检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒及多肽配体转让专利
申请号 : CN201210483295.3
文献号 : CN102964428B
文献日 : 2014-12-17
发明人 : 段旭 , 焦守恕 , 李全
申请人 : 同昕生物技术(北京)有限公司
摘要 :
本发明公开了检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒及多肽配体。本发明所提供的多肽配体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。本发明所提供的检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含序列表中序列1所示的多肽配体。本发明所提供的试剂盒较Bender MedSystems sCD40L ELISA试剂盒具有更好的灵敏度和特异性，其对ACS的临床诊断及病情监测具有重要的应用价值。本发明的试剂盒采用的是化学发光免疫分析技术，比ELISA具有更高的检测灵敏度，安全可靠，操作简便，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，为临床心脑血管病特别是ACS临床诊断及病情监测提供了一种新的检测产品。
权利要求 :
1.一种多肽配体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。
2.一种检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的多肽配体。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记的sCD40L单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括已知浓度的重组全长CD40L抗原稀释液作为标准品。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括鲁米诺作为化学发光体系的底物，对碘苯酚作为发光增强剂。
6.权利要求1所述的多肽配体在制备检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒中的应用。
说明书 :
检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒及多肽配体
技术领域
[0001] 本发明涉及生物检测领域，尤其涉及检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒及多肽配体。
背景技术
[0002] 近年研究提示炎症与免疫在动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）的发生、发展中起重要作用，提示动脉粥样硬化可能是一种慢性炎症性疾病。研究发现，白细胞分化抗原40（CD40）信号通路参与了动脉粥样硬化斑块内主要细胞成分（血管内皮细胞、血管平滑肌细胞以及巨噬细胞）的炎症反应的调节，参与了动脉粥样硬化的发生和发展。存在于动脉粥样硬化斑块内的细胞通过CD40-CD40配体相互作用，导致自身活化，表达和分泌有利于免疫应答发生、炎症反应、血凝和血栓形成的蛋白质细胞因子，而最终导致粥样硬化斑块病变的恶化。CD40配体（CD40L）可激活在动脉粥样硬化斑块中的关键性细胞成分，如黏附分子、细胞因子、基质金属蛋白酶（MMPs）、组织因子等的产生，导致斑块的不稳定和破裂。在AS的免疫反应调节中CD40-CD40配体的相互作用非常重要，它们的相互作用显著影响AS相关细胞的功能，并且与斑块的发生发展密切相关。
[0003] CD40L也称Pg39、CD154，由261个氨基酸组成的Ⅱ型跨膜蛋白，其三维结构类似于+肿瘤坏死因子α（TNF-α），属于TNF家族细胞因子。主要表达于活化的CD4T细胞表面。
近年发现，除了T细胞，CD40L还表达于B细胞、自然杀伤细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞以及非造血系统起源的内皮细胞等。血小板在激活中表达CD40L，并在激活后数分钟至数小时降解为可溶性白细胞分化抗原40配体（sCD40L）。sCD40L可通过促进血小板-单核细胞聚集和产生活性氧自由基维持炎症反应，其在动脉粥样斑块形成过程中的作用目前已经在研究中证实，急性冠状动脉综合症（ACS）病人的sCD40L值较正常人又明显升高，这预示着sCD40L水平对ACS临床诊断及病情监测具有一定意义。
近年发现，除了T细胞，CD40L还表达于B细胞、自然杀伤细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞以及非造血系统起源的内皮细胞等。血小板在激活中表达CD40L，并在激活后数分钟至数小时降解为可溶性白细胞分化抗原40配体（sCD40L）。sCD40L可通过促进血小板-单核细胞聚集和产生活性氧自由基维持炎症反应，其在动脉粥样斑块形成过程中的作用目前已经在研究中证实，急性冠状动脉综合症（ACS）病人的sCD40L值较正常人又明显升高，这预示着sCD40L水平对ACS临床诊断及病情监测具有一定意义。
发明内容
