一株耐重金属的多环芳烃降解菌及其在复合污染土壤修复中的应用

摘要

本发明属于环境工程和微生物工程技术领域。尤其涉及一株降解多环芳烃的克雷白氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae tzyx1）及其在复合污染土壤修复中的应用。该菌株为克雷白氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）Tzyx1，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M2012239，具备降解多环芳烃的能力。该菌株在治理多环芳烃和重金属污染土壤中可以应用。

权利要求

1.一种耐重金属的多环芳烃降解菌，其特征在于，该菌株为克雷白氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）tzyx1，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：M

2012239，具备降解多环芳烃的能力，所述多环芳烃选自萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽、苯并芘的一种或其混合物，所述菌株具有以多环芳烃为唯一碳源和能源进行生长的能力，所述菌株

2+ 2+ 3+

的16SrDNA序列如SEQ NO.1所示，所述重金属选自Cu 、Zn 、Pb 中的一种或其混合物。

2.根据权利要求1所述的菌株在被多环芳烃污染的土壤的生物修复中的应用，其特征在于所述多环芳烃选自萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽、苯并芘的一种或其混合物。

3.根据权利要求1所述的菌株在被重金属和多环芳烃复合污染土壤中降解多环芳烃

2+ 2+ 3+

的应用，其特征在于所述重金属选自Cu 、Zn 、Pb 中的一种或其混合物；所述多环芳烃选自萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽、苯并芘的一种或其混合物。

4.利用权利要求1所述耐重金属的多环芳烃降解菌进行土壤生物修复的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：选取重金属和多环芳烃污染的土壤100g，按质量百分比2.0%加入克雷白氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae ）tzyx1，与土壤混合均匀，加水使土壤含水率保持在15%，放入恒温振荡器中，控制培养温度在25℃的恒温条件下，振荡培养修复

15d，即能实现对复合污染土壤的生物修复。

说明书

一株耐重金属的多环芳烃降解菌及其在复合污染土壤修复

中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于环境工程和微生物工程技术领域。尤其涉及一株降解多环芳烃的克雷白氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae tzyx1）及其在复合污染土壤修复中的应用。

背景技术

[0002] 多环芳烃（PAHs）是一类持久性有机污染物（POPs）。PAHs污染的源主要来自于废旧机器油、电器产品的润滑油和来自废旧金属拆解中的木材、有机高分子化合物、纸张等含碳氢化合物的物质经不完全燃烧或在还原性气氛中经热分解而生成的。由于多环芳烃及其衍生物具有致癌性、致突变性和致畸性，以及急性毒性和亚致死作用，目前已引起人们的极大关注。

[0003] 多环芳烃（PAHs）污染土壤修复是当前环境修复中研究的热点。生物降解是对PAHs污染土壤进行修复的重要途径之一。对于多环芳烃污染，国内外进行了大量多环芳烃降解微生物的筛选工作。到目前为止，已分离出多个具有多环芳烃降解能力的菌株，如假单胞菌属、分枝杆菌属、芽孢杆菌属等，但是未见肺炎杆菌用于多环芳烃降解中的报道。

[0004] 调查研究表明，许多污染土壤都呈现出重金属和多环芳烃复合污染的趋势。这两类不同性质的污染物共存时会产生一系列复杂的化学、生化及物理化学过程三方面的交互作用，致使复合条件下的污染物的环境行为与非复合污染环境中的相比更加复杂，而重金属离子对微生物菌群的生物毒性影响也不容忽视，当土壤中的重金属离子含量较高时，会破坏微生物的生理结构，使其彻底丧失分解有机物、修复土壤的功能。

[0005] 因此，现有技术缺乏一种可以耐受重金属环境的多环芳烃降解菌株

发明内容

[0006] 本发明针对现有技术中多环芳烃降解菌不耐重金属的不足之处，提供一种降解多环芳烃菌株、该菌株在治理多环芳烃和重金属污染土壤中可以应用。

[0007] 为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案得以实现的：

[0008] 一种耐重金属的多环芳烃降解菌，其特征在于，该菌株为克雷白氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）Tzyx1，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M2012239，具备降解多环芳烃的能力。

