling）起着重要的作用(Branzei, D. &. Foiani, M., Nat Rev Mol Cell Biol, 2008, 9: 297-308)。通过对人Pol δ 进一步的研究发现，Pol δ 本身也是一个DNA损伤响应的靶目标(Zhang, S., et al., J Biol Chem, 2007, 282: 15330-40)。在体外培养的人细胞中，通过遗传毒物处理或射线诱导而引起DNA损伤的情况下，Pol δ 的小亚基p12在ATR/Chk1通路调控下以泛素化依赖的形式降解，从而导致细胞内Pol δ由原来的四聚体形式Pol δ4转换为三聚体Pol δ3以应对DNA损伤 (Meng, X., et al., Nucleic Acids Res, 2009, 37: 647-657)。类似的研究也表明，p12和Pol δ的另外一个调节亚基p68也能被泛素化和SUMO修饰(Liu, G. &. Warbrick, E., Biochem Biophys Res Commun, 2006, 349: 360-6)，但到目前为止，对p12被降解（下调）的泛素修饰机制不清楚，其关键点在于，还没有建立一个很好的方法从众多的E3中确定出特异性识别和介导靶蛋白进行泛素化修饰的连接酶E3，寻找E2/E3系统调控靶蛋白的泛素化修饰途径成为一项令人“恐怖”的实验。

[0005] 癌症是一种由遗传和表观遗传改变，以细胞异常增殖及转移为特点的一大类疾病，而泛素修饰系统则由一系列能催化细胞内靶蛋白泛素化的酶和底物蛋白所组成，对细胞内的多种功能进行调控，如果泛素修饰系统出现问题将引起人体内的多种病理改变，如各种肿瘤的发生等。鉴于Pol δ所具有的特殊生物学功能以及泛素蛋白修饰途径在DNA修复机制中的关键性作用，阐明Pol δ小亚基p12降解的泛素化修饰机制，对理解多种疾病的发生机制和遗传信息的调控表达有着重要意义，而查找出特异性识别靶蛋白p12的E3和介导p12泛素化修饰的E2/E3调控系统已成为目前制约我们了解p12降解的泛素化修饰机制的瓶颈。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是：建立体外泛素化分析手段，通过已知的泛素活化酶E1和以Hela S100馏分作为E3源，筛选出介导靶蛋白泛素反应的结合酶E2；采用多重层析柱组合，结合质谱分析，从人体细胞中查找特异性识别靶蛋白的泛素连接酶E3和调控靶蛋白泛素化修饰的E2/E3系统。通过这种方法，可以方便、准确地查找出识别靶蛋白的底物识别因子－泛素连接酶E3；建立介导靶蛋白泛素化修饰的E2/E3调控系统，解除制约“阐明p12降解的泛素化修饰机制”的瓶颈。

[0007] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

[0008] 1. 建立泛素化修饰反应的体外(In vitro)分析系统和E2的确定：泛素反应的体外分析系统是以经纯化的GST融合蛋白作为基质，GST为对照，反应体系中还含有泛素，活化酶E1，结合酶E2，连接酶E3，Ubiquitin aldehyde（抑制蛋白酶体泛素化水解和去泛素0
化酶的活性），ATP能量再生系统。E2的确定过程是将以上反应混合物于反应缓冲液中30C下反应60分钟。反应完成后，用Glutathione珠回收GST融合蛋白（靶蛋白）或GST的耦合物，SDS-PAGE电泳并转膜后，以抗泛素的抗体Western Blot检测靶蛋白-泛素耦合物，从待选的多种E2中筛选出在已知E1情况下介导靶蛋白多泛素化反应最强的、与未知E3配对的E2。