[0004] 本发明的一个目的是提供一种多肽配体。
[0005] 本发明所提供的多肽配体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。
[0006] 本发明的另一个目的是提供一种检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒。
[0007] 本发明所提供的检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含所述的多肽配体。
[0008] 所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记的sCD40L单克隆抗体。
[0009] 所述试剂盒还包括已知浓度的重组全长CD40L抗原稀释液作为标准品。
[0010] 所述试剂盒还包括鲁米诺作为化学发光体系的底物，对碘苯酚作为发光增强剂。
[0011] 本发明的又一个目的是提供一种检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒的制备方法。
[0012] 本发明所提供的检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[0013] 将所述多肽配体按终浓度0.5μg/ml、1.0μg/ml或2.0μg/ml加入到20mmol pH4.0醋酸盐缓冲液或20mmol pH7.4磷酸盐缓冲液或50mmol pH9.6碳酸盐缓冲液中混匀后，加入化学发光板内，每孔100μl，4℃温浴16-22小时，弃去孔内液体后加入含有牛血清白蛋白或胎牛血清的20mmol pH7.4的磷酸盐缓冲液120μl，37℃下静置2小时后，弃去孔内液体，干燥发光板，得到包被多肽配体的板条。
[0014] 所述方法还包括以下步骤：将sCD40L单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记。
[0015] 所述方法还包括以下步骤：将重组全长CD40L抗原用蛋白稳定剂稀释成6个梯度浓度，分别为0ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml和20.0ng/ml。
[0016] 所述方法还包括以下步骤：制备化学发光底物液A液和B液：
[0017] 用超纯水中配制0.1mol/L pH8.2-8.7的Tris-HCl缓冲液，加入终浓度为3mmol/L的鲁米诺、0.3mmol/L的Tween20和碘苯酚混合溶液，作为A液；
[0018] 用超纯水配制的0.1mol/L pH4.4-4.8的柠檬酸缓冲液，加入终浓度为30%的H2O2溶液，作为B液。
[0019] 所述多肽配体在制备检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
[0020] 所述检测可溶性白细胞分化抗原40配体的试剂盒的检测方法如下：
[0021] （1）自2-8℃冰箱中取出所述试剂盒，室温平衡30分钟。
[0022] （2）取出包被板条，插入发光板架上。
[0023] （3）将6个标准品（浓度分别为0ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml和20.0ng/ml）及待检测样本加入发光板中，每孔100μl。振荡混匀后贴上封板膜，置于37℃温育30分种。
[0024] （4）甩去反应液，每孔加满稀释后的磷酸盐洗液，清洗5次，最后在干净的吸水纸上扣干。
[0025] （5）加入HRP标记的sCD40L抗体试剂，每孔100μLl。振荡混匀后贴上封板膜，置于37℃温育20分种。
[0026] （6）甩去反应液，每孔加满稀释后的磷酸盐洗液，清洗5次，最后在干净的吸水纸上扣干。
[0027] （7）使用前将化学发光底物液A和B等体积混合，每孔加入100μl的化学发光底物混合液，振荡混合均匀，置于室温避光反应5分钟。
[0028] （8）将化学发光板在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度（RLU）。
[0029] （9）根据标准品的浓度与发光强度（RLU）建立标准曲线，以标准品浓度为横坐标，发光强度（RLU）值为纵坐标，在坐标系中标出6个标准品的散点图，采用回归方式建立标准2
曲线（要求相关系数R ＞0.99）和曲线方程。根据待测样品的发光强度（RLU）反推计算出样品的sCD40L浓度。
曲线（要求相关系数R ＞0.99）和曲线方程。根据待测样品的发光强度（RLU）反推计算出样品的sCD40L浓度。
[0030] （10）以样品中sCD40L浓度5.00ng/ml为临界值，判定ACS临床诊断及病情监测的预警提示。
[0031] 本发明通过构建可溶性白细胞分化抗原40配体（sCD40L）的多肽配体库，采用酶联免疫法（ELISA）筛选，进一步确定具有较高效价的多肽配体。sCD40L的多肽配体的应用主要表现在可用于检测血清中sCD40L的含量，包括化学发光法等。
[0032] 本发明所提供的试剂盒较Bender MedSystems sCD40L ELISA试剂盒具有更好的灵敏度和特异性，其对ACS的临床诊断及病情监测具有重要的应用价值。本发明的试剂盒采用的是化学发光免疫分析技术，比ELISA具有更高的检测灵敏度，安全可靠，操作简便，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，为临床心脑血管病特别是ACS临床诊断及病情监测提供了一种新的检测产品。
