电感耦合等离子体质谱在氯高铁血红素药物检测中的应用转让专利
申请号 : CN201210483525.6
文献号 : CN102967649B
文献日 : 2015-03-04
发明人 : 陈西敬 , 赵娣 , 江骥 , 胡蓓 , 张永杰 , 王越 , 张训缨 , 唐明清 , 刘进兵 , 王子厚
申请人 : 新疆科丽生物技术有限公司
摘要 :
本发明涉及电感耦合等离子体质谱在氯高铁血红素药物检测中的应用。测定动物血浆中稳定性同位素铁浓度的方法使用ICP-MS法进行测定，步骤：提供电感耦合等离子体质谱仪；确定ICP-MS的工作条件；提供稳定性同位素铁粉末、标记后的氯高铁血红素、内标元素等；配制标准溶液和内标溶液；ICP-MS稀释剂的配制；标准曲线的建立；血浆中同位素铁浓度测定：取含有铁的动物血浆样品样品管，加入ICP-MS稀释剂，混匀后置冰箱冷藏，进样测定，用所得标准曲线确定血浆中铁的浓度。本发明方法具有良好的性能，例如该方法具有良好的定量下限、精密度、绝对回收率试验、样品稳定性、介质效应和质量控制要求，可以作为分析生物样品例如血浆中稳定性同位素铁的含量测定方法。
权利要求 :
58
1.测定动物血浆中稳定性同位素 Fe浓度的方法，该方法是使用电感耦合等离子体质谱法进行测定，其包括以下步骤：(1)提供电感耦合等离子体质谱仪即ICP-MS仪；
(2)确定ICP-MS的工作条件；
58
(3)提供稳定性同位素 Fe金属粉末、标记后的氯高铁血红素、内标元素锗、曲拉通；
(4)配制标准溶液和内标溶液；
(5)ICP-MS稀释剂的配制；
58
(6)标准曲线的建立：取Eppendorf管9个，加入 Fe对照品溶液50 μL，于37°C恒温水浴挥干后，分别加入大鼠空白血浆50 μL，混匀后加入所配制的ICP-MS稀释剂，使得58
Fe在血浆中的浓度分别为0、5、10、20、50、100、200、800、1000 ng/mL，涡旋混合30秒，借助三通装置，进行在线加入内标，进样测定，以校正后的响应值ICPS为纵坐标，浓度C为横坐58
标，浓度C的单位为ng/mL，进行回归，得 Fe的标准曲线；
58 58
(7)血浆中 Fe的浓度测定：取服用含 Fe的物质的动物血浆样品50 μL至Eppendorf管，加入ICP-MS稀释剂950 µL，混匀后置4°C冰箱冷藏，进样测定，用步骤(6)所得标准58
曲线确定血浆中 Fe的浓度。
2.根据权利要求1的方法，其中所述ICP-MS的工作条件为：离子源为ICP 源，采用石英玻璃同心雾化器，规格为0.8 mL/m，整体型石英炬管，1.5 mm口径喷射；雾化器氩气的流量为0.7L/min；检测模式为CCT模式，使用含7%(v/v)H2的He作为碰撞气；检测器模拟级电压为1880 v，检测器脉冲级电压为3812 v，射频功率为1300 w，冷却气流量为13.0L/min，样品提升量为1 mL/min，样品提升时间为40 s，重复次数为3次，分别选择铁Fe(54，58)，镍Ni(58)，铬Cr(53)，锗Ge(72)为扫描元素，扫描方式为跳峰扫描。
3.根据权利要求1的方法，其中所述动物是大鼠。
4.根据权利要求1的方法，其中所述电感耦合等离子体质谱仪是Thermo SCIENTIFIC的型号为X SERIES 2的ICP-MS仪。
5.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中，在配制标准溶液和内标溶液时，分别配制58
含 Fe浓度为2 mg/mL的储备液，溶剂是2%的硝酸；配制含锗浓度为1 mg/mL的内标溶液，溶剂是2%的硝酸。
6.根据权利要求1的方法，其中步骤(5)中，该ICP-MS稀释剂中含有水、曲拉通、硝酸和丁醇。
7.根据权利要求6的方法，该ICP-MS稀释剂中曲拉通、硝酸和丁醇三者的重量比为1：4.5-5.5：180-220。
8.根据权利要求6的方法，该ICP-MS稀释剂中曲拉通、硝酸和丁醇三者的重量比为1:5:200。
9.根据权利要求6的方法，用去离子水配制ICP-MS稀释剂，使得去离子水中曲拉通、硝酸和丁醇的比例分别0.01%、0.05%和2%。
