包拉米虫LAMP检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种包拉米虫LAMP检测试剂盒。本发明提供了检测包拉米虫的环介导等温扩增引物组，包括引物1、引物2、引物3和引物4；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本发明的实验证明，本发明MDPV的保守序列设计了针对8个特异区域的6条引物，用其进行LAMP检测，具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，仅需使用一台能控温的水浴锅，并且结果可以无需仪器而仅通过肉眼判定，适合在基层兽医站和养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。

权利要求

1.检测包拉米虫的环介导等温扩增引物组，包括引物1、引物2、引物3和引物4；

所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为8：8：1：1。

3.根据权利要求1或2所述的引物组，其特征在于：所述引物组还包括引物5和引物

6；所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列5和序列6；

所述引物组具体由所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6组成。

4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为

8：8：1：1：4：4。

5.含有权利要求1-4中任一所述的引物组的检测包拉米虫的环介导等温扩增试剂。

6.根据权利要求5所述的环介导等温扩增试剂，其特征在于：所述环介导等温扩增试剂由权利要求1-4中任一所述的引物组、环介导等温扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、钙黄绿素、甜菜碱、MnCl2和水组成。

7.根据权利要求6所述的环介导等温扩增试剂，其特征在于：所述引物组中的引物1和所述引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为40μmol/L；

所述引物组中的引物3和所述引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为

5μmol/L；

所述引物组中的引物5和所述引物6在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为

20μmol/L。

8.检测包拉米虫的环介导等温扩增试剂盒，包括权利要求1-4中任一所述的引物组或权利要求5-7中任一所述的环介导等温扩增试剂。

9.权利要求1-4中任一所述的引物组、权利要求5-7中任一所述的环介导等温扩增试剂或权利要求8所述环介导等温扩增试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有包拉米虫的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述应用采用环介导等温扩增，所述环介导等温扩增的条件为64℃反应50h，80℃作用5min灭活。

说明书

包拉米虫LAMP检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种包拉米虫LAMP检测试剂盒。

背景技术

[0002] 包拉米虫（Bonamia）是影响世界贝类养殖业发展的主要病原，所有种类的贝类和其余贝类科的贝类都被认为有易感性，主要寄生在血淋巴细胞内，能造成较大的死亡率。包拉米虫病（Bonamiasis）因为包拉米虫的高致病性和广阔的地理分布，为OIE规定的必报水生动物疫病之一。

[0003] 传统的检测方法，需要使用昂贵的仪器和试剂等。而环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由Notomi等于2000年建立的一种新型核酸扩增技术，该技术具有操作简便、反应快速、成本低廉和结果可视化等优点，目前在一些病原微生物的检测中被广泛运用。

[0004] 目前，国内外均未见有建立Bonamia LAMP可视化检测试剂盒和方法的相关报道。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供一种检测包拉米虫的环介导等温扩增引物组。

[0006] 本发明提供的引物组，包括引物1、引物2、引物3和引物4；

[0007] 所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

[0008] 上述引物组中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为8：8：1：1。

[0009] 上述引物组还包括引物5和引物6；所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列5和序列6；

[0010] 上述引物组具体由所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6组成。

[0011] 上述引物组中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为8：8：1：1：4：4。

[0012] 含有上述的引物组的检测包拉米虫的环介导等温扩增试剂也是本发明保护的范围。

[0013] 上述环介导等温扩增试剂由上述的引物组、环介导等温扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、钙黄绿素、甜菜碱、MnCl2和水组成。

[0014] 上述环介导等温扩增试剂中，所述引物组中的引物1和所述引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为40μmol/L；

[0015] 所述引物组中的引物3和所述引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5μmol/L；

[0016] 所述引物组中的引物5和所述引物6在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为20μmol/L。

[0017] 本发明的第二个目的是提供一种检测包拉米虫的环介导等温扩增试剂盒。

[0018] 本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的环介导等温扩增试剂。

[0019] 上述的引物组、上述的环介导等温扩增试剂或上述环介导等温扩增试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有包拉米虫的产品中的应用。

