成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白及其编码基因转让专利
申请号 : CN201210534877.X
文献号 : CN102964453B
文献日 : 2014-03-12
发明人 : 余琼
申请人 : 黑龙江大学
摘要 :
成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白及其编码基因，涉及一种融合蛋白及其编码基因。本发明的目的在于提供成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白及其编码基因，以期获得一种能同时具有治疗骨质疏松症和心肌缺血双种作用的融合蛋白，两种蛋白之间作用互补且协同增效。融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明将成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合，两者之间作用互补且协同增效，所得融合蛋白经实验证实具有很好的治疗骨质疏松和心肌缺血的作用。本发明的融合蛋白可由于制备预防和治疗骨质疏松及心肌缺血疾病的药物。
权利要求 :
1.成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.如权利要求1所述成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白的编码基因，其特征在于基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
说明书 :
成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白及其编码基因
技术领域
[0001] 本发明涉及一种融合蛋白及其编码基因。
背景技术
[0002] 当前，我国已进入老龄社会，骨质疏松患者病例逐年增加，而骨折又是创伤学中最常见最多发的疾病。心肌缺血是心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。心肌缺血严重危害中老年人的健康，近年来随着生活水平的提高，冠状动脉粥样硬化呈现年轻化的趋势，一些20-30岁的年轻人也出现心肌缺血的表现。
[0003] 成骨生长肽（OGP）具有促进体外成骨细胞增殖、体内成骨及刺激造血等功能，可促进骨折愈合，预防骨质疏松。由14个氨基酸小肽组成，并且其氨基酸序列与组蛋白H4的C末端完全一致，与小鼠T细胞受体β链V区部分同源，对于骨折的愈合，骨质疏松症，急、慢性贫血病的预防和治疗及其在肿瘤放、化疗过程中刺激骨髓细胞造血的作用，已经得到高度的重视和肯定。
[0004] 降钙素基因相关肽(Calcitonin Gene Related peptide,CGRP)是在1983年由Rosenfeld等首次应用DNA基因重组和分子生物技术研究发现的第一个活性多肽，由37种氨基酸组成，其分子量约为3800道尔顿，它与降钙素基因同源，其中含有五个内含子和六个外显子，为内源性扩血管肽类物质，可以治疗心肌缺血。
[0005] 然而目前这两种蛋白单独作用，效果单一。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白及其编码基因，以期获得一种能同时具有治疗骨质疏松症和心肌缺血双种作用的融合蛋白，两种蛋白之间作用互补且协同增效。
[0007] 本发明成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0008] 上述成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0009] 本发明的有益效果：本发明进行合理设计，将成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合，两者之间作用互补且协同增效，所得融合蛋白经实验证实具有很好的治疗骨质疏松和心肌缺血的作用。本发明的融合蛋白可由于制备预防和治疗骨质疏松及心肌缺血疾病的药物，为预防和治疗骨质疏松及心肌缺血疾病的研究打下基础。
具体实施方式
[0010] 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
[0011] 具体实施方式一：本实施方式成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0012] 本实施方式成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白的制备方法，按以下步骤进行：
[0013] 一、融合蛋白OGP/CGRP基因的合成：OGP和CGRP融合基因内设计一个KpnⅠ酶切位点，由上海生工公司合成核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的融合蛋白OGP/CGRP基因，并在融合蛋白OGP/CGRP基因两端分别添加BamHI和EcoRⅠ酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC（OGP/CGRP）载体；
[0014] 二、重组表达载体的构建：将步骤一获得的pUC（OGP/CGRP）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切，再与同样经BamHI和EcoRⅠ双酶切的表达载体pGEX-6P-1连接，获得融合蛋白OGP/CGRP基因重组表达载体pGEX- OGP/CGRP；
[0015] 三、基因工程菌株的构建：然后将载体pGEX- OGP/CGRP转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，随机挑取转化菌37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒（购买自北京艾德莱生物科技有限公司）提取质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，并用相应的空白质粒pGEX-6P-1作为对照，将含有KpnⅠ酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌BL21（DE3- OGP/CGRP）；其中大肠杆菌BL21（DE3）为购买得到；
[0016] 四、融合蛋白的诱导表达与纯化：将重组菌BL21（DE3- OGP/CGRP）置于LB培养基28℃培养15h，然后采用GST标签融合蛋白方法进行蛋白的分离纯化，本实施方式成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白表达量为39%。
