一种荆芥内酯氟苯甲酸酯及其制备工艺和用途转让专利
申请号 : CN201210508922.4
文献号 : CN102964321B
文献日 : 2014-11-19
发明人 : 丁安伟 , 张丽 , 李念光 , 包贝华 , 陈佩东 , 曹雨诞
申请人 : 南京中医药大学
摘要 :
本发明公开了一种荆芥内酯氟苯甲酸酯及其制备工艺和用途，荆芥内酯氟苯甲酸酯，其特征是分子式为C17H17FO4，熔点为158-160℃，其比旋度为(c 1.0,CH3OH)，本发明还公开了它的提取方法，以及在制备抗流感病毒药物中的应用。
权利要求 :
1.荆芥内酯氟苯甲酸酯在制备抗H3N2流感病毒药物中的应用，其特征在于荆芥内酯氟苯甲酸酯，具有如下结构：制备方法包括如下步骤：
A.取荆芥内酯，间氟苯甲酸和4-二甲氨基吡啶适量,此三种物质物质的量比例为
0.5～1.5:1.5～2.5:0.5～1.5，置于反应容器中，加入二氯甲烷，搅拌使其完全溶解，加入N,N'-二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，此两种物质物质的量是荆芥内酯的1.5～2.5倍，于室温反应，TLC检验反应终点，得反应液；
B.将A步骤所得反应液，滴加甲醇使溶液澄清，加入硅胶，减压蒸馏溶剂至干，得硅胶混合样；
C.将B步骤所得硅胶混合样装柱进行柱层析，用体积配比为4～7:1的石油醚-乙酸乙酯进行洗脱，收集含有荆芥内酯氟苯甲酸酯的流份，合并后减压回收洗脱液，可得荆芥内酯氟苯甲酸酯白色结晶性粉末。
2.如权利要求1所述的荆芥内酯氟苯甲酸酯在制备抗H3N2流感病毒药物中的应用，其特征是制备方法步骤A中荆芥内酯，间氟苯甲酸和4-二甲氨基吡啶三种物质物质的量比例为1:2:1；加入的N,N'-二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，此两种物质物质的量是荆芥内酯的2倍；步骤C中石油醚-乙酸乙酯的体积配比为5:1。
说明书 :
一种荆芥内酯氟苯甲酸酯及其制备工艺和用途
技术领域
[0001] 本发明涉及一种荆芥内酯氟苯甲酸酯及其制备工艺和用途，属于药物制剂技术领域。
背景技术
[0002] 荆芥内酯（C10H14O3）为由中药材荆芥中提取而得的一种单萜内酯，为无色粒晶（乙酸乙酯），mp:188～189℃。TLC显红色（10%硫酸乙醇），分子式为C10H14O3，其结构式为[0003] 中国专利CN01108186.4披露了荆芥内酯的结构图谱及其用途，其可以用来制备抗感冒药物、消炎药物、抗菌药物、镇痛剂等，中国专利CN201010217622.1披露了荆芥内酯的一种改进制备工艺，使得荆芥内酯的制备操作简化、得率提高、生产成本降低。但荆芥内酯在体外对流感病毒作用力较弱，为了获得更强抗流感病毒作用的药物，拟通过结构改造，以获得具有更强体外抗流感病活性的荆芥内酯衍生物。但迄今为止，尚未有报道由荆芥内酯经氟苯甲酸酯化后得到荆芥内酯氟苯甲酸酯。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种由荆芥内酯经氟苯甲酸酯化后得到荆芥内酯氟苯甲酸酯以及它的制备方法和作为药物的用途。
[0005] 本发明的技术方案如下述
[0006] 荆芥内酯氟苯甲酸酯，其特征是分子式为C17H17FO4，熔点为158-160℃，其比旋度为＝＋13.2°(c 1.0,CH3OH)，它的结构式如下所示，本发明人暂命名为荆芥内酯氟苯甲酸酯：
[0007]
[0008] 本发明的荆芥内酯氟苯甲酸酯制备方法包括如下步骤：
[0009] A.取荆芥内酯，间氟苯甲酸和4-二甲氨基吡啶（英文缩写为DMAP）适量,此三种物质物质的量比例为0.5～1.5:1.5～2.5:0.5～1.5，置于反应容器中，加入二氯甲烷，搅拌使其完全溶解，加入N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（英文缩写为EDCI），此两种物质物质的量是荆芥内酯的1.5～2.5倍，于室温反应，TLC检验反应终点，得反应液；
