一种N-(3-氧化十二烷酰基)-L-同型丝氨酸内酯核酸适体及其筛选方法和应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种N-(3-氧化十二烷酰基)-L-同型丝氨酸内酯(OdDHL)核酸适体及其筛选方法和应用，本发明的核酸适体能够高亲和力和高特异性结合OdDHL，从而具有干扰铜绿假单胞菌的群体效应系统，抑制铜绿假单胞菌毒力基因的表达的潜力。本发明的核酸适体与OdDHL结合的亲和力与抗体相当，而且制备过程更加简单、更易于操作，且成本更低。

权利要求

1.一种 N-(3-氧化十二烷酰基)-L-同型丝氨酸内酯(OdDHL)核酸适体，其特征在于：所述核酸适体为SEQ ID NO:1所示的DNA分子。

2. 一种如权利要求1所述的核酸适体的应用，其特征在于：在制备抑制铜绿假单胞菌毒性的试剂中的应用。

说明书

一种 N-(3-氧化十二烷酰基)-L-同型丝氨酸内酯核酸适

体及其筛选方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用分子生物学技术筛选到一种能够与N-(3-氧化十二烷酰基)-L-同型丝氨酸内酯发生高亲和力和特异性结合的核酸适体及其筛选方法和应用。

背景技术

[0002] 铜绿假单胞菌（Pseudomonase aeruginosa，PA）是一种机会感染性致病菌，它对临床上应用的大部分抗生素都具有较强的耐药性，而且其耐药性的发展速度非常快，极易对新型抗生素产生耐药性。

[0003] 研究表明，铜绿假单胞菌产生的各种严重感染与其毒力因子的释放密切相关，而铜绿假单胞菌的绝大部分毒力因子的表达都受其群体效应系统（quorum sensing，QS）的正性调控。N-(3-氧化十二烷酰基)-L-同型丝氨酸内酯（N-(3-oxo-dodecanoyl)-l-homoserine lactone，简称OdDHL）是铜绿假单胞菌群体效应系统的信号分子，铜绿假单胞菌在生长过程中，不断向细胞外分泌OdDHL，当细菌周围环境中的OdDHL浓度达到阈值时，便激活铜绿假单胞菌的QS系统，启动细菌毒力基因的表达，增强铜绿假单胞菌的致病性。研究发现，干扰铜绿假单胞菌的群体效应系统可以抑制细菌毒力，降低其致病性，具有治疗感染的作用。

[0004] 目前，国外已经报道了一类可以与OdDHL结合的鼠源性单克隆抗体，亲和力在5nM～150nM之间。这类抗体在体外实验中可结合OdDHL分子，干扰铜绿假单胞菌的QS系统的信号转导，从而可抑制细菌毒力的表达。然而，这类抗体虽然具有治疗铜绿假单胞菌感染的潜在价值，但由于鼠源性抗体对人类来说是一种异种蛋白，如果直接将OdDHL的鼠源性单克隆抗体应用于人体的治疗，人体可产生针对鼠抗的抗体（人抗鼠反应），从而与抗体结合并清除鼠抗，降低其的疗效。而且，直接应用鼠源性抗体还可能会诱发过敏反应，对患者造成损伤。由此，鼠源性抗体需要通过人源化改造后才能应用于人体，但是，鼠源性抗体的人源化改造是一个复杂、费时的过程，对技术要求相当高，而且在改造过程中容易导致抗体亲和力降低，甚至完全丧失，这导致鼠源性抗体应用于治疗的开发逐渐被放弃。

[0005] 与抗体相比，核酸适体是通过体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)从DNA/RNA文库中筛选出来的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸片段（ssDNA或ssRNA），它具有高特异性和亲和力识别其靶标分子，一些与疾病密切相关的生长因子、酶、受体等物质均能成为核酸适体的靶标，而且其化学性质稳定，因此，亟需要研究和发展能够特异性抑制铜绿假单胞菌毒性的核酸适体，从而为疾病治疗的临床应用奠定基础。