[0009] 上述反应体系中，所述的基质（靶蛋白）是：经纯化后的带GST标签的DNA聚合酶Pol δ小亚基p12的融合蛋白。

[0010] 所述的泛素是：从BostonBiochem公司购买的商业化人源泛素蛋白(Ubiquitin)。

[0011] 所述的活化酶E1是：从BostonBiochem公司购买的商业化人源重组UBE1 (Ubiquitin E1 Enzyme)。

[0012] 所述的结合酶E2是：从BostonBiochem公司购买的商业化人源重组UbcH5c、UbcH2、UbcH3(Cdc34)以及UbcH13/Uev1a 复合物 (以UbcH13表示)。

[0013] 所述的连接酶E3是指：在上述的反应体系中，以BostonBiochem公司购买的商业化Hela细胞S100馏分作为E3源。

[0014] 所述的ATP能量再生系统是指：从BostonBiochem公司购买的商业化ERS (Energy Regeneration System)。

[0015] 所述的反应缓冲液是：40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM DTT, 5 mM MgCl2。

[0016] 所述的抗泛素的抗体是指：从Cell Signaling Technology公司购买的商业化兔源抗泛素的多克隆抗体。

[0017] 2. 基于已知E1和通过上述技术途径筛选出的E2对特异性识别靶蛋白的E3进行查找：人体细胞抽提液经过4个不同性质的层析柱，每一步层析后，运用上述所建立的泛素反应体外分析系统，对各洗脱馏分检测E3的活性，合并含E3活性的洗脱馏分峰，再通过下一个层析柱，在最后一步层析后，对含E3活性馏分峰进行质谱鉴定，确定出特异性识别靶蛋白的E3。

[0018] 上述技术方案中所述的人体细胞抽提液是指：体外培养的大约2×108Hela细胞在0
裂解缓冲液存在下经超声波裂解，4C下进行高速离心后所收集的上清液。

[0019] 所述的4个不同性质层析柱是指：免疫亲和层析柱，由本实验室采用抗DNA聚合酶Pol δ纯化大亚基p125而制备的层析柱（中国发明专利，申请号：201010556585.7），该步层析目的是将Pol δ四亚基蛋白复合物与E3活性分开；其它的三个层析柱分别是Phenyl Sepharose疏水层析柱、Mono Q离子交换层析柱、Superdex 200分子筛层析柱。

[0020] 所述的质谱鉴定是指：将Superdex 200分子筛层析柱后的含E3活性峰经SDS-PAGE凝胶电泳，用手术刀将胶均匀切割成多个条带，每个条带经胰蛋白酶消化后，分别在4800 Plus MALDI TOF/TOF质谱仪上进行分析，利用MASCOT搜索引擎在NCBInr数据库中匹配，查找出特异性识别靶蛋白（Pol δ小亚基p12）的E3。

[0021] 所确定出的特异性识别靶蛋白Pol δ小亚基p12的E3是： Ring Finger Protein (C3HC4 type) 8，即RNF8；介导p12泛素化修饰的E2/E3调控系统是：UbcH13/Uev1a/RNF8。

[0022] 3. 对筛选出的E3是否特异性介导靶蛋白泛素化反应进行进一步签定：将RNF8作为E3源取代技术途径1所述的泛素化修饰反应体外分析系统中的Hela细胞S100馏分，0
30C下反应60分钟后的反应物直接进行SDS-PAGE电泳并转膜，以抗泛素的抗体Western Blot检测靶蛋白-泛素耦合物，确定所筛选出的RNF8是否特异性介导靶蛋白（Pol δ小亚基p12）的泛素化反应。

[0023] 本发明的突出优点表现为：利用4个不同性质层析柱的组合，结合体外泛素化反应分析系统，通过质谱分析，从人体细胞数量众多的E3中，方便、准确的查找出特异性识别靶蛋白的E3和介导靶蛋白泛素化反应的E2/E3系统，解除制约我们深入研究蛋白质泛素化修饰机制的瓶颈；本发明所运用的体外泛素化反应分析系统所涉及到的泛素、E1、E2、抗体等生物材料均为商业化产品，能够方便地通过外购而获得。

