用于解酒的蜂胶乙醇提取物、制备方法及在生产肠溶片中的应用转让专利
申请号 : CN201210500238.1
文献号 : CN102940650B
文献日 : 2014-07-09
发明人 : 周斌 , 叶满红
申请人 : 扬州大学
摘要 :
用于解酒的蜂胶乙醇提取物、制备方法及在生产肠溶片中的应用，涉及从动植物，特别是从蜂胶中提取有效物质的工艺技术领域。先将蜂胶冷冻、粉碎除杂，再以常压常温乙醇浸泡后的超声波提取，冷冻离心除去固体杂质，取醇溶液，最后，在1～5℃的环境温度下分离出分子量为5000D以下的蜂胶乙醇提取物，经乙醇蒸馏回收得到采用乙醇从蜂胶中提取的分子量小于5000D的固形物含量大于90%的生物活性干燥物，将其与蜂王浆冻干粉、异麦芽糖醇、硬脂酸镁和包衣粉等混合制解酒肠溶片，本发明对于解酒效果显著，且无副作用，而且费用低廉，简单易行。
权利要求 :
1.用于解酒的蜂胶乙醇提取物，为采用乙醇从蜂胶中提取的分子量小于5000D的固形物含量大于90%的生物活性干燥物；所述生物活性干燥物的制取方法包括以下步骤：
1）将蜂胶置于-18℃的环境温度条件下冷冻20～40小时后粉碎；
2）常温常压下将体积浓度为50%～90%的食用酒精与粉碎后的蜂胶按1～10︰1的重量比混合，先于低频超声波、于10～40℃温度下处理10～40分钟，然后于环境温度为
10～40℃的条件下密闭浸泡1～4天；
3）取浸泡后混合物以8000～16000转冷冻离心10～15分钟，除去固体杂质，取乙醇溶解蜂胶的上清液；
4）将上清液在1～5℃环境温度条件下以5000D分子筛超滤分离，取得分子量小于
5000D的蜂胶乙醇提取物；
5）将上述分子量小于5000D的蜂胶乙醇提取物置于乙醇蒸馏回收器中，蒸去食用酒精，得到分子量小于5000D的固形物含量大于90%的生物活性干燥物。
2.一种如权利要求1所述用于解酒的蜂胶乙醇提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将蜂胶置于-18℃的环境温度条件下冷冻20～40小时后粉碎；
2）常温常压下将体积浓度为50%～90%的食用酒精与粉碎后的蜂胶按1～10︰1的重量比混合，先于低频超声波、于10～40℃温度下处理10～40分钟，然后于环境温度为
10～40℃的条件下密闭浸泡1～4天；
3）取浸泡后混合物以8000～16000转冷冻离心10～15分钟，除去固体杂质，取乙醇溶解蜂胶的上清液；
4）将上清液在1～5℃环境温度条件下以5000D分子筛超滤分离，取得分子量小于
5000D的蜂胶乙醇提取物；
5）将上述分子量小于5000D的蜂胶乙醇提取物置于乙醇蒸馏回收器中，蒸去食用酒精，得到分子量小于5000D的固形物含量大于90%的生物活性干燥物。
3.一种如权利要求1所述用于解酒的蜂胶乙醇提取物在生产肠溶片中的应用，其特征在于以所述用于解酒的蜂胶乙醇提取物、蜂王浆冻干粉、异麦芽糖醇、硬脂酸镁和包衣粉制成用于制备蜂胶解酒的肠溶片；所述蜂胶乙醇提取物、蜂王浆冻干粉、异麦芽糖醇、硬脂酸镁和包衣粉分别占肠溶片总质量的20～30%、7～10%、55～70%、0.2～0.4%、1～3%，各组分含量百分数之和为100%。
说明书 :
用于解酒的蜂胶乙醇提取物、制备方法及在生产肠溶片中
的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及从动植物及其分泌物，特别是从蜂胶中提取活性物质的工艺技术领域。
背景技术
[0002] 我国是世界上酿酒最早的国家，酒文化渗透于许多社会文化中，早已成为日常生活必不可少的一部分。随着人民物质、文化和生活水平的提高，过量饮酒已成为世界性的社会公共卫生问题，由此而发生的酒精性肝炎的发生率亦不断增长，在我国已成为继病毒性肝炎后的第二大肝病；由于文化、历史或个人嗜好等原因，完全消除不良饮酒习惯尚需要整个社会的长期努力。
[0003] 目前各种各样的应酬越来越多，由于酗酒所引起的各种肝脏疾病的发病率逐年提高，酒精性脂肪肝已经成为影响现代人生活质量的重要问题，社会迫切需要新型廉价的天然解酒产品的出现。
[0004] 酒性热而气壮，饮酒过度，酒毒蓄积，肝脾胃诸多脏器受损而致气阴两伤。中医治疗当以清解酒毒、清热化痰、益气养阴为主；美国FDA批准了3个用于酒精中毒治疗的药物，即纳曲酮、阿坎酸和托毗酯。动物试验和临床研究中发现，如乌苯美司、尼莫地平、依米丁等也具有一定程度改善酒精中毒的作用。
[0005] 蜂胶具有很强的生理调节作用，蜂胶是由蜜蜂收集的来自不同植物的树脂类物质，自远古时代就被人类当作药物治疗，现在它仍然是巴尔干半岛国家最常用的治疗物品，应用于创伤、烧伤、喉咙痛、胃溃疡等治疗。近10年来研究者对蜂胶的药理活性及化学成分进行了全面的研究，发现蜂胶具有广泛的药理活性，如抗菌性、抗真菌、抗病毒、消炎、保肝、抗氧化、抗癌等。蜂胶黄酮是蜂胶中所含的主要有效成分之一，其药理作用非常广泛，有抗炎、抗过敏、抗致癌、抗增生、抗病毒和抗细胞分化等作用；可以减轻活性氧自由基对生物膜的破坏和保护SOD；可大量减少肝组织中所含MDA，并明显提高小鼠肝脏SOD、CAT活性；提示蜂胶黄酮具有较强的清除氧自由基，抗氧化的作用。Mahran等研究发现，蜂胶水溶液呈剂量依赖性地保护肝细胞的损伤，其机制可能是蜂胶水提液对肝细胞损伤有修复作用。Lin等研究发现，蜂胶对酒精造成的肝损伤也有保护作用。蜂胶醇提液能使血清转氨酶和TG水平显著降低，肝脂肪变程度明显下降。总之，蜂胶具有抗菌、抗病毒、抗溃疡、抗炎、抗肿瘤，降血压、调节血脂血糖、增强免疫力，保护心血管，镇静麻醉，保护肝脏，抗衰老，改善记忆功能等作用，其制剂已被广泛应用于临床。但蜂胶乙醇提取物应用于解酒的研究，目前仍然是空白，通过这几年的研究我们已经基本搞清楚蜂胶解酒的分子作用机理，为研发新的解酒类药物奠定理论基础。
[0006] 目前的植物解酒制剂大致包括以五加科植物为代表的乙醇吸收抑制剂，以葛根、葛花为代表的肝脏代谢促进剂，后者因其兼具保肝作用而更受重视；另外，枳棋子能够通过激活与酒精代谢相关的酶类，来加速机体乙醇和乙醛的分解，也能对各种化学性肝损伤起到一定的预防和治疗效果，是一类醒酒保肝的良药。