58 58
10.制备 Fe标记的氯高铁血红素的方法，该方法包括以下步骤：使用 Fe和盐酸或氯化氢气体，在无氧条件下制备无水氯化亚铁；以此无水氯化亚铁为原料与酸化的原卟啉钠58
反应，经过后处理制备出以 Fe标记的氯高铁血红素。
11.根据权利要求10的方法，该方法包括以下步骤：(1)称取铁粉于圆底烧瓶中，加入水，确保铁粉完全浸于水中，无附于瓶壁上；
(2)在90~120°C加热，同时通入HCl气体至水中，Fe粉表面有大量微小气泡产生，直至Fe粉完全消失，整个溶液澄清透明，停止通入HCl气体；
(3)在旋转蒸发仪上旋干水，同时给予氮气保护，得到淡绿色的FeCl2粉末；
(4)称取原卟啉钠，用80~120倍量的DMF溶解，加入浓盐酸酸化，充分振荡超声，使pH控制呈中性；以甲醇稀释，观察稀释液澄清，呈酒红色，无不溶颗粒；
(5)将酸化的原卟啉钠的DMF溶液转移至盛有FeCl2粉末的圆底烧瓶中；油浴升温至液内温度为130±2°C，隔一段时间取样，甲醇稀释以供HPLC分析，监测产物生成及原料减少情况，待产物生成达到平衡时，停止反应；
(6)取反应终液，置旋转蒸发仪上85°C加热，旋干DMF至只有5-10 mL的DMF剩余，取下反应瓶，冷却，加入大量的蒸馏水洗涤，使产物充分析出；
(7)向含有产物的混悬液中加入浓盐酸，使其pH<1；超声振荡30 min，静止；采用布氏漏斗和抽滤瓶抽滤，布氏漏斗上垫有两层混合滤膜，抽干后，再以蒸馏水洗涤沉淀至滤液呈中性；刮下滤饼，烘箱80°C烘干，以研钵研磨固体，得到细且均一的粉末，即为产物。
12.根据权利要求11的方法，其中步骤(1)中，所述的水是无氧水。
13.根据权利要求11的方法，其中步骤(1)中，铁粉与水的重量比为1：80~120。
14.根据权利要求11的方法，其中步骤(2)中，在110°C下加热。
15.根据权利要求11的方法，其中步骤(2)中，所述HCl气体是由浓硫酸和氯化钠新生成的HCl气体。
16.根据权利要求11的方法，其中步骤(4)中，原卟啉钠的取用量是铁用量的8~10倍。
17.根据权利要求11的方法，其中步骤(4)中，加入浓盐酸酸化，使pH=7±0.3。
18.根据权利要求11的方法，其还包括以下将所得产物进行重结晶的步骤(8)：(8)称取1重量份步骤(7)所得产物，置于烧杯中，加入50~100重量份DMF，超声溶解后过滤，以10~20重量份DMF洗涤滤饼，合并滤液；称取10~15重量份表面活性剂氯化苄基十二烷基二甲胺溶于水中，在恒温磁力搅拌器上加热至90°C；将滤液倒入表面活性剂溶液中，90°C下搅拌加热10 min；以滴液漏斗缓慢向其中滴加18%的盐酸溶液，其使用体积为表面活性剂溶液体积的40%；停止加热和搅拌，静置3 h，抽滤，刮下滤饼，烘干，即得。
19.根据权利要求18的方法，其中表面活性剂氯化苄基十二烷基二甲胺溶于水中制成浓度4~6%的溶液。
说明书 :
电感耦合等离子体质谱在氯高铁血红素药物检测中的应用
技术领域
[0001] 本发明属生物医药技术领域，具体涉及电感耦合等离子体质谱在氯高铁血红素药物检测中的应用。
背景技术
[0002] 铁是一种非常重要的金属元素，同时也是人体必须的微量元素。缺铁是世界范围内最常见的微量元素缺乏症，影响的人群包括成人、儿童、孕妇等达到了20亿人。由于铁缺乏症的普遍性与严重性，许多国家都要求将补铁纳入日常饮食中。目前的研究中铁以非血红素铁制剂为主，以强化铁的形式在膳食中出现。但是血红素铁是一种生物态铁，不会产生消化道刺激症状，吸收率高，影响吸收的因素少，容易获得，是一种比较理想的补铁剂。氯高铁血红素是血红素铁的稳定存在形态。
[0003] 现在市面上有各种各样的补铁剂，包括血红素铁和非血红素铁。通常都认为血红素铁的吸收要优于非血红素铁。血红素铁的基本结构成份是由吡咯组成的卟吩，带上侧链后形成卟啉，再和一分子亚铁构成化合物。当它一旦与珠蛋白分离后即自动氧化成三价铁。所以血红素铁是非常不稳定的。氯高铁血红素中的铁化学价为三价，是稳定的氧化态。和极易被氧化的血红素相比，用氯高铁血红素开展有机铁的吸收变得非常有意义。Villarroel和Jahn在体外Caco-2水平研究铁吸收时，也都支持了这一观点。
