棉花GhTCP2基因启动子及其应用

摘要

本发明涉及棉花GhTCP2基因启动子及其应用。所述的棉花GhTCP2基因启动子序列如SEQ ID No.1所示。本发明发现GhTCP2基因启动子在植物（拟南芥、棉花等）的腋芽和花蕾中特异表达，可为在棉花腋芽和花蕾中特异性表达抗虫基因提供启动子，减小抗虫基因在其他组织表达对棉花产生的负面影响，在不影响棉花产量的前提下，提高棉花的抗虫能力。

权利要求

1.棉花GhTCP2基因启动子，其特征在于，其核苷酸序列为：SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述基因启动子的载体。

3.如权利要求2所述的载体，其为pBI121-GhTCP2。

4.权利要求1所述的基因启动子在制备转基因植物中的应用，所述的植物为拟南芥或棉花。

5.权利要求1所述的基因启动子在植物组织中表达模式的应用，所述的植物为拟南芥或棉花。

6.如权利要求5所述的应用，所述的植物组织为腋芽或花蕾。

7.如权利要求5所述的应用，所述的表达模式为表达抗虫基因。

说明书

棉花GhTCP2基因启动子及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及棉花GhTCP2基因启动子及其组织特异性表达模式的应用。

背景技术

[0002] 棉花(Gossypium Hirsutum)作为全球最重要的经济作物之一，其纤维是人类纺织业的主要原材料。与此同时，棉花的种子和油料也是人们日常生产生活中不可或缺的优良资源，在畜牧业和柴油生产方面发挥着重要作用。但是，棉花病虫害很多，尤其是虫害，直接影响棉花产量。其中，棉铃虫是棉花蕾铃期重要钻蛀性害虫，主要蛀食蕾、花、铃，也取食嫩叶。该虫是中国棉区蕾铃期害虫的优势种，近年为害十分猖獗，搞好棉铃虫的预测预报及综合防治显得十分重要。

[0003] TCP2基因隶属于TCP转录因子家族，最早发现的TCP家族成员包括玉米teosinte branched 1（TBI )基因、金鱼草的cycloidea（CYC）基因和水稻PCF1，PCF2基因，这三个成员的英文缩写首字母组即位该家族名称的由来。TCP转录因子蛋白成员有独特的二级结构，其中部含有一个约60个氨基酸组成的保守的DNA结构域（TCPdomain），形成一个非典型的碱性螺旋-环-螺旋结构[non-canonicalbasic-Helix-Loop-Helix(bHLH)structure]，可能参于蛋白质的二聚化和与DNA结合的功能。

[0004] 研究进展表明，TCP家族成员主要在植物的花器官、叶腋、顶端分生组织、腋芽等快速生长的部位表达，这一现象表明，TCP家族可能在细胞分裂和生长发育中起着重要的作用。

[0005] 虫害是影响棉花产量的重要因素之一，棉铃虫主要取食棉花的嫩叶和棉蕾。转基因抗虫棉携带的Bt基因能有效抑制棉铃虫侵害。目前市场上销售的转基因抗虫棉的Bt基因是由花椰菜病毒的35S启动子驱动的，该启动子在植物各个组织都有表达，使得不被棉铃虫取食的其他组织或器官过量表达异源Bt基因，可能对棉花的生长发育，抵御生物和非生物胁迫的能力造成影响。

[0006] 本发明涉及的GhTCP2启动子可以取代目前市场上广泛应用的转基因棉花中的花椰菜病毒的35S启动子，让抗虫基因Bt在棉铃虫取食的主要部位表达，降低了抗虫基因对转基因棉花除抗虫能力外的其他能力的影响。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供棉花GhTCP2基因启动子序列、其组织特异性表达模式及应用。

[0008] 本发明提供棉花GhTCP2基因启动子，其具有：

[0009] 1）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或

[0010] 2）SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或[0011] 3）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

[0012] 本发明提供含有棉花GhTCP2基因启动子的载体。

[0013] 在本发明的实施例中，含有棉花GhTCP2基因启动子的载体为pBI121-GhTCP2。

[0014] 本发明还提供含有上述载体的宿主细胞。

[0015] 本发明还提供含有棉花GhTCP2基因启动子的转化植物细胞。

[0016] 本发明提供了棉花GhTCP2基因启动子在制备转基因植物中的应用。

[0017] 本发明提供了棉花GhTCP2基因启动子在植物组织中表达模式的应用。

[0018] 其中，所述的植物组织为腋芽或花蕾。

[0019] 其中，所述的表达模式为表达抗虫基因。

[0020] 其中，所述的植物为拟南芥、水稻或棉花。

[0021] 本发明具有下列优点及有益效果：

[0022] （1）本发明提供了棉花GhTCP2基因启动子（核苷酸序列如SEQID No.1所示）及其在植物腋芽及花蕾中组织特异性表达模式。

[0023] （2）通过转化拟南芥野生型Col-0，并进行GUS染色，发现GhTCP2在植物腋芽和花蕾中特异表达（拟南芥、水稻、棉花等），有望对为在棉花幼嫩的棉铃中表达抗虫基因提供特异的启动子，以提高棉花的抗虫能力。