[0020] 上述应用采用环介导等温扩增，所述环介导等温扩增的条件为64℃反应50min，80℃作用5min灭活。上述应用具体为分别利用上述的引物组、上述的试剂或上述试剂盒对所述待测样品进行环介导等温扩增反应。

[0021] 本发明的实验证明，本发明MDPV的保守序列设计了针对8个特异区域的6条引物，使扩增反应具有很高的特异性，在内引物之间增加两条环引物提高了扩增效率，缩短了LAMP的反应时间。通过优化反应条件后，建立了的LAMP检测方法。所建立的BonamiaLAMP检测方法只需要在62-64℃的水浴锅中反应50分钟即可完成，能特异的检测Bonamia，并且检测的灵敏度非常高，能检测到15.4fg的Bonamia DNA样品，灵敏度是常规PCR的10倍。总之，本发明的引物和方法，具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，仅需使用一台能控温的水浴锅，并且结果可以无需仪器而仅通过肉眼判定，适合在基层水产兽医站和养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。

附图说明

[0022] 图1为LAMP方法检测Bonamia的特异性

[0023] 图2为LAMP方法检测Bonamia的敏感性

[0024] 图3为PCR方法检测Bonamia的敏感性

具体实施方式

[0025] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0026] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0027] 下述实施例中部分材料如下：Bst DNA聚合酶（大片段）购自New England Biolabs公司；PCR试剂购自北京全式金生物技术有限公司；海洋动物组织基因组抽提试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司。

[0028] 包拉米虫记载在“中国沿海主要养殖贝类四种原虫病流行病学的调查研究”，基因组学与应用生物学，2012，31（6）：1-8，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

[0029] 单孢子虫、派琴虫、折光马尔太虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌均记载在“3种贝类原虫多重荧光定量PCR方法的建立”，生物技术通讯，2012，23（5）：713-717，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

[0030] 实施例1、引物的设计

[0031] 根据GenBank中包拉米虫的基因保守序列，使用在线软件Primer Explorer V4(http://primerexplorer.jp/e/v4-manual/index.html)设计LAMP引物。引物由广州Invitrogen公司合成。6条引物序列见表1。

[0032] 表1为LAMP引物序列

[0033]

[0034] LF和LB引物不加也可以，加入可以提高检测的敏感性。

[0035] 实施例2、引物在LAMP检测包拉米虫中的应用

[0036] 一、核酸的提取

[0037] 参照海洋动物组织基因组抽提试剂盒说明书，提取包拉米虫、单孢子虫、派琴虫、折光马尔太虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌的基因组DNA。

[0038] 二、优化LAMP反应体系、反应条件和试剂盒的构建

[0039] 25μL LAMP反应体系：1-4μL dNTPs(10mmol/L，终浓度为0.4mmol/L-1.6mmol/L)、2.5μL10×Bst buffer、1μl Bst DNA聚合酶8U（终浓度为320U/L）、4-7μL甜菜碱Betaine(5mmol/L，终浓度为0.8mmol/L-1.4mmol/L)、2-9μLMgSO4(25mmol/L，终浓度为2mmol/L-9mmol/L)、1μL引物(FIP40μmol/L、BIP40μmol/L、LF20μmol/L、LB20μmol/L、B35μmol/L、F35μmol/L；终浓度为FIP1.6μmol/L、BIP1.6μmol/L、LF0.8μmol/L、LB0.8μmol/L、B30.2μmol/L、F30.2μmol/L)、1ul钙黄绿素Calcein(625μmol/L，终浓度为25μmol/L)、1ul MnCl2(12.5mmol/L，终浓度为0.5mmol/L)和1μL模板（包拉米虫的基因组DNA），加水至25μL。

[0040] 反应条件：温度按60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃依次递增反应50h，80℃作用5min灭活。