[0007] 酒精性肝病发病率呈逐年递增趋势，由饮酒造成的肝脏疾病日益严重，因此找到高效、安全的解决方法刻不容缓，通过研究目前普遍认为解酒护肝主要通过以下几种途径可以达到：
[0008] 1、通过提高乙醇脱氢酶（ADH）、醛脱氢酶（ALDH）活性达到解酒护肝作用[0009] 目前关于解酒药物的研究多集中于提高ADH活性方面，包括胃ADH的首过代谢（FPM）及肝脏ADH的氧化代谢。葛根、葛花、枳棋子是中国传统医学最具代表性的解酒类药物，经研究发现它们发挥解酒作用的有效成分是黄酮类物质，在枳黄方（枳棋子和大黄）对酒精性肝损伤大鼠胃ADHmRNA的影响实验中，枳黄方被证实可以提高酒精在胃的首过代谢从而减轻酒精对肝脏造成的负荷。枳黄方和清肝活血方（柴胡、黄芩、丹参、鳖甲、葛根）均可提高肝组织ADH的活性及mRNA的表达。长期大量饮酒的情况下，导致肝中ADH活性下降，乙醇则主要通过CYP2E1代谢，但此途径会产生大量的乙醛和活性氧，活性氧使氧化还原状态失衡，产生氧化应激反应诱发肝脏组织损伤。因此，对于长期酗酒者而言，提高其ADH活性可减缓由CYP2E1代谢产生的氧化应激，也可起到保护肝脏的作用。如上述所述的枳黄方和清肝活血方可以起到解酒作用，同时也能起到护肝作用。另外，乙醛是酒精性肝损伤的主要因素之一，其代谢缓慢且毒性大。研究发现枳棋子水提液干预后的急性酒精中毒大鼠肝组织ADH、ALDH活性比模型组均显著增高（P<0．05），表明枳棋子水提液能够有效增强急性酒精中毒大鼠肝组织ADH、ALDH活性，从而加速乙醇在肝脏内的氧化分解代谢，降低其毒性代谢产物（主要是乙醛）对肝脏的毒性作用，达到一定的护肝效果。然而，仅提高ADH、ALDH活性并不能减缓乙醇在体内代谢的毒性作用，还应对乙醇代谢全过程相关的关键酶，如CYP2E1、CAT进行系统研究，保证乙醇、乙醛的彻底代谢及体内氧化还原状态的平衡。
[0010] 2、通过减缓氧化应激作用达到解酒护肝作用
[0011] 如上所述，乙醇在肝脏中代谢的3个途径均会产生自由基与活性氧，引发氧化应激反应，诱发肝脏组织发生以脂肪变为主要特征的损伤。与氧化应激相关的因子有：丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）。MDA的含量体现脂质过氧化水平，SOD及GSH-PX的活性强弱体现清除活性氧的能力，它们是解酒护肝研究中的常用指标。肝脏中存在着抗氧化系统与促氧化系统的平衡，摄入酒精后此平衡就会被打破，SOD及GSH-PX的活性降低。因此保护体内抗氧化系统的活性、清除体内自由基对防治由氧化应激所致的肝损伤具有重要意义。目前有关膳食与药物对乙醇代谢影响和抗ALD的研究表明：红茶中的抗氧化成分可抑制乙醇代谢过程中导致的机体内酶系统及非酶系统的抗氧化活性降低，有助于机体维持正常的氧化还原状态，而对于蜂胶在这方面的研究仍然是一片空白。
[0012] 3、通过抑制NF-κB活化和下调COX-2表达减轻脂质过氧化和炎症反应[0013] 最新研究表明，氧化应激使NF-κB、COX-2活化，NF-κB是一种调控炎症和免疫反应、细胞凋亡以及感染与应激反应的一种转录因子，COX-2是经刺激迅速产生的诱导酶，是炎症反应的中心环节。COX-2及其合成产物可以通过干扰脂肪、糖类及蛋白质的代谢，加重肝脏的氧应激和促进多种细胞因子的释放，从而参与肝脏的脂肪变性、肝脏炎症、纤维化等病理变化。对此两因子探索，已成为研究乙醇代谢造成肝损伤的新着眼点。茶多酚、枳黄方均可通过抑制大鼠体内NF-κB的活化和下调COX-2表达的作用机制，减轻脂质过氧化和炎症反应，实现保护肝组织的目标。
[0014] 4、通过降低内毒素水平及CD-14表达
[0015] 血浆中内毒素水平升高也是引起ALD的重要因素，但现代的解酒护肝制品中，研究关于制品如何影响内毒素水平的甚少，双环醇作为中国自主研制的新型抗肝炎药物，已用于治疗慢性病毒肝炎。最新研究表明，双环醇可降低血浆内毒素水平及下调CD-14表达，具有保护酒精性肝损伤的作用，防治ALD的形成。因此，可通过降低内毒素水平及CD-14表达，从抑制Kupffer细胞活化角度实现保护肝脏组织的作用。
[0016] 综上所述，ALD的发病机制与多种因素有关，主要包括：乙醇代谢过程中的关键酶，如ADH、ALDH、CYP2E1、CAT；氧化应激影响因子，如MDA、SOD、GSH-PX；信号传导关键核因子，如NF-κB、COX-2；内毒素水平及其受体CD-14表达等。
[0017] 因此，关于解酒护肝作用机制的研究也应围绕这些关键因素展开。同时，中国解酒护肝药品、保健品中多以中草药为主，有关膳食成分的开发很少，因此根据中医学“药食同源”的理念，从膳食中寻找到高效无毒害的解酒护肝成分具有创新意义，也为多靶点协同抗ALD的营养干预和药物开发提供了理论依据，而经过我们研究发现蜂胶能够有效缓解酒精对肝脏的损伤作用，解酒效果明显，其解酒分子机制与其较强的调节多种具有解酒作用的基因有关，有望开发为一种减轻酒精化学性肝损伤的保健食品。
[0018] 肝脏是人体重要的解毒器官，酒精代谢过程主要在肝脏中进行。长期大量摄人酒精，会超过肝脏正常生理代谢解毒能力，引发机体许多重要生理、生化以及代谢紊乱，严重损伤肝细胞，导致酒精性肝脏病（ALD）。酒精性脂肪肝（AFLD）是ALD的3种组织病理学形式之一，发病机制非常复杂，主要表现为脂肪变性。肝脏脂肪变性和脂肪浸润与脂代谢紊乱，例如脂肪酸氧化率的下降、甘油三酯合成的增加、脂肪输出的减少以及肝外脂肪动员等密切相关。酒精对机体特别是对肝脏的损伤主要表现为以下几个方面：1、酶活性标志着机体基础新陈代谢过程中的功能改变：肝细胞内酒精代谢有3个主要通路，其中之一是胞浆质的乙醇脱氢酶（ADH）通路。乙醇氧化过程中，肝内耗氧增加，胞浆质内伴有大量辅酶I（NAD）被还原，形成还原性辅酶I（NADH），导致NAD+／NADH的比值下降而失衡，改变了细胞的氧化还原状态，严重干扰了细胞的新陈代谢，从而使三羧酸循环受到抑制；另外，由于琥珀酸脱氢酶（SDH）等线粒体酶活性减弱使氧化磷酸化能力降低，影响细胞的呼吸，加重肝细胞的损伤。上述变化是引起AFLD最主要的原因。