附图说明

[0024] 图1为GhTCP2基因棉花不同部位半定量PCR结果。

[0025] 图2为含有棉花GhTCP2基因启动子的载体图谱。

[0026] 图3为含有棉花GhTCP2基因启动子的载体酶切验证结果；其中1为空载体pBI121用EcoRV和BamHI双酶切的酶切结果；2为pBI121-GhTCP2载体用EcoRV和BamHI双酶切酶切结果；M代表博迈德生物技术有限公司1kb DNA ladder。

[0027] 图4为棉花GhTCP2基因启动子驱动GUS基因转化拟南芥后GUS染色结果，其中1.在拟南芥幼苗中表达；2.在幼嫩的根尖部分表达；3.在整个花器官中都有表达；4.在叶腋处表达；5.花器官放大后，发现在幼嫩的花蕾中表达量较强。

具体实施方式

[0028] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

[0029] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

[0030] 实施例1棉花GhTCP2基因启动子的获得

[0031] 本发明的GhTCP2基因启动子是采用Genome Walking法从市场上购得的陆地棉（Gossypium hirsutum）品种新陆早13号中克隆得到的。将本实验室之前扩增获得的GhTCP2基因中间保守序列（其序列如SEQ ID No.2所示）、5’RACE和3’RACE侧翼序列用SeqMan软件进行拼接，根据拼接得到的序列设计引物GhTCP2ProSP1、GhTCP2ProSP2和GhTCP2ProSP3。以棉花基因组总DNA为模板，用Genome Walking Kit同种AP引物进行3次巢式PCR反应扩增基因启动子区。将1stPCR反应液稀释1000倍后，取1μL作为2nd PCR反应的模板，配制2ndPCR反应液。取2nd反应液稀释1000倍后，取1μL作为3rdPCR反应的模板，配制3rdPCR反应液。分别用试剂盒中提供的四种AP引物进行三次巢式PCR反应，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。操作步骤如下：

[0032] （1）配制1st PCR反应液：

[0033]

[0034] 反应条件：94℃ 1min；98℃ 1min；94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 2min，5个循环；94℃ 30s；25℃ 3min；72℃ 2min；94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 2min，94℃ 30s，65℃1min，72℃ 2min，94℃ 30s，44℃ 1min，72℃ 2min，15个循环；72℃ 10min。将1st PCR反应液稀释1000倍后，取1μL作为2nd PCR反应的模板。（2）配制2nd PCR反应液[0035]

[0036]

[0037] 反应条件：94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 2min，94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 2min，94℃ 30s，44℃ 1min，72℃ 2min，15个循环；72℃ 10min。

[0038] 将2nd PCR反应液稀释1000倍后，取1μL作为3rd PCR反应的模板。

[0039] （3）配制3rd PCR反应液，同2nd PCR反应液加样量，模板为稀释后的2nd PCR反应产物，基因特异引物用GhTCP2ProSP3，反应条件，同2nd PCR反应条件。

[0040] 取1st，2nd，3rd PCR反应液各5μL，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。

[0041] 试剂盒包括4种AP引物应分别进行巢式PCR，取条带最大的3rdPCR切胶回收电泳条带。然后与T载体（pMD19-T vector）连接，转化大肠杆菌感受态细胞，提质粒酶切验证。

[0042] 根据测序正确的序列，设计引物GhTCP2PFF和GhTCP2PFR,以基因组DNA为模板，用TaKaRa PrimeSTAR HS DNA Polymerase withGC Bufer高保真Taq酶扩增启动子区。

[0043] 50μL反应体系如下：

[0044]

[0045]

[0046] 反应条件为：98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸2min，35个循环。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收目的条带。回收产物与pEASY-Blunt Simpl Cloning Kit进行连接，转化大肠杆菌，提质粒进行酶切鉴定，将鉴定正确的结果进行测序。

[0047] 表1本发明涉及的引物序列

[0048]

[0049] 测序结果表明，序列3’端与GhTCP2序列相吻合，说明该序列的确为GhTCP2基因的启动子区，该启动子全长1681bp，其序列如SEQID No.1所示，其中包涵156bp的5’UTR区。在GenBank中进行比对，结果发现该序列首次被克隆到。

[0050] 实施例2棉花GhTCP2基因半定量PCR

[0051] 1、使用百泰克通用植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）提取生长85天的新陆早13号棉花根、茎、叶、顶芽、侧芽、花蕾的总RNA，具体操作步骤如下：