[0010] B.将A步骤所得反应液，滴加甲醇使溶液澄清，加入硅胶，减压蒸馏溶剂至干，得硅胶混合样；
[0011] C.将B步骤所得硅胶混合样装柱进行柱层析，用体积配比为4～7:1的石油醚-乙酸乙酯进行洗脱，收集含有荆芥内酯氟苯甲酸酯的流份，合并后减压回收洗脱液，可得荆芥内酯氟苯甲酸酯白色结晶性粉末。
[0012] 上述步骤A中荆芥内酯氟苯甲酸酯的制备方法，荆芥内酯，间氟苯甲酸和4-二甲氨基吡啶三种物质物质的量比例为1:2:1；加入的N,N'-二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，此两种物质物质的量是荆芥内酯的2倍；步骤C中石油醚-乙酸乙酯的体积配比为5:1。
[0013] 荆芥内酯氟苯甲酸酯的体外抗流感病毒药效学试验表明，它具有较好的抗H3N2活性，因此可用于制备抗流感病毒药物。
[0014] 本发明的荆芥内酯氟苯甲酸酯是一种新的薄荷烷型单萜类化合物，结构简单，制备方法简便价廉，且具有较强的生理活性。
附图说明
[0015] 图1是化合物荆芥内酯氟苯甲酸酯的紫外光谱图，λmax(CH3OH):227.6nm，提示化合物具有共轭吸收特征。
[0016] 图2是化合物荆芥内酯氟苯甲酸酯的HPLC纯度图谱，归一化法进行计算得荆芥内酯对溴苯甲酸酯纯度为96.2%。
具体实施方式
[0017] 以下通过实施例形式，对本发明涉及的荆芥内酯氟苯甲酸酯及其制备方法作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0018] 实施例1：称取荆芥内酯（照中国专利CN201010217622.1披露的方法，采用唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.花穗以水蒸气蒸馏法提取所得的市售荆芥挥发油经氧化制备而得，纯度98%以上）18.2mg(0.10mmol)，间氟苯甲酸35.1mg(0.25mmol，国产AR级)，DMAP 12.3mg(0.10mmol，国产AR级)，将其置于50mL圆底烧瓶中，加入4mL二氯甲烷（国产AR级），搅拌使其完全溶解，加入DCC 51.6mg(0.25mmol，国产AR级)，于室温（20-25℃）反应，TLC检验反应终点。反应结束后，滴加甲醇（国产AR级）使溶液澄清，加入三倍量硅胶（青岛海洋化工厂出品，柱层析用）约500mg，减压蒸馏溶剂至干。称取5g硅胶装柱，洗脱剂(石油醚(60-90℃，国产AR级):乙酸乙酯（国产AR级）=5:1)洗脱，洗脱40mL左右时，TLC跟踪可发现目标化合物荆芥内酯氟苯甲酸酯，此时收集洗脱液，每5mL收集一次，约30mL左右时TLC跟踪发现目标化合物已基本完全洗脱，合并洗脱液，减压回收洗脱液，可得荆芥内酯氟苯甲酸酯白色结晶性粉末，纯度为96%以上，收率87%。
[0019] 实施例2：
[0020] 实施例1制备得到的荆芥内酯氟苯甲酸酯结构解析：
[0021] HR-ES IMS：m/z 305.1454[M+H]+(计算值C17H17FO4为：304.3123);(c 1.0,CH3OH)。
-1
-1
[0022] IR(KBr压片，cm ):3070（vФ-H）；2931,2848（饱和环烃vCH）；1704（内酯羰基vC＝O）；1655（共轭羰基vC＝O）；1606,1551，1505,1454（共轭苯环vC＝C）；899,795,691（苯环间位取代γФ-H）。
