一种检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒

摘要

本发明涉及一种检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒。该试剂盒包括膜条、酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液，膜条由载片和依次固定在载片上的抗原条带、临界质控带、功能质控线构成，抗原条带由PR3、MPO和GMB中的至少两个彼此独立的划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上形成。本发明具有独创性的临界质控带，一个临界质控带可以同时对两个乃至更多的检测条带（抗原条带）起到判读的作用，结果判定更加简单可靠。

权利要求

1.一种检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒，包括膜条，其特征在于，膜条由载片和依次固定在载片上的抗原条带、临界质控带、功能质控线构成，抗原条带由PR3、MPO和GBM中的至少两个彼此独立的划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上形成；所述临界质控带的临界质控值确定方法包括下述步骤：

1）选择m个确诊为阴性的新鲜血液标本作为样本，膜条的抗原条带中具有n个抗原，取膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将m个样本中相同的抗原所检测抗体的灰度值作为一组数值得到n组数值，分别计算这n组数值的平均值Mp、标准差SDp和各个抗原所检测抗体的临界质控值COp，其中COp=（Mp+2×SDp），m、n、p均为自然数且m≥120，n≥2，n≥p≥1；

2）将各个抗原所检测抗体的临界质控值COp进行处理，计算其平均值M、标准差SD、变异系数CV；

3）如CV≤10%，则可得到膜条的临界质控值CO，其中CO=（M+2×SD）；如CV＞10%，调整印迹抗原量重复步骤1）、步骤2）重新测定，直至CV≤10%；

4）选择确诊为阳性的新鲜血液标本作为样本，取膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将其与膜条的临界质控值CO比较，如所有的样本灰度值均不小于CO，则CO有效；如有一个或以上的样本灰度值小于CO，需再次测定验证；

如仍有一个或以上的样本灰度值小于CO，则调整印迹抗原量重复步骤1）、步骤2）、步骤3）重新确定膜条的临界质控值CO。

2.根据权利要求1所述的一种检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于，还包括酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液。

3.根据权利要求1所述的一种检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于，所述临界质控带的成分为50ng/mL ~25μg/mL的人IgG。

4.根据权利要求3所述的一种检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于，所述临界质控带的成分为300ng/mL ~5μg/mL的人IgG。

5.根据权利要求1所述的一种检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于，根据确定的膜条的临界质控值确定临界质控带包被人IgG的浓度，具体方法为：将一定浓度的人IgG溶于Tris或Hepes缓冲液中，然后划线于硝酸纤维素膜上制备成成品膜条，且膜条上仅包被临界质控带；随机选取30个膜条检测步骤1）的随机阴性样本，并扫描灰度，计算30次测定的均值MS、标准差SDS和变异系数CVS，其中CVS=MS/SDS，临界质控带合格的标准为：1）0.97×CO ≤ MS ≤ 1.03×CO；2）CVS < 5%；如果不符合其中的任意一个，则需重新调整浓度重复本步骤所有实验，直至得到合格的临界质控带，此时的人IgG包被浓度即为临界质控带的包被浓度。

6.根据权利要求2所述的一种检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于，所述底物为质量百分比浓度为0.02%-2%的鲁米诺或质量百分比浓度为0.002%-0.2%的过氧化氢构成的单一试剂。

7.根据权利要求1至4任一项所述的一种检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于，所述抗原条带相互平行并且每个抗原条带宽度均一，各相邻抗原条带之间间隔等宽。

8.根据权利要求1至4任一项所述的一种检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于，所述血管炎疾病包括魏格纳氏肉芽肿、显微镜下血管炎、肺出血-肾炎综合征、急进性肾小球肾炎或结节性多动脉炎。

9.根据权利要求1至4任一项所述的一种检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于，所述PR3、MPO和GBM是由昆虫细胞sf9表达并纯化制得。

说明书

一种检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种诊断疾病的试剂盒，具体地，涉及一种检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒。