附图说明
[0033] 图1为化学发光免疫试剂盒对不同对象的检测结果。
具体实施方式
[0034] 实施例1、CD40L多肽配体库的建立
[0035] 采用生物信息学分析，结合PDB中CD40L数据进行分析，进一步确定了能够与CD40L结合的潜在的多肽配体所具有的元件序列主要包括：
[0036] Glu\Tyr\Gln\Leu-Tyr\Ser-Glu\Leu-Glu\Thr-Ser-Glu-Glu\Lys\Tyr-Glu\Tyr\Gln\Leu-Asp\Glu-Glu\Lys\Tyr-Tyr\Ser-Glu\Leu
[0037] 进行兼并分析后，提交上海生工生物技术有限公司辅助合成多肽片段：
[0038] Glu-Tyr-Glu-Glu-Ser-Glu-Lys-Glu-Asp-Glu-Tyr-Glu（序列表中序列1）[0039] 要求合成的多肽纯度＞90%。
[0040] 实施例2、CD40L多肽配体库的筛选
[0041] 多肽配体库的筛选采用ELISA法进行，具体方法如下：
[0042] ①sCD40L的标记。采用改良的过碘酸钠氧化法将sCD40L（sCD40L购自美国Peprotech公司，1mg/ml）分子进行辣根过氧化物酶（HRP）标记（HRP购自sigma公司）。
[0043] ②以多肽库片段（序列表中序列1）进行包被（包被液选择pH7.4PB缓冲液，包被浓度1.0μg/ml），封闭液为含有BSA或胎牛血清的磷酸盐缓冲液。
[0044] ③将HRP标记的sCD40L用PBS制备成1:1000、1:5000、1:10000三个浓度，分别加100μl至多肽片段包被板中，37℃反应60min后，PBST洗板5次后，加入TMB底物液（其中A液为含有过氧化脲的柠檬酸溶液，B液为含有TMB的柠檬酸溶液），避光反应15min后，于
450nm下读取吸光值，吸光值与多肽配体效价成正比。结果如表1所示。
450nm下读取吸光值，吸光值与多肽配体效价成正比。结果如表1所示。
[0045] 表1多肽配体效价检测结果
[0046]
[0047] 根据表1结果显示本发明的CD40L多肽配体（序列表中序列1所示）具有较高效价，具有潜在的检查应用价值。
[0048] 实施例3、基于CD40L多肽配体制备的化学发光免疫试剂盒及其检测方法[0049] 一、基于CD40L多肽配体制备的化学发光免疫试剂盒的制备方法如下：
[0050] （1）化学发光板的包被
[0051] 将包被用CD40L多肽配体按终浓度0.5μg/ml、1.0μg/ml或2.0μg/ml加入到20mmol pH4.0醋酸盐缓冲液或20mmol pH7.4磷酸盐缓冲液或50mmol pH9.6碳酸盐缓冲液中混匀后，加入化学发光板内，每孔100μl，4℃温浴16-22小时，弃去孔内液体后加入含有牛血清白蛋白（BSA）或胎牛血清的20mmol pH7.4的磷酸盐缓冲液120μl，37℃下静置2小时后，弃去孔内液体，彻底干燥发光板，干铝铂袋真空包装，置于2-8℃保存。
[0052] （2）HRP标记抗体的制备
[0053] 采用改良的过碘酸钠氧化法将sCD40L单克隆抗体（sCD40L单克隆抗体购自美国Peprotech公司）进行HRP（HRP购自sigma公司）标记。
[0054] 标记抗体采用HRP稀释稳定剂稀释，该稀释稳定剂是含0.1%Proclin300（非叠氮化钠）的0.1%氨基比林、安替比林或异丙安替比林的pH7.4的磷酸盐缓冲液。
[0055] （3）标准品的制备
[0056] 将重组全长CD40L抗原（购自美国Peprotech公司）用蛋白稳定剂（购自北京科跃中楷生物技术有限公司）稀释成6个梯度浓度，分别为0ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml和20.0ng/ml。
[0057] （4）化学发光底物液的制备
[0058] A液：用超纯水中配制0.1M pH8.2-8.7的Tris-HCl缓冲液（上海生工，500g/瓶），加入终浓度为3mmol/L的鲁米诺（Luminol）（购自杰韦弗、1g/瓶）、0.3mmol/L的Tween20（上海生工，500ml/瓶）和碘苯酚（上海生工，500ml/瓶）混合溶液。
[0059] B液：用超纯水配制的0.1M pH4.4-4.8的柠檬酸缓冲液（上海生工，500g/瓶），加入终浓度为30%的H2O2（国药，500ml/瓶）溶液。
[0060] 使用时将A液与B液等体积混合。
[0061] 二、化学发光免疫试剂盒的检测方法
[0062] （1）自2-8℃冰箱中取出上述制备得到的试剂盒，室温平衡30分钟。
[0063] （2）取出包被板条，插入发光板架上。
[0064] （3）将6个标准品（浓度分别为0ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml和20.0ng/ml）及待检测样本加入发光板中，每孔100μl。振荡混匀后贴上封板膜，置于37℃温育30分种。
[0065] （4）甩去反应液，每孔加满稀释后的洗液，清洗5次，最后在干净的吸水纸上扣干。
[0066] （5）加入HRP标记的sCD40L抗体试剂，每孔100μl。振荡混匀后贴上封板膜，置于37℃温育20分种。
