转基因棉花多重PCR-DHPLC检测引物及检测方法

摘要

本发明公开了一种转基因棉花的多重PCR-DHPLC检测引物及检测方法，所述引物具有较强的特异性，能够用于PCR扩增以及DHPLC分析。所述检测方法提供了一种操作简便、扩展性能好、灵敏度高的转基因棉花检测方法，实现了转基因棉花的多靶标检测。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，其片段大小区分率可达数个碱基，分辨率高。本发明的引物和检测方法为转基因棉花检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的高通量检测方法，特别适合用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

权利要求

1.用于转基因棉花多重PCR-DHPLC检测的引物，其特征在于：所述引物包括引物对1、引物对2、引物对3和引物对4；

引物对1的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列；

引物对2的上游引物为Seq ID No.3所示序列，下游引物为Seq ID No.4所示序列；

引物对3的上游引物为Seq ID No.5所示序列，下游引物为Seq ID No.6所示序列；

引物对4的上游引物为Seq ID No.7所示序列，下游引物为Seq ID No.8所示序列；

Seq ID No.1：5’-TCCATGCCGCCTCACAAG-3’Seq ID No.2：5’-CCCAGCCCTCCAAAGATT-3’Seq ID No.3：5’-TTGAAATTAAAAACCAATGCCAC-3’Seq ID No.4：5’-GATGTTAGTTTCCCATTCGAGTTT-3’Seq ID No.5：5’-AACGGGCGGAAACCCTTG-3’Seq ID No.6：5’-GCAATTACCTTACTGCCAATAAAGC-3’Seq ID No.7：5’-TGTCATCTATGTTACTAGATCGGGG-3’Seq ID No.8：5’-GCCGAACGCTGTTATCCTCAT-3’。

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：

所述引物对1的上游引物替换为Seq ID No.11所示序列，下游引物替换为Seq ID No.12所示序列；

引物对2的上游引物替换为Seq ID No.13所示序列，下游引物替换为Seq ID No.14所示序列；

引物对3的上游引物替换为Seq ID No.15所示序列，下游引物替换为Seq ID No.16所示序列；

引物对4的上游引物替换为Seq ID No.17所示序列，下游引物替换为Seq ID No.18所示序列；

Seq ID No.11：5’-CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCCATGCCGCCTCACAAG-3’Seq ID No.12：5’-CTCAGCGGCGGAGCTACAGACCCAGCCCTCCAAAGATT-3’Seq ID No.13：5’-CGTGGCCTCGCGATCTGACTTTGAAATTAAAAACCAATGCCAC-3’Seq ID No.14：5’-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGATGTTAGTTTCCCATTCGAGTTT-3’Seq ID No.15：5’-CGTGGCCTCGCGATCTGACTAACGGGCGGAAACCCTTG-3’Seq ID No.16：5’-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGCAATTACCTTACTGCCAATAAAGC-3’Seq ID No.17：5’-CGTGGCCTCGCGATCTGACTTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGG-3’Seq ID No.18：5’-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGCCGAACGCTGTTATCCTCAT-3’。

3.根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于：

所述引物对1为检测棉花内源基因sad Ⅰ基因的引物，

引物对2为检测转基因棉花品系MON531的引物，

引物对3为检测转基因棉花品系MON1445的引物，

引物对4为检测转基因棉花品系MON15985的引物。

4.一种用于转基因棉花多重PCR-DHPLC检测方法，其特征在于：所述检测方法包括采用权利要求1-3任一项所述的引物，以棉花DNA为模板进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行变性高效液相色谱分析。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括以marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对。

说明书

转基因棉花多重PCR-DHPLC检测引物及检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种转基因产品的检测，特别是涉及一种转基因棉花多重PCR-DHPLC检测引物及检测方法。

背景技术

[0002] 目前对转基因棉花的检测方法主要包括常规PCR，实时荧光PCR、PCR-基因芯片等。传统的常规PCR检测方法的扩展性存在一定的局限，随着待检目标的增加，需要对体系中的每套引物的用量及比例重新进行优化，并且兼顾扩增效率等因素，工作量较大；另一方面，通常采用的凝胶电泳分析扩增产物的方法，区分效率不高，检测结果不理想。实时荧光PCR虽然在检测灵敏度等方面较常规PCR检测方法有优势，但是由于目前仪器自身及荧光染料研制的限制，仅能同时提供互不干扰的4个荧光通道，也限制了该技术在检测通量扩展。常规的多套PCR-基因芯片检测方法，需要多套引物进行扩增，操作步骤繁琐，并不适合大规模的高通量检测。变性高效液相色谱技术(Denaturing High-performance Liquid Chromatography，DHPLC)是一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法，分辨率高、扩展性能好、灵敏度高。该技术在50℃条件下分析样品，样品峰的洗脱只由碱基对的数量决定洗脱顺序，当过柱的乙腈浓度提高，核酸片段会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。通过得到的洗脱峰与marker比较确定分子量大小，判定是否含有目标检测基因，分辨率高。目前，尚没有转基棉花的PCR结合DHPLC的检测技术(PCR-DHPLC)。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种用于转基因棉花的多重PCR-DHPLC检测的引物。

