分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其单克隆抗体及其应用

摘要

本发明提供了一种分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其单克隆抗体及其应用。本发明的分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株保藏号为CCTCC？NO：C2012107。本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，基于此建立的BoIFN-γELISPOT检测试剂盒具有较好的灵敏度和特异性，用作牛机体免疫状态的评价及感染性疾病诊断相关的研究。

权利要求

1.一种分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO：C2012107，分类命名为：杂交瘤细胞系2G5。

2.一种牛γ干扰素单克隆抗体，由保藏号为CCTCC NO：C2012107的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生，所述杂交瘤细胞株的分类命名为：杂交瘤细胞系2G5。

3.如权利要求1所述分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株或权利要求2所述牛γ干扰素单克隆抗体在制备牛疫病的检测试剂或诊断试剂中的应用。

4.一种牛γ干扰素的ELISPOT检测试剂盒，所述试剂盒包括：a.选自以下任一：

1）微孔滤膜板，以及权利要求2所述牛γ干扰素单克隆抗体；

2）包被有权利要求2所述牛γ干扰素单克隆抗体的微孔滤膜板；

b.生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体。

5.如权利要求4所述牛γ干扰素的ELISPOT检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体中的牛γ干扰素单克隆抗体不同于权利要求2所述牛γ干扰素单克隆抗体。

6.如权利要求4所述牛γ干扰素的ELISPOT检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体中的牛γ干扰素单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C2012108的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。

7.如权利要求4-6任一所述牛γ干扰素的ELISPOT检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：

1）亲和素-碱性磷酸酶结合物；

2）底物液；

3）洗涤液。

8.如权利要求7所述牛γ干扰素的ELISPOT检测试剂盒，其特征在于，所述底物液为NBT/BCIP。

说明书

分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其单克隆抗

体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分泌牛γ干扰素单抗的杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及其在免疫检测及诊断领域的应用。

背景技术

[0002] γ干扰素（IFN-γ）主要是由被有丝分裂原或特异性抗原刺激而活化的CD4+Th1+细胞、CD8T细胞及NK细胞等产生的细胞因子，具有广泛抗病毒、抗肿瘤活性以及免疫调节功能，是机体防御系统的重要组成部分。研究表明内源性IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状态，而抗原特异性的IFN-γ反应则可以作为机体针对某种特定外来抗原的细胞免疫状态的指标。

[0003] IFN-γ及其单克隆抗体（McAb）在畜牧兽医领域有着广泛的应用，将基因重组牛IFN-γ（rBoIFN-γ）及其McAb用于牛病的研究，抗原特异性的BoIFN-γ试验已在很多发达国家被用于多种牛疫病的检测，尤以在牛结核病诊断中的应用最为广泛，相关的研究也最为深入。

[0004] IFN-γ的免疫学检测是在特异性抗IFN-γMcAb的基础上建立的用于对样本中的IFN-γ进行定性定量分析的实验方法。应用不同的单抗标记物和检测技术，已经开发出多种方法，如反向被动血凝试验（RPH），酶免疫分析法（EIA），酶联免疫吸附法（ELISA），酶联免疫斑点法（ELISPOT），流式细胞术（FCM）分析法等。

[0005] 1983年建立的酶联免疫斑点实验（Enzyme-linked Immunospot，简称ELISPOT）技术具有高度的敏感性和应用广泛性，已成为近年来最吸引人的免疫检测方法之一，在疫苗的研发、临床诊断以及基础研究等方面得到广泛应用。与传统的用于IFN-γ检测的抗病毒活性分析方法（AVA）相比，建立在免疫反应基础上的IFN-γ检测方法的灵敏度和特异性更高，作为细胞免疫状态的重要指标，IFN-γ的ELISPOT检测方法目前已被广泛地用于研究基础和临床免疫学、疫苗免疫效果评估、器官移植、过敏反应以及多种胞内病原感染的诊断等。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，以及该杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在免疫检测及诊断领域的应用。

[0007] 本发明一方面提供了一种分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO：C2012107。