发明内容

[0006] 本发明的目的之一在于克服现有技术中的不足之处而提供一种易于制备、节约成本、安全性好的能够与OdDHL高亲和力和高特异性结合的核酸适体。

[0007] 本发明的目的之二在于克服现有技术中的不足之处，提供一种上述核酸适体的筛选方法。

[0008] 本发明的目的之三在于克服现有技术中的不足之处，提供一种上述核酸适体在制备抑制铜绿假单胞菌毒性的试剂中的应用。

[0009] 本发明的目的由以下技术措施实现：

[0010] 提供一种N-(3-氧化十二烷酰基)-L-同型丝氨酸内酯（OdDHL）核酸适体，所述核酸适体为SEQ ID NO:1核苷酸序列所示的DNA分子。

[0011] 本发明还提供一种上述核酸适体的筛选方法，包括以下步骤：

[0012] (1) OdDHL类似物与载体的偶联

[0013] 用冰冷的MES缓冲液配制浓度均为20mg/ml的OdDHL类似物及EDC溶液，将二者加入到用MES缓冲液充分洗涤后的氨基化纳米磁颗粒中，室温下反应2h，OdDHL类似物通过其分子中的羧基与氨基化纳米磁颗粒表面的氨基发生缩合反应，使分子偶联到氨基化纳米磁颗粒的表面；偶联结束后，用Tris-HCl缓冲液充分洗涤去除EDC及未偶联的OdDHL类似物后，获得的偶联有OdDHL类似物的氨基化纳米磁颗粒备用；

[0014] (2) 随机单链DNA文库的设计

[0015] 随机单链DNA文库是两端为固定的引物序列、中间为45个碱基的随机序列：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-(N45)- CAAAGTGCACGCTACTTCGTAA -3’，其中，N45表示45个随机核苷酸；

[0016] (3) 核酸适体的筛选

[0017] a）正向筛选

[0018] ① 随机单链DNA文库的预处理

[0019] 将步骤(2)设计的随机单链DNA文库于95℃变性5min后立即置于冰中10min，然后用选择缓冲液稀释至所需体积；

[0020] ②随机单链DNA文库中单链DNA与OdDHL类似物的结合

[0021] 将经过预处理后的随机单链DNA文库加入到步骤(1)获得的偶联有OdDHL类似物的氨基化纳米磁颗粒中，并于37℃缓慢颠倒混合温育45min，在磁力架上静置5min，再用洗涤缓冲液连续洗涤，去除未与靶分子结合及结合不牢固的单链DNA；

[0022] ③ 单链DNA的扩增

[0023] 将所述步骤②获得的溶液，用Tris-HCl重悬氨基化纳米磁颗粒，上磁力架，取上清液作为PCR模版，用第一引物和生物素标记的第二引物进行PCR扩增；

[0024] ④ 用于下一轮筛选的单链DNA的制备

[0025] 将所述步骤③获得的PCR产物用PCR产物纯化试剂盒进行回收，然后加入到链亲和素磁珠中，室温下温育30min后，上磁力架，去掉上清，向氨基化纳米磁颗粒中加入200mol/L的氢氧化钠溶液，使目的单链DNA脱离氨基化纳米磁颗粒；然后在磁力架上静置后，取上清，用200mmol/L的盐酸调节pH值至6.8-7.2，所获得的单链DNA即可用于下一轮筛选；

[0026] b）反向筛选

[0027] 为了除去文库中可能存在的与磁珠本身结合的核酸适体，在每两轮正向筛选之间，进行一次反向筛选：将经过正向筛选后获得的单链DNA加入到未与OdDHL类似物偶联的氨基化纳米磁颗粒中，于37℃缓慢颠倒混合温育45min，使氨基化纳米磁颗粒与核酸适体充分结合，然后在磁力架上静置后，取上清，用上清进行下一轮筛选；

[0028] (4) 克隆测序

[0029] 经过上述多轮正向筛选和反向筛选后，将筛选所获的PCR产物，克隆入T-A克隆载体，转化大肠杆菌DH5α，取阳性克隆进行测序，并制备单链DNA并进行亲和力检测，最终获得核酸适体。

[0030] 其中，步骤③中，所述第一引物的序列为：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-3’；所述第二引物的序列为：5’-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’。

[0031] 其中，步骤a中，所述选择缓冲液为pH7.4的50 mmol/L Tris-HCl含1% BSA、0.01%鲑鱼精DNA、100 mmol/L NaCl、