[0023] UV(CH3OH)λmax:227.6nm，提示化合物具有共轭吸收特征。见附图1[0024] H1-NMR(300MHz,CDCl3,ppm):δ1.04(d,3H,J=6.6Hz,6’-CH3),1.07(dd,1H,J=4.2,13.2Hz,5a-H),1.29(m,1H,4a-H),1.91(s,3H,3’-H),1.94-2.03(m,2H,5b-H,6-H),2.23(m,1H,4b-H),2.78-2.87(m,2H,7H),7.28-7.79(m,4H,Ar-H)。
[0025] 13C-NMR(75MHz,CDCl3,ppm):δ171.3(C-8),164.1(C-7’),162.6(C-3),160.8(C-1’),132.3,130.2(C-2’,C-6’),127.8,125.5(C-3’,C-5’),123.3(C-4’),116.7(C-7),104.5(C-4),45.1(C-5),34.5(C-1),28.9(C6),24.3(C-2),20.9(C-10),8.3(C-9)。
[0026] 荆芥内酯氟苯甲酸酯纯度：利用HPLC法进行检测，荆芥内酯氟苯甲酸酯峰面积为7802336，杂质总峰面积为306852，采用归一化法进行计算得荆芥内酯氟苯甲酸酯纯度为
96.2%。见附图2
96.2%。见附图2
[0027] 实施例3：称取荆芥内酯（照中国专利CN201010217622.1披露的方法，采用唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.花穗以水蒸气蒸馏法提取所得的市售荆芥挥发油经氧化制备而得，纯度98%以上）18.2mg(0.10mmol)，间氟苯甲酸35.1mg(0.25mmol，国产AR级)，DMAP 12.3mg(0.10mmol，国产AR级)，将其置于50mL圆底烧瓶中，加入4mL二氯甲烷（国产AR级），搅拌使其完全溶解，加入EDCI 46mg(0.24mmol，国产AR级)，于室温（20-25℃）反应，TLC检验反应终点。反应结束后，滴加甲醇（国产AR级）使溶液澄清，加入三倍量硅胶（青岛海洋化工厂出品，柱层析用）约500mg，减压蒸馏溶剂至干。称取5g硅胶装柱，洗脱剂(石油醚(60-90℃，国产AR级):乙酸乙酯（国产AR级）=5:1)洗脱，洗脱40mL左右时，TLC跟踪可发现目标化合物荆芥内酯氟苯甲酸酯，此时收集洗脱液，每5mL收集一次，约30mL左右时TLC跟踪发现目标化合物已基本完全洗脱，合并洗脱液，减压回收洗脱液，可得荆芥内酯氟苯甲酸酯白色结晶性粉末，纯度为97%以上，收率84%。
[0028] 实施例4：称取荆芥内酯（照中国专利CN201010217622.1披露的方法，采用唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.花穗以水蒸气蒸馏法提取所得的市售荆芥挥发油经氧化制备而得，纯度98%以上）24.3mg(0.15mmol)，间氟苯甲酸44.8mg(0.32mmol，国产AR级)，DMAP18.5mg(0.15mmol，国产AR级)，将其置于50mL圆底烧瓶中，加入4mL二氯甲烷（国产AR级），搅拌使其完全溶解，加入DCC 66.1mg(0.32mmol，国产AR级)，于室温（20-25℃）反应，TLC检验反应终点。反应结束后，滴加甲醇（国产AR级）使溶液澄清，加入三倍量硅胶（青岛海洋化工厂出品，柱层析用）约550mg，减压蒸馏溶剂至干。称取5g硅胶装柱，洗脱剂(石油醚(60-90℃，国产AR级):乙酸乙酯（国产AR级）=6:1)洗脱，洗脱45mL左右时，TLC跟踪可发现目标化合物荆芥内酯氟苯甲酸酯，此时收集洗脱液，每5mL收集一次，约35mL左右时TLC跟踪发现目标化合物已基本完全洗脱，合并洗脱液，减压回收洗脱液，可得荆芥内酯氟苯甲酸酯白色结晶性粉末，纯度为97%以上，收率88%。
