msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株转让专利
申请号 : CN201210534879.9
文献号 : CN102965327B
文献日 : 2014-06-11
发明人 : 余琼
申请人 : 黑龙江大学
摘要 :
msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株，它涉及一种融合蛋白转基因工程菌株。解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和肥胖药品的缺陷。msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）按以下步骤制备：一、获得融合蛋白DAN片段；二、双酶切质粒；三、酶连接；四、转化大肠杆菌BL21。本发明可用于医药制备领域。
权利要求 :
1.msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’），大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）按以下步骤制备：一、将含有msCT-rhLeptin融合蛋白基因的质粒载体pUC（msCT/Obese’）用BamH I和EcoRⅠ双酶切，获得msCT-rhLeptin融合蛋白的DNA片段；
二、用BamHI和EcoRⅠ双酶切质粒pGEX-6P-1；
三、msCT-rhLeptin融合蛋白的DNA片段与经过双酶切的载体pGEX-6P-1进行酶连接，然后16℃放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/Obese’；
四、用载体pGEX-msCT/Obese’转化大肠杆菌BL21（DE3），选择阳性重组子，即获得msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）；
步骤一中msCT-rhLeptin融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤一中质粒载体pUC（msCT/Obese’）酶切反应体系为
3.根据权利要求1所述的msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤二中质粒pGEX-6P-1酶切反应体系为
4.根据权利要求1所述的msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤三中酶连接反应体系为
5.根据权利要求1所述的msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤一中msCT-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
说明书 :
msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株
技术领域
[0001] 本发明涉及一种融合蛋白转基因工程菌株。
背景技术
[0002] 老年人骨质疏松发病率较高，全球有2亿骨质疏松患者，并且女性多于男性。根据世界卫生组织（WHO）的标准，美国国家健康和营养调查（NHANESⅢ，1988～1994年）结果表明，骨质疏松严重影响老年人生活质量，50岁以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他们的一生中都会出现骨质疏松性骨折，一旦患者经历了第一次骨质疏松性骨折，继发性骨折的危险明显加大。中国老年人居于世界首位，现有骨质疏松症患者9000万，占总人口的7.1%。随着社会老龄化的进程，骨质疏松症的发病率呈上升趋势，预计到2050年将增加到
2.21亿，那时全世界一半以上的骨质疏松性骨折将发生在亚洲，绝大部分在中国。有学者对
1995～1996年美国骨质疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年发生数进行调查显示，每年发生骨质疏松性骨折150万次，其中椎体骨折70万次，腕部骨折20万次，髋部骨折30万次，其它骨折30万次。
2.21亿，那时全世界一半以上的骨质疏松性骨折将发生在亚洲，绝大部分在中国。有学者对
1995～1996年美国骨质疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年发生数进行调查显示，每年发生骨质疏松性骨折150万次，其中椎体骨折70万次，腕部骨折20万次，髋部骨折30万次，其它骨折30万次。
[0003] 肥胖与骨量关系临床观察表明，肥胖与骨密度(BMD)提高有关。肥胖是骨量的保护因素，超重和肥胖的妇女绝经后较同龄非超重妇女骨量高且骨丢失较慢。体重下降是绝经早期骨丢失的危险因素，提高体重指数可减缓绝经后骨丢失。但肥胖也常常引发高血糖、高血压、高血脂、高血粘、高尿酸、高胰岛素血症、冠心病、脑卒中、下肢静脉曲张、脂肪肝、胆石症、睡眠呼吸暂停症、糖尿病、痛风症及关节炎，是很多疾病的诱因之一。
发明内容
[0004] 本发明要解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和肥胖药品的缺陷，而提供的一种msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株。
[0005] msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’），大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）按以下步骤制备：
[0006] 一、将含有msCT-rhLeptin融合蛋白基因的质粒载体pUC（msCT/Obese’）用BamH I和EcoRⅠ双酶切，获得msCT-rhLeptin融合蛋白的DNA片段；
[0007] 二、用BamHI和EcoR Ⅰ双酶切质粒pGEX-6P-1；
[0008] 三、msCT-rhLeptin融合蛋白的DNA片段与经过双酶切的载体pGEX-6P-1进行酶连接，然后16℃放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/Obese’；
[0009] 四、用载体pGEX-msCT/Obese’转化大肠杆菌BL21（DE3），选择阳性重组子，即获得msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）。