[0032] 1 mmol/L MgCl2、5 mmol/L KCl和0.05% Tween 20 配置而成的溶液。

[0033] 其中，步骤a中，所述洗涤缓冲液为pH 7.4的50 mmol/L Tris-HCl含0.05%（V/V）Tween 20 配置而成的溶液。

[0034] 本发明的核酸适体可用于制备抑制铜绿假单胞菌毒性的试剂：

[0035] 由于上述核酸适体能够特异性结合OdDHL分子，干扰铜绿假单胞菌的群体效应系统系统的信号转导，从而可抑制铜绿假单胞菌毒力的表达，并对核酸适体抑制铜绿假单胞菌群体效应系统介导的毒力表达功能进行验证：

[0036] 采用一株由哥本哈根大学Michael Givskov教授赠送的表达绿色荧光的铜绿假单胞菌报告菌株PAO1验证核酸适体的功能；

[0037] 由于PAO1细菌能够表达一种受弹性蛋白酶B毒素启动子调控的绿色荧光蛋白，而弹性蛋白酶B毒素启动子又受群体效应系统的调控，因此，绿色荧光蛋白的表受到群体效应系统的调控，故可以用绿色荧光蛋白的表达与否或者表达量的高低来表示铜绿假单胞菌群体效应系统的激活状态及毒素的表达水平，从而验证核酸适体干扰其群体效应系统并抑制毒力因子表达的功能；

[0038] 向PAO1细菌培养物中加入核酸适体至终浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4及0.5μmol/L，在37℃培养16小时后，在synergy biotek多功能酶标仪上读取荧光值，激发光为485nm，发射光为525nm，同时设置不加核酸适体的空白对照和加入无关DNA的阴性对照；

[0039] 实验结果表明，该核酸适体可以有效地抑制铜绿假单胞菌毒力的表达。

[0040] 本发明的有益效果：

[0041] 本发明采用SELEX技术筛选到一种能够与OdDHL高亲和力和高特异性结合的核酸适体，该核酸适体能结合OdDHL，因而具有干扰铜绿假单胞菌的群体效应系统，抑制铜绿假单胞菌毒力基因的表达的作用。由于干扰细菌群体效应系统并不具有杀菌或者抑菌的作用，不对细菌的生长产生选择压力，因此，本发明的核酸适体既具有抗铜绿假单胞菌感染的潜力，又不存在诱发耐药性的风险；

[0042] 核酸适体仅需要通过简单的PCR技术即可大量制备，与抗体相比，核酸适体的生产过程更加简单，成本更低，无明显的毒性及过敏源性，而且核酸适体是一种DNA分子或者经过修饰后的RNA，其理化性质相当稳定，无需特殊条件即可以稳定保存。另一方面，单克隆抗体的分子量为160KD，而核酸适体的分子量介于4.95KD-29KD之间，在相同质量的情况下，核酸适体捕获的靶分子较抗体多，治疗效果可能会更好，到目前为止，尚未发现核酸适体具有明显的毒性或过敏源性，因而，本发明的核酸适体完全可以替代抗体，可用于制备抑制铜绿假单胞菌毒性的试剂，其具有极佳的临床治疗应用前景。

附图说明

[0043] 图1为本发明的OdDHLS的核磁共振碳谱图。

[0044] 图2为本发明的OdDHLS的核磁共振氢谱图。

[0045] 图3为本发明的OdDHLS在MES缓冲液(pH5.0)中的HPLC检测结果图。

[0046] 图4为本发明的OdDHLS在Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中的HPLC检测结果图。

[0047] 图5为本发明的核酸适体对OdHLS亲和力的SPR检测结果图。

[0048] 图6为本发明的荧光竞争法检测核酸适体对OdHL亲和力的检测结果图。

[0049] 图7为本发明的核酸适体抑制LasB毒素分泌的作用结果图。

具体实施方式

[0050] 以下通过实施例对本发明进行进一步描述。

[0051] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0052] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0053] 实施例1核酸适体

[0054] 核酸适体的核苷酸序列为：

[0055] GCAATGGTACGGTACTTCCACCTTGAGAGCTGTCTGATCTGTACACGCCCTTTTACATGCTCATCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA （SEQ ID NO:1）。

[0056] 实施例2 核酸适体的筛选方法

[0057] 一、主要试剂及缓冲液：

[0058] （一）主要试剂：

[0059] 1. OdDHL类似物（OdDHL surrogates，OdDHLS）

[0060] 本 发 明 选 用 的 OdDHLS 为：7-oxo-7-[[(3S)-2-oxo-3-pyrrolidinyl] amino]-Heptanoic acid，是由上海科胜药物研发有限公司合成。