[0008] 该菌株已于2012年9月4日在中国典型培养物保藏中心（地址：武汉市武汉大学）注册保藏，保藏号为CCTCC NO：C2012107，分类命名为：杂交瘤细胞系2G5。

[0009] 本发明第二方面提供了一种牛γ干扰素单克隆抗体，由保藏号为CCTCC NO：C2012107的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。

[0010] 本发明第三方面提供了前述分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及前述牛γ干扰素单克隆抗体在制备牛疫病的检测试剂或诊断试剂中的应用。

[0011] 本发明第四方面提供了一种牛γ干扰素的ELISPOT检测试剂盒，所述试剂盒包括：

[0012] 1.选自以下任一：

[0013] 1）微孔滤膜板和捕获抗体；

[0014] 2）包被有捕获抗体的微孔滤膜板；

[0015] 所述捕获抗体为前述牛γ干扰素单克隆抗体；

[0016] 2.生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体；

[0017] 所述试剂盒中，微孔滤膜板可以事先包被有捕获抗体，也可以只提供空白微孔滤膜板与捕获抗体，在检测前由操作者自行采用常规方法在微孔滤膜板上包被捕获抗体。

[0018] 所述微孔滤膜板可为各种常见规格的微孔滤膜板，如96孔滤膜板。

[0019] 所述生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体中的牛γ干扰素单克隆抗体不同于前述捕获抗体。生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体的方法采用常规。

[0020] 进一步优选的，所述生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体中的牛γ干扰素单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C2012108的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。

[0021] 保藏号为CCTCC NO：C2012108的杂交瘤细胞株已于2012年9月4日在中国典型培养物保藏中心（地址：武汉市武汉大学）注册保藏，分类命名为：杂交瘤细胞系5E11。

[0022] 进一步的，所述试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：

[0023] 1）亲和素-碱性磷酸酶结合物；

[0024] 2）底物液；

[0025] 3）洗涤液。

[0026] 上述试剂均为ELISOPT检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据需要有选择地加入试剂盒，也可由操作者自行配置或者单独购买。为方便操作者，最优的选择是试剂盒中同时包括亲和素-碱性磷酸酶结合物、底物液和洗涤液。

[0027] 所述底物液可为ELISPOT检测试剂盒中常用的通用底物液，如液氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（NBT/BCIP）底物液。

[0028] 所述洗涤液可为ELISPOT检测试剂盒中常用的洗涤液，如磷酸盐缓冲液等。可以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。

[0029] 进一步的，所述试剂盒中还可以有选择地包括其他ELISPOT检测所需通用试剂，如封闭液、细胞培养液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐吐温缓冲液等。

[0030] 所述封闭液可为包被微孔滤膜板常用的封闭液，如脱脂乳液、FBS、BSA或酪蛋白等。

[0031] 通常情况下，本发明的试剂盒中，各试剂分别隔离储存。

[0032] 本发明进一步基于上述BoIFN-γELISPOT检测试剂盒，建立了具有较好特异性和灵敏度的牛γ干扰素的ELISPOT检测方法，用于检测分泌牛γ干扰素的T淋巴细胞，从而进行机体免疫状态评价及疾病诊断方面的研究。

[0033] 本发明的试剂盒既可用于分析牛外周血单个核细胞样品，也可用于分析牛全血样品。

[0034] 利用本发明的试剂盒检测牛外周血单个核细胞样品的检测方法包括下列步骤：

[0035] 1、捕获抗体包被微孔滤膜板；

[0036] 2、制备牛外周血单个核细胞悬液；

[0037] 3、细胞孵育及检测

[0038] ①在上述捕获抗体包被的微孔滤膜板中加入下列试剂：50μL细胞培养液至每个对照孔，50μL 5μg/mL的美洲商陆（PWM）至每个阳性孔。每孔加入50μL细胞悬液，将96孔滤膜板置于37℃、5%CO2培养箱培养24-48小时；

[0039] ②弃培养上清，洗板后，加入1μg/mL的生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；

[0040] ③洗板后，加入稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；

[0041] ④每孔加入100μL底物液，放置于室温避光显色。在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，去除液体，室温下过夜或37℃烤箱中2-3小时烘干；