[0004] 血红素铁是一种生物态铁，吸收率高，影响吸收的因素少，不会产生消化道刺激症状，是一种比较理想的补铁剂。全世界每年可利用的畜禽血液资源相当可观，但是大部分屠宰场的血液都被废弃了。如果从中提制出的氯高铁血红素可以开发为补铁药，将会充分利用牧区的天然优势，有效的发挥血红蛋白的经济效益和社会效益。氯高铁血红素的化学结构式如下：
[0005]
[0006] 铁吸收研究存在有诸多问题。首先，生物样本中铁定量检测存在的有许多问题。与稀有元素铂不同的是，铁在自然界有较高的丰度而且是人体必需的元素，在血液和组织中大量存在。所以在进行体内铁含量测定时面临着如何解决内源性铁干扰的问题。这样在开展氯高铁血红素体内铁吸收时仍然非常困难。目前所测得的铁吸收率在不同实验室之间存在较大的差异。Meredith C Fidler等人的研究中，硫酸亚铁的吸收率为4.1％，但是在Femando Pizarro的研究中，硫酸亚铁的吸收率可以达到10.5%。另外同一实验室不同受试对象的实验结果也具有较大的个体差异。比如Femando Pizarro的研究中个体的硫酸亚铁吸收率在4.1%-27.0%之间。这就使得亟需建立生物样本中铁的测定方法。铁的定量常使用的方法是原子吸收分光光度法。但是这种方法存在很大的局限性。一是灵敏度过低。在尚所建立的方法里，定量下限为1μg/ml，线性范围为1-4μg/ml。同时所建立的方法通常是为了对食品和药品中的铁进行定量，由于低灵敏度，就很难拓展到生物样品分析中。二是本底问题。铁是一个非常有挑战性的金属元素，因为它在很多基质里都存在很高的背景，比如血液，组织甚至是空气和水。这样就很难区分开哪些是外源性铁，哪些是内源性铁。所以在建立生物样本中铁的定量方法的时候，必须使用标记的铁作为示踪剂以达到和内源性的
55 59
铁相区分准确定量的目的。铁的放射性同位素包括 Fe和 Fe，二者经常用于铁的吸收与代
59
谢研究中。在Swati’s的研究中，Fe被成功用于评价铁蛋白在Caco-2细胞水平的铁摄取情况。但是，放射性同位素存在辐射的危险性，相比之下，稳定性同位素可能是一个更好的
54 56 57 58
选择。自然界铁有四种同位素，Fe(5.85%)，Fe(91.75%)，Fe(2.12％)和 Fe(0.28％)。
鉴于ICP-MS(电感耦合等离子体质谱)可以同时检测同一元素不同同位素的特点，使得建立一种准确测定生物样本中铁摄取量的方法成为了可能。自从1983年，ICP-MS商业化以来，大量的试验已经表明其高灵敏度和选择性非常适合用于含金属药物的测定中。最近许多研究报道了ICP-MS在测定铁元素比例方面的应用。但是在Whittaker的方法中样品的分析非常耗时，同位素的比例变化而不是浓度作为了铁吸收研究的信息，另外该方法也没
58
有得到系统的认证。同时我们发现，尚未有人通过ICP-MS法对生物样本中的 Fe进行绝对定量。生物样本中铁定量检测存在的问题在包括钙、锌等元素在内的研究中普遍存在。存在的原因主要有以下两点：一，上述元素是人体必不可少的元素之一。内源性存在对测定干扰过大；二，上述微量元素在空气等自然环境中普遍存在，极容易在实验的一系列操作过程中引入外源性污染。传统的FAAS法、ICP-AES法只能对元素的总量进行测定，不能排除内源性干扰而严重影响实验结果的准确性。
55 59
铁相区分准确定量的目的。铁的放射性同位素包括 Fe和 Fe，二者经常用于铁的吸收与代
59
谢研究中。在Swati’s的研究中，Fe被成功用于评价铁蛋白在Caco-2细胞水平的铁摄取情况。但是，放射性同位素存在辐射的危险性，相比之下，稳定性同位素可能是一个更好的
54 56 57 58
选择。自然界铁有四种同位素，Fe(5.85%)，Fe(91.75%)，Fe(2.12％)和 Fe(0.28％)。