[0061] OdDHL和OdDHLS的化学式：

[0062]

[0063] OdDHLS的核磁共振（NMR）及稳定性检测结果如下：

[0064] 1）OdDHLS的核磁共振检测

[0065] 如图1和图2所示，分别为OdDHLS的核磁共振碳谱图和氢谱图，其中：

[0066] 图 1：1H NMR (CD3OD,400MHz),δppm ： 4.52-4.47 (m,1H,-HCN-)；3.42-3.36 e(m,2H,-HNCH2-)；2.53-2.50(m,1H,ring–HCH-)；2.38-2.22(m, 4 H, HNCOCH2-)；
a
2.08-1.92(m,1H,ring–HCH-)；2.70-2.57(m,4H,2(-CH2-))；1.45-1.38 (m,2H,-CH2-)；

[0067] 图 2：13C NMR (CD3OD, 400MHz),δppm：177.84 (O-C=O)；176.44 (2(-NHC=O) ；51.77 (-CH-NH-)；40.18 (-H2C-COOH)；36.86 (-NHCO-CH2-)；34.88 (NH2-CH2-)；29.83(-CH2-)；29.56(-CH2-)；26.61(ring,-CH2-)；25.88(-CH2-)。

[0068] 图1和图2所示的核磁共振碳谱和氢谱的解谱结果表明：合成的分子即为预期的OdDHLS分子。

[0069] ）OdDHLS的稳定性检测：

[0070] 将OdDHLS分别溶解在Tri-HCl 缓冲液 (50mM, pH7.4) 和 MES 缓冲液 (0.1M, pH5.0) 中，至终浓度1mg/ml，然后用HPLC检测0、2、4、8、12和24小时的稳定性 (Agilent XDB-C18 250mm×4.6mm, 5μm；流速：1.0ml/min；温度：30℃；检测器：210nm)。

[0071] HPLC检测结果如图3和图4所示：

[0072] 图3中，Blank表示MES 缓冲液的HPLC出峰图，其余的为OdDHLS在0～24h的稳定性检测结果；箭头表示OdDHLS的峰位置。

[0073] 结果表明，在MES缓冲液中，OdDHLS在24小时内无明显降解，能够稳定存在，完全可用于通过EDC在MES缓冲液中进行偶联。

[0074] 图4中，Blank表示Tris-HCl 缓冲液的HPLC检测的出峰图，其余的为OdDHLS在0h～24h的稳定性检测结果；箭头表示OdDHLS的峰位置。

[0075] 结果表明，在pH值为7.4的Tris-HCl 缓冲液中，OdDHLS能够稳定存在，完全可以用pH值为7.4的Tris-HCl 缓冲液进行核酸适体的筛选。

[0076] 其他主要试剂

[0077] PCR产物纯化试剂盒（购自Qaigen公司）、T-A克隆试剂盒及Taq DNA聚合酶（购自宝生物大连有限公司）、Oligreen 单链DNA染料（购自Invitrogen公司）、氨基化纳米磁颗粒Dynabeads® M-270 Amine磁珠及链亲和素磁珠（购自Invitrogen公司）、2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid（MES，Ameresco）、生 物 素 及 EDC（购 自Thermofisher公司），牛血清白蛋（bovin serum album，BSA）购自罗氏公司。

[0078] （二）主要缓冲液及溶液

[0079] 1.Tris-HCl缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4；

[0080] 2.MES缓冲液：0.1M，pH5.0；

[0081] 3.选择缓冲液（selection buffer，SB）：pH 7.4的50 mmol/L Tris-HCl含1% BSA、0.01%鲑鱼精DNA、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2、5 mmol/L KCl和0.05% Tween 20；

[0082] 4.洗涤缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl含0.05%（V/V）Tween 20，pH 7.4；

[0083] 5.40%丙烯酰胺溶液：分别加入 38g 丙烯酰胺和 2g 亚甲双丙烯酰胺，用蒸馏水定溶至 100ml；

[0084] 6.DNA上样缓冲液：尿素 4.8g、0.5M EDTA 0.4ml、1M Tris-HCl（pH 8.5） 0.05ml、溴酚蓝 0.025g、超纯水定容至 10ml，4℃贮存；