[0019] 有人把脂肪肝和冠心病比喻成高脂血症一根绳上的两个蚂蚱，因为肥胖、高脂血症、糖尿病和酗酒是脂肪肝的常见病因，而这些因素也同样与动脉粥样硬化和冠心病关系密切。有明显心肌损伤和血流动力学紊乱，T细胞免疫功能下降，肝活检研究显示，这些病例中91.4%有肝细胞脂肪变性。一般而言，酒精脂肪肝属可逆性疾病，早期诊断并及时治疗常可恢复正常。长期食用高脂食物或大量饮酒，酒精会直接毒害肝细胞，影响其结构及功能；许多人就是因为饮酒过度才患上酒精性肝炎、脂肪肝致使肝脏受损。而肝损伤可导致甘油三酯（TG）下降，甘油三酯是长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子。是人体内含量最多的脂类，大部分组织均可以利用甘油三酯分解产物供给能量，是体内能量的主要来源。脂肪肝会导致食入的大量脂肪吸收减少，胆汁分泌不足，不能分解吃进去的脂肪，脂肪在肝脏形成脂肪滴从而加重病情。
[0020] 蜂胶是蜜蜂采集胶源植物的幼芽或愈伤组织分泌的树脂状物质，并混合自身腺体的分泌物、花粉和蜂蜡等混合而成的一种具有黏性的胶状物质。蜂胶富含多种生物活性物质，尤其是含有大量的黄酮类物质，具有多种医疗保健功效，被誉为“紫色黄金”。蜂胶在采收过程中不可避免的会混入木屑、蜂尸、杂草、沙石等杂质，在用于食品、药品等之前，必须经提纯净化，否则不能够服用。
[0021] 蜂胶提取方法不同所得的有效成分也不相同，目前常用提取方法有：乙醇提取法、水提取法、超临界提取法、超声波辅助提取法、酶提取法、硼高分子电解质法、微波辅助提取法。通过研究发现不同提取方法、不同提取溶媒会表现不同的药理药效，表现出提取与药理药效具有明显的相关性。通过比较，超临界CO2萃取法，不但设备昂贵、操作条件不易掌握，而且提取物得率低且抑菌能力较乙醇浸提法低，但该方法萃取物安全、无残留、无污染，有一定的开发前景，目前主要还是用于实验室研究。有机溶剂浸提法常用的有机溶剂有乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等，其中乙醇最为常用。乙醇浸提法所需设备简单，试剂容易购得，操作也十分方便，用乙醇作为提取溶剂，可以很容易使蜂胶脱蜡，并且可以保护一些多酚类物质，从而获得富含多酚类物质的精制蜂胶，故乙醇是最常用的提取溶剂，特别是70％和80％的乙醇。虽然有时也用95％的乙醇进行提取，但与水醇溶液相比，水醇溶液提取可以使蜂蜡更快地游离出来，同时提取液中还富含大量的多酚类物质。用不同浓度的乙醇对蜂胶进行提取，并测定不同浓度提取液中黄酮类物质的吸收光谱，结果显示在290nm处，80％乙醇提取的蜂胶提取液中有最高的吸收峰，这也就意味着其中含有最多的黄酮类物质，主要是莰菲醇、刺槐黄素和异樱花素。但是，用60％的乙醇提取出的最多的黄酮类物质是异樱花素、槲皮素和莰非醇，70％的乙醇可以提取出最多的乔松素和樱花素；用纯水可以提取出一些易溶于水的多酚类物质，甲醇、正己烷、氯仿有时也被作为提取剂使用。国内外对有机溶剂浸提蜂胶总黄酮的研究主要围绕其影响因素（如乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度）以及其他处理辅助措施（如微波处理、超声波处理）等方面展开。超声波辅助提取可以大大缩短提取时间，近年来已成为蜂胶总黄酮提取工艺研究的热点。以往大多围绕超声波处理时间、超声波功率等方面进行研究，关于超声波频率变化对蜂胶总黄酮提取影响的研究报道较少，且研究也不够深入。
[0022] 蜂王浆是5～15日龄工蜂舌腺和上腭腺所分泌的乳白色或淡黄色乳状液体，是蜂王幼虫整个发育期和雄蜂幼虫前期的唯一食物，类似于哺乳动物的乳汁，又称蜂皇浆、王浆、蜂乳。对蜂王浆的重视和注意，首先是发现了喂饲蜂蜜的幼蜂只能长成工蜂，寿命一般30～40天，最长7～8个月，而喂饲蜂王浆的幼蜂能够长成蜂王，寿命长达3～5年，这一现象提示人们利用蜂王浆作为延年益寿的食品，但对其性质和作用机理并不了解。到1888年，德国化学家A Von Planta才第一个对蜂王浆的组分进行一般性研究，至此人们开始了探讨蜂王浆的奥妙，但对蜂王浆进行包括生物学、化学药理和临床实验的全面研究，还是最近几十年才开始的，至今人们对蜂王浆中的一些微量生物活性物质还未完全研究清楚。目前，已确定的功能因子共 9大类：它们是肽和蛋白质类；功能性甜味剂；功能性油脂；自由基清除剂；维生素；微量活性元素；活性多糖；黄酮类化合物及微生态因子如乳酸菌等。根据人们的研究发现，蜂王浆中含有这些丰富的功能因子，对人类有极强的营养保健功能和医疗作用。
[0023] 现代研究表明：蜂王浆可减轻 ALD病程中肝细胞的损伤作用，对损伤后的肝脏组织有促进再生的作用，其作用机制可能是通过降低或抑制COX-2的生成，避免过度的炎性反应，达到减轻线粒体及脂质过氧化损伤，从而降低血清AST和ALT的水平；蜂王浆降低了TNF-α在肝细胞中的表达，而TNF-α作为炎性因子，介导了肝细胞的炎性反应，免疫反应、肝细胞凋亡和扩增肝纤维化等多种病理和生理活动。分析蜂王浆TNF-α降低的原因可能是蜂王浆是天然的氧自由基清除剂，可以减少ROS引起的核转录因子的活化，从而减少受其调控的TNF-α基因的表达。蜂王浆在酒精性肝病的形成过程中能够抑COX -2和 TNF-α的表达，对酒精性肝损伤有一定的保护作用。 蜂王浆还对CC14 肝纤维化大鼠的肝脏纤维化血清学指标及肝脏病理形态学均具有显著的改善作用，但对已经形成肝纤维化后的肝组织纤维化改善不明显，其可能的机制为蜂王浆能改善肝组织的炎症、减少ECM的合成和抑制TNF-α的分泌。而且蜂王浆和蜂胶具有天然的功能协调和一致性，二者结合使用效果会更好。
[0024] 肠溶片，是一类在胃中不溶、在肠液中可溶解的物质为主要包衣材料进行包衣而制成的片剂。片剂包肠溶衣是由药物性质和用药目的决定的：①为了防止酸性及酶对某些药物的破坏或防止药物对胃的强烈刺激性；②为了使药物如驱虫药、肠道消毒药等在肠内发生作用，③希望某些药物在肠道吸收或需要在肠道保护较长时间以延长药物作用。包上肠溶衣后，能在胃中保持完整而在肠道中释放出药物。
[0025] 人们在大量饮酒的同时也摄取了大量的食物，特别是高油高脂性食物使人胃呈高饱腹状态，其胃容物的排空一般需要2小时左右，如果同时服用解酒的药物，由于服用量与胃容物相比相差太悬殊，很难发挥作用而失效，但如果采用大剂量的解酒药物，又会受到胃容量的限制而无法实施，所以饭后使用的解酒药物必须采用胃不溶性的处理方式，这就是我们为什么要开发肠溶片的主要原因。