[0041] 分别按照上述的反应体系和反应条件进行摸索，获得下述的最佳反应体系和条件：

[0042] 最佳反应体系如下：25μL LAMP反应体系：2μL dNTPs(10mmol/L，终浓度为0.4mmol/L)、2.5μL10×Bst buffer、1μL Bst DNA聚合酶8U（终浓度为320U/L）、5μL甜菜碱Betaine(5mmol/L，终浓度为1mmol/L)、3μL MgSO4(25mmol/L，终浓度为3mmol/L)、1μL引物(FIP40μmol/L、BIP40μmol/L、LF20μmol/L、LB20μmol/L、B35μmol/L、F35μmol/L，其中各条引物的终浓度为FIP1.6μmol/L、BIP1.6μmol/L、LF0.8μmol/L、LB0.8μmol/L、B30.2μmol/L、F30.2μmol/L)、1μL钙黄绿素Calcein(625μmol/L，终浓度为25μmol/L)、1ul MnCl2(12.5mmol/L，终浓度为0.5mmol/L)、1μL模板DNA，加水至25μL。

[0043] 最佳反应条件：64℃反应50h，80℃作用5min灭活。

[0044] 包拉米虫LAMP检测试剂盒包括FIP、BIP、F3、B3的4条引物或FIP、BIP、F3、B3、LF、LB的6条引物或上述最佳反应体系（除去模板）。

[0045] 三、特异性检测

[0046] 分别以上述一得到单孢子虫、派琴虫、折光马尔太虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌DNA为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。

[0047] LAMP反应结果的判断有2种：

[0048] 1）直接用肉眼观察颜色变化：若反应产物颜色变为绿色（翠绿色），则说明样品中含有包拉米虫，反之，则说明样品中不含有包拉米虫；

[0049] 2）电泳观察：LAMP反应产物进行琼脂糖电泳检测，并在凝胶成像仪下观察结果；若反应产物有典型的连续梯状条带，则说明样品中含有包拉米虫；反之，则样品中不含有包拉米虫；

[0050] 结果如图1所示，A图为电泳检测结果，B图为肉眼观察结果，其中M为100bp DNAladder、1为包拉米虫、2为单孢子虫、3为派琴虫、4为折光马尔太虫、5为副溶血弧菌、6为溶藻弧菌、7为河弧菌、8为阴性对照（水）；可以看出，只有包拉米虫（1）检测为阳性结果（肉眼观察可见翠绿色，琼脂糖凝胶电泳呈现典型的连续梯状条带），而对单孢子虫、派琴虫、折光马尔太虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌的检测均为阴性（肉眼观察可见橙黄色，均没有特征性梯形条带出现）。

[0051] 四、灵敏度检测

[0052] 将包拉米虫的DNA按10倍倍比稀释至15.4ng/μL、1.54ng/μL、154pg/μL、15.4pg/μL、1.54pg/μL、154fg/μL、15.4fg/μL、1.54fg/μL和0.154fg/μL为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。

[0053] 结果如图2所示，A图为电泳检测结果，B图为肉眼观察结果，其中M为100bp DNAladder、1 为 15.4ng/μL、2 为 1.54ng/μL、3 为 154pg/μL、4 为 15.4pg/μL、5 为1.54pg/μL、6为154fg/μL、7为15.4fg/μL、8为1.54fg/μL、9为0.154fg/μL、10为阴性对照（水）；可以看出，LAMP对包拉米虫的DNA的最小检测限为15.4fg/μL（肉眼观察可见翠绿色，琼脂糖凝胶电泳呈现特征性梯形条带）。

[0054] 对照组：将包拉米虫的DNA按10倍倍比稀释至15.4ng/μL、1.54ng/μL、154pg/μL、15.4pg/μL、1.54pg/μL、154fg/μL、15.4fg/μL和1.54fg/μL为模板，以常规的PCR扩增（常规的PCR扩增引物F：CGGGGGCATAATTCAGGAAC,R：CCATCTGCTGGAGACACAG）(OIE推荐检测引物http://www.oie.int/en/international-standard-setting/aquatic-manual/access-online）。

[0055] 对照组2%琼脂糖凝胶电泳观察结果如图3所示，M为100bp DNA ladder、1为15.4ng、2为1.54ng、3 为154pg、4 为15.4pg、5为 1.54pg、6为154fg、7 为15.4fg、8 为
1.54fg、9为阴性对照（为水）；得到PCR预期扩增片段大小约为760bp，常规PCR方法最小检测限为154fg。

[0056] 从上述可以看出，本发明的引物建立的LAMP敏感性比常规PCR高10倍。