[0085] 7.包被缓冲液：pH 9.5，每升含1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3，2mL 10% NaN3； [0086] 8.封闭缓冲液：即含有1% BSA 和0.05%Tween 20的PBS缓冲液。

[0087] 二、OdDHL核酸适体的筛选方法，包括以下步骤：

[0088] 1. OdDHLS与载体的偶联

[0089] 用冰冷的MES缓冲液配制浓度均为20mg/ml的OdDHLS及EDC溶液，将二者加入到用MES缓冲液充分洗涤后的100μl氨基化纳米磁颗粒（羧基结合容量为0.152μmol/ml）中，室温下反应2h，OdDHLS通过其分子中的羧基与氨基化纳米磁颗粒表面的氨基发生缩合反应，使分子偶联到氨基化纳米磁颗粒的表面；偶联结束后，用Tris-HCl缓冲液充分洗涤去除EDC及未偶联的OdDHLS后，获得的偶联有OdDHLS的氨基化纳米磁颗粒备用。

[0090] 随机单链DNA文库的设计

[0091] 随机单链DNA文库由Invitrogen广州公司合成，中间45个碱基为随机序列，两端15
为固定的引物序列，库容量大约为10 ，如下：

[0092] 5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-(N45)-CAAAGTGCACGCTACTTCGTAA -3’。

[0093] 引物由Invitrogen广州公司合成，用于核酸适体的扩增、扩增结果的检测及从PCR产物中分离单链DNA的分离：

[0094] 第一引物：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-3’；

[0095] 生物素标记的第二引物：5’-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’；

[0096] 3. 核酸适体的筛选

[0097] a）正向筛选

[0098] ① 随机单链DNA文库的预处理

[0099] 将步骤(2)设计的随机单链DNA文库于95℃变性5min后立即置于冰中10min，然后用选择缓冲液稀释至100μl；

[0100] ②随机单链DNA文库中单链DNA与OdDHL类似物的结合

[0101] 将经过预处理后的随机单链DNA文库加入到步骤(1)获得的偶联有OdDHL类似物的氨基化纳米磁颗粒中，并于37℃缓慢颠倒混合温育45min，在磁力架上静置5min，再用200μl 洗涤缓冲液连续洗涤5次，每次3min，去除未与靶分子结合及结合不牢固的单链DNA，如此重复5次；

[0102] ③ 单链DNA的扩增

[0103] 将所述步骤②获得的溶液，用100μl Tris-HCl重悬氨基化纳米磁颗粒，95 ℃处理5min，上磁力架，取上清液作为PCR模版，用第一引物和第二引物按照下述方案进行PCR扩增：94℃ 5min后，进行3个循环：94℃ 1min，37℃ 1min 20sec，58 ℃40sec；然后58℃2min；取 1μl上述PCR 产物为模板，再次 PCR扩增，每3个循环取样进行凝胶电泳分析：

[0104] i) 制备聚丙烯酰胺凝胶：将尿素3.78g、40%丙烯酰胺溶液2.7ml、10×TBE0.9ml、超纯水3.2ml、TEMED 90μl及10%过硫酸铵90μl混合制成尿素-聚丙烯酰胺凝胶；

[0105] ii) 将 DNA 样品与DNA上样缓冲液混合，80℃处理5min，加样，在 100V 恒压下进行电泳，电泳结束后，取胶进行银染，检测DNA电泳的条带；

[0106] 根据电泳结果，选择 PCR 产量大、无杂带的循环数为最佳循环数，然后按最佳循环次数将剩余 PCR产物扩增成双链DNA；

[0107] ④ 用于下一轮筛选的单链DNA的制备

[0108] 将所述步骤③获得的PCR产物用PCR产物纯化试剂盒进行回收，然后加入到链亲和素磁珠中，室温下温育30min后，上磁力架，去掉上清，向氨基化纳米磁颗粒中加入200mol/L的氢氧化钠溶液，处理30min，使目的单链DNA脱离氨基化纳米磁颗粒；在磁力架上静置5min，取上清，用200mmol/L的盐酸调节pH值至7.0左右，所获得的单链DNA即可用于下一轮筛选。

[0109]）反向筛选

[0110] 为了除去文库中可能存在的与磁珠本身结合的核酸适体，在每两轮正向筛选之间，进行一次反向筛选：将经过正向筛选后获得的单链DNA加入到未与OdDHL类似物偶联的氨基化纳米磁颗粒中，于37℃缓慢颠倒混合温育45min，使氨基化纳米磁颗粒与核酸适体充分结合，然后再磁力架上静置5min，取上清，用上清进行下一轮筛选；