发明内容
[0026] 本发明第一目的在于发明一种能高效从根本上解酒的蜂胶乙醇提取物。
[0027] 本发明用于解酒的蜂胶乙醇提取物为采用乙醇从蜂胶中提取的分子量小于5000D的固形物含量大于90%的生物活性干燥物。
[0028] 发明人经试验证明，从蜂胶中提取的分子量小于5000D的乙醇溶解的生物活性物质具有较好的解酒效果。
[0029] 本发明的第二个目的是提出上述蜂胶乙醇提取物的制备方法。
[0030] 本发明方法包括以下步骤：
[0031] 1）将蜂胶置于-18℃的环境温度条件下冷冻20～40小时后粉碎；
[0032] 2）常温常压下将体积浓度为50%～90%的食用酒精与粉碎后的蜂胶按1～10︰1的重量比混合，先于低频超声波、于10～40℃温度下处理10～40分钟，然后于环境温度为10～40℃的条件下密闭浸泡1～4天；
[0033] 3）取浸泡后混合物以8000～16000转冷冻离心10～15分钟，除去固体杂质，取乙醇溶解蜂胶的上清液；
[0034] 4）将上清液在1～5℃环境温度条件下以5000D分子筛超滤分离，取得分子量小于5000D的蜂胶乙醇提取物；
[0035] 5）将上述分子量小于5000D的蜂胶乙醇提取物置于乙醇蒸馏回收器中，蒸去食用酒精，得到分子量小于5000D的固形物含量大于90%的生物活性干燥物。
[0036] 目前研究发现影响蜂胶提取活性的因素主要有温度、pH值、提取次数、溶剂种类、溶剂浓度、浸泡时间、提取时间等。不同的提取工艺及溶媒提取的蜂胶，其有效成分会有所不同，提取方法不同，提取的成分、含量、溶剂都可能影响其机能发挥，造成种种差异，进而出现不同的药理作用。
[0037] 本发明将蜂胶冷冻后使蜂胶变脆，确保粉碎蜂胶时做到细度均匀，便于有效成分的提取；浸泡前的低频超声波处理除了能够实现最大化的分离外，还能保持提取时的乙醇温度不超过40℃，确保乙醇溶液中提取分离出的物质保持活性，并保证蜂胶中易挥发性成分最大限度的保留；本发明浸泡的利于蜂胶中有效的生物活性物质的分离、溶解和保持活性；提供合适的蜂胶与乙醇的比例是为了确保蜂胶中乙醇溶性物质能够得到最大化的溶解；浸泡后冷冻离心是确保离心分离时的温度较低，保证蜂胶乙醇提液中蜂蜡更好地析出，使提取出来的蜂胶更纯，利于下一步超滤时得到足够多的有效物质；取上清液5000D分子筛超滤分离，取得分子量为5000D以下的蜂胶乙醇溶性物质，首先经过研究发现分子量5000D以下的蜂胶乙醇溶性物质均具有解酒的作用，其次确保提取液纯清、透明，使提取物纯净，控制提取温度在1～5℃条件下是确保乙醇溶性物质纯洁性的最关键措施之一；以乙醇蒸馏回收器回收乙醇得到蜂胶固形物含量大于90%的干燥物，除去乙醇是为了便于下一步的应用。
[0038] 综上，本发明采用以上改良的乙醇提取法，可提取效率更高，速度更快，特别是能够显著保留对解酒有效的成分，表现出很强的解酒效应。
[0039] 本发明第三个目的是提出用于解酒的蜂胶乙醇提取物的用途。
[0040] 用途之一是：以所述用于解酒的蜂胶乙醇提取物、蜂王浆冻干粉、异麦芽糖醇、硬脂酸镁和包衣粉制成用于制备蜂胶解酒的肠溶片；所述蜂胶乙醇提取物、蜂王浆冻干粉、异麦芽糖醇、硬脂酸镁和包衣粉分别占肠溶片总质量的20～30%、7～10%、55～70%、0.2～0.4%、1～3%。
[0041] 经试验，利用蜂胶乙醇提取物合并蜂王浆冻干粉解酒效果显著，且无副作用，而且费用低廉，简单易行。蜂胶是蜜蜂采集胶源植物的幼芽或愈伤组织分泌的树脂状物质，并混合自身腺体的分泌物、花粉和蜂蜡等混合而成的一种具有黏性的胶状物质。蜂胶富含多种生物活性物质，尤其是含有大量的黄酮类物质，具有多种医疗保健功效，被誉为“紫色黄金”。蜂王浆是 5-1 5日龄工蜂舌腺和上腭腺所分泌的乳白色或淡黄色乳状液体，是蜂王幼虫整个发育期和雄蜂幼虫前期的食物，类似于哺乳动物的乳汁，又称蜂皇浆、王浆、蜂乳。研究发现，蜂王浆中含有丰富的功能因子，对人类有极强的营养保健功能和医疗作用。蜂胶乙醇提取物合并蜂王浆能够在基因水平上发挥解酒的药理作用，但对蜂胶和蜂王浆中是何物质起作用目前研究不多，对其解酒的分子机理不完全清楚。
[0042] 但是本发明的发明人的研究已经基本解决了蜂胶合并蜂王浆解酒的分子机理。本发明就是利用乙醇提取的方法从蜂胶中分离出对解酒有治疗效果的成份，合并蜂王浆生产解酒肠溶片。
[0043] 作为肠溶片的优点是使用方便、吸收快，直接吸收进入肝脏解酒效果好、价格低廉；饮酒后胃内呈饱腹状态，会对解酒效果产生不利影响，而制作成肠溶片可以很好地克服这一不良情况，肠溶片可作为普通百姓的一般解酒产品使用，价廉物美。
[0044] 经过研究发现，蜂胶乙醇提取物中有许多生物活性物质在胃中易被胃酸破坏，所以制作肠溶片可以更好地保护生物活性物质免遭破坏，提高产品的使用效果。
附图说明
[0045] 图1为自然健康组肝脏组织切片图。
[0046] 图2为自然健康组肾脏组织切片图。
[0047] 图3为酗酒模型对照组肝脏组织切片图。
[0048] 图4为酗酒模型对照组肾脏组织切片图。
[0049] 图5为灌胃本发明肠溶片组肝脏组织切片图。
[0050] 图6为灌胃本发明肠溶片肾脏组织切片图。
具体实施方式
[0051] 一、制备分子量小于5000D的固形物含量大于90%的生物活性干燥物：
[0052] 1、将蜂胶置于-18℃的环境温度条件下冷冻20～40小时后粉碎。
[0053] 2、常温常压下将体积浓度为50%～90%的食用酒精与粉碎后的蜂胶按1～10︰1的重量比混合，先于低频超声波、于10～40℃温度下处理10～40分钟，然后于环境温度为10～40℃的条件下密闭浸泡1～4天。
[0054] 3、取浸泡后混合物以8000～16000转冷冻离心10～15分钟，除去固体杂质，取乙醇溶解蜂胶的上清液。
[0055] 4、将上清液在1～5℃环境温度条件下以5000D分子筛超滤分离，取得分子量小于5000D的蜂胶乙醇提取物。
[0056] 5、将上述分子量小于5000D的蜂胶乙醇提取物置于乙醇蒸馏回收器中，蒸去食用酒精，得到分子量小于5000D的固形物含量大于90%的生物活性干燥物。
[0057] 二、制备蜂胶解酒肠溶片：
[0058] 1、典型的几种质量配比表：（单位：kg）
