人sDR5蛋白或sDR5-Fc抗体融合蛋白作为心肌梗死治疗药物的应用

摘要

本发明属医药领域，具体涉及人sDR5（可溶性死亡受体5，solubleDR5，简称sDR5）蛋白和sDR5-Fc抗体融合蛋白（sDR5-Fc）的药用用途，尤其是人sDR5和sDR5-Fc抗体融合蛋白作为心肌梗死急救和治疗药物的应用。本发明经实验证实，所述的人sDR5蛋白和sDR5-Fc抗体融合蛋白在大鼠心肌缺血模型和缺血-再灌注模型中可明显减少心肌梗死面积，并显著降低心肌细胞凋亡率。本发明作为治疗心肌梗死的新型候选药物，极具开发潜力。？

权利要求

1.人sDR5-Fc抗体融合蛋白在制备治疗心肌梗死药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人sDR5-Fc抗体融合蛋白在制备治疗急性心肌梗死或心肌梗死-再灌注损伤药物中的应用。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述人sDR5-Fc抗体融合蛋白通过阻断TRAIL/DR5通路诱导的细胞凋亡，来减少心肌梗死面积，以达到保护心肌细胞的作用。

说明书

人sDR5蛋白或sDR5-Fc抗体融合蛋白作为心肌梗死治疗药

物的应用

[0001] 技术领域

[0002] 本发明属于医药领域，具体涉及人sDR5（soluble death receptor 5，sDR5）蛋白和sDR5-Fc抗体融合蛋白（sDR5-Fc）的药用用途，尤其是人sDR5蛋白和sDR5-Fc抗体融合蛋白作为心肌梗死急救和治疗药物的应用。

[0003] 背景技术

[0004] 急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是指心肌的缺血性坏死，为在冠状动脉病变的基础上，冠状动脉的血流急剧减少或中断，使相应的心肌出现严重而持久的急性缺血，最终导致心肌的缺血性坏死。

[0005] 急性心肌梗死是严重危害人类健康的心血管急危重症。我国心肌梗死的发病率为50/10万左右，每年死于心肌梗死及其并发症的人数已超过100万，且随着人口老龄化程度的加剧，AMI发病率逐年攀升。另外值得注意的是，AMI发病年龄年轻化趋势也日趋严重。
世界卫生组织有报告指出，即使从现在开始就采取有力的预防措施，我国心血管疾病发病率的上升趋势也将持续到2020年左右。

[0006] 临床研究证明：心肌缺血及缺血-再灌注过程均会造成严重的损伤，引起心肌细胞死亡。目前，临床对于急性心肌梗死的治疗仅包括：1）监护和一般治疗；2）解除疼痛；3）心肌血流再灌注，包括介入（PTA）和溶栓；4）消除心律失常；5）控制休克等在内的对症治疗和血运重建，尚没有直接基于心肌细胞死亡机制的治疗药物，这主要受限于对心肌细胞的死亡机制还不够清楚。所以，对心肌细胞的死亡机制进行深入研究，并在此基础上开发效果好、特异性强、作用快、副作用少的心肌梗死治疗药物迫在眉睫。

[0007] 细胞死亡包括坏死（necrosis）和凋亡（apoptosis），其中坏死曾一度被认为是心肌梗死的主导因素。近年来，凋亡在心肌梗死中的作用日益受到重视。死亡受体5（Death receptor，DR5）与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF－related apoptosis-inducing ligand, TRAIL）结合所激活的死亡受体通路，可通过招募相关蛋白形成DISC（death-inducing signaling complex），进而级联式活化Caspase-8、3等，引起细胞凋亡。全长的DR5是含有411个氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白。可溶性死亡受体5（soluble DR5，sDR5）因缺乏跨膜区域不能在细胞膜上表达而被分泌至细胞外。sDR5在正常人外周血中表达较低，因其具有与TRAIL配体相结合的胞外段完整结构，可与细胞膜上的死亡受体竞争性结合TRAIL分子，从而阻断TRAIL诱导的细胞凋亡。

[0008] 有研究表明：sDR5可通过阻断TRAIL诱导的细胞凋亡来减轻乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的肝细胞损伤（参见：Yu-Gang Liu , Su-Xia Liu , Xiao-Hong Liang et al. Blockade of TRAIL pathway ameliorates HBV-induced hepatocyte apoptosis in an acute hepatitis model. Biochemical and Biophysical Research Communications352 (2007) 329–334）及改善因缺血造成的中枢系统损伤（参见：Min Cui , Limei Wang , Xiaohong Liang et al. Blocking TRAIL-DR5 signaling with soluble DR5 reduces delayed neuronal damage after transient global cerebral ischemia. Neurobiology of Disease 39 (2010) 138–147）。目前，sDR5对于同样因缺血引起的心肌梗死是否存在治疗作用，国内外尚无报道。