背景技术

[0002] 系统性血管炎(systemic vasculitis)是一组以血管坏死和炎症为主要病理改变的疾病，常见的血管炎有魏格纳氏肉芽肿、显微镜下血管炎、肺出血-肾炎综合征和结节性多动脉炎等。这些疾病都有共同的特点：疾病累计全身各个部位的大小动脉和静脉，可因受累血管的类型、大小、部位、病程及病理改变导致复杂多变的临床表现；但他们都可检出特征性的抗中性粒细胞胞质抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibody, ANCA)，是系统性血管炎诊断重要依据。同时，ANCA常在疾病活动或复发前数周即出现浓度的快速升高，而当疾病缓解时，抗体水平迅速下降甚至消失，是检测病情、判断治疗效果、评价疾病转归的重要指标。

[0003] ANCA是一种以中性粒细胞和单核细胞胞质成分为靶抗原的自身抗体，包括了大量的自身抗体，其中抗蛋白酶3（PR3）抗体和抗髓过氧化物酶（MPO）抗体具有明确的临床诊断意义，是最重要的ANCA抗体。本发明涵盖了最重要的ANCA抗体：PR3和MPO抗体，同时加入了肾小球基底膜抗体（GBM）——与血管炎相关的急进性肾小球肾炎的标志性抗体，能够更全面的诊断系统性血管炎。

[0004] 对于自身免疫疾病诊断方法多采用间接免疫荧光分析法（IFA）、酶联免疫吸附法〔ELISA)和免疫印迹，但各有其不足。间接免疫荧光分析法是检测自身抗体的常用技术。其实验基质为Hep-2细胞，含有完整的抗原谱，适合筛查试验。但是有如下缺点：不能作为确诊依据；结果的判断需要有丰富的经验；滴度的意义大于核型，但滴度的判定主观性强；灵敏度较低，特异性也不高。

[0005] 酶联免疫吸附法(ELISA)具有灵敏度高，可作为筛选实验，也可作为确诊依据，还可定量测定，检测病情和治疗效果。但一次试验只能检测单一指标，通量低，检测成本较高，在自身免疫疾病的诊断应用推广方面存在着极大的局限性。Western blot（WB）是在凝胶电泳和免疫分析技术基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性的优点，比较适合发现未知的抗体。而对于检测已知的抗体，由于使用了天然的混合抗原，实验过程中经常出现找不到目标条带和条带偏移的问题，给结果的判读造成了不少困难，极易误判和漏判。同时WB使用时间长，也不适合在临床检验中推广。有人将WB改进，直接将纯化抗原包被于硝酸纤维素膜上，然后进行免疫反应检测抗体，形成了改良的免疫印迹方法，但目前还没有将该方法用于检测血管炎的3种自身抗体的应用。

[0006] 对于现有的试剂盒，存在下述缺点：

[0007] 1、WB使用时间长，操作复杂。

[0008] 2、WB使用了天然的混合抗原，实验过程中经常出现找不到目标条带和条带偏移的问题，给结果的判读造成了不少困难，极易误判和漏判。

[0009] 3、ELISA方法一次只能检测一个项目，效率不高。

[0010] 4、IFA方法仅能进行筛查，不具有辅助诊断的意义。

[0011] 5、目前还没有能同时检测血管炎相关的3种自身抗体的改良免疫印迹方法。

[0012] 6、目前的试剂盒中，一般没有对照线或者一个对照线只能作为一个检测结果对照，没有能够同时至少作为2个检测结果对照的质控带。

发明内容

[0013] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒，该试剂盒的质控带可以同时对两个乃至更多的检测条带起到判读的作用。

[0014] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒，包括膜条，膜条由载片和依次固定在载片上的抗原条带、临界质控带、功能质控线构成，抗原条带由PR3、MPO和GBM中的至少两个彼此独立的划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上形成。

[0015] 该方法中，功能质控线属于现有技术，其目的是用于判断该膜条的一次反应是否有效。步骤1）的阴性和步骤4）的阳性是指当具有这些抗原所能检测的抗体时为阳性，不具有这些抗原所能检测的抗体为阴性。本方案的膜条的每个抗原都彼此独立地划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上形成一个独立的抗原检测线，这些所有的抗原检测线统称为抗原条带，步骤1中的“取膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值”，这里的灰度值为每一个抗原检测线检测样品后扫描得到的灰度值。步骤5）中根据确定的膜条的临界质控值，技术人员通过本领域的常规技术手段，可以得到合适的人IgG的浓度，采用现有的包被工艺，即可制备临界质控带，或者采用本发明下述的专用确定方式来确定。本方案的发明点可同时检测血管炎相关的3种自身抗体，而且设置了一个可以同时对两个乃至更多的检测条带（抗原条带）起到判读的临界质控带。随着检测条带的增多，每增加一条被检测条带，都要对重新进行完整的临界质控值确定实验，同时实验难度显著加大。通常，确定一个临界质控值需要许多次实验，才能最终确定。