[0029] 实施例5：称取荆芥内酯（照中国专利CN201010217622.1披露的方法，采用唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.花穗以水蒸气蒸馏法提取所得的市售荆芥挥发油经氧化制备而得，纯度98%以上）24.3mg(0.15mmol)，间氟苯甲酸44.8mg(0.32mmol，国产AR级)，DMAP 18.5mg(0.15mmol，国产AR级)，将其置于50mL圆底烧瓶中，加入4mL二氯甲烷（国产AR级），搅拌使其完全溶解，加入EDCI61.3mg(0.32mmol，国产AR级)，于室温（20-25℃）反应，TLC检验反应终点。反应结束后，滴加甲醇（国产AR级）使溶液澄清，加入三倍量硅胶（青岛海洋化工厂出品，柱层析用）约550mg，减压蒸馏溶剂至干。称取5g硅胶装柱，洗脱剂(石油醚(60-90℃，国产AR级):乙酸乙酯（国产AR级）=6:1)洗脱，洗脱45mL左右时，TLC跟踪可发现目标化合物荆芥内酯氟苯甲酸酯，此时收集洗脱液，每5mL收集一次，约35mL左右时TLC跟踪发现目标化合物已基本完全洗脱，合并洗脱液，减压回收洗脱液，可得荆芥内酯氟苯甲酸酯白色结晶性粉末，纯度为97%以上，收率83%。
[0030] 实施例6：称取荆芥内酯（照中国专利CN201010217622.1披露的方法，采用唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.花穗以水蒸气蒸馏法提取所得的市售荆芥挥发油经氧化制备而得，纯度98%以上）36.5mg(0.20mmol)，间氟苯甲酸53.2mg(0.38mmol，国产AR级)，DMAP 24.5mg(0.20mmol，国产AR级)，将其置于50mL圆底烧瓶中，加入5mL二氯甲烷（国产AR级），搅拌使其完全溶解，加入DCC 78.5mg(0.38mmol，国产AR级)，于室温（20-25℃）反应，TLC检验反应终点。反应结束后，滴加甲醇（国产AR级）使溶液澄清，加入三倍量硅胶（青岛海洋化工厂出品，柱层析用）约600mg，减压蒸馏溶剂至干。称取6g硅胶装柱，洗脱剂(石油醚(60-90℃，国产AR级):乙酸乙酯（国产AR级）=7:1)洗脱，洗脱50mL左右时，TLC跟踪可发现目标化合物荆芥内酯氟苯甲酸酯，此时收集洗脱液，每5mL收集一次，约40mL左右时TLC跟踪发现目标化合物已基本完全洗脱，合并洗脱液，减压回收洗脱液，可得荆芥内酯氟苯甲酸酯白色结晶性粉末，纯度为97%以上，收率86%。
[0031] 实施例7：称取荆芥内酯（照中国专利CN201010217622.1披露的方法，采用唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.花穗以水蒸气蒸馏法提取所得的市售荆芥挥发油经氧化制备而得，纯度98%以上）36.5mg(0.20mmol)，间氟苯甲酸53.2mg(0.38mmol，国产AR级)，DMAP 24.5mg(0.20mmol，国产AR级)，将其置于50mL圆底烧瓶中，加入5mL二氯甲烷（国产AR级），搅拌使其完全溶解，加入EDCI 72.8mg(0.38mmol，国产AR级)，于室温（20-25℃）反应，TLC检验反应终点。反应结束后，滴加甲醇（国产AR级）使溶液澄清，加入三倍量硅胶（青岛海洋化工厂出品，柱层析用）约600mg，减压蒸馏溶剂至干。称取6g硅胶装柱，洗脱剂(石油醚(60-90℃，国产AR级):乙酸乙酯（国产AR级）=7:1)洗脱，洗脱50mL左右时，TLC跟踪可发现目标化合物荆芥内酯氟苯甲酸酯，此时收集洗脱液，每5mL收集一次，约40mL左右时TLC跟踪发现目标化合物已基本完全洗脱，合并洗脱液，减压回收洗脱液，可得荆芥内酯氟苯甲酸酯白色结晶性粉末，纯度为97%以上，收率85%。
[0032] 实施例8荆芥内酯氟苯甲酸酯的抗H3N2病毒作用
[0033] 1病毒滴度(TCID50)的测定
[0034] 1.1流感病毒的制备
[0035] 利用鸡胚尿囊腔接种法制备流感病毒，收获尿囊液，通过红细胞凝集试验测定病毒的存在，分装后-70℃冻存。