[0024] 本发明通过以下附图和实施例作进一步详细阐述。

附图说明

[0025] 图1. 泛素化修饰体外反应系统的建立和E2的确定。A：蛋白质被泛素化修饰作用机制的示意图。首先E1类酶在ATP提供能量情况下激活泛素；泛素转移至E2类酶；E3类酶具有特异性，可以识别出需破坏的目标蛋白质，与目标蛋白质接近的E2-泛素复合体将泛素转移至目标蛋白质；E3类酶释放出被泛素标记的蛋白质；重复以上过程，在被标记的蛋白质分子尾端形成一小段多泛素分子链。B：在标准泛素化体外反应系统中不同E2对p12多泛素反应响应的Western Blot分析。以人重组UBE1 作为E1，以Hela S100馏分作为E3源，以GST蛋白作为对照反应，图从左到右分别表示反应中加入不同商品化的人源E2，其中，以UbcH13/Uev1a 复合物（图中以UbcH13表示）介导p12的泛素反应信号最强。

[0026] 图2. 依赖于UbcH13/Uev1a介导p12泛素化的E3分离纯化流程示意图。大约8
2×10 Hela细胞抽提液经过1.免疫亲和层析柱、2.Phenyl Sepharose疏水层析柱、3.Mono Q离子交换层析柱和4.Superdex 200分子筛层析柱4步层析，每一步层析后由所建立的泛素化分析系统检测E3的活性，合并含E3活性的洗脱馏分，再通过下一个柱层析。在最后一步层析后，对含E3活性馏分峰进行质谱鉴定，确定出特异性识别靶蛋白p12的E3。

[0027] 图3. 免疫亲和层析后E3活性检测。A：免疫亲和层析后的洗脱馏分 Western Blot分析。检测到的人DNA聚合酶Pol δ的4个亚基如图左的箭头所示，图下方的Bc：细胞裂解离心后上清液(Before column)，Ft：过柱后的上清液(Flow through)，W：漂洗液(Wash)，泳道3-40：洗脱的馏分，大部分Pol δ复合物已经被分离。B： E3活性检测的Western Blot分析。图左数字表示标准蛋白Marker (KDa)，Ck：标准泛素化体外反应系统中以GST蛋白作为对照反应，Ft：标准泛素化体外反应系统中以过柱后的上清液作为E3源，泳道15：标准泛素化体外反应系统中以第15洗脱馏分为E3源。介导p12泛素化反应的E3活性主要存在于Ft，被分离的Pol δ复合物15号洗脱峰中未检测到E3的活性。

[0028] 图4. Phenyl Sepharose疏水层析后E3活性检测的Western Blot分析。图左数字表示标准蛋白Marker (KDa)，Ck：标准泛素化体外反应系统中以GST蛋白作为对照反应，图上面数字表示层析后的不同馏分洗脱峰在标准泛素化体外反应系统中作为E3源，以第50号馏分介导p12泛素化反应的E3活性最强。

[0029] 图5. Mono Q离子交换层析后E3活性检测的Western Blot分析。图左数字表示标准蛋白Marker (KDa)，Ck：标准泛素化体外反应系统中以GST蛋白作为对照反应，图上面数字表示层析后的不同馏分洗脱峰在标准泛素化体外反应系统中作为E3源，以第9－12号馏分介导p12泛素化反应的E3活性为最强。

[0030] 图6. Superdex 200分子筛层析后E3活性检测的Western Blot分析。图左数字表示标准蛋白Marker (KDa)，Ck：标准泛素化体外反应系统中以GST蛋白作为对照反应，图上面数字表示层析后的不同馏分洗脱峰在标准泛素化体外反应系统中作为E3源，以第40号馏分介导p12泛素化反应的E3活性为最强。