[0016] 该检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒还包括酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液。酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液的选择和范围都属于现有技术，对于酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液而言，选用现有技术的产品也可以实现本发明的技术方案。

[0017] 所述临界质控带的成分为50ng~25μg/mL的人IgG。现有技术中有选用抗羊IgG作为对照线的记载，如CN200810132304.8中，但是该专利中的每一个抗原条带上都需要划一个抗羊IgG的对照线，这样制作工艺比较比较繁琐，而且成本较高，在CN200810132304.8中，没有关于同一对照线可以用于2个或者2个以上的抗原条带判读的记载。本发明通过创造性实验发现，选择一定浓度范围的人IgG作为临界质控带，可以清楚、准确的对2个或者2个以上的抗原条带进行判读。

[0018] 作为进一步的优选，所述临界质控带的成分为300ng~5μg/mL的人IgG。

[0019] 所述临界质控带的临界质控值确定方法包括下述步骤：1）选择m个确诊为阴性的新鲜血液标本作为样本，膜条的抗原条带中具有n个抗原，取膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将m个样本中相同的抗原所检测抗体的灰度值作为一组数值得到n组数值，分别计算这n组数值的平均值Mp、标准差SDp和各个抗原所检测抗体的临界质控值COp，其中COp=（Mp+2×SDp），m、n、p均为自然数且m≥120，n≥2，n≥p≥1；2）将各个抗原所检测抗体的临界质控值COp进行处理，计算其平均值M、标准差SD、变异系数CV；3）如CV≤10%，则可得到膜条的临界质控值CO，其中CO=（M+2×SD）；如CV＞10%，调整印迹抗原量重复步骤1）、步骤2）重新测定，直至CV≤10%；4）选择确诊为阳性的新鲜血液标本作为样本，取膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将其与膜条的临界质控值CO比较，如所有的样本灰度值均不小于CO，则CO有效；如有一个或以上的样本灰度值小于CO，需再次测定验证；如仍有一个或以上的样本灰度值小于CO，则调整印迹抗原量重复步骤1）、步骤2）、步骤3）重新确定膜条的临界质控值CO。

[0020] 根据确定的膜条的临界质控值确定临界质控带包被人IgG的浓度，具体方法为：将一定浓度的人IgG溶于Tris或Hepes缓冲液中，然后划线于硝酸纤维素膜上制备成成品膜条，且膜条上仅包被临界质控带；随机选取30个膜条检测步骤1）的随机阴性样本，并扫描灰度，计算30次测定的均值MS、标准差SDS和变异系数CVS，其中CVS=MS/SDS。临界质控带合格的标准为：1）0.97×CO ≤ MS ≤ 1.03×CO；2）CVS < 5%；如果不符合其中的任意一个，则需重新调整浓度重复本步骤所有实验，直至得到合格的临界质控带，此时的人IgG包被浓度即为临界质控带的包被浓度。根据确定的膜条的临界质控值，技术人员通过本领域的常规技术手段，可以确定合适的人IgG的浓度，采用现有的包被工艺，即可制备临界质控带。也可以才本方案的专用确定方式进行确定。

[0021] 所述酶标液为辣根过氧化物酶标记的羊/鼠/兔抗人IgG抗体。

[0022] 所述底物为质量百分比浓度为0.02%-2%的鲁米诺或质量百分比浓度为0.002%-0.2%的过氧化氢构成的单一试剂。采用该改良单试剂底物，加入底物后不需终止。

[0023] 所述抗原条带相互平行并且每个抗原条带宽度均一，各相邻抗原条带之间间隔等宽。具体地，抗原条带宽度为0.5mm-3mm，相邻抗原条带之间间隔为2mm-20mm。