[0059]蜂胶粉 蜂王浆冻干粉 异麦芽糖 硬脂酸镁 包衣粉
配比130 10 56.6 0.4 3
配比225 10 62.7 0.3 2
配比320 10 67.7 0.3 2
配比130 10 56.6 0.4 3
配比225 10 62.7 0.3 2
配比320 10 67.7 0.3 2
[0060] 2、制粒工艺：沸腾锅预热到40～60℃后，先将蜂胶乙醇提取物干粉、蜂王浆冻干粉、异麦芽糖醇加入沸腾锅内，按照下表参数设置，打开蠕动泵喷纯化水进行一步制粒。制粒结束后低温干燥，过筛后，加入硬脂酸，混合均匀。
[0061] 生产工艺参数：
[0062]参数 进风温度 出风温度 引风频率 蠕动泵 雾化压力
喷浆时 60-80℃ 40-60℃ 40Hz 150rpm 0.2MPa
喷浆后 70-80℃ 50-60℃ 35Hz 150rpm 0.2MPa
喷浆时 60-80℃ 40-60℃ 40Hz 150rpm 0.2MPa
喷浆后 70-80℃ 50-60℃ 35Hz 150rpm 0.2MPa
[0063] 3、压片工艺：采用ZP1100压片机（29冲）进行压片实验，工艺参数：转速30～40转/分；工作压力7～15kN；片重0.4～0.6g。
[0064] 4、包衣工艺：包衣粉采用肠溶性包衣粉，包衣参数如下表。
[0065]包衣浆浓度 50%
热风温度 60-90℃
滚筒转速 5-8转/分
负压 -0.5KPa
片剂增重 1-3%
热风温度 60-90℃
滚筒转速 5-8转/分
负压 -0.5KPa
片剂增重 1-3%
[0066] 三、应用：
[0067] （一）试验对象：
[0068] 灌胃22周龄的Wistar清洁级雄性大鼠，体重344.43±38.49。
[0069] 自然对照组大鼠每天按体重1%灌胃纯净水。
[0070] 模型组大鼠每天按体重1%灌胃二锅头制模型。
[0071] 灌胃肠溶片实验组大鼠每天按体重1%灌胃二锅头后8小时灌胃本发明肠溶片。
[0072] （二）肠溶片的使用剂量：
[0073] 50～150mg/天，连接灌胃30～40天。
[0074] （三）对比结果：
[0075] 1、试验组大鼠肝脏和肾脏组织切片结果比较：
[0076] （1）将自然对照组肝脏和肾脏组织切片，见图1、2。
[0077] 从图1、2可见雄性大白鼠肝脏组织切片中肝细胞结构清晰呈多边形，肝血窦明显，肝细胞索排列整齐，肝细胞中没有明显的脂肪空泡；肾脏组织切片中肾小球结构清楚，肾小球囊间隙明显适中，没有明显损伤。
[0078] （2）将灌胃白酒模型组肝脏和肾脏组织切片，见图3、4。
[0079] 从图3、4可见肝细胞边界不清，变圆内有空泡，肝血窦受压变窄，肝索排列紊乱；肾小球结构不清楚，损伤严重，肾小球囊变形。
[0080] （3）灌胃本发明肠溶片的动物肝脏和肾脏组织切片，见图5、6。
[0081] 从图5、6可见肝脏肝小叶结构清晰, 肝血窦分布均匀，肝细胞呈多边形,排列整齐；肾脏肾小球结构明显改善，肾小球囊间隙明显，存在明显肾小球修复过的痕迹。
[0082] 2、肠溶片干预后对各试验组大鼠主要血液生化指标比较分析：
[0083] 采用麻醉腹主动脉采血，取血清后由东芝全自动血液生化检测仪检测主要血液生化指标。
[0084] 比较分析如下表：
[0085]组别自然组 模型组 肠溶片组
ALT 73.00±16.67 91.25±29.33 46.60±7.09
ALP 102.50±11.90 146.75±21.70 78.00±22.93
TG 1.25±0.18 1.84±0.37 1.19±0.20
BUN 5.89±0.65 4.78±0.71 5.25±0.65
ALB 15.50±0.43 14.88±0.53 15.89±1.20
ALT 73.00±16.67 91.25±29.33 46.60±7.09
ALP 102.50±11.90 146.75±21.70 78.00±22.93
TG 1.25±0.18 1.84±0.37 1.19±0.20
BUN 5.89±0.65 4.78±0.71 5.25±0.65
ALB 15.50±0.43 14.88±0.53 15.89±1.20
[0086] 经SPSS统计，灌胃肠溶片ALT与模型组差异极显著，与自然对照组差异显著；转氨酶广泛存在组织细胞内，尤以肝、心肌、脑、肾等组织中活性最强，正常时血浆含量很低，ALT主要存在于肝脏，当肝组织病损时ALT大量释放入血可引起血中转氨酶升高。本实验灌胃肠溶片组血清转氨酶活力很低，说明灌胃本发明肠溶片对肝脏的修复作用很强。
[0087] 健康人血清ALP主要来自肝脏和骨骼，肝脏中的ALP与物质的转运和排泄有关。而2型糖尿病患者由于胰岛素分泌障碍或胰岛素抵抗引起，造成糖代谢障碍，同时也导致脂类代谢的障碍及在肝内沉积，甚至形成脂肪肝，而使肝脏受损引起ALP的升高。经SPSS统计，模型组碱性磷酸酶与其它二实验组差异极显著；肠溶片组碱性磷酸酶与自然对照组差异显著，说明肠溶片实验组能够改善肝细胞损伤，降低碱性磷酸酶水平，肠溶片的调控作用效果优于自然对照组。
[0088] 近年来高甘油三酯（HTG）所致的脂毒性已引起广泛关注，其可引起并加重胰岛素抵抗（IR），使胰岛素的生物学效应降低。肝脏通过参与糖原合成、糖原分解和糖异生在维持血糖稳定中起着直接而重要的作用，特别是葡萄糖-6-磷酸酶在肝糖生成中起关键作用，肝脏胰岛素抵抗还表现为脂代谢异常，如甘油三酯释放增加和肝脏脂肪变性。经SPSS统计，模型组甘油三酯与灌胃肠溶片组差异极显著，与自然对照组差异显著；从实验情况，模型组出现血清高甘油三酯水平，说明长期酗酒会生产高甘油三酯血症，是诱发2型糖尿病的致病因素之一；而本发明肠溶片对由于酗酒诱发的甘油三酯代谢异常具有很好的调控作用，这种调控作用也好于自然对照组。
[0089] 尿素浓度除受肾脏影响外，还易受饮食中蛋白质和机体代谢状态的影响，如高蛋白饮食、胃肠功能不良等。经SPSS统计，模型组尿素氮与自然对照组差异显著。在本实验条件下，模型组大鼠由于过量酗酒，醉酒严重，导致采食量下降和蛋白质代谢障碍，使得尿素氮不升反降，是所有实验组中最低的，而经本发明肠溶片干预后，对肝脏蛋白质的代谢改善明显，尿素氮水平都呈上升势头，是乎显示肠溶片具有很强的促进蛋白质代谢的功能。经SPSS统计，模型组白蛋白水平与肠溶片实验组差异显著，从白蛋白水平的变化也能够发现肠溶片具有对蛋白质代谢的调控能力。