[0004] 本发明的另一目的是提供一种基于上述引物的扩展性能好、灵敏度和分辨率高的转基因棉花的PCR-DHPLC检测方法。

[0005] 为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

[0006] 本发明公开了用于转基因棉花的多重PCR-DHPLC检测的引物，其特征在于：所述引物包括引物对1，以及引物对2、引物对3和引物对4中的至少一对引物；引物对1的上游引物含有Seq ID No.1所示序列，下游引物含有Seq ID No.2所示序列；引物对2的上游引物含有Seq ID No.3所示序列，下游引物含有Seq IDNo.4所示序列；引物对3的上游引物含有Seq ID No.5所示序列，下游引物含有Seq ID No.6所示序列；引物对4的上游引物含有Seq ID No.7所示序列，下游引物含有Seq ID No.8所示序列；

[0007] Seq ID No.1：5’-TCCATGCCGCCTCACAAG-3’

[0008] Seq ID No.2：5’-CCCAGCCCTCCAAAGATT-3’

[0009] Seq ID No.3：5’-TTGAAATTAAAAACCAATGCCAC-3’

[0010] Seq ID No.4：5’-GATGTTAGTTTCCCATTCGAGTTT-3’

[0011] Seq ID No.5：5’-AACGGGCGGAAACCCTTG-3’

[0012] Seq ID No.6：5’-GCAATTACCTTACTGCCAATAAAGC-3’

[0013] Seq ID No.7：5’-TGTCATCTATGTTACTAGATCGGGG-3’

[0014] Seq ID No.8：5’-GCCGAACGCTGTTATCCTCAT-3’。

[0015] 需要指出的是，上述Seq ID No.1至Seq ID No.8是与转基因棉花的检测靶标序列互补配对的特异序列，具有很强的特异性识别性。本发明中所述的用于转基因大豆的PCR结合变性高效液相色谱技术检测的引物，在本发明中作为一个不可分割的整体概念，由多对引物对混合而成，具体来说所述引物包括引物对1，以及选自引物对2-4的至少一对引物。其中，各引物对的特异性是本发明所述引物的基础，但本发明所述引物的特异性等其它效果，更重要的还体现在其作为一个整体，其中的各引物对之间的理化特性以及PCR扩增产物之间的统一协调，这也是多重PCR扩增中引物组合配伍的关键与难点。

[0016] 进一步的，所述引物对1-4的上游引物的5’端还包括Seq ID No.9所示序列，所述引物对1-4的下游引物的5’端还包括Seq ID No.10所示序列；

[0017] Seq ID No.9：5’-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’

[0018] Seq ID No.10：5’-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3’。

[0019] 需要指出的是，上述Seq ID No.9和Seq ID No.10是分别在上游引物和下游引物的5’端添加的与检测靶标序列无关的一段序列，该序列可以是与检测靶标序列同源性很远的其它物种的序列，也可以是一段随机生成的序列。该序列可以用于调控PCR扩增产物的大小，以便于PCR扩增产物的进一步分析。

[0020] 本发明中，优选的，所述引物对1的上游引物具有Seq ID No.11所示序列，下游引物具有Seq ID No.12所示序列；引物对2的上游引物具有Seq ID No.13所示序列，下游引物具有Seq ID No.14所示序列；引物对3的上游引物具有SeqID No.15所示序列，下游引物具有Seq ID No.16所示序列；引物对4的上游引物具有Seq ID No.17所示序列，下游引物具有Seq ID No.18所示序列；

[0021] Seq ID No.11：5’-CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCCATGCCGCCTCACAAG-3’[0022] Seq ID No.12：5’-CTCAGCGGCGGAGCTACAGACCCAGCCCTCCAAAGATT-3’[0023] Seq ID No.13：5’-CGTGGCCTCGCGATCTGACTTTGAAATTAAAA CCAATGCCAC-3’[0024] Seq ID No.14：5’-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGATGTTAGTTTCCCATTCGAGTTT-3’[0025] Seq ID No.15：5’-CGTGGCCTCGCGATCTGACTAACGGGCGGAAACCCTTG-3’[0026] Seq ID No.16：5’-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGCAATTACCTTACTGCCAATAAAGC-3’[0027] Seq ID No.17：5’-CGTGGCCTCGCGATCTGACTTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGG--3’[0028] Seq ID No.18：5’-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGCCGAACGCTGTTATCCTCAT-3’。