[0024] 所述血管炎疾病包括魏格纳氏肉芽肿、显微镜下血管炎、肺出血-肾炎综合征、急进性肾小球肾炎和结节性多动脉炎等。

[0025] 所述PR3、MPO和GBM是由昆虫细胞sf9表达并纯化制得。

[0026] 与现有技术相比较，本发明的有益效果是：

[0027] 1、可同时检测血管炎相关的3种自身抗体，并可作为辅助诊断的依据。

[0028] 2、本发明具有独创性的临界质控带，一个临界质控带可以同时对两个乃至更多的检测条带（抗原条带）起到判读的作用，将显色条带与临界质控带的颜色的深浅比较即可判断结果：阳性: 颜色比临界质控带相同或深；阴性: 颜色比临界质控带浅。

[0029] 3、本发明还改良了单试剂底物，加入底物后不需终止。

[0030] 4、每个抗原条带宽度均一，条带间隔等宽，膜条背景干净，使结果判定更加简单可靠。

附图说明

[0031] 图1是本发明膜条的结构示意图；

[0032] 图2是临界质控值确定流程图。

具体实施方式

[0033] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但本发明的实施方式不仅限于下述实施例。

[0034] 实施例1：

[0035] 参见图1至图2所示，图2中的CO质控线即为临界质控带；本实施例的检测血管炎相关自身抗体谱的试剂盒包括膜条、酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液，其中酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液的选择和范围都属于现有技术，对于酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液而言，选用现有技术的产品也可以实现本发明的技术方案。

[0036] 膜条由载片和依次固定在载片上的抗原条带、临界质控带、功能质控线构成，抗原条带由PR3、MPO和GMB中的至少两个彼此独立的划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上形成，本实施例的临界质控带的成分为50ng~25μg/mL的人IgG。

[0037] 本试剂盒创造性的加入了能同时最多对3个被检抗体（抗原条带）进行阴阳性判定的临界质控带。具体的流程见图2的流程图所示。临界质控带的临界质控值确定方法包括下述步骤：

[0038] 1）选择m个确诊为阴性的新鲜血液标本作为样本，膜条的抗原条带中具有n个抗原，取膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将m个样本中相同的抗原所检测抗体的灰度值作为一组数值得到n组数值，分别计算这n组数值的平均值Mp、标准差SDp和各个抗原所检测抗体的临界质控值COp，其中COp=（Mp+2×SDp），m、n、p均为自然数且m≥120，n≥2，n≥p≥1；

[0039] 2）将各个抗原所检测抗体的临界质控值COp进行处理，计算其平均值M、标准差SD、变异系数CV；

[0040] 3）如CV≤10%，则可得到膜条的临界质控值CO，其中CO=（M+2×SD）；如CV＞10%，调整印迹抗原量重复步骤1）、步骤2）重新测定，直至CV≤10%；

[0041] 4）选择确诊为阳性的新鲜血液标本作为样本，取膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将其与膜条的临界质控值CO比较，如所有的样本灰度值均不小于CO，则CO有效；如有一个或以上的样本灰度值小于CO，需再次测定验证；如仍有一个或以上的样本灰度值小于CO，则调整印迹抗原量重复步骤1）、步骤2）、步骤3）重新确定膜条的临界质控值CO。

[0042] 总的来说，临界质控值的确定有两个关键点，第一是3个条带的灰度上限的CV不能超过10%，否则需要重新调整相应抗原的印迹浓度后再进行实验。第二是用阳性样本来验证临界质控带，如果两次实验某个样本的灰度都小于临界质控值，那么需要重新做整个实验。并且随着检测条带的增多，每增加一条被检测条带，都要对重新进行完整的临界质控值确定实验，同时实验难度显著加大。通常，确定一个临界质控值需要许多次实验，才能最终确定。

[0043] 实施例2：

[0044] 本实施例是对由PR3、MPO和GMB这3个彼此独立的划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上形成的抗原条带进行试验测定。在实施例1的基础上，为了使结果判定更加简单可靠，将每个抗原条带宽度均一设置，条带间隔等宽，抗原条带宽度为0.5mm-3mm，相邻抗原条带之间间隔为2mm-20mm，膜条背景干净，并且采用改良的单试剂底物，加入底物后不需终止，底物为鲁米诺0.02%-2%或过氧化氢0.002%-0.2%构成的单一试剂；所有的印迹抗原都是高度纯化的，且采用了国际最新的包被工艺，具体包被方法见后述。