[0052] （1）取100mg植物组织在液氮中快速充分研磨，研磨过程中要保持研钵中始终有液氮。

[0053] （2）将研磨成匀浆的样品转移至1.5mL RNase free离心管中，加入1mL裂解液颠倒混匀，65℃温育5min以使核蛋白体完全分解。4℃，12000rpm离心10min，取上清移至RNase free过滤柱。

[0054] （3）4℃，10000rpm离心45s，收集下滤液于收集管。

[0055] （4）在收集管加入1倍体积70%乙醇混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中。

[0056] （5）4℃，10000rpm离心45s，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。

[0057] （6）向吸附柱中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min。

[0058] （7）加入500μL去蛋白液，4℃ 12 000rpm离心45s，弃掉废液。

[0059] （8）加入700μL漂洗液，4℃ 12 000rpm离心45s，弃掉废液。

[0060] （9）加入500μL漂洗液，4℃ 12 000rpm离心45s，弃掉废液。

[0061] （10）将吸附柱放回空收集管中，4℃ 12 000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。

[0062] （11）取出吸附柱放入无RNase离心管中向吸附膜中间位置滴加适量65℃温育的RNase free water，室温放置2min后，12 000rpm离心1min收集RNA。

[0063] 2、以棉花各部位的cDNA为模板，做半定量RT-PCR，检测基因在植株各部位的表达情况。

[0064] （1）cDNA第一链的合成

[0065] ①在RNase free离心管配制下列混合液：

[0066]

[0067] ②70℃保温5min后迅速在冰上急冷2min以上；离心数秒混合液聚集于管底部；

[0068] ③加入其它反转录反应液：

[0069]

[0070]

[0071] ④42℃，60min；得到的cDNA溶液稀释1～100倍后用于PCR扩增。

[0072] （2）半定量RT-PCR

[0073] 以棉花polyubiquitin基因（GhUBI）（AY189972）作为RT-PCR反应的内标，设计的引物GhTCP2RTF和GhTCP2RTR进行扩增。设计基因特异性上下游引物如下：

[0074] GhUBIF：5’-AAGACCTACACCAAGCCCAA-3’

[0075] GhUBIR：5’-AAGTGAGCCCACACTTACCA-3’

[0076] GhTCP2RTF：5’-CAAACTCAGTTCATGGTGTTC-3’

[0077] GhTCP2RTR：5’-CAGAAACCCAGTGATCTGATG-3’

[0078] 先扩增内标，调整PCR反应体系模板加入量，使扩增内标扩增产物的量相同。再用相应的模板量扩增检测目的基因的转录表达水平。PCR的反应体系如下（20μL）：

[0079]

[0080] 反应条件如下：94℃3min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，25～40个循环；72℃10min。其中polyubiquitin基因（GhUBI）扩增25个循环，GhTCP2基因扩增40循环。用
2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR的扩增结果。

[0081] 半定量PCR结果显示（图1），GhTCP2基因主要在棉花的腋芽和花蕾中特异表达，在顶芽中也有少量表达。

[0082] 实施例3棉花GhTCP2基因启动子转化拟南芥

[0083] 将GhTCP2基因启动子克隆至植物表达载体pBI121（由中国科学院遗传与发育生物学研究所李家洋院士惠赠）得到表达载体pBI121-GhTCP2，并在大肠杆菌DH5α中扩繁。通过农杆菌介导转化方法，将pBI121携带的GhTCP2基因启动子转入拟南芥，共获得20株转基因拟南芥。

[0084] 将基因克隆至载体、载体在大肠杆菌DH5α中扩繁以及农杆菌介导转化的过程如下：

[0085] 1、载体的构建

[0086] 根据GhTCP2基因启动子序列设计上下游引物GhTCP2ProEBF和GhTCP2ProEBR，通过PCR获得GhTCP2启动子片段，在5’端引入EcoRV（平末端），3’端引入BamHI，含GhTCP2的前7个AA，与GUS基因翻译水平融合。

[0087] 50μL反应体系如下：

[0088]

[0089] 将PCR产物回收，与pEASY-Blunt Simpl Cloning Kit连接，转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒酶切鉴定，将鉴定正确的菌株送往公司测序。将测序正确的菌株提取质粒，用EcoRV和BamHI双酶切，回收GhTCP2启动子目的片段。先用HindIII单切，完全切开后，用Klenow DNApolymerase补成平端，加热失活Klenow，再用BamHI单切，回收大片段作为载体。将获得的GhTCP2启动子片段与载体片段用T4连接酶连接过夜。

[0090] 连接体系：

[0091]