[0009] 急性心肌梗死及血运重建后再灌注损伤的发生与心肌细胞的过度凋亡密切相关，针对凋亡发生的信号转导通路，利用sDR5与膜型DR5竞争结合TRAIL，使TRAIL不能启动凋亡程序的发生，这样可减少心肌梗死范围，延长心肌细胞死亡“窗口期”，改善患者长期预后。

[0010] 发明内容

[0011] 本发明目的在于研究人sDR5和sDR5-Fc抗体融合蛋白通过阻断/封闭TRAIL-死亡受体通路来减少心肌细胞凋亡的作用，并进一步提供人sDR5和sDR5-Fc抗体融合蛋白作为心肌梗死治疗药物的应用。

[0012] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0013] 人sDR5蛋白或sDR5-Fc抗体融合蛋白作为心肌梗死治疗药物的应用，尤其是作为急性心肌梗死或心肌梗死-再灌注损伤治疗药物的应用。

[0014] 人sDR5蛋白或sDR5-Fc抗体融合蛋白在制备阻断TRAIL诱导的细胞凋亡药物中的应用。

[0015] 所述人sDR5蛋白或sDR5-Fc抗体融合蛋白通过阻断TRAIL/DR5通路诱导的细胞凋亡，来减少心肌梗死面积，以达到保护心肌细胞的作用。

[0016] 人sDR5蛋白或sDR5-Fc抗体融合蛋白与其它药物在急性心肌梗死中的协同治疗应用。

[0017] 人sDR5蛋白或sDR5-Fc抗体融合蛋白的蛋白序列、序列修饰及相关生物工程产品在制备治疗心肌梗死药物中的应用。

[0018] 本发明利用酵母来源的人sDR5蛋白，在Wistar大鼠心肌梗死模型中测试了人sDR5对心肌梗死的治疗作用，分别获得所述人sDR5能够减少心肌梗死面积、降低心肌细胞凋亡率的结果。实验结果显示：通过单次尾静脉注射，在心肌缺血6h模型中，0.5－2mg/只所述的人sDR5与对照组相比均可明显减少心肌梗死面积，最佳剂量为1.5mg/只，可减少心肌梗死面积50%（见图3）。另外，所述的人sDR5可明显降低缺血模型中心肌细胞凋亡率（见图4）。

[0019] 在心肌缺血72小时模型中，通过多次（1mg/次）尾静脉注射（-5、0、24h、48h，结扎冠脉时间计为0），72h取材，实验结果显示所述的人sDR5与对照组相比可减少心肌梗死面积24%（见图5）；同样的给药方式在心肌缺血-再灌注模型中可减少心肌梗死面积32%（见图6）。

[0020] 另外，本发明利用中国仓鼠卵巢细胞（CHO）来源的人sDR5-Fc抗体融合蛋白在大鼠心肌缺血6小时模型中通过3mg/只单次尾静脉注射，与对照组相比可减少心肌梗死面积42.7%，并且能显著降低缺血模型中心肌细胞凋亡率（见图8、9）。

[0021] 本发明通过动物实验证实，所述的人sDR5和sDR5-Fc抗体融合蛋白能阻断TRAIL/DR5通路诱导的细胞凋亡，减少心肌梗死面积，达到保护心肌细胞的作用，对心肌梗死和心肌梗死-再灌注损伤有治疗作用，作为新型候选药物极具开发潜力和临床应用前景。

[0022] 为了更好地理解本发明的实质及本发明所述人sDR5和sDR5-Fc抗体融合蛋白的作用效果，以下将通过具体的附图和实施例对本发明在制备治疗急性心肌梗死的药物中的应用进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了理解和说明，本领域的技术人员或其他人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对其做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

[0023] 附图说明

[0024] 图1 纯化的人sDR5蛋白对TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡的阻断效应；

[0025] A为纯化前后蛋白考马斯亮蓝染色；B. 200ngTRAIL单独或与1mg人sDR5蛋白同6
时加入5×10Jurkat细胞，24小时后流式细胞术检测细胞凋亡，加入培养基组作为对照；