[0045] 临界质控值的确定：

[0046] 1）确定各抗体的临界质控值

[0047] 随机选取临床确诊为阴性的新鲜血清、血浆标本123份，用本实施例的试剂盒检测。测定其抗原条带所检测的相应抗体的灰度值，计算125份标本中各相同抗体的灰度值均值Mp和标准差SDp，可得到每个抗体95%的置信上限（Mp+2×SDp），即为各抗体的临界质控值，记作COp。结果见下表，本实施例m=123，n=p=3。

[0048]

[0049] 2）确定膜条的临界质控值

[0050] 将上述各抗体的COp进行处理：计算它们的平均值M和标准差SD和变异系数CV（CV = M/SD），若CV＞10%，应调整相应印迹抗原的浓度，重做步骤1）、步骤2）；若CV≤10%，则可得到膜条的临界质控值，记作CO =（M+2×SD）。结果见下表：

[0051]

[0052] 本次实验CV = 4.4%，CO有效，为148.2。

[0053] 3）验证膜条的临界质控值的有效性。

[0054] 随机选取临床确诊为阳性的新鲜血清、血浆标本95份，测定其相应抗体灰度值，与CO比较。经试验确定，本次实验所有阳性样本的灰度值均超过临界质控值，该临界质控值有效。

[0055] 实施例3：

[0056] 本实施例是根据实施例2确定的膜条的临界质控值（在图2及本发明的所有实施例中，COp为单个抗体的临界质控值，CO为整个膜条的临界质控值），来调节临界质控带包被人IgG的浓度，最终确定临界质控带的包被浓度和包被工艺。具体操作为：将一定浓度的人IgG溶于Tris或Hepes缓冲液中，然后用全自动点样仪划线于硝酸纤维素膜上，并经过封闭、干燥、切割等工艺制备成成品膜条，且膜条上仅包被临界质控带。随机选取30个膜条检测步骤1）的随机阴性样本，并扫描灰度，计算30次测定的均值（MS）、标准差（SDS）和变异系数（CVS），其中CVS=MS/SDS。临界质控带合格的标准为：1）0.97×CO（膜条的临界质控值） ≤ MS ≤ 1.03×CO；2）CVS < 5%。如果不符合其中的任意一个，则需重新调整浓度或包被工艺进行本实施例所述的所有实验，直至得到合格的临界质控带，此时的人IgG包被浓度即为临界质控带的包被浓度。结果见下表：

[0057]

[0058] 其中，MS=151.4=1.02×CO；CVS=2.7%<5%，均符合要求。此时的临界质控带的包被浓度为25μg/mL。

[0059] 实施例4：

[0060] 采用实施例1的技术方案，我们对由PR3、MPO和GMB中的随机选取2个彼此独立地划线到硝酸纤维素膜或尼龙膜上形成抗原条带，再进行试验测定，其结果如下：

[0061] 1）确定各抗体的临界质控值

[0062] 根据实施例1步骤1）的方法，随机选取临床确诊为阳性的新鲜血清、血浆标本121份用本试剂盒测定，各抗体的临界质控值COp的结果见下表。本实施例中，m=121，n=p=2。

[0063]

[0064] 2）确定膜条的临界质控值

[0065] 根据实施例1步骤2）的方法，得到M、CO和CV，结果见下表。

[0066]

[0067] 本次实验CV = 5.8%，CO有效，为132.5。

[0068] 3）验证膜条的临界质控值的有效性。

[0069] 根据实施例1步骤3）的方法，随机选取临床确诊为阳性的新鲜血清、血浆标本62份进行检测。结果：所有阳性样本的灰度值均超过临界质控值，该临界质控值有效。

[0070] 4）临界质控带包被浓度的确定。

[0071] 根据实施例2的方法，计算30个膜条测定的均值（MS）、标准差（SDS）和变异系数（CVS）。结果见下表：

[0072]