鉴于ICP-MS(电感耦合等离子体质谱)可以同时检测同一元素不同同位素的特点，使得建立一种准确测定生物样本中铁摄取量的方法成为了可能。自从1983年，ICP-MS商业化以来，大量的试验已经表明其高灵敏度和选择性非常适合用于含金属药物的测定中。最近许多研究报道了ICP-MS在测定铁元素比例方面的应用。但是在Whittaker的方法中样品的分析非常耗时，同位素的比例变化而不是浓度作为了铁吸收研究的信息，另外该方法也没
58
有得到系统的认证。同时我们发现，尚未有人通过ICP-MS法对生物样本中的 Fe进行绝对定量。生物样本中铁定量检测存在的问题在包括钙、锌等元素在内的研究中普遍存在。存在的原因主要有以下两点：一，上述元素是人体必不可少的元素之一。内源性存在对测定干扰过大；二，上述微量元素在空气等自然环境中普遍存在，极容易在实验的一系列操作过程中引入外源性污染。传统的FAAS法、ICP-AES法只能对元素的总量进行测定，不能排除内源性干扰而严重影响实验结果的准确性。
[0007] 获得同位素铁标记的氯高铁血红素是本领域技术人员期待的，并且期待这些同位素铁标记的氯高铁血红素可用于医药生物技术领域例如金属如铁的吸收、药代动力学及相关研究。
发明内容
[0008] 在本发明的诸多目的中，其中之一是提供一种同位素铁标记的氯高铁血红素，期待这些同位素铁标记的氯高铁血红素可用于医药生物技术领域例如金属如铁的吸收、药代58
动力学及相关研究。本发明人发现使用本发明所述方法获得同位素铁例如 Fe标记的氯高铁血红素可以有益地用于诸多生物学检测方法和科学研究中。本发明基于此发现而得以完成。为此，本发明提供了至少如下的一项或者多项以及说明书所记载的任何一方面和实施方案。
动力学及相关研究。本发明人发现使用本发明所述方法获得同位素铁例如 Fe标记的氯高铁血红素可以有益地用于诸多生物学检测方法和科学研究中。本发明基于此发现而得以完成。为此，本发明提供了至少如下的一项或者多项以及说明书所记载的任何一方面和实施方案。
[0009] 项目1、铁络合物在制备用于测试生物体吸收有机铁的试药中的用途。
[0010] 项目2、根据项目1的用途，其中铁选自54Fe、55Fe、56Fe、57Fe、58Fe、59Fe，优选58Fe。
[0011] 项目3、根据项目1-2任一项的用途，其如说明书所述。
[0012] 项目4、氯高铁血红素在制备用于测试生物体吸收有机铁的试药中的用途。
[0013] 项目5、根据项目4的用途，其中所述氯高铁血红素中的铁是同位素铁，例如选自54 55 56 57 58 59 58
Fe、Fe、Fe、Fe、Fe、Fe，优选 Fe。
Fe、Fe、Fe、Fe、Fe、Fe，优选 Fe。
[0014] 项目6、根据项目4的用途，其中所述氯高铁血红素中的同位素铁是外源性的。
[0015] 项目7、根据项目4-6任一项的用途，其如说明书所述。
[0016] 项目8、一种同位素铁标记的氯高铁血红素。
[0017] 项目9、根据项目8的氯高铁血红素，其中所述的同位素铁选自54Fe、55Fe、56Fe、57 58 59 58
Fe、Fe、Fe，优选 Fe。
Fe、Fe、Fe，优选 Fe。
[0018] 项目10、根据项目8的氯高铁血红素，其是58Fe标记的。
[0019] 项目11、根据项目8-10的氯高铁血红素，其如说明书所述。
[0020] 项目12、根据上述任一项项目，其中所述测试中使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法。
[0021] 项目13、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法在含金属药物体内分析与药动学研究测试中的应用。
[0022] 项目14、根据项目13的应用，其中所述含金属药物是金属络合物。
[0023] 项目15、根据项目13的应用，其中所述含金属药物是氯高铁血红素。
[0024] 项目16、根据项目13的应用，其中所述含金属药物是氯高铁血红素，所述铁是同58
位素铁 Fe。
位素铁 Fe。
[0025] 项目17、根据项目13-16的应用，其中所述测试的过程/方法/步骤如说明书所述。