[0026] 图2 TRAIL和DR5 在大鼠急性心肌梗死中的表达；

[0027] A、B. real-time PCR检测大鼠缺血6小时模型各处理组心肌组织DR5及TRAIL的mRNA水平；C为Western blot检测蛋白表达。MI：myocardial infarction；

[0028] 图3大鼠缺血6小时模型各处理组心肌组织TTC染色及心肌梗死面积统计；

[0029] 其中将心肌梗死PBS处理组梗死面积计为100%，各处理组均为相对梗死面积；下同；

[0030] 图4人sDR5可减少大鼠缺血6小时模型心肌细胞凋亡；

[0031] 图 5 缺血72小时大鼠模型中sDR5对心肌细胞的保护作用；

[0032] 图 6 缺血-再灌注72小时大鼠模型中sDR5对心肌细胞的保护作用；

[0033] IR: Ischemia Reperfusion；

[0034] 图 7 人sDR5-Fc质粒构建及蛋白表达和体外功能检测；

[0035] WCL: whole cell lysis; IP: Immunoprecipitation；

[0036] 图 8 缺血6小时大鼠模型中人sDR5-Fc融合蛋白对心肌细胞的保护作用；

[0037] 图 9人sDR5-Fc可减少大鼠缺血6小时模型心肌细胞凋亡。

[0038] 具体实施方式

[0039] 以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

[0040] 实施例1：

[0041] 人sDR5蛋白的制备 活化含pGAPZαA－sDR5的毕赤酵母GS115菌株（参见：Song K, Chen Y, Goke R, et al. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is an inhibitor of autoimmune inflammation and cell cycle progression. J Exp Med, 2000; 191(7):1095- 1104），挑取转化阳性的酵母菌，30℃培养72小时后收集培养上清，经Eppendorf离心机低温高速离心（4 ℃，8 000 rpm，30 min）后利用His亲和层析柱纯化重组sDR5蛋白。获得纯化的重组人sDR5蛋白，经SDS-PAGE（见图1 A）检测纯度；BCA法测定纯化后的浓度并稀释至1mg/ml；用流式细胞术进行Annexin V 及PI双染检测纯化的人sDR5蛋白对TRAIL诱导人白血病细胞系Jurkat细胞凋亡作用的阻断效应，200ng/ml TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡达80%，人sDR5预处理可基本阻断细胞凋亡（见图 1 B）。

[0042] 转化阳性的毕赤酵母GS115菌株可成功表达分子量大小约为20 kD的sDR5蛋白，纯化后的sDR5蛋白经鉴定，结果显示获得了高纯度的重组人sDR5蛋白，蛋白产量达20 mg/L；经去内毒素和过滤除菌后进行体外活性检测，结果显示纯化的人sDR5蛋白可阻断TRAIL诱导的Jurkat细胞凋亡。最后，将经上述验证后的人sDR5蛋白-80 ℃保存，备用。

[0043] 实施例2：人sDR5蛋白对急性心肌梗死大鼠心肌细胞的保护作用

[0044] （1）急性心肌梗死大鼠动物模型的制备

[0045] 清洁级雄性Wistar 大鼠（体重200－250g），10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3－4ml/kg），气管插管并在打开肋间隙之前接呼吸机，调参数吸呼比1:2，呼吸频率90－120次/分，潮气量2－4ml；胸骨左缘3－4 肋间横行切口，剪开心包，暴露心脏，以肺动脉圆锥与左心耳交界处的左冠状静脉为标志，于左心耳下缘正中约0.1cm 处绕左前降支穿线结扎，同时设假手术组作为对照（只穿线不结扎）。术后常规注射青霉素40万U/只。

[0046] 将进行冠状动脉结扎的大鼠随机分组，分为PBS组、人血清白蛋白组（HSA）和人sDR5组，每组根据剂量不同再分为三小组，每小组6只老鼠，实验均重复三次，具体实验方法及结果叙述如下。

[0047] 在冠状动脉结扎后30min，人sDR5组通过大鼠尾静脉分别注射人sDR5 0.5mg，1mg，1.5mg，2mg；HSA组分别通过尾静脉注射人血清白蛋白0.5mg，1mg，1.5mg，2mg；PBS组则通过尾静脉注射相应剂量的无菌PBS。