[0042] ⑤使用倒置显微镜计数每个反应孔中紫色的斑点，每一个点代表一个分泌牛γ干扰素的T细胞；或将微孔滤膜板放入ELISPOT仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。

[0043] 上述方法通过密度梯度离心分离牛外周血单个核细胞，以经美洲商陆刺激的牛外周血单个核细胞为阳性样品，以未经刺激的牛外周血单个核细胞为对照样品，并以纯化的保藏号为CCTCC NO：C2012017的杂交瘤细胞株分泌的单抗为捕获抗体，以生物素标记的另一牛γ干扰素单抗为检测抗体，结果显示，该方法可以有效检测出分泌牛γ干扰素的T淋巴细胞。

[0044] 利用本发明的试剂盒检测牛全血样品的检测方法包括下列步骤：

[0045] 1、捕获抗体包被微孔滤膜板；

[0046] 2、全血孵育及检测

[0047] ①无菌采取1mL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；

[0048] ②在上述捕获抗体包被的微孔滤膜板中加入下列试剂：50μL培养液至每个对照孔，50μL5μg/mL的PWM至每个阳性孔。每孔加入50μL牛全血（与灭菌PBS 1：1稀释），将96孔滤膜板置于37℃、5%CO2培养箱培养24-48小时；

[0049] ③弃培养上清，洗板后，加入1μg/mL的生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；

[0050] ④洗板，加入1：1000稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；

[0051] ⑤每孔加入100μL底物液，放置于室温避光显色。在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，去除液体，室温下过夜或37℃烤箱中2-3小时烘干；

[0052] ⑥使用倒置显微镜计数每个反应孔中紫色的斑点，每一个点代表一个分泌牛γ干扰素的T细胞；或将96孔滤膜板放入ELISPOT仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。

[0053] 本发明的技术效果：

[0054] 本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，基于此建立的BoIFN-γELISPOT检测试剂盒，在检测牛外周血单核细胞样品时，阳性样品孔中出现的特异性斑点数显著多于对照样品孔，表明该试剂盒可以有效检测出PWM刺激牛外周血中分泌牛γ干扰素的T淋巴细胞，具有较好的灵敏度和特异性。另外，本试剂盒通过对牛全血进行直接检测，结果显示同样可以检测出阳性孔中分泌牛γ干扰素的T淋巴细胞。采用本发明的试剂盒操作简便，极大缩短了检测时间，可以广泛应用于免疫学研究，用作牛机体免疫状态的评价及感染性疾病诊断相关的研究。

附图说明

[0055] 图1.牛外周血单个核细胞样品检测结果图

[0056] A.PWM刺激牛外周血单个核细胞检测结果；B.未刺激牛外周血单个核细胞检测结果图2.牛全血样品检测结果图

[0057] A.PWM刺激牛全血检测结果；B.未刺激牛全血检测结果

具体实施方式

[0058] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

[0059] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

[0060] 实施例1杂交瘤细胞株的获得

[0061] 保藏号为CCTCC NO：C2012107的杂交瘤细胞株及保藏号为CCTCC NO：C2012108的杂交瘤细胞株的获得。

[0062] 1.动物免疫

[0063] 具体免疫程序如下：首次免疫，腹部皮下多点注射100μg经弗氏完全佐剂充分乳化的重组牛γ干扰素纯化蛋白，2周后腹部皮下多点注射100μg经弗氏不完全佐剂充分乳化的纯化蛋白进行二次免疫，间隔2周后腹腔注射100μg不加佐剂的纯化蛋白进行第三次免疫，7天后眼眶采血测定血清抗体效价，选取效价较高的小鼠进行尾静脉加强免疫100μg不加佐剂的纯化蛋白。

[0064] 2.细胞融合

[0065] 具体步骤如下：尾静脉加强免疫3d后，采集少量血液，分离血清-20℃冻存，作为筛选时的阳性对照。按生物安全方法处死免疫鼠，75%酒精浸泡消毒5min，无菌取脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0在PEG（MW4000）作用下融合，用ICR小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，融合好的细胞及饲养细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37℃、6%CO2培养箱中培养。5d后加入新鲜HAT培养基，10d后改用HT培养基进行培养，定期观察，换液和检测。