[0036] 1.2病毒的稀释
[0037] 取一管冻存病毒尿囊液，1:10稀释。
[0038] 第一排孔加入146μL 1:10稀释过的病毒液，然后做系列对数稀释，使之成为-1 -2 -3 -1010 、10 、10 、…10 。每孔含有100μL病毒液，每个稀释度接种一纵排共8孔。
[0039] 1.3MDCK细胞的准备及病毒滴度的测定
[0040] 使用前2天将MDCK细胞1:10传代，使之70%～90%成片，弃去细胞培养液，用2
5mLEDTA-胰酶洗细胞一次，然后弃去。将4mL-5mL EDTA胰酶覆盖细（162cm 的细胞培养瓶）37℃培养箱中消化10min～20min。待细胞开始脱落时，加5mL～10mL MDCK细胞培养液，吹打分散细胞并将细胞转入离心管，2000r/min离心5min，用PBS洗涤2次，以除去牛血清。将细胞悬浮于1mL病毒稀释液中，用吸管充分吹打分散细胞，加病毒稀释液至10mL，用
5
细胞计数板计数细胞数量。用病毒稀释液将细胞稀释成1.5×10 细胞/mL，加100μL细
4
胞（1.5×10/孔）于稀释好病毒的微量细胞培养板中。设正常细胞对照作两纵排，在37℃，
5%CO2孵箱中培养，观察7天并记录结果。
5mLEDTA-胰酶洗细胞一次，然后弃去。将4mL-5mL EDTA胰酶覆盖细（162cm 的细胞培养瓶）37℃培养箱中消化10min～20min。待细胞开始脱落时，加5mL～10mL MDCK细胞培养液，吹打分散细胞并将细胞转入离心管，2000r/min离心5min，用PBS洗涤2次，以除去牛血清。将细胞悬浮于1mL病毒稀释液中，用吸管充分吹打分散细胞，加病毒稀释液至10mL，用
5
细胞计数板计数细胞数量。用病毒稀释液将细胞稀释成1.5×10 细胞/mL，加100μL细
4
胞（1.5×10/孔）于稀释好病毒的微量细胞培养板中。设正常细胞对照作两纵排，在37℃，
5%CO2孵箱中培养，观察7天并记录结果。
[0041] 按Reed-Muench两氏法计算TCID50
[0042] 2样品细胞毒性实验
[0043] 2.1样品浓度的配制
[0044] 按上述实施例1方法制备样品，首先用二甲亚砜配制成20mg/mL。然后用MDCK细胞维持液（即不含血清的细胞培养液）分别稀释为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.562μg/mL。
[0045] 2.2毒性测试
[0046] MDCK细胞在96孔培养板单层培养37℃，5%CO2培养24小时，吸弃上清液，分别加入不同浓度药液，4孔，每孔加药液100μL。经72小时观察细胞形态，计算药物致细胞半数毒性TC50。
[0047] 3细胞病变抑制试验
[0048] MDCK细胞在96孔培养板单层培养37℃，5%CO2培养24小时，吸弃上清液，细胞经稀释液洗涤，每孔加入洗涤液100μL，吸弃洗涤液，加入30TCID50病毒液，37℃，5%CO2吸附2小时，吸去病毒，加入最大无毒浓度下药液，4孔，每孔加药100μL。经37℃，5%CO2培养72小时，观察CPE（病变），设细胞对照组，病毒对照组，阳性对照组（利巴韦林）及药物组，同时观察CPE，计算IC50(半数有效抑制浓度）及治疗指数TI值。
[0049] 4结果
[0050] 化合物荆芥内酯氟苯甲酸酯表现出较好的抗H3N2活性，IC50为10.53μg/mL，TC50为29.33μg/mL，TI为2.78。同样条件下，荆芥内酯未表现出较好的抗H3N2活性，因此，荆芥内酯氟苯甲酸酯在体外有显著优于荆芥内酯的抗H3N2活性。见表1。
[0051] 表1荆芥内酯氟苯甲酸酯体外抗H3N2活性
[0052]
[0053] 注：“-”表示样品在TC50浓度下时未见对病毒的抑制或不予检测。
[0054] TI=TC50/IC50。