[0031] 图7. RNF8作为E3介导p12泛素化反应的确认。A：纯化后用于p12泛素化反应的带His标签的RNF8融合蛋白在考马司亮蓝染色的SDS-PAGE胶上的分析。泳道1：标准蛋白Marker (KDa)，泳道2：Ni柱纯化后的His-RNF8融合蛋白（用箭头表示）。B： 验证RNF8作为E3介导p12泛素化反应的Western Blot分析。Mix表示泛素反应的预配混合物，含：泛素、E1（UBE1）、E2（UbcH13/Uev1a）、Ubiquitin aldehyde，ATP能量再生系统、40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM DTT, 5 mM MgCl2。His-RNF8融合蛋白以RNF8表示，图左数字表示标准蛋白Marker (KDa)，用抗泛素的多克隆抗体检测到的p12多泛素耦合物以短线所指示，耦合了两个泛素分子的p12用p12-Ub2表示，以此类推。

[0032] 实施方式

[0033] 实验材料：

[0034] 泛素反应体外分析系统所用的泛素Ubiquitin、活化酶E1、结合酶E2、作为E3源的Hela 细胞S100馏分，Ubiquitin aldehyde、ATP能量再生系统等均购自BostonBiochem公司；回收GST融合蛋白的Glutathione珠购自GE Healthcare Bio-Sciences公司；查找特异性识别靶蛋白p12的链激酶E3技术方案中所采用的免疫亲和层析柱为本实验室所制备（中国发明专利，申请号：201010556585.7），Phenyl Sepharose疏水层析柱、Mono Q离子交换层析柱和Superdex 200分子筛层析柱均购自Amersham Biosciences Corporation；兔源抗泛素多克隆抗体为Cell Signaling Technology公司产品；GST-p12和His-RFN8融合蛋白为江苏大学生命科学研究院制备并保持，也可参照文献制备（李骁等，中国生物工程杂志，2012，32(5)：12-18；Zhang, S., et al., Cell Cycle, 2008, 7(21): 3399-3404）；其它常用实验材料和试剂均为国产。

[0035] 实施例一：泛素化修饰体外反应系统的建立和E2的确定

[0036] 体外泛素化反应采用15 µL的反应体系，含：10 µg 泛素，30 nM UBE1，20 ng of Ubiquitin aldehyde, 1x ENS，300 ng GST-p12作为基质，HeLa S-100 馏分作为E3 源，以500 nM UbcH5c、UbcH2、UbcH3(Cdc34)以及UbcH13/Uev1a 复合物分别作为E2；反应缓冲液为5 mM MgCl2, 40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM DDT，同时以GST作为对照实验。在0
30C条件下反应60分钟，反应结束时加入800 µL的Pull-down缓冲液（1xPBS 中含 0.5% NP-40）终止反应，然后加入10 µL Glutathione Sepharose-4B球珠，室温下摇晃60分钟；
0
再用Pull-down缓冲液洗球珠6次；加入 1 x SDS-PAGE的上样缓冲液，95C保温5分钟，样品经12% SDS-PAGE凝胶电泳后转膜。用抗泛素的多克隆抗体检测到的、被球珠吸附下的p12多泛素耦合物如图1B所示，在已知E1(UBE1)，用HeLa S-100 作为E3 源，以UbcH13/Uev1a 复合物（图中以UbcH13表示）介导p12的多泛素反应信号最强。

[0037] 实施例二：经第一级免疫亲和层析后各馏分E3活性的确定

[0038] 大约2×108个体外培养的Hela细胞，经超声裂解、40C下高速离心后，取上清液为细胞裂解抽提液（所用的细胞裂解缓冲液为：20 mM Tris-Cl, pH7.8, 0.5 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl, 50 mM NaCl, 10% Glycerol, 蛋白酶抑制剂）。经过如图2所示的技术路线示意图，通过4个层析柱组合来鉴定未知的E3。检测各步层析洗脱馏分的E3活性，然后合并各E3活性峰并再通过下一个层析柱，在最后一步层析后，对含E3活性馏分峰进行质谱鉴定，确定出特异性识别靶蛋白p12的E3。