[0066] 3.间接ELISA检测方法的建立

[0067] 采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆。方阵试验确定检测抗原的包被浓度。

[0068] 检测抗原用包被缓冲液横向梯度稀释，每孔50μl包被ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入200μl封闭液，4℃过夜；免疫鼠血清纵向倍比稀释，每孔50μl，正常小鼠血清同样倍数稀释作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗涤3次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔50μl，37℃孵育1.5h；PBST洗涤后，OPD显色，酶联检测仪测定OD490的值，判定检测抗原的最佳包被浓度。

[0069] 根据方阵试验确定的检测抗原的包被浓度，将稀释后的检测抗原50μl/孔加入酶标板中，4℃过夜，PBST洗液洗涤3次，5min/次，用含10%小牛血清的PBST洗液4℃封闭过夜，洗涤，-20℃保存，用于筛选阳性细胞克隆。

[0070] 4.筛选阳性克隆

[0071] 采用建立好的间接ELISA方法检测杂交瘤细胞分泌抗体的情况。具体方法如下：将杂交瘤细胞培养上清加入预先包被好的ELISA板中，50μl/孔，以SP2/0细胞上清作为阴性对照，免疫鼠多抗血清作为阳性对照，37℃水浴2h；PBST洗涤3次；加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG和IgM抗体，50μl/孔，37℃水浴1.5h；洗涤后，OPD显色10~15min，显色终止后酶标仪测定OD490读数。被测孔OD490读数大于阴性对照两倍以上判定为阳性。将筛选到的两株阳性克隆分别命名为2G5和5E11。

[0072] 5.阳性杂交瘤细胞的克隆化

[0073] 采用有限稀释法对筛选到的阳性细胞克隆2G5和5E11进行2~3次的亚克隆并进行保藏。阳性细胞克隆2G5对应保藏号为CCTCC NO：C2012107的杂交瘤细胞株，阳性细胞克隆5E11对应保藏号为CCTCC NO：C2012108的杂交瘤细胞株。

[0074] 实施例2牛γ干扰素单抗制备

[0075] 1.腹水制备

[0076] 采用体内诱生腹水法，按常规方法进行。10~12周龄健康BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3~0.5ml/只，7~10d后，分别腹腔接种经PBS稀释的培养至对数生长期的杂交瘤5
细胞2G5和5E11，5×10 个细胞/只；7d后收集腹水，离心去除沉淀，收集上清，间接ELISA法测定抗体效价，分装，-70℃保存。杂交瘤细胞株CCTCC NO：C2012107（对应杂交瘤细胞
2G5）分泌的单抗记为2G5，杂交瘤细胞株CCTCC NO：C2012108（对应杂交瘤细胞5E11）分泌的单抗记为5E11。

[0077] 2.抗体纯化标记

[0078] 将制备的2G5和5E11腹水使用Protein G亲和层析方法进行纯化，并将单抗5E11进行生物素标记。

[0079] 将纯化5E11单抗采用标准生物素标记法进行标记。溶解2~10mg单抗5E11蛋白于1ml的磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数；平衡生物素至室温，加2mg Sulfo-NHS-Biotin于100ul超纯水中，加入一定浓度的生物素；室温30分钟，或冰上放置2小时；用30ml PBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5ml或1ml于单独的管中，以280nm的吸收值测定单抗蛋白含量。

[0080] 实施例3单克隆抗体特性检测

[0081] 1.单抗亚类的鉴定

[0082] 按单克隆抗体亚类试剂盒说明书进行，采用抗原介导的ELISA法。在已包被的酶标板内分别加入细胞培养上清50μl/孔，37℃1h，PBST洗涤3次，每次5min；分别加入1:1000稀释的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM亚类抗体50μl/孔，37℃0.5h，每株单抗加每种亚类两孔，PBST洗涤3次每次5min；加入1:5000稀释的兔抗羊酶标二抗50μl/孔，37℃15min，PBST洗涤3次；加显色液邻苯二胺（OPD）溶液50μl/孔，37℃避光显色
10~15min，2M H2SO450μl/孔终止反应，以肉眼观察颜色明显高于其它孔者所加亚类抗体为单抗亚类。