[0010] 本发明中msCT-rhLeptin融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
[0011] 本发明中msCT-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0012] 本发明msCT-rhLeptin融合蛋白采用人为改造的Leptin和鲑鱼降钙素基因编码翻译而成。具有降低使用者体重，并防治骨质疏松的效果。
[0013] 本发明用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白微生物制剂，不产生拮抗反应，使用安全。
[0014] 本发明msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）发酵产生的msCT-rhLeptin融合蛋白共70个氨基酸。本发明采用生物基因工程手段获得大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）。采用本发明基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）可大规模发酵生产msCT-rhLeptin融合蛋白，具有广泛应用前景。本发明为治疗骨质疏松和肥胖奠定了物质基础。
具体实施方式
[0015] 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
[0016] 具体实施方式一：本实施方式msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’），大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）按以下步骤制备：
[0017] 一、将含有msCT-rhLeptin融合蛋白基因的质粒载体pUC（msCT/Obese’）用BamH I和EcoR Ⅰ双酶切，获得msCT-rhLeptin融合蛋白的DNA片段（msCT/Obese’）；
[0018] 二、用BamHI和EcoRⅠ双酶切质粒pGEX-6P-1；
[0019] 三、msCT-rhLeptin融合蛋白的DNA片段与经过双酶切的载体pGEX-6P-1进行酶连接，然后16℃放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/Obese’；
[0020] 四、用载体pGEX-msCT/Obese’转化大肠杆菌BL21（DE3），选择阳性重组子，即获得msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）。
[0021] 本实施方式步骤四采用电击转化法转化大肠杆菌BL21（DE3）。
[0022] 具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于：步骤一中质粒载体pUC（msCT/Obese’）酶切反应体系为
[0023]
[0024] 其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
[0025] 具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点在于：步骤三中质粒pGEX-6P-1酶切反应体系为
[0026]
[0027] 其他步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
[0028] 具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一、二或三的不同点在于：步骤二中酶连接反应体系为
[0029]
[0030] 其他步骤及参数与具体实施方式一、二或三相同。
[0031] 具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同点在于：步骤一中msCT-rhLeptin融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。其他步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
[0032] 本实施方式msCT-rhLeptin融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的质粒载体pUC（msCT/Obese’）。
[0033] 具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同点在于：步骤一中msCT-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。其他步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
[0034] 具体实施方式七：本实施方式msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’），大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）按以下步骤制备：
[0035] 一、将含有msCT-rhLeptin融合蛋白基因的质粒载体pUC（msCT/Obese’）用BamH I和EcoR Ⅰ双酶切，获得msCT-rhLeptin融合蛋白的DNA片段（msCT/Obese’）；
[0036] 二、用BamHI和EcoRⅠ双酶切质粒pGEX-6P-1；
[0037] 三、msCT-rhLeptin融合蛋白的DNA片段与经过双酶切的载体pGEX-6P-1进行酶连接，然后16℃放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/Obese’；
[0038] 四、用载体pGEX-msCT/Obese’转化大肠杆菌BL21（DE3），选择阳性重组子，即获得msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）；
[0039] 其中步骤一中质粒载体pUC（msCT/Obese’）酶切反应体系为：
[0040]
[0041] 其中步骤三中质粒pGEX-6P-1酶切反应体系为：
[0042]
[0043] 其中步骤二中酶连接反应体系为：
[0044]