[0009] 所述菌株具有以多环芳烃为唯一碳源和能源进行生长的能力。

[0010] 所述菌株的16SrDNA序列如SEQ NO.1所示。

[0011] 所述重金属选自Cu2+、Zn2+、Pb3+中的一种或其混合物。

[0012] 所述耐重金属的多环芳烃降解菌在多环芳烃污染的土壤的生物修复中的应用。

[0013] 所述耐重金属的多环芳烃降解菌在重金属和多环芳烃复合污染土壤生物修复中的应用。

[0014] 利用所述耐重金属的多环芳烃降解菌进行土壤生物修复的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：选取重金属和多环芳烃污染的土壤100g，按质量百分比2.0%加入克雷白氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）tzyx1，与土壤混合均匀，加水使土壤含水率保持在15%，放入恒温振荡器中，控制培养温度在25℃的恒温条件下，振荡培养修复15d，即能实现对复合污染土壤的生物修复。

[0015] 本发明提供的克雷白氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae），命名为于tzyx1，2012年6月24日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号CCTCC NO：M 2012239。

[0016] tzyx1是从浙江省台州市固体废弃物拆解场某污染土壤中分离，并筛选得到。菌株可在15～35℃，pH值6.0～8.5培养条件下较好生长；菌株形态特征为革兰氏染色呈阴性,电子显微镜下观察为较粗短的杆菌,单独、成双或短链状,无芽胞和鞭毛,有荚膜和菌毛。菌株LB培养24h菌落特征为圆形，白色,以接种环挑之易拉成丝;菌落表面光滑，边缘整齐。

[0017] 作为优选，本发明所述菌株能以多环芳烃为唯一碳源和能源生长。

[0018] 上述耐重金属多环芳烃降解菌的筛选方法，可按如下步骤依次实施：

[0019] （1）从固废拆解场采集距地表下5～20cm处表层土壤样品，作为菌源进行自然富集培养；所述富集培养基含有：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、MgSO4；

[0020] （2）取（1）中所述富集培养液接种于无机盐选择培养基中进行选择培养，所无机盐选择培养基含有：柠檬酸钠、（NH4）2SO4、MgSO4、K2HPO4、KH2PO4；添加多环芳烃和重金属。（多2+ 2+
环芳烃萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽、苯并芘的浓度均为150mg/L～250mg/L；重金属Cu 、Zn 、
3+
Pb 浓度均为150mg/L～250mg/L，）；

[0021] （3）取（2）中所述选择培养物稀释涂布于固体无机盐选择培养基上，进行分离进行分离即得到多环芳烃降解菌Tzyx1。

[0022] 上述多环芳烃降解菌Tzyx1可用于多环芳烃和重金属污染土壤的生物修复。

[0023] 本发明Tzyx1可在15～35℃，pH值6.0～8.5培养条件下较好生长；菌株形态特征为革兰氏染色呈阴性,电子显微镜下观察为较粗短的杆菌,单独、成双或短链状,无芽胞和鞭毛,有荚膜和菌毛。菌株LB培养24h菌落特征为圆形，白色,以接种环挑之易拉成丝;菌落表面光滑，边缘整齐。

[0024] tzyx1在LB（胰蛋白胨1.0%，酵母提取物0.5%，氯化钠1.0%）培养24小时菌落特征为圆形，菌落直径2～3mm，白色，表面光滑，边缘整齐。tzyx1的生理生化特征，见表1。

[0025] 表1tzyx1的生理生化特征

[0026]鉴定项目 鉴定结果
吲哚产生 -
M．R实验 -
V．P实验 +
明胶水解 +
尿酶实验 +
酪素水解 -
苯丙氨酸脱羧酶 -
精氨酸双水解酶 -
卵磷脂酶 -
KCN +
KNO3 +
丙二酸盐利用 +
柠檬酸盐利用 +
葡萄糖产酸产气 +
乳糖产酸产气 +
过氧化氢酶 +
葡萄糖利用 +
麦芽糖利用 +
阿拉伯糖利用 -
木糖利用 -
甘露醇利用 +
棉子糖利用 +
蔗糖利用 +

[0027] tzyx1的16SrDNA基因的PCR扩增、测序由北京三博远志公司完成，得到了长度为1430bp的序列。选择同源性大于97%的基因序列进行系统发育分析，表明菌株与Klebsiella pneumoniae同源性最高，结合菌株形态、菌落特征及生理生化特性，鉴定菌株属于克雷白氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）。

[0028] 本发明的tzyx1既可以在营养培养基，如：普通牛肉膏蛋白胨、普通LB、营养琼脂中生长，又可在以多环芳烃为唯一碳源、能源的无机盐基础培养基中生长。

[0029] 综上所述，本发明具有以下优点：本发明提供的tzyx1对重金属和多环芳烃复合污染土壤中的多环芳烃有快速降解能力，且降解底物范围广，在短时间内降解率高。由于该菌具有耐重金属作用，使其在重金属和多环芳烃复合污染土壤修复中有着广阔的应用潜力。