[0048] （2）TRAIL和DR5 在大鼠急性心肌梗死中的表达

[0049] 把所用到的耗材和器械进行去RNA酶处理。将新鲜的各处理组大鼠心肌组织置于装有Trizol 的EP管中，剪碎并匀浆，抽提总RNA。经去除基因组DNA和逆转录得到cDNA，然后进行real-time PCR检测TRAIL、DR5 的RNA水平，GAPDH作为内参。

[0050] 与假手术组相比，缺血6小时注射PBS及注射HSA的大鼠心肌组织TRAIL、DR5 的RNA水平明显升高（见图 2A、2B）。

[0051] 将心肌组织进行匀浆，提取总蛋白，用Western blot 检测TRAIL、DR5蛋白表达，得到类似结果（见图 2C）。

[0052] （3）大鼠心肌组织TTC（氯化三苯四唑）染色

[0053] 用水合氯醛将大鼠麻醉，开胸并快速剪下左心室，将取下的组织在预冷的生理盐水中漂洗三次，置-20℃冷冻1小时。染色前从冰箱中取出组织，在锡箔纸上迅速切成1mm厚的切片并置于装有TTC染液的12孔板中，37℃避光孵育15min，然后用组织冲洗应用液（TTC染液试剂盒，南京建成科技有限公司）将组织表面多余的染液冲掉，观察并拍照。

[0054] 与假手术组相比，缺血6小时注射PBS及注射HSA的大鼠心肌出现大面积灰白区（即梗死区），而注射sDR5的大鼠梗死区缩小，其中注射剂量达到1.5mg时梗死面积最小，与对照组相比减少达50%（见图3 A，3B）。

[0055] 心肌梗死面积计算方法：梗死区心肌重量/左心室心肌重量×100%；心肌梗死面积减少率计算方法：（缺血组梗死面积-用药组梗死面积）/缺血组梗死面积×100%。

[0056] 在心肌缺血72小时模型及缺血-再灌注（结扎半小时后打开结扎线）72小时模型中，通过多次（1mg/次）尾静脉注射（-5、0、24、48h，结扎冠脉时间计为0），72h取材，经染色取得与上述类似的结果，其中缺血72小时模型sDR5可减少心肌梗死面积24%；缺血-再灌注72小时模型sDR5可减少心肌梗死面积32%（见图5，6）。

[0057] （4）人sDR5和sDR5-Fc抗体融合蛋白对心肌细胞凋亡的抑制

[0058] 利用TUNEL标记试剂盒（ROCHE），分别将各组大鼠心肌组织石蜡包埋切片进行TUNEL染色，显微镜下观察心肌组织细胞凋亡情况。

[0059] 与假手术组相比，缺血6小时注射PBS及注射HSA的大鼠心肌出现大量凋亡细胞（TUNEL染色胞核呈棕色），而注射人sDR5和sDR5-Fc抗体融合蛋白组大鼠凋亡心肌细胞显著减少（见图4、9）。

[0060] 实施例3：人sDR5-Fc融合蛋白的制备和应用

[0061] 以实施例1中带人sDR5的酵母菌为PCR模板，将DR5胞外段基因序列（133个氨基酸）克隆入带人IgG Fc段的真核表达载体pGS-Fc中，设计引物为：sense（5’-3’）: ggaagcttgccaccATG GAA CAA CGG GGA CAG，antisense（5’-3’）: aagaattcTCT GGT CGT GGT GCA GGG；质粒构建如图7A、7B所示。提取高纯度质粒（OMEGA Plasmid Midi Kit）并调整浓度为500 ng/μl，将质粒瞬时转染293T细胞，48小时后收集上清和细胞，用Protein A/G珠子对上清和细胞裂解液进行吸附，Western blot检测融合蛋白表达（见图7C）。复苏CHO/K1细胞，调整细胞状态至最佳，瞬时电转（300v, 间隔时间0.125s，持续时间0.1ms，电击三次），24小时后收集上清并经亲和层析柱纯化得到人sDR5-Fc抗体融合蛋白。目前本发明融合蛋白产量可达到10mg/L。用纯化后的蛋白进行体外功能验证，检测其是否可以阻断TRAIL诱导的人白血病细胞系Jurkat细胞凋亡，结果显示人sDR5-Fc抗体融合蛋白有很好的阻断效应（见图 7 D）。

[0062] 将上述人sDR5-Fc融合蛋白用于心肌缺血6小时大鼠模型中（方法同人sDR5），经TTC染色发现：与对照组相比，3mg人sDR5-Fc抗体融合蛋白单次注射可减少心肌梗死面积达42.7%，且大鼠凋亡心肌细胞显著减少（见图 8、9）。