[0045] 其中步骤一中msCT-rhLeptin融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示；步骤一中msCT-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0046] 本实施方式中msCT-rhLeptin融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的质粒载体pUC（msCT/Obese’）。本实施方式在构建msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）时改变了天然鲑鱼降钙素（salmon calcitonin，sCT）的基因和瘦素（Leptin）的基因，而且在msCT和Obese’之间插入Kpn Ⅰ酶切位点，既可以提高所编码融合蛋白的稳定性，同时也改变融合蛋白的二级结构，使其生物性能提高。并在融合蛋白基因两侧分别加上BamHI和EcoR Ⅰ酶切位点，而且根据大肠杆菌偏爱密码子的特点，重新设计了融合基因编码碱基序列。
[0047] 载体pGEX-6P-1上不含有KpnⅠ酶切位点，本实施方式合成的pGEX-msCT/Obese’均能为KpnⅠ单酶切开，说明本实施方式msCT-rhLeptin融合蛋白成功导入质粒pGEX-6P-1中。然后将质粒pGEX-msCT/Obese’导入大肠杆菌BL21（DE3）中，选取阳性克隆。
[0048] 随机挑取阳性克隆大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）菌落37℃过夜培养，提取质DNA，用Kpn Ⅰ进行单酶切，并用相应的空白质粒pGEX-6P-1作为对照，将含有KpnⅠ酶切位点的质粒进行基因测序。测序工作委托生物公司进行，大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）内含有SEQ ID NO：1所示DNA。
[0049] 将大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）置于LB培养基28℃环境条件下培养15h，然后采用GST标签融合蛋白纯化方法进行蛋白的分离纯化，本实施方式用于治疗骨质疏松和肥胖的融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白的表达量为39%。
[0050] 利用本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）发酵获得的msCT-rhLeptin融合蛋白进行试验：
[0051] msCT-rhLeptin融合蛋白治疗骨质疏松实验：
[0052] 取雌性SD大鼠，无菌条件下摘除双侧卵巢，其中阴性对照组切除双侧一小块脂肪。5天后取存活健康大鼠48只，随机分为6组，每组8只，分别口服以下药物：
[0053] 模型组：质量浓度为0.5%的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5ml/kg；
[0054] 阴性对照组：质量浓度为0.5%的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5ml/kg；
[0055] 实验组：质量浓度为0.5%的msCT-rhLeptin融合蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg；（获得的用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白用无菌水溶液溶解）[0056] 阳性对照组1：阿仑膦酸钠(Alen)5mg/kg。
[0057] 阳性对照组2：质量浓度为0.5%的msCT蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg。
[0058] 阳性对照组3：质量浓度为0.5%的rhLeptin溶液，灌胃剂量为5ml/kg。
[0059] 连续给药三个月，处死后各取大鼠股骨头，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金刚石锯将股骨头矢面锯开，取其一片，经清洗，10%次氯酸钠浸泡6h，超声清洗15min，乙醇梯度脱水，乙醚浸泡，干燥，离子溅射镀膜，SX-40扫描电镜观察，加速电压20kV。
[0060] 观察骨质疏松治疗对比实验结果，实验结果见表1，结果表明阳性对照组1、阳性对照组2、阳性对照组3和实验组都具有治疗骨质疏松的作用，且实验组的效果最好。
[0061] 表1骨小梁宽度的比较和骨面积（X±SD）
[0062]组别 n 给药剂量 骨小梁宽度X±SD 骨小梁面积X±SD
模型组 8 5ml/kg 50.40±13.7 0.3557±0.071
阴性对照组 8 5ml/kg 114.35±13.5 0.6382±0.0344
阳性对照组1 8 5mg/kg 111.35±14.7 0.6590±0.0422
阳性对照组2 8 5ml/kg 118.46±13.0 0.6882±0.0478
阳性对照组3 8 5ml/kg 54.34±17.27 0.5782±0.0413
实验组 8 5ml/kg 126.69±15.8 0.7335±0.0417
模型组 8 5ml/kg 50.40±13.7 0.3557±0.071
阴性对照组 8 5ml/kg 114.35±13.5 0.6382±0.0344
阳性对照组1 8 5mg/kg 111.35±14.7 0.6590±0.0422
阳性对照组2 8 5ml/kg 118.46±13.0 0.6882±0.0478
阳性对照组3 8 5ml/kg 54.34±17.27 0.5782±0.0413
实验组 8 5ml/kg 126.69±15.8 0.7335±0.0417
[0063] msCT-rhLeptin融合蛋白体重调节实验：
[0064] 将雌性ob/ob小鼠40只，以10只为一组，共分为4组。分别注射媒介物（0.7%生理盐水）、rhLeptin、sCT-rhLeptin融合蛋白和L-肉碱，每天1mg、持续28天，每天记录小鼠的体重，实验结果如表2所示。本实施方式融合蛋白体重调节效果最为明显。
[0065] 表2
[0066]0.7%生理盐水 rhLeptin sCT-rhLeptin融合蛋白 L-肉碱
原始体重（g） 57.6±0.6 59.8±0.7 60.2±0.7 57.9±0.8
28d后体重（g） 56.6±0.5 51.3±0.7 51.1±0.6 50.9±0.8
体重改变（g） -0.1 -8.5 -9.1 -7.0
P