[0030] 分类命名：克雷白氏肺炎杆菌tzyx1

[0031] 拉丁文名：Klebsiella pneumoniae tzyx1

[0032] 保藏单位：中国典型培养物保藏中心

[0033] 地址：中国武汉武汉大学

[0034] 保藏日期：2012年6月28日

[0035] 保藏编号：CCTCC NO：M 2012239。

附图说明

[0036] 图1为土壤中萘随时间的动力学降解曲线图。

[0037] 图2为土壤中菲随时间的动力学降解曲线图。

[0038] 图3为土壤中荧蒽随时间的动力学降解曲线图。

[0039] 图4为土壤中芘随时间的动力学降解曲线图。

[0040] 图5为土壤中苯并蒽随时间的动力学降解曲线图。

[0041] 图6为土壤中苯并芘随时间的动力学降解曲线图。

具体实施方式

[0042] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。

[0043] 实施例1

[0044] 本发明提供的tzyx1的分离筛选方法。

[0045] 从固废拆解场采集距地表下5～20cm处表层土壤样品，作为菌源进行自然富集培养，将葡萄糖2g，胰蛋白胨4g，牛肉膏4g，MgSO40.8g加入到400mL的蒸馏水中，配制好的培养液在121℃的温度条件下灭菌处理20min，在此培养基上培养三天，再配制无机盐基础培养基，加入芘、苯并蒽、苯并芘的多环芳烃化合物，再加入重金属离子，配制成溶液后，然后再加入蒸馏水定容至500mL，上述加入芘、苯并蒽、苯并芘的量要使配制好的培养液中芘、苯2+ 2+ 3+
并蒽、苯并芘的最终浓度均为200mg/mL，上述加入重金属Cu 、Zn 、Pb 的量要使配制好的
2+ 2+ 3+
培养液中重金属Cu 、Zn 、Pb 的最终浓度均为200mg/mL，然后将配制好的培养液在121℃的温度条件下灭菌处理20min，即得所需的培养液。在此培养基上培养三天，稀释涂布分离出一株菌命名为Tzyx1，该菌于2012年6月24日保藏于“中国典型培养物保藏中心”其保藏号CCTCC M 2012239。

[0046] tzyx1的16SrDNA基因的PCR扩增、测序由北京三博远志公司完成。根据测序结果构建系统发育树。系统发育表明菌株与Klebsiella pneumoniae的进化距离最近，结合形态、菌落特征及生理生化特性，鉴定菌株属于克雷白氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）。

[0047] 实施例2

[0048] tzyx1降解复合污染土壤中的多环芳烃。

[0049] 选取重金属和多环芳烃污染的土壤100g，tzyx11按2.0%（质量百分比）用量与土壤混合均匀，加少量水使土壤含水率保持在15%左右，放入恒温振荡器中，控制培养温度在25℃的恒温条件下，振荡培养修复15d，即能实现对复合污染土壤进行修复，得到修复后的土壤。

[0050] 图1-图6分别表示了不同处理土壤中PAHs萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽、苯并芘随时间的动力学降解曲线。三个不同处理分别为多环芳烃对照污染土样（CK），不加重金属、不接种；多环芳烃污染土样不加重金属，接种PAHs降解菌株（KL）；多环芳烃污染土样加重金属，接种PAHs降解菌株（KL+M）。由图2可知,6种PAHs萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽、苯并芘在培养15d后都得到了不同程度的降解。

[0051] CK土样PAHs降解非常缓慢。重金属Cu2+、Zn2+、Pb3+试验组和对照组的克雷白氏2+ 2+ 3+
肺炎杆菌对多环芳烃降解差异不显著，说明克雷白氏肺炎杆菌对重金属Cu 、Zn 、Pb 都具有较强的耐受性。数据监测显示，15d后KL+M处理土壤多环芳烃的降解率为：萘86.6%、菲
91.0%、荧蒽54.7%、芘91.7%、苯并蒽64.7%、苯并芘49.7%。

[0052] 利用本发明的方法对复合污染土壤进行修复后的土壤多环芳烃的修复效果好，对多环芳烃的降解效果明显，说明菌株耐重金属并对复合污染土壤进行修复达到较好的多环芳烃降解的效果，与现有技术相比，提高了对多环芳烃复合污染土壤的修复效果，更有利于实际中对复合污染土壤的修复。

[0053] 本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。