[0083] 结果显示，单抗2G5和5E11亚类均为IgG1。

[0084] 2.单抗腹水效价的测定

[0085] 使用包被缓冲液将检测抗原稀释至一定浓度，每孔50μl包被ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入200μl封闭液，4℃过夜；将单抗腹水倍比稀释，每孔50μl，同样倍数稀释SP2/0腹水作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗涤3次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔50μl，37℃孵育1.5h；PBST洗涤后，OPD显色，酶联检测仪测定OD490的值，以P/N值≥2.1为判定标准，测定单抗腹水效价。

[0086] 结果显示，单抗2G5和5E11的效价分别达到1：2048000和1：320000。

[0087] 3.单抗特异性的鉴定

[0088] 以Dot-ELISA鉴定单抗的特异性，具体步骤如下：剪取一定大小的NC膜，在去离子水中浸透后晾干；用移液器分别吸取工作浓度的rHis-BoIL-4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-ChIFN-γ、rHis-ChIL-4、rGST-ChIL-4， 以 及BL21(DE3)(pET)和BL21(pGEX-6P-1)经IPTG诱导后的超声裂解液上清各5μl点于NC膜上，37℃30min干燥后，用含10%小牛血清的PBST封闭，室温轻摇过夜；PBST洗涤后，再将NC膜浸入细胞培养上清或稀释的腹水中，37℃孵育2h；PBST洗涤3次，每次10min，再浸入工作浓度的羊抗鼠HRP-Ig(G+M)酶标抗体溶液中，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，每次10min，最后DAB显色，蒸馏水终止反应。

[0089] 在Dot-ELISA试验中，单抗2G5和5E11只与rBoIFN-γ反应，而不与原核表达的上述其它重组细胞因子和对照菌反应。

[0090] 实施例4试剂盒的组装

[0091] 步骤：

[0092] 1）生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体（记为Bio-5E11）的制备：

[0093] 将纯化5E11单抗采用标准生物素标记法进行标记。溶解2~10mg单抗5E11蛋白于1ml的磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数；平衡生物素至室温，加2mg Sulfo-NHS-Biotin于100ul超纯水中，加入一定浓度的生物素；室温30分钟，或冰上放置2小时；用30ml PBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5ml或1ml于单独的管中，以280nm的吸收值测定单抗蛋白含量。

[0094] 2）将96孔滤膜板、单抗2G5、生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体分别包装组装成试剂盒。

[0095] 进一步的，试剂盒中依据需要组装入：亲和素-碱性磷酸酶结合物、NBT/BCIP底物液、浓缩PBS缓冲液、封闭液、细胞培养液、磷酸盐缓冲液或磷酸盐吐温缓冲液中的一种或多种。

[0096] 试剂盒中，微孔滤膜板、单抗2G5也可采用包被牛γ干扰素单克隆抗体的微孔滤膜板替代。

[0097] 包被牛γ干扰素单克隆抗体的微孔滤膜板的制备方法：

[0098] ①96孔滤膜板中加入2.5μg/mL的捕获牛γ干扰素抗体2G5，100μL/孔，4℃过夜包被；

[0099] ②弃包被液，使用含有0.05%吐温的灭菌PBST洗板3次，5min/次；

[0100] ③加入含10%胎牛血清的完全1640培养基，200μL/孔，37℃孵育封闭2h；

[0101] ④弃封闭液，使用PBST洗板1次，将96孔滤膜板放于密封袋中，置4℃保存。

[0102] 实施例5牛外周血单个核细胞样品的检测

[0103] 1.抗体包被

[0104] ①96孔滤膜板中加入2.5μg/mL的捕获牛γ干扰素抗体2G5，100μL/孔，4℃过夜包被；

[0105] ②弃包被液，使用含有0.05%吐温的灭菌PBST洗板3次，5min/次；

[0106] ③加入含10%胎牛血清的完全1640培养基，200μL/孔，37℃孵育封闭2h；

[0107] ④弃封闭液，使用PBST洗板1次，将96孔滤膜板直接用于检测，或放于密封袋中，置4℃保存，1周内使用。

[0108] 2.牛外周血单个核细胞的制备

[0109] ①无菌采取5mL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；

[0110] ②将抗凝血与灭菌PBS 1：1稀释后，再按1：1的比例将稀释牛血缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000rpm离心20-30min；