[0090] 通过对主要血液生化指标的分析，我们不难得出这样的结论在酗酒之后，肠溶片不但能够帮助机体解酒，而且能够迅速恢复机体对三大物质的代谢，改善多项血液生化指标，使机体代谢机能恢复到正常状态。
[0091] 3、灌胃本发明肠溶片干预后对试验组大鼠肝脏代谢中主要基因表达变化比较分析：
[0092] 通过基因芯片技术研究发现长期酗酒的模型组大鼠肝脏表达基因中许多影响重要代谢途径（比如与解酒相关基因、脂肪代谢相关基因、肝脏损伤修复基因）关键基因的表达均表现出不利于机体正常代谢的状况，而灌胃肠溶片干预后这种基因表达的变化得到了很好的修正，从下例表中我们不难发现这种类似于“纠错”表达的能力正体现出灌胃肠溶片对由于长期酗酒形成的肝脏代谢障碍、组织损伤的修复具有很强的改善作用，通过我们的研究从基因水平发现灌胃肠溶片能够有效地解酒，改善肝脏的代谢机能。
[0093] 3.1灌胃肠溶片干预后对肝脏内与糖脂代谢相关的关键基因表达的影响[0094]组别 Ehhadh Fasn Scd Scd1
模型组/自然组 ↓2.74↑4.86↑5.04 ↑5.65
肠溶片组/模型组 ↑2.77↓2.24↓14.73 ↓26.25
模型组/自然组 ↓2.74↑4.86↑5.04 ↑5.65
肠溶片组/模型组 ↑2.77↓2.24↓14.73 ↓26.25
[0095] 注：表中，↓2.74表示Ehhadh基因在肝细胞mRNA中模型组与自然对照组的表达比下调2.74倍，↑2.77表示Ehhadh基因灌胃肠溶片组与模型组的表达比上调2.77倍。
[0096] 3.1.1 Ehhadh：双功能过氧化物酶（peroxisomalbifunctionalenzyme）、烯酰辅酶A水合酶，过氧化物酶体，参与脂代谢，脂肪酸代谢。过氧化物酶体是饱和／不饱和的极长链脂肪酸进行β氧化的唯一场所，D-3羟脂酰CoA脱水酶／D-3羟脂酰CoA脱氢酶即D-双功能蛋白（D-BP）是首次报道的参与过氧化物酶体脂肪酸β氧化的一种酶，在多不饱和脂肪酸、2-甲基支链脂肪酸和D-异构体羟基脂肪酸的β氧化中起着至关重要的作用。糖尿病状态下血浆极长链脂肪酸和多不饱和脂肪酸水平的升高是否与过氧化物酶体脂肪酸β氧化，特别是D-BP活性的改变有关。真核细胞的线粒体和过氧化物酶体都进行脂肪酸的β氧化，碳链长度小于20个碳的脂肪酸主要在线粒体内β氧化供能，而碳链长度大于2O个碳的饱和／不饱和极长链脂肪酸、二甲基支链脂肪酸及胆汁酸合成代谢中间产物主要在过氧化物酶体中氧化，生成的中短链脂肪酸然后转入线粒体彻底氧化。过氧化物酶体脂肪酸β氧化途径的第二步和第三步反应，即烯脂酰CoA经水合、脱氢生成3-酮脂酰CoA的反应，由一种具有烯脂酰CoA水合酶／3-羟脂酰CoA脱氢酶活性的双功能蛋白催化，已经证实过氧化物酶体中存在两种双功能蛋白：L-双功能蛋白(L-BP)和D-双功能蛋白。L-BP催化反式烯酰CoA转化为L型3-羟脂酰CoA，进而脱氢为3-酮脂酰CoA；而D-BP催化反式烯酰CoA水合生成的中间产物为D型3-羟脂酰CoA，并以其为底物催化其脱氢。底物专一性研究表明，L-BP主要在饱和脂肪酸、非支链脂肪酸的氧化中起作用；而D-BP不仅是唯一与多不饱和脂肪酸、2-甲基支链脂肪酸的烯脂酰CoA氧化有关的酶，而且对D-BP缺陷病人的研究还发现，D-BP也是参与极长链直链脂肪酸，例如二十四烷酸β氧化的主要酶。在肝脏中D-BP与L-BP的含量几乎相等，每克蛋白质中大约含2．5mg，说明两种双功能蛋白在肝细胞的过氧化物酶体脂肪酸β氧化中起同等重要的作用。高等生物体内有两种多功能酶具有L-3-羟脂酰CoA脱氢酶活性，分别是存在于过氧化物酶体中的L-BP，和线粒体中具有烯酰CoA水合酶／L-3-羟脂酰CoA脱氢酶／3-酮脂酰CoA硫解酶活性的三功能蛋白。已知，糖尿病时线粒体和过氧化物酶体的脂肪酸β氧化活性是同时增加的，研究发现，糖尿病大鼠肝过氧化物酶体脂肪酸β氧化活性与肝L-3-羟脂酰CoA脱氢酶活性也同时升高，说明糖尿病时线粒体和过氧化物酶体直链饱和脂肪酸、L-异构体羟基脂肪酸的β氧化增强；但是，有研究观测到D-BP的蛋白量和酶活性显著降低，因而多不饱和脂肪酸、支链脂肪酸和D-异构体长链羟基脂肪酸的β氧化很可能减弱，导致不饱和极长链脂肪酸的中间产物D-异构体、支链脂肪酸的堆积。这一发现与观察到的Ⅱ型糖尿病患者血浆极长链脂肪酸和花生四烯酸水平明显升高的现象相符，提示D-BP活性降低可能是造成糖尿病时血浆脂肪酸谱异常的原因之一。
[0097] 本实验条件下酗酒模型组与自然对照组比下调双功能过氧化物酶基因的表达2.74倍，说明模型组大鼠长期酗酒会通过下调该基因，使过氧化物酶体和线粒体中脂肪酸β氧化能力减弱，促进肝脏脂肪变，是长期酗酒诱发肝脏脂肪变的主要分子机制之一。
[0098] 本实验条件下灌胃本发明肠溶片组与模型组比上调了双功能过氧化物酶基因2.77倍，促进肝脏组织过氧化物酶体和线粒体中的脂肪酸β氧化，对防治酗酒引起的脂肪肝有积极意义，是灌胃肠溶片防治长期酗酒诱发肝脏脂肪变的主要分子机制之一。
[0099] 3.1.2 Fasn：脂肪酸合成酶，参与脂肪酸生物合成。哺乳动物中，脂肪酸合成酶在脂肪酸合成中起着至关重要的作用，负责乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A从头合成一种长链软脂酸（棕榈酸酯）的所有催化步骤，基因的表达直接影响着脂肪酸合成酶多寡对控制动物体脂沉积具有重要的意义。
[0100] 本实验条件下模型组长期酗酒使肝细胞中脂肪酸合成酶基因与自然对照组比表达上调4.86倍，说明：模型组能够使脂肪酸合成酶合成增加是导致肝细胞脂肪过量沉积的罪魁祸首，是形成脂肪肝分子机理之一。
[0101] 本实验条件下灌胃本发明肠溶片组与模型组下调脂肪酸合成酶的基因表达2.24倍，说明：肠溶片组可以通过减少脂肪酸合成酶的合成，减少肝组织脂肪酸合成，对缓解肝脏脂肪变意义重大。