[0039] 以UBE1为E1，以经实施例一所确定的UbcH13/Uev1a 复合物为E2，通过所建立的泛素反应体外分析系统，对经第一级免疫亲和层析分离后各馏分E3活性进行检测。如图3A所示，经免疫亲和层析，DNA Pol δ四亚基蛋白复合物从第12馏分到第30馏分被洗脱，层析过程中所用的洗脱液为：TGEE (40 mM Tris-Cl, pH7.8, 10% Glycerol, 0.5 mM EGTA,1 mM EDTA ) 中含 400 mM NaCl 和30% ethylene glycol。如图3B所示，以GST-p12为底物的E3活性主要存在于Ft馏分（过柱后的上清液Flow through），在Pol δ四亚基蛋白复合物的洗脱峰15号馏分中未检测到E3的活性。Pol δ四亚基蛋白复合物和E3活性已经被分开。

[0040] 实施例三：经第二级Phenyl Sepharose疏水层析分离后各馏分E3活性的确定[0041] 将实施例二中的Ft在透析液TGEED (TGEE+1 mM DDT)/500 mM ammonium sulfate中进行透析，透析过的Ft再经过Phenyl Sepharose疏水层析分离，用TGEED中含500 mM 到0 mM ammonium sulfate 进行梯度洗脱，然后对各洗脱馏分中的E3活性进行检测。如图4所示，以GST-p12为底物的E3活性主要存在于第50号馏分。合并40－60馏分并在TGEED透析液中进行透析以去除ammonium sulfate。

[0042] 实施例四：经第三级Mono Q离子交换层析分离后各馏分E3活性的确定[0043] 将实施例三中在TGEED透析液中透析过的Phenyl Sepharose柱第40－60洗脱馏分再经过Mono Q离子交换层析，用TGEED中含0-500 mM NaCl 进行梯度洗脱，并对各洗脱馏分中的E3活性进行检测。如图5所示，以GST-p12为底物的E3活性主要存在于第9-12号馏分。

[0044] 实施例五：经第四级Superdex 200分子筛层析分离后各馏分E3活性的确定[0045] 合并Mono Q离子交换层析柱洗脱馏分9－15，将其浓缩到250 μL，然后经过Superdex 200分子筛层析（洗脱液为TGEED中含100 mM NaCl），并对各洗脱馏分中的E3活性进行检测。如图6所示，以GST-p12为底物的E3活性主要存在于第40号馏分。含E3活性峰的第40号馏分经SDS-PAGE凝胶电泳后，用手术刀将胶均匀切割成多个条带，每个条带经胰蛋白酶消化后，分别在4800 Plus MALDI TOF/TOF质谱仪上进行分析，利用MASCOT搜索引擎在NCBInr数据库中匹配，查找特异性识别靶蛋白（Pol δ小亚基p12）的E3。经过比对，成功地获得唯一能够作为E3功能的蛋白：Ring Finger Protein (C3HC4 type) 8，即RNF8。

[0046] 实施例六：RNF8作为E3介导p12泛素化反应的确认

[0047] 如图7A所示，由本实验室制备并保存的、在昆虫细胞中表达并经纯化的带His标0
签的RNF8作为E3，以代替实施例一中泛素化反应体外系统中的Hela S100，30C下反应一小时，反应结束后直接进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后进行的Western Blot分析结果如图
7B所示，RNF8能够作为E3连接酶介导靶蛋白p12发生多泛素化反应，p12的多泛素耦合物清晰可见，其介导p12泛素化修饰的E2/E3调控系统是：UbcH13/Uev1a/RNF8。

[0048] 综上所述，利用本发明的技术路线，可以方便、准确地从人细胞抽提物中确定出特异性识别靶蛋白的E3并介导靶蛋白进行泛素化反应的E2/E3系统。