[0067] （6）甩去反应液，每孔加满稀释后的洗液，清洗5次，最后在干净的吸水纸上扣干。
[0068] （7）使用前将化学发光底物液A和B等体积混合，每孔加入100μl的化学发光底物混合液，振荡混合均匀，置于室温避光反应5分钟。
[0069] （8）将化学发光板在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度（RLU）。
[0070] （9）根据标准品的浓度与发光强度（RLU）建立标准曲线，以标准品浓度为横坐标，发光强度（RLU）值为纵坐标，在坐标系中标出6个标准品的散点图，采用回归方式建立标准2
曲线（要求相关系数R ＞0.99）和曲线方程。根据待测样品的发光强度（RLU）反推计算出样品的sCD40L浓度。
曲线（要求相关系数R ＞0.99）和曲线方程。根据待测样品的发光强度（RLU）反推计算出样品的sCD40L浓度。
[0071] （10）以样品中sCD40L浓度5.00ng/ml为临界值，判定ACS临床诊断及病情监测的预警提示。
[0072] 实施例4、化学发光免疫试剂盒的检测精密性、稳定性、特异性及灵敏度[0073] （1）空白对照及标准品的检测精密性
[0074] 按照本发明所述检测方法，对空白对照和6个标准品进行了3个批次，每批次8个重复的精密度检测，结果如表2所示。
[0075] 表2空白对照及标准品的检测精密性结果
[0076]批次 浓度 1（n=8） 2（n=8） 3（n=8）
空白对照 / 0.000±0.005 0.001±0.007 0.000±0.003
标准品1 0ng/ml 0.002±0.007 0.002±0.003 0.002±0.005
标准品2 1.0ng/ml 0.997±0.004 1.002±0.003 0.996±0.005
标准品3 2.5ng/ml 2.498±0.005 2.502±0.003 2.507±0.008
标准品4 5.0ng/ml 4.996±0.008 4.999±0.006 5.002±0.006
标准品5 10.0ng/ml 10.002±0.004 9.997±0.006 10.001±0.003
标准品6 20.0ng/ml 19.996±0.006 20.002±0.005 19.998±0.004
空白对照 / 0.000±0.005 0.001±0.007 0.000±0.003
标准品1 0ng/ml 0.002±0.007 0.002±0.003 0.002±0.005
标准品2 1.0ng/ml 0.997±0.004 1.002±0.003 0.996±0.005
标准品3 2.5ng/ml 2.498±0.005 2.502±0.003 2.507±0.008
标准品4 5.0ng/ml 4.996±0.008 4.999±0.006 5.002±0.006
标准品5 10.0ng/ml 10.002±0.004 9.997±0.006 10.001±0.003
标准品6 20.0ng/ml 19.996±0.006 20.002±0.005 19.998±0.004
[0077] 从表2的结果可见，本发明的化学发光免疫试剂盒具有较高的精密性。
[0078] （2）本试剂盒的稳定性
[0079] 将本试剂盒置于37℃下3天后，采用同批次2-8℃保存试剂盒进行对比。按照本发明所述检测方法，对标准品及30个随机健康的人血清样本（体检健康人血清，来源于医院体检中心）分别进行了3次检测。结果两组数据间CV值为7.6%、5.9%和6.7%。
[0080] （3）本试剂盒的特异性和灵敏度
[0081] 采用本试剂盒对临床已确诊的28例ACS血清样本（来源于医院检验科）进行检测，以sCD40L浓度＞5.00ng/ml为标准检出26例，灵敏度为92.86%。同时对285例随机健康的人血清样本（来源于医院体检中心）进行检测，以sCD40L浓度＞5.00ng/ml为标准检出61例，特异性为78.60%。而对临床表现胸痛症状8例的血清样本（来源于医院检验科）进行检测，以sCD40L浓度＞5.00ng/ml为标准检出7例，经进一步确诊7例全为ACS患者。
[0082] 采用Bender MedSystems sCD40L ELISA试剂盒（购自奥地利Bender MedSystems公司，产品目录号为BMS265），对上述样本进行检测，结果显示临床已确诊的28例ACS血清样本中，以sCD40L浓度＞5.00ng/ml为标准检出24例，灵敏度为85.72%。同时对285例随机健康的人血清样本进行检测，以sCD40L浓度＞5.00ng/ml为标准检出67例，特异性为76.49%。而对临床表现胸痛症状8例的血清样本进行检测，以sCD40L浓度＞5.00ng/ml为标准检出7例，与本试剂盒的检测结果一致。
[0083] 综上所述，本发明试剂盒较Bender MedSystems sCD40L ELISA试剂盒具有更好的灵敏度和特异性，其对ACS的临床诊断及病情监测具有重要的应用价值。
[0084] 实施例5、化学发光免疫试剂盒对不同对象的检测结果
[0085] 将实施例3制备得到的试剂盒的灵敏度和特异性实验的结果进行进一步分析，将28例ACS病例和285份随机样本以及临床表现的8例胸痛病例的检测结果进行作图，结果显示如图1所示。从图1可见，本发明的试剂盒对临床ACS的确诊具有一定的辅助作用，同时对临床表现胸痛症状的病例具有一定的警示。