[0029] 需要说明的是，所述Seq ID No.11至Seq ID No.18序列是由上述Seq IDNo.1至Seq ID No.8序列分别在其5’端添加调控序列而成，尽管上述已经说明Seq ID No.9和Seq ID No.10所示调控序列可以是随机生成的序列，但是，并不是任意序列都可以添加，具体到本发明中，需要考虑调控序列与Seq ID No.1至Seq ID No.8所示序列的理化性质的统一协调，并且还需要考虑添加调控序列后的Seq ID No.11至Seq ID No.18所示序列作为检测引物的整体性能。

[0030] 本发明中，更优选的，所述引物对1为检测棉花内源基因sad I基因的引物，引物对2为检测转基因棉花品系MON531的引物，引物对3为检测转基因棉花品系MON1445的引物，引物对4为检测转基因棉花品系MON15985的引物。

[0031] 本发明还公开了一种用于转基因棉花多重PCR-DHPLC检测方法，所述检测方法包括采用上述的引物对1，以及选自上述引物对2、引物对3和引物对4中的至少一对引物，组成的引物混合物，以棉花DNA为模板进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行变性高效液相色谱分析。

[0032] 进一步的，所述检测方法还包括以marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对。

[0033] 优选的上述检测方法包括如下步骤：

[0034] (A)采用上述引物对1，以及选自上述引物对2、引物对3和引物对4中的至少一对引物，以棉花DNA为模板，进行PCR扩增；

[0035] (B)以步骤(A)的PCR扩增产物为样品进行DHPLC分析，同时以marker为参考标准进行DHPLC分析；

[0036] (C)将步骤(B)中样品的DHPLC分析结果与marker的DHPLC分析结果进行比较，确定样品的分子量大小，从而判断是否含有检测的靶标序列。

[0037] 由于采用以上技术方案，本发明的有益效果在于：

[0038] 本发明的转基因棉花检测引物具有较强的特异性，能够用于后续的PCR扩增以及DHPLC分析。本发明将PCR与DHPLC相结合，提供了一种操作简便、扩展性能好、灵敏度和分辨率高的转基因棉花检测方法，实现了转基因棉花的多靶标检测。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，对不同大小的PCR产物片段区分率可达数个碱基，碱基分辨率高。本发明的引物和检测方法为转基因棉花检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的高通量检测方法，特别适合用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

附图说明

[0039] 图1至图3为本发明实施例中DHPLC分析的部分结果，其中W为水对照，1为转基因棉花LLcotton25、2为非转基因棉花、3为转基因棉花MON1445、4为转基因棉花MON531、5为转基因棉花MON15985、6为转基因棉花MON531和MON1445的混合样品、7为转基因棉花MON1445、MON531和MON15985的混合样品、8为转基因棉花GHB614、9-14为阴性对照，分别为玉米MON810、玉米、大豆、油菜、水稻、马铃薯的DNA；marker-puc为puc18 marker，marker的各峰值从左至右依次为80bp、102bp、174bp、257bp、267bp、296bp、434bp、458bp、587bp。

具体实施方式

[0040] 本发明公布了用于转基因棉花多重PCR-DHPLC检测的引物，该引物分别针对转基因棉花的内源基因和转基因棉花品系的特异序列进行设计。包括引物对1，以及引物对2、引物对3、引物对4中的至少一个。进一步的，还在引物对1-4的上游和下游分别添加了一段与检测靶标序列无关或者同源性很远的调控序列，用于实现对扩增产物的片段大小的调控。需要指出的是，在上述检测引物已经保证了检测的特异性和稳定性，可以实现对转基因棉花的多重检测分析，调控序列的加入只是为了获得更优异的检测效果，因此，本发明优选的，用于转基因棉花的PCR结合DHPLC技术检测的4对引物是加入了调控序列的引物，分别具有Seq ID No.11至Seq ID No.18所示序列。还需要指出的是，本发明所述引物对1是针对棉花内源基因sad I基因设计的引物，用于检测样品中是否含有棉花成分；引物对2是针对棉花品系MON531设计的引物，用于检测是否含有转基因棉花MON531品系；引物对3是针对棉花品系MON1445设计的引物，用于检测是否含有转基因棉花MON1445品系；引物对4是针对棉花品系MON15985设计的引物，用于检测是否含有转基因棉花MON15985品系。