[0111] (4) 克隆测序

[0112] 经过上述多轮正向筛选和反向筛选后，取第14轮筛选所获的PCR产物，克隆入T-A克隆载体，转化大肠杆菌DH5α，取阳性克隆进行测序，并制备单链DNA，最终获得优化的核酸适体。

[0113] 三、核酸适体与OdDHLS的亲和力（解离平衡常数Kd）的检测

[0114] 1.SPR技术检测

[0115] 采用strepavidin芯片，在Biacore3000上进行表面等离子共振检测，检测温度为25℃；芯片用30 μl 1M NaCl （含50 mM NaOH）洗涤两次，然后在第一通道注射溶于工作缓冲液 （50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.4，0.005%（V/V）Tween 20）的10nM生物素化的OdDHL样品，上样流速为5 ul/ml，第二通道同时注射工作缓冲液，作为对照。

[0116] 将核酸适体溶于工作缓冲液（10至 500 nM）后上样，上样时间为120s，滞留300s，然后洗涤五次；芯片表面用溶于工作缓冲液的30 μl的5 M 尿素进行再生，用仪器自带的软件进行Kd的分析。

[0117] 核酸适体对OdHLS 亲和力的SPR检测结果如图5所示。

[0118] 核酸适体对OdHLS 亲和力的SPR检测结果表明，核酸适体与OdDHL的亲和力的解7
离平衡常数Kd为30nM，由于Ka为Kd的倒数，Ka为3.3×10 L/mol。

[0119] 荧光竞争法检测

[0120] 由于天然的OdDHL分子的内酯环容易水解，因此，无法采用上述SPR技术检测亲和力，只能采用荧光竞争法检测。

[0121] 用不同浓度的OdDHLS-BSA包被96孔酶免疫板4℃过夜，用PBST充分洗涤5次后，用封闭缓冲液封闭2h，然后用洗涤缓冲液洗涤5次；加入100μl含有200ng的核酸适体，37℃温育30min，充分洗涤后，加入0nM～1μM的ODDHL分子溶液100μl，37℃温育30min；
用洗涤缓冲液充分洗涤后，加入同1：200倍稀释的oligreen染料，室温下温育15min，在多功能酶标仪Synergy BioTek上检测荧光（激发光为480nm，发射光为520nm）。每个浓度重复三次。采用Oligo7.0软件拟合曲线。核酸适体使最大荧光值下降50%的ODDHL溶液的浓度即为核酸适体的亲和力，Kd。

[0122] 如图6所示，荧光竞争法检测核酸适体对OdHL亲和力检测结果，通过拟合方程计算出Kd为55nM。

[0123] 四、核酸适体抑制铜绿假单胞菌群体效应系统介导的毒力表达功能的验证[0124] 采用一株由哥本哈根大学Michael Givskov教授赠送的表达绿色荧光的铜绿假单胞菌报告菌株（PAO1）来验证核酸适体在抑制铜绿假单胞菌群体效应系统介导的毒力因子表达的功能。

[0125] 该细菌能够表达一种受弹性蛋白酶B（简称LasB）毒素启动子调控的绿色荧光蛋白，而LasB毒素启动子又受群体效应系统的调控，因此，绿色荧光蛋白的表受到群体效应系统的调控，故可以用绿色荧光蛋白的表达与否或者表达量的高低来表示铜绿假单胞菌群体效应系统的激活状态及毒素的表达水平，从而验证核酸适体干扰其群体效应系统并抑制毒力因子表达的功能。

[0126] 具体方法为：向PAO1细菌培养物中加入核酸适体至终浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4及0.5μmol/L，在37℃培养16小时后，在synergy biotek多功能酶标仪上读取荧光值，激发光为485nm，发射光为525nm；同时设置不加核酸适体的空白对照和加入无关DNA的阴性对照。

[0127] 检测结果如图7所示，随着核酸适体浓度的增加，抑制LasB毒素分泌的作用也随之增加，在浓度为0.5μmol/L时，可抑制96%的该LasB毒素的分泌。

[0128] 结果表明，该核酸适体可以有效地抑制铜绿假单胞菌毒力的表达。

[0129] 最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。