[0111] ③可见外周血单个核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入灭菌PBS，将细胞混匀后，于室温2000rpm离心10min，重复两次；

[0112] ④弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μL细胞悬液加入10μL台酚蓝混匀后加入血球计数板，在显微镜下计数，并使用完全1640培养基将细胞悬
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液稀释至1×10 个细胞/mL。

[0113] 3.细胞孵育及检测

[0114] ①在上述包被的96孔滤膜板中加入下列试剂：50μL培养液至每个对照孔，50μL5μg/mL的PWM至每个阳性孔。每孔加入50μL细胞悬液，将96孔滤膜板置于37℃、5% CO2培养箱培养24-48小时；

[0115] ②将96孔滤膜板取出，弃培养上清，使用PBST洗板5次，5min/次，洗板后甩干。加入1μg/mL的牛γ干扰素检测抗体Bio-5E11，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；

[0116] ③用PBS洗板3次，5min/次，洗板后甩干，加入1：1000稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；

[0117] ④每孔加入100μL底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置于室温避光显色。在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，去除液体，室温下过夜或37℃烤箱中2-3小时烘干；

[0118] ⑤使用倒置显微镜计数每个反应孔中紫色的斑点，每一个点代表一个分泌牛γ干扰素的T细胞；或将96孔滤膜板放入ELISPOT仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。试验结果参见图1，结果显示在检测牛外周血单核细胞样品时，阳性样品孔中出现的特异性斑点数显著多于对照样品孔，这表明该试剂盒可以有效检测出PWM刺激牛外周血中分泌牛γ干扰素的T淋巴细胞，具有较好的灵敏度和特异性。

[0119] 实施例6牛全血样品的检测

[0120] 1.抗体包被

[0121] ①96孔滤膜板中加入2.5μg/mL的捕获牛γ干扰素抗体2G5，100μL/孔，4℃过夜包被；

[0122] ②弃包被液，使用含有0.05%吐温的灭菌PBST洗板3次，5min/次；

[0123] ③加入含10%胎牛血清的完全1640培养基，200μL/孔，37℃孵育封闭2h；

[0124] ④弃封闭液，使用PBST洗板1次，将96孔滤膜板直接用于检测，或放于密封袋中，置4℃保存，1周内使用。

[0125] 2.全血孵育及检测

[0126] ①无菌采取1mL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；

[0127] ②在上述包被的96孔滤膜板中加入下列试剂：50μL培养液至每个对照孔，50μL5μg/mL的PWM至每个阳性孔。每孔加入50μL牛全血（与灭菌PBS 1：1稀释），将96孔滤膜板置于37℃、5%CO2培养箱培养24-48小时；

[0128] ③将96孔滤膜板取出，弃培养上清，使用PBST洗板5次，5min/次，洗板后甩干。加入1μg/mL的牛γ干扰素检测抗体Bio-5E11，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；

[0129] ④用PBS洗板3次，5min/次，洗板后甩干，加入1：1000稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；

[0130] ⑤每孔加入100μL底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置于室温避光显色。在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，去除液体，室温下过夜或37℃烤箱中2-3小时烘干；

[0131] ⑥使用倒置显微镜计数每个反应孔中紫色的斑点，每一个点代表一个分泌牛γ干扰素的T细胞；或将96孔滤膜板放入ELISPOT仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。结果如图2所示。结果表明本发明的试剂盒也可用于对牛全血进行直接检测，结果同样可以检测出阳性孔中分泌牛γ干扰素的T淋巴细胞。

[0132] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。