[0092] 2、载体在大肠杆菌DH5α中扩繁过程如下：

[0093] 质粒载体和外源片断的摩尔量为1：3。连接过夜后转入DH5α内，涂到含卡那霉素抗性的平板进行阳性筛选。

[0094] 筛选到的阳性克隆用酶切鉴定。由于GhTCP2启动子5’端和转录终止点后各含有一个EcoRI酶切位点，所以采用EcoRI进单酶切检测，应切下3699bp大小条带。载体图谱如图2，酶切验证结果如图3。最后将构建好的载体质粒转化农杆菌GV3101。

[0095] 3、转化农杆菌感受态细胞的步骤如下：

[0096] （1）取-70℃保存的农杆菌于含50μg/mL利福平(Rifampicin)的YEP平板上划线，28℃培养2~3d。

[0097] （2）挑取单菌落接种于5mL YEP液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12~16h。

[0098] （3）取2mL菌液转接于100mL YEP液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.4~0.6。

[0099] （4）转入无菌离心管，5000rpm离心5min,弃上清。

[0100] （5）每50mL菌液加入5mL预冷的0.1M CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min,弃上清。

[0101] （6）每50mL菌液加入2mL预冷的含15%甘油的0.1M CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞。

[0102] （7）将农杆菌悬浮液分装于1.5mL无菌的EP管中，每管100μL（可冻存于-70℃）。

[0103] （8）取1μg左右的质粒DNA加入到100μL农杆菌感受态细胞中，混匀后冰浴30min。

[0104] （9）液氮速冻5min,再在37℃水浴5min。

[0105] （10）马上冰浴2min,加入800μL YEP液体培养基，28℃175rpm振荡培养2~4h后，涂在含50μg/ml卡那霉素的YEP固体平板上，28℃培养2~3d到形成单菌落。

[0106] （11）挑取单菌落，PCR验证。阳性克隆用于转化植物。

[0107] 4、农杆菌介导的拟南芥Col-0转化过程如下：

[0108] 拟南芥受体材料准备：拟南芥(从拟南芥生物研究中心（arabidopsis biological research centre）购得)移栽后，其主苔长至10~15cm，生成1~2个角果时即可用于转化试验。为得到较多花序，可将顶芽除去，促使更多侧芽生长，转化前剪去已开花的花蕾和已长成的角果。

[0109] 挑取已活化并含有目的载体的GV3101单菌落于5mL YEB液体培养基（卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L）中，28℃220rpm震荡培养12~16h，取20~60μL菌液涂与含相应抗生素的平板上28℃黑暗培养2~3d，收集菌体溶于30mL液体YEB使OD600值达到2.0，将菌液加入到含120mL转化介质的塑料袋中用于转化。

[0110] 将花序浸入转化液10s，轻轻抖落多余菌液，侧放并避光保湿处理16~24h，将转化好的植株放到培养架上继续光照培养。1周后以同样的方法重新转染一次。收集T0代种子。

[0111] 5、转基因阳性苗的筛选过程如下：

[0112] T0代种子经消毒后，重悬于0.05%的琼脂溶液中（40μL种子/ml琼脂）。在含卡纳霉素90x90x25mm的MS培养基平板铺种1mL混合物，4℃冰箱春化3d，转基因阳性苗（T0代植株）可以长成真叶，而不含目的基因片段的幼苗则不能成活，将阳性苗移栽。

[0113] 实施例4棉花GhTCP2基因启动子转化拟南芥阳性植株的GUS染色

[0114] 选取不同发育时期的实施例3中的转基因植物，进行GUS组织染色，检测组织表达。方法如下:

[0115] （1）取新鲜的鉴定正确的转基因拟南芥植株的不同部位置于15mL离心管中。

[0116] （2）向各管中加入GUS染色液使其淹没植物样品；

[0117] （3）打开离心管盖，抽真空30min；

[0118] （4）盖上离心管盖，用锡箔纸包裹离心管壁使其避光，置于37℃水浴过夜，使样品充分染色；

[0119] （5）用无水乙醇脱色数次，直至样品的绿色消失；

[0120] （6）用体式显微镜观察样品着色情况并拍照。

[0121] GUS染色结果显示（图4），在苗期，GUS主要在植物的根尖、叶边缘及生长点中表达，在成熟期，GUS主要在腋芽和幼嫩的花蕾中特异表达。以上实验结果表明，GhTCP2基因除在苗期大量表达外，在成熟植物的腋芽和幼嫩的花蕾中有较强的表达，在叶片和茎秆中没有表达。所以本领域技术人员可以根据GhTCP2基因启动子能够在棉花腋芽和花蕾中特异性表达抗虫基因提供启动子，减小抗虫基因在其他组织表达对棉花产生的负面影响，在不影响棉花产量的前提下，提高棉花的抗虫能力，有目的地将GhTCP2基因启动子应用于转基因抗虫棉的研发。

[0122] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。