[0073] 其中，MS=135.8=1.02×CO；CVS=3.9%<5%，均符合要求。此时的临界质控带的包被浓度为50ng/mL。

[0074] 由PR3、MPO和GMB中选择3个抗原，按照实施例2、实施例3的方法实验10次，得到临界质控带的包被浓度分别为83ng/ml、180ng/mL、300 ng/mL、615 ng/mL 、760 ng/mL 、860 ng/mL 、1.0μg/ml 、2.2g/ml、5μg/ml、13μg/ml。在上述的全部实施例中，实验结果表明，人IgG浓度在50ng~300ng/mL、5μg ~25μg/mL的范围内时，其包被的临界质控带都可以同时用于至少2个抗原条带的比对，但是确定临界质控带的包被浓度需要做实验的次数较多；在300ng~5μg/mL的范围内，实验表明这个浓度范围内确定临界质控带时，所需要的实验次数显著减少，可以较快的确定临界质控带的包被浓度，减少了实验成本并提高了产品的生产效率。

[0075] 在上述的全部实施例中，酶标液、底物和浓缩洗涤孵育液都可以使用现有技术已经公开的方案，酶标液可以优选辣根过氧化物酶标记的羊/鼠/兔抗人IgG抗体。上述血管炎疾病包括魏格纳氏肉芽肿、显微镜下血管炎、肺出血-肾炎综合征、急进性肾小球肾炎和结节性多动脉炎等。所述PR3、MPO和GBM由昆虫细胞sf9表达并纯化制得。本发明具有独创性的临界质控带，将显色条带与临界质控带的颜色的深浅比较即可判断结果：阳性: 颜色比临界质控带相同或深；阴性: 颜色比临界质控带浅。检测的抗体数共3种：PR3、MPO和GMB相应的自身抗体。本发明所使用的抗原绝大多数为重组抗原，且所有的抗原纯度均为98%以上，显著地提高了检测的灵敏度和特异性。

[0076] 上述实施例中所应用到的技术包括：

[0077] 1）抗原鉴定：通过聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定抗原及其纯度应>98%。

[0078] 2）包被：将人IgG和本实施例的3种抗原分别溶解于0. 01-0. 1M的tris缓冲液或HEPES缓冲液，pH7.4，得到浓度为1-100mg/mL溶液。将1-l00ul的上述溶液用全自动点样仪划线于硝酸纤维素膜上，条带宽度为0.5mm-3mm，条带间隔为2mm-20mm。4℃包被24-48个小时。各种抗原的排列顺序可以进行任意调整。

[0079] 3）封闭：用10-100ml的含0.05-0.5%Tween20，0.5-5%BSA, 0.5-5%酪蛋白，0.5-5%的脱脂奶粉，5-10%的蔗糖的0. 01-0.1M的tris缓冲液或HEPES缓冲液，pH7.4，25-37℃封闭3-12小时，用孵育洗涤缓冲液洗涤。晾干后，于2-8℃备用。

[0080] 4）膜条制备：将所制备的硝酸纤维膜固定在载片上，牢固后，用全自动切割机将其切割成为1mm-3mm宽的膜条，分装到膜条盒中。

[0081] 4）酶标液：经典的高碘酸钠氧化法标记辣根过氧化物酶（HRP）到羊/鼠/兔抗人IgG抗体，组分：标记HRP的羊/鼠/兔抗人IgG抗体0.01-0.1%，0.2-2%BSA，0.2-2%蔗糖，Proclin 300 0.01-0.1%，吐温-20 0.01-0.1%，PBS0.01-0.1mol/L。

[0082] 5）孵育洗涤缓冲液：PBS0.01-0.1mol/L，0.2-2%BSA，Proclin 300 0.01-0.1%，吐温-20 0.01-0.1%。孵育洗涤缓冲液有洗涤和孵育两大功能，可用于稀释样本，孵育样本和洗涤膜条。

[0083] 6）底物配制：鲁米诺或其衍生物0.02%-2%，过氧化氢0.002%-0.2%，Proclin 3000.01-0.1%，吐温-20 0.01-0.1%。底物无需终止，膜条显色后用蒸馏水洗涤3次晾干即可，显色长期稳定。

[0084] 7）试剂盒的组装：将膜条盒、孵育洗涤缓冲液、酶标液、底物包装成试剂盒。

[0085] 如上所述，可较好的实施本发明。