[0102] 3.1.3 Scd：固醇辅酶A脱饱和酶，参与脂肪酸生物合成。硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)能在脂肪酸碳链cis-9位置引入双键，是催化乳脂cis-9，trans-11CLA和trans-7，cis-9 CLA合成的关键酶。
[0103] 3.1.4 Scd1：固醇辅酶A脱饱和酶1，参与脂肪酸生物合成。硬脂酰辅酶A去饱和酶1（Scd -1）是单不饱和脂肪酸生物合成的限速酶，在脂肪酸代谢中起中心调节作用，也是瘦素（Leptin）作用的目的基因之一。瘦素与糖尿病、肥胖、脂肪肝有着密切关系，是近年来代谢性疾病的热点领域之一。2型糖尿病患者，常常伴有胰岛素抵抗、高瘦素血症，同时约50%的2型糖尿病患者存在脂肪肝。Scd -1是催化饱和脂肪酸向单不饱和脂肪酸转变的关键酶，与肥胖、脂肪性肝脏病变和胰岛素抵抗等一系列的代谢综合征的发生、发展密切相关，因而研究Scd -1的表达、调控可能为临床脂代谢紊乱相关疾病的诊断和治疗效果的监测提供了一个十分重要的实验室指标，在临床医学中有广阔的应用前景。因Scd -1主要存在于内质网膜，目前对体内Scd -1的检测主要采用测定血脂不饱和指数（不饱和脂肪酸／饱和脂肪酸比值）或通过分子生物学方法对细胞内Scd -1mRNA表达水平进行检测。综上所述，Scd -1在能量代谢中起了重要的作用。通过对Scd -1和能量代谢关系的研究，可以更清楚的了解Scd -1在能量代谢中的机制，从而为临床靶向调节能量代谢和避免脂毒性，预防或治疗肥胖、脂肪性肝脏病变及糖尿病等一系列代谢综合症提供基础。
[0104] 本实验条件下酗酒模型组与自然对照组比上调固醇辅酶A脱饱和酶（Scd）基因表达5.04倍、固醇辅酶A脱饱和酶1（SCD-1）上调5.65倍，说明：二基因表达上调是造成酒精性脂肪变的最主要分子机理之一，防治脂肪肝的发生是解酒过程中最关键的病理指标，处理方式有效性就在于是否能够控制脂肪肝，模型组上调了二基因，而模型组肝脏切片显示模型组大鼠出现了严重的脂肪肝，甚至达到肝纤维化的状态。
[0105] 本实验条件下灌胃肠溶片组与模型组比下调固醇辅酶A脱饱和酶（Scd）基因表达14.73倍，下调固醇辅酶A脱饱和酶1（Scd-1）基因表达26.25倍，说明：肠溶片组对酗酒的不良习惯所形成的脂肪肝具有显著的改善作用，并且与肝脏切片的结果一致，这一改变是本发明肠溶片防治脂肪肝主要的分子机理之一。
[0106] 3.2灌胃肠溶片后对肝脏内与肝损伤、修复相关的关键基因表达的影响[0107]组别 Igfbp6 Il7r Irs2 Socs2 Srd5a1 Tgfb2
解酒模型组/自然组 ↓3.16↓3.21↓21.42 ↓33.58 ↑4.0 ↑3.63
肠溶片组/酒模型组 ↑4.46↑4.12↑3.92 ↑4.18 ↓4.25↓2.48
解酒模型组/自然组 ↓3.16↓3.21↓21.42 ↓33.58 ↑4.0 ↑3.63
肠溶片组/酒模型组 ↑4.46↑4.12↑3.92 ↑4.18 ↓4.25↓2.48
[0108] 注：表中，↓3.16表示Igfbp6基因在肝细胞mRNA中模型组与自然对照组的表达比下调3.16倍，↑4.46表示Igfbp6基因灌胃肠溶片组与模型组的表达比上调4.46倍。
[0109] 3.2.1 Igfbp6：胰岛素样生长因子结合蛋白6，调控细胞生长，信号转导，负调控细胞增殖。上调有利于Igf1发挥作用，对防治脂肪肝和肝脏纤维化有很好作用。
[0110] 研究已证实，IGFs与肝纤维化、肝硬化的形成发展有关。目前已分离出两种IGFs即IGF-l和IGF-2。它们以自分泌、旁分泌和内分泌的方式作用于靶器官。几乎所有内分泌的IGF-l或IGF-2在体液中均与胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）形成相对分子质量为150kb或50kb的复合物。IGF-l是由70个氨基酸残基组成的单链多肽，主要在肝脏合成，是机体广泛存在的细胞有丝分裂和分化成熟的促进剂，影响许多器官内细胞的生长、分化及代谢的调节。IGF-l的上述功能是通过IGF-l受体（IGF-lR）介导的，IGF-l与IGF-lR结合的有效性受IGFBPs的调节。刘立新等研究显示，胰岛素样生长因子结合蛋白6（IGFBP6）在IGF-βl诱导活化的HSC-T6中表达明显增强，提示IGF及其受体参与肝纤维化的形成。
由于IGFBPs与IGFs具有高亲和力且能够调节IGFs的生物活性，这些结合蛋白的诱导产生亦能影响肝纤维化的发生发展。然而另有研究表明，IGF-1具有体内抗肝纤维化的作用，可抑制HSC的活化，其可能与提高超氧化物歧化酶及过氧化氢酶的活性，提高肝细胞清除自由基的能力，减少HS活化的刺激因素等有关。
由于IGFBPs与IGFs具有高亲和力且能够调节IGFs的生物活性，这些结合蛋白的诱导产生亦能影响肝纤维化的发生发展。然而另有研究表明，IGF-1具有体内抗肝纤维化的作用，可抑制HSC的活化，其可能与提高超氧化物歧化酶及过氧化氢酶的活性，提高肝细胞清除自由基的能力，减少HS活化的刺激因素等有关。
[0111] 本实验条件下模型组与自然对照组比模型组大鼠下调了胰岛素样生长因子结合蛋白6基因3.16倍，说明：模型组通过下调胰岛素样生长因子结合蛋白6基因的表达，刺激肝细胞向纤维化方向转化，促进了肝细胞脂肪变和纤维化。
[0112] 本实验条件下肠溶片组与模型组比上调胰岛素样生长因子结合蛋白6基因4.46倍，说明：肠溶片干预后可以通过调控胰岛素样生长因子结合蛋白6基因的表达，减缓或防治肝细胞纤维化的进程，对防治酒精性脂肪肝有积极意义。
[0113] 3.2.2 Il7r：白细胞介素7，受体，参与调控DNA重组，免疫应答，细胞表面受体信号连接传导，抗微生物体液应答。
[0114] 本实验条件下模型组与自然对照组比模型组下调了白细胞介素7基因3.21倍，说明：模型组大鼠长期酗酒导致肝细胞免疫应答能力下降，下调白细胞介素7基因的表达就是意味着加重肝细胞的炎症反应，促进肝细胞脂肪变和纤维化的进程。
[0115] 本实验条件下肠溶片组与模型组比上调白细胞介素7基因4.12倍，说明：肠溶片干预后，通过上调白细胞介素7基因的表达加强肝细胞的免疫应答能力，缓解肝脏炎症反应，对防治由于长期酗酒引起的脂肪肝和纤维化有积极意义。