[0041] 本发明还公开了一种用于转基因棉花多重PCR-DHPLC检测方法，所述检测方法包括采用多重引物，以棉花DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行变性高效液相色谱分析；所述上述引物进行PCR检测，并利用DHPLC对PCR产物进行分析。进一步的，所述检测方法还包括以marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对，根据比对结果判断PCR扩增产物的大小，从而判断是否含有检测的靶标序列。本发明中，引物对1扩增产物的DHPLC洗脱峰为89bp，表示样品中含有棉花成分；引物对2扩增产物的DHPLC洗脱峰为133bp，表示样品中含有转基因棉花MON531；引物对3扩增产物的DHPLC洗脱峰为194bp，表示样品中含有转基因棉花MON1445；引物对4扩增产物的DHPLC洗脱峰为206bp，表示样品中含有转基因棉花MON15985。

[0042] 下面通过具体实验例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实验例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。

[0043] 实施例1DNA提取

[0044] 采用CTAB法提取样品DNA，具体如下：

[0045] a)称取样品5g，在研钵中加入液氮研磨至样品呈0.5mm左右大小的粉末；

[0046] b)称取300mg磨碎的样品，迅速转入2mL离心管中，加65℃预热的CTAB提取液700μL，混匀，放入65℃水浴锅中水浴30min；

[0047] c)加5μL RNase(10mg/mL)，37℃水浴30min；

[0048] d)加入等体积Tris饱和酚，充分混匀，12000r/min离心15min；

[0049] e)取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)混匀，12000r/min离心15min；

[0050] f)取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)混匀，12000r/min离心15min；

[0051] g)加入等体积预冷的异丙醇，轻轻摇晃，置于-20℃冰箱静置30min，12000r/min离心15min；

[0052] h)弃上清，加70％乙醇500μL，12000r/min离心3min，去上清，重复2次；

[0053] i)得到DNA沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加入50μL～100μL TE或无菌去离子水，充分溶解后，测量DNA的纯度和浓度后置于-20℃冰箱中保存。

[0054] 实施例2DNA浓度测定

[0055] 对提取的样品DNA进行浓度和纯度测定；采用紫外分光光度计测定260nm和280nm处吸收值，分别计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：

[0056] DNA纯度＝OD260/OD280

[0057] DNA浓度＝50×OD260mg/mL

[0058] DNA的纯度比值在1.7～1.9之间，浓度大于10ng/μL。

[0059] 实施例3PCR扩增

[0060] 根据sad I基因、转基因品系MON531和MON15985设计特异性检测引物的结合位点，根据转基因品系MON1445设计品系的特异性引物结合位点，并在上述的引物结合位点的5’端添加调控序列，合成含有调控序列的检测引物对(表1)。

[0061] 表1转基因棉花检测引物结合位点及引物

[0062]

[0063] PCR反应体系总体积为50μL，各成分分别为：多重PCR反应混合液Multiplex PCR Mix(TaKaRa)25μL，10μmol/L引物各1μL，DNA 2μL，5U/μL Taq酶0.25μL，用灭菌双蒸水补足为50μL。

[0064] PCR反应条件：94℃变性1min；然后进入35个循环，94℃30s，57℃1min，72℃1min；循环结束后72℃延伸10min。

[0065] 实施例4DHPLC检测

[0066] 将PCR产物置于DHPLC的自动进样平台上；打开DHPLC控制软件Navigator，在检测方法中选择Multiplex，即多片段分析，同时设定检测上限为600bp，下限为70bp；运行两个blank，即空针，平衡色谱柱；运行一个marker，用于参考对照，检测样品的核酸片段大小；依次对待测样本进行分析，部分结果见图1-3。

[0067] 结果判断：观察DHPLC得到的洗脱峰，通过与marker比对及WAVE 4500自动分析确定洗脱峰位置的DNA片段大小，据此进行判断。

[0068] 洗脱峰89bp，为引物对1的扩增产物，即用于判定样本中含有棉花成分的sad I基因；洗脱峰133bp，为引物对2的扩增产物，即用于判定样品中含有转基因棉花MON531；洗脱峰194bp，为引物对3的扩增产物，即用于判定样品中含有转基因棉花MON1445；洗脱峰206bp，为引物对4的扩增产物，即用于判定样品中含有转基因棉花MON15985。

[0069] 对含有所有转基因品系的棉花样本的分析显示，该样本既含有棉花内源基因的洗脱峰和三个转基因品系的洗脱峰(图3样本7)，包括89bp的内源基因，133bp的MON531品系，194bp的MON1445品系，206bp的MON15985品系；对非转基因棉花或者不含上述品系的转基因棉花的样本分析显示，该样本只有一个洗脱峰，即内源基因的89bp的洗脱峰(图1样本1和图3样本8为其它转基因棉花，图2样本2为非转基因棉花)；空白对照以及其它非转基因样品无洗脱峰(图1-3样本9-14)。

[0070] 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。