[0017] 步骤二中pUC（OGP/CGRP）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切的体系如下：
[0018]
[0019] 酶切反应条件：37℃水浴，10h。
[0020] 步骤二中表达载体pGEX-6P-1双酶切的体系如下：
[0021]
[0022] 酶切反应条件：37℃水浴，10h。
[0023] 步骤二中连接反应体系如下：
[0024]
[0025] 连接反应条件：16℃水浴，8～12h。所述T4 DNA连接酶，购买自TaKaRa公司。
[0026] 为验证本实施方式的效果，进行以下实验：
[0027] （一）OGP-CGRP融合蛋白治疗骨质疏松实验：
[0028] 取雌性SD大鼠48只，40只无菌条件下摘除双侧卵巢，其中8只假手术对照组切除双侧一小块脂肪。12周后取造模组存活健康大鼠40只，随机分为5组，每组8只。假手术对照组取8只，共计5组，分别口服以下药物：假手术对照组：0.5% CMC-Na溶液5ml/kg；模型对照组：0.5% CMC-Na溶液5ml/kg。阳性对照组：阿仑膦酸钠(Alen)5mg/kg；实验1组：0.5% OGP蛋白溶液5ml/kg；实验2组：0.5% OGP-CGRP融合蛋白溶液5ml/kg。连续给药三个月，处死后各取大鼠股骨头，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金刚石锯将股骨头矢面锯开，取其一片，经清洗，10%次氯酸钠浸泡6h，超声清洗15min，乙醇梯度脱水，乙醚浸泡，干燥，离子溅射镀膜，SX-40扫描电镜观察，加速电压为20kV。
[0029] 观察结果见表1，结果表明，阳性对照组、实验1组和实验2组与阴性对照组相比虽然都有治疗骨质疏松的作用，但是OGP-CGRP融合蛋白的治疗效果最佳，且比单独服用OGP蛋白溶液的效果有显著提高，说明OGP和CGRP融合可以增强成骨生长肽（OGP）的作用。
[0030] 表1骨小梁宽度的比较和骨面积（X±SD）
[0031]
[0032] 与阴性对照组比较:*P<0.05，**P<0.01
[0033] （二）OGP-CGRP融合蛋白治疗大鼠心肌缺血的实验：
[0034] 取SD大鼠30只，造成心肌缺血模型；大鼠随机分成三组（对照组、实验A组和实验B组），实验A组按2.5mg/kg·b.w剂量注射CGRP蛋白；实验B组按2.5mg/kg·b.w剂量注射OGP-CGRP融合蛋白；对照组注射同等剂量的生理盐水。
[0035] 实验进行4次，对大鼠心肌进行危险区域、坏死区及坏死区与危险区域的比值检测，检测结果如表2所示，其中AAR（Area at risk）为危险区域，IS（Infarct size）为坏死区。
[0036] 表2 梗死区大小（±S）
[0037]
[0038] *P<0.05，**P<0.01
[0039] 结果表明：实验A组和实验B组与对照组相比虽然都有治疗心肌缺血的作用，但是OGP-CGRP融合蛋白的治疗效果最佳，且比单独注射CGRP蛋白的效果有显著提高，说明OGP和CGRP融合可以增强降钙素基因相关肽（CGRP）的作用。
[0040] 由骨质疏松实验和心肌缺血实验结果可知，成骨生长肽（OGP）和降钙素基因相关肽（CGRP）融合可以互相促进，协同增效。
[0041] （三）OGP-CGRP融合蛋白毒性实验：
[0042] 哈尔滨医科大学实验动物中心提供 SPF 级昆明小鼠。取60只6周龄、雌雄各半、体质量为18±2g的小鼠作为实验对象。将小鼠随机分为2组：实验组和对照组，采用最大耐药量给药（根据临床干扰素用量50ug/kg）。实验组注射OGP-CGRP融合蛋白，总剂量 1mg/kg，一次性给药0.02mL。对照组小鼠注射同等剂量生理盐水。
[0043] 给药过程中小鼠表现正常，进食、饮水正常、尿粪正常、毛色顺白而有光泽、活动自如、反应性好、小鼠之间无相互撕咬现象。连续饲养14天和30天，小鼠均未出现死亡。
[0044] OGP-CGRP融合蛋白给药14天、30天后，处死小鼠，摘眼球取血，3000r/min离心 5 min，吸取血清，用 Beckman 全自动生化分析仪检测主要生化指标：天冬氨酸转氨酶( AST) 、丙氨酸转氨酶( ALT) 、肌酐( CREA) 、尿素氮( BUN) 、尿酸 ( URCA) 、总胆红素( TBIL) 、总胆汁酸( TBA) 。血生化指标如表3所示。
[0045] 表3 血生化指标
[0046]
[0047] OGP-CGRP融合蛋白给药14天、30天后处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾，观察脏器颜色、形态，计算各脏器系数。根据统计学样本估计，在每组中随机抽取7只小鼠，取心、肝、脾、肺、肾 HE 染色做病理组织学检查；取骨髓组织瑞氏染色观察细胞有无水肿、变性、坏死等。主要脏器的病理观察结果如表4所示。
[0048] 表4 脏器病理观察结果
[0049]组别 天数 心 肝 脾 肺 肾
对照组 14 3.46±0.90 31.44±2.73 4.38±0.78 2.91±0.83 7.85±0.79
实验组 14 3.31±0.81 30.43±3.02 4.35±0.78 2.85±0.86 7.81±0.93
对照组 30 3.67±0.61 31.93±2.95 4.72±0.84 2.90±0.77 7.96±0.89
实验组 30 3.58±0.78 30.74±3.71 4.58±0.87 2.89±0.52 7.88±0.84
对照组 14 3.46±0.90 31.44±2.73 4.38±0.78 2.91±0.83 7.85±0.79
实验组 14 3.31±0.81 30.43±3.02 4.35±0.78 2.85±0.86 7.81±0.93
对照组 30 3.67±0.61 31.93±2.95 4.72±0.84 2.90±0.77 7.96±0.89
实验组 30 3.58±0.78 30.74±3.71 4.58±0.87 2.89±0.52 7.88±0.84
[0050] 实验组与对照组主要脏器心、肝、脾、肺、肾的 HE 染色及骨髓 Wright 染色对比观察发现：各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾和骨髓均无水肿、变性、坏死等异常改变。
[0051] 本实验对心、脾、肺、肾的病理切片和骨髓涂片进行了观察，均未见明显的损伤性改变。对5种脏器的脏器系数统计学分析得出各组间差异无显著性。均说明OGP-CGRP融合蛋白及其代谢产物未对脏器产生器质性损害。血生化指标检测各组间差异性无显著说明OGP-CGRP融合蛋白对肝脏、肾脏无功能性损害。表明OGP-CGRP融合蛋白具有较好的生物相容性，对小鼠无明显急性毒性、长期毒性。
[0052] 具体实施方式二：具体实施方式一所述成骨生长肽与降钙素基因相关肽融合蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。