[0116] 3.2.3 Irs2：胰岛素受体底物2，Irs2在肝脏和胰腺β细胞表达，参与葡萄糖代谢，信号转导，正调控细胞增殖，Irs2蛋白表达下调使PI3-K活性减低，会加重肝胰岛素抵抗。使用基因敲除技术已证实Irs2基因的缺陷可导致胰岛素抵抗，Kubota等发现，敲除Irs2后，肝脏表现出明显胰岛素抵抗，而对骨骼肌的胰岛素敏感性无作用。
[0117] 本实验条件下模型组与自然对照组比模型组下调了胰岛素受体底物2基因21.42倍，说明：模型组大鼠由于酗酒导致胰岛素受体底物2基因下调了21.42倍，必然使胰岛素受体底物合成大受影响，显然会影响到肝细胞对胰岛素反应的敏感性，促使模型组产生严重的胰岛素抵抗，诱发一系列代谢综合征，最终形成脂肪肝，是长期酗酒诱发二型糖尿病和脂肪肝的主要分子机理之一。
[0118] 本实验条件下以肠溶片干预后与模型组比，上调了Irs2基因的表达3.92倍，说明：灌胃本发明肠溶片可通过上调Irs2基因的表达来改善肝细胞对胰岛素反应的敏感性，本发明肠溶片可以起到一定的缓解胰岛素抵抗作用。
[0119] 3.2.4 Socs2：细胞因子信号转导抑制因子2，1997年由Starr R等发现，根据4O个氨基酸的Socs框命名。目前已发现这类负调节分子有6种，多数成员参与JAK／STAT通路的负反馈调节。该家族有8个成员含SH2结构域，即CIS和Socs -1～7，这个结构直接与磷酸酪氨酸相互作用，是Socs家族起抑制作用的关键。Socs 2作用广泛，对脂肪沉积、骨骼肌发育、中枢神经系统作用、免疫应答，癌症发生都有重要作用。另外Socs 2能调节胰岛素、催乳素等激素分泌，并对GH／1GF、胰岛素、白介素等细胞因子信号通路起促进或抑制作用。多种细胞因子通过复杂的信号网络调控细胞和机体内脂肪代谢的平衡，目前多数研究集中生长激素（GH）对脂代谢的影响，而Socs 2是生长激素信号通路的关键负反馈抑制因子。
[0120] 本实验条件下模型组与自然对照组比，Socs2基因的表达下调了33.58倍，说明：模型组长期酗酒会造成肝细胞内的代谢“刹车”调控系统严重失灵，必然会对肝细胞内正常的脂代谢和胰岛素作用产生影响，形成代谢障碍，最终促使肝细胞脂肪变，是长期酗酒诱发脂肪肝的主要分子机理之一。
[0121] 本实验条件下以本发明肠溶片干预后与干预前模型组比，Socs2基因的表达上调了4.18倍，说明：本发明肠溶片可以通过提高Socs2基因的表达，修复由于酗酒导致的肝细胞内“刹车”调控系统失灵，对改善肝细胞脂肪代谢和胰岛素作用具有重要意义。
[0122] 3.2.5 Srd5a1：类固醇5α还原酶，α肽1，分布内质网、微粒体，3-C-5α类固醇4脱氢酶，参与细胞信号转导，性别决定，细胞分化。能催化睾酮转化为另一种雄激素—二氢睾酮，故在性分化及雄激素生理中发挥重要作用，该酶具有Srd5a 1、2两个异构体。主要表达于皮肤和脂肪组织及肝脏，可催化绝大部分第4，5位碳原子上非饱和类固醇的还原反应，使有活性的糖皮质激素（GC）转化为无活性的代谢产物。研究发现，糖皮质激素作用不仅与血循环中GC水平相关，还与组织局部有生理活性的GC浓度密切相关。肝脏中增强的Srd5a1活性导致血清皮质醇（COR）清除率增加，进而代偿性下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPA）活性增强，COR分泌增加，进一步导致腹型肥胖及MS（MS指一系列代谢紊乱和心脑血管危险因素在同一个体上的聚集，即为肥胖、高血压、血脂异常及糖耐量异常等多种代谢异常临床体征的征候群）。
[0123] 本实验条件下模型组与自然对照组比，Srd5a1基因的表达上调了4.0倍，说明：模型组通过提高Srd5a1基因表达增强Srd5a1活性导致血清皮质醇清除率增加，使得模型组出现MS，最终使肝细胞发生脂肪变。
[0124] 本实验条件下以肠溶片干预后与干预前模型组比，Srd5a1基因的表达下调了4.25倍，说明：本发明肠溶片能够通过下调该基因表达，改善由于酗酒所带来的代谢综合征，这从另一方面解释了本发明肠溶片为什么可以防治代谢综合征的原因，也是肠溶片防治酗酒引起脂肪肝的分子机理之一。
[0125] 3.2.6 Tgfb2：转化生长因子β2，参与细胞死亡，正调控进程，调控细胞增殖，调控免疫应答，多巴胺生物合成。研究证实，细胞因子中只有Tgf-β能刺激HSC合成胶原纤维，而其他细胞因子则只刺激HSC增殖。肝纤维化形成过程中，KC通过自分泌或旁分泌的方式产生大量的Tgf-β，其不仅能够促进HSC转化为成纤维细胞，促进HSC的激活，而且能增强ECM的合成，抑制其降解。同时Tgf-β可以增加HSC上PDGF受体的表达，促进HSC自分泌Tgf-β、PDGF，明显抑制活化HSC的凋亡。PDGF和Tgf-β构成了活化HSC的自分泌循环，是HSC的持续激活的重要机制。
[0126] 本实验条件下模型组与自然对照组比，Tgfb2基因的表达上调了3.63倍，说明：长期酗酒导致肝细胞损伤，上调Tgfb2基因的表达，刺激HSC合成胶原纤维，促进肝纤维化的形成，与切片结果一致。
[0127] 本实验条件下以肠溶片干预后实验组与干预前模型组比，Tgfb2基因的表达下调了2.48倍，说明：本发明肠溶片可以通过下调该基因表达防治肝纤维化的进程，对维护肝细胞正常代谢机能意义重大。
[0128] 通过对模型组基因表达上的变化分析，不难发现这些变化的后果就是导致脂肪合成上升，脂肪酸氧化能力下降，糖异生减弱，产生类似于胰岛素和瘦素抵抗效应，肝脏出现严重的脂肪变；而灌胃本发明肠溶片后由于长期酗酒导致的基因表达的改变得到调整，使肝脏组织功能得到恢复，脂肪肝和肝纤维化得到有效控制，所以服用本发明肠溶片既能够发挥解酒的作用，又能够很好地防治脂肪肝，值得推广。
[0129] 总之，通过以上试验表明：本发明产品能有效解酒，防治酗酒引起的肝脏脂肪变，且肠溶片的疗效好。目前我国使用蜂胶和蜂王浆解酒的研究方面刚刚起步，通过实验，发现蜂胶合并蜂王浆肠溶片对解酒及防治酗酒引起的脂肪肝防治效果好，为开发蜂胶和蜂王浆剂型的解酒药物提出新思路。蜂胶和蜂王浆是我国传统保健产品，能提高肝细胞活性，改善多种血液生化指标，预防脂肪肝，对维护和提高我国民众的肝脏保健具有重大意义。蜂胶和蜂王浆产品可以作为解酒的首选保健品，加以推广和应用。