原始体重（g） 57.6±0.6 59.8±0.7 60.2±0.7 57.9±0.8
28d后体重（g） 56.6±0.5 51.3±0.7 51.1±0.6 50.9±0.8
体重改变（g） -0.1 -8.5 -9.1 -7.0
P
[0067] msCT-rhLeptin融合蛋白毒性实验：
[0068] 哈尔滨医科大学实验动物中心提供SPF级昆明小鼠。取60只6周龄、雌雄各半、体质量为18±2g的小鼠作为实验对象。采用最大耐药量给药（根据临床干扰素用量50ug/kg）。实验组注射总剂量1mg/kg，一次性给药0.02mL。对照组小鼠注射同等剂量生理盐水。
[0069] 给药过程中小鼠表现正常，进食、饮水正常、尿粪正常、毛色顺白而有光泽、活动自如、反应性好、小鼠之间无相互撕咬现象。连续饲养14天和30天，小鼠均未出现死亡。
[0070] msCT-rhLeptin融合蛋白给药14天、30天后，处死小鼠，摘眼球取血，3000r/min，离心5min，吸取血清，用Beckman全自动生化分析仪检测主要生化指标：天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)、尿酸(URCA)、总胆红素(TBIL)、总胆汁酸(TBA)。血生化指标如表3所示。
[0071] 表3
[0072]
[0073] msCT-rhLeptin融合蛋白给药14天、30天后处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾，观察脏器颜色、形态，计算各脏器系数。根据统计学样本估计，在每组中随机抽取7只小鼠，取心、肝、脾、肺、肾HE染色做病理组织学检查；取骨髓组织瑞氏染色观察细胞有无水肿、变性、坏死等。主要脏器的病理观察结果如表4所示。
[0074] 表4
[0075]组别 天数 心 肝 脾 肺 肾
对照组 14 3.59±0.60 32.02±2.28 4.33±0.90 2.72±0.93 7.63±0.90
实验组 14 3.51±0.86 30.52±3.27 4.49±0.74 2.88±0.73 7.62±0.65
对照组 30 3.63±0.63 32.01±2.15 4.36±0.75 2.89±0.61 7.75±0.80
实验组 30 3.55±0.70 30.55±3.27 4.29±0.62 2.92±0.79 7.78±0.65
对照组 14 3.59±0.60 32.02±2.28 4.33±0.90 2.72±0.93 7.63±0.90
实验组 14 3.51±0.86 30.52±3.27 4.49±0.74 2.88±0.73 7.62±0.65
对照组 30 3.63±0.63 32.01±2.15 4.36±0.75 2.89±0.61 7.75±0.80
实验组 30 3.55±0.70 30.55±3.27 4.29±0.62 2.92±0.79 7.78±0.65
[0076] 实验组与对照组主要脏器心、肝、脾、肺、肾的HE染色及骨髓Wright染色对比观察发现：各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾和骨髓均无水肿、变性、坏死等异常改变。
[0077] 本实验对心、脾、肺、肾的病理切片和骨髓涂片进行了观察，均未见明显的损伤性改变。对5种脏器的脏器系数统计学分析得出各组间差异无显著性。均说明msCT-rhLeptin融合蛋白及其代谢产物未对脏器产生器质性损害。血生化指标检测各组间差异性无显著说明msCT-rhLeptin融合蛋白对肝脏、肾脏无功能性损害。表msCT-rhLeptin融合蛋白msCT-rhLeptin融合蛋白较好的生物相容性，对小鼠无明显急性毒性、长期毒性。
[0078] 本实施方式对天然鲑鱼降钙素（salmon calcitonin，sCT）进行了改造，改造后的8 16 22
msCT［Gly，Ala ，del-Tyr ］（sCT第8位的缬氨酸变为甘氨酸，第16位的亮氨酸用丙氨酸置换，删除第22位的酪氨酸），改造后的msCT的生物活性可达8600IU/mg。
msCT［Gly，Ala ，del-Tyr ］（sCT第8位的缬氨酸变为甘氨酸，第16位的亮氨酸用丙氨酸置换，删除第22位的酪氨酸），改造后的msCT的生物活性可达8600IU/mg。
[0079] Leptin是obese基因编码的表达产物，由白色脂肪细胞和胎盘产生的由167个氨基酸组成的分泌蛋白，此蛋白可作为影响能量平衡的传入信号，其功能主要是通过影响能量摄取和支出实现减低体重的作用。本实施方式对obese基因进行了重新的设计获得Obese’基因。Obese’基因由105个碱基组成，编码35个氨基酸的rhLeptin（Recombinant Human Leptin，人重组瘦素）。
[0080] 本实施方式msCT-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）发酵产生的msCT-rhLeptin融合蛋白在msCT和rhLeptin之间插入GlyThr，改变了多肽的二级结构，但不仅没有使msCT和rhLeptin丧失生物活性，反而提高了其生物活性；并且在融合基因C-端添加Arg，可以去除C-末端酰胺化的基团。本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）内msCT-rhLeptin融合蛋白的表达量也比单一的CTx或msCT在大肠杆菌中的表达量高。
[0081] 本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）产生的融合蛋白在治疗骨质疏松和肥胖方面的效果也超过单一的msCT或CTx，且该融合蛋白可通过注射或者口服的方式进行给药，不存在首过效应。
[0082] 本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）所产融合蛋白二级结构的改变没有产生体内毒性，具有安全性；而且二级结构的改变不影响层析和纯化，所产融合蛋白具有分离纯化容易的特点。
[0083] 采用本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）发酵制备msCT-rhLeptin融合蛋白具有生产成本低，生物活性高，免疫原性低，活性高，半衰期长的优点。
[0084] 本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均购买获得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。