[0026] 项目18、制备58Fe标记氯高铁血红素的方法，其如说明书所述。
[0027] 项目19、根据项目18的方法，其中使用58Fe对氯高铁血红素进行标记的步骤。
[0028] 项目20、根据项目18的方法，其包括如下步骤：使用58Fe和盐酸，在无氧条件下制备无水氯化亚铁；以此无水氯化亚铁为原料与酸化的原卟啉钠反应，经过后处理制备出以58
Fe标记的氯高铁血红素。
Fe标记的氯高铁血红素。
[0029] 项目21、根据项目20的方法，其中所述无水氯化亚铁(或58Fe)与原卟啉钠的重量比(或者摩尔比)为1:1~1:100，例如1:2~1:50，例如1:5~1:25。
[0030] 项目22、一种方法，其如说明书任一方面和/或任一实施方案所述。
[0031] 项目23、一种产品，其如说明书任一方面和/或任一实施方案所述。
[0032] 项目24、制备项目23所述产品的方法，其如说明书任一方面和/或任一实施方案所述。
[0033] 基于上述问题分析，本实验以铁类药物为例。首次提出解决电感耦合等离子体质谱法(在本文中可简称为ICP-MS法)在体内药物分析方面应用的瓶颈问题，设计氯高铁血58
红素的稳定同位素标记法，建立以 Fe稳定性同位素进行标记的生物样本中铁的直接定量方法并提出了一种新的可以弥补稳定性同位素并非真正示踪剂不足的数据处理方法。同时将所建立的ICP-MS方法和药动学思路相结合，对铁类补血药物的吸收率进行研究。这对于钙等其他微量元素研究工作的开展具有借鉴意义。为含金属药物的体内药物分析和药物代谢动力学研究提供新的技术手段。这一工作还将进一步推广电感耦合等离子体质谱技术在含金属药物体内分析与药动学研究中的应用。
红素的稳定同位素标记法，建立以 Fe稳定性同位素进行标记的生物样本中铁的直接定量方法并提出了一种新的可以弥补稳定性同位素并非真正示踪剂不足的数据处理方法。同时将所建立的ICP-MS方法和药动学思路相结合，对铁类补血药物的吸收率进行研究。这对于钙等其他微量元素研究工作的开展具有借鉴意义。为含金属药物的体内药物分析和药物代谢动力学研究提供新的技术手段。这一工作还将进一步推广电感耦合等离子体质谱技术在含金属药物体内分析与药动学研究中的应用。
[0034] 本发明第一方面提供了测定动物(例如大鼠)血浆中稳定性同位素58Fe浓度的方法，该方法是使用ICP-MS法进行测定，其包括以下步骤：
[0035] (1)提供电感耦合等离子体质谱仪(其例如Thermo SCIENTIFIC的型呈为X SERIES2的ICP-MS仪)；
[0036] (2)确定ICP-MS的工作条件；
[0037] (3)提供稳定性同位素58Fe金属粉末、标记后的氯高铁血红素、内标元素(例如锗元素)、曲拉通等；
[0038] (4)配制标准溶液和内标溶液(例如分别配制含58Fe浓度为2mg/mL的储备液，溶剂例如可以是1.7%~2.3%的硝酸；例如分别配制含锗浓度为1mg/mL的内标溶液，溶剂例如可以是1.7%~2.3%的硝酸，溶剂例如可以是2%的硝酸)；
[0039] (5)ICP-MS稀释剂的配制(在一个实施方案中，该ICP-MS稀释剂中含有水、曲拉通、硝酸和丁醇。在一个实施方案中，该ICP-MS稀释剂中曲拉通、硝酸和丁醇三者的重量比为1：4.5-5.5：180-220。例如该ICP-MS稀释剂中曲拉通、硝酸和丁醇三者的重量比为1:5:200。例如按照1:5:200的比例，用去离子水配制ICP-MS稀释剂，使得去离子水中曲拉通、硝酸和丁醇的比例分别0.01%、0.05%和2%)；
[0040] (6)标准曲线的建立：取Eppendorf管9个，加入58Fe对照品溶液50μL，于37°C恒温水浴挥干后，分别加入大鼠空白血浆50μL，混匀后加入所配制的ICP-MS稀释剂，使得58
Fe在血浆中的浓度分别为0、5、10、20、50、100、200、800、1000ng/mL，涡旋混合30秒，借助三通装置，进行在线加入内标(锗，50ng/mL)，进样测定，以校正后的响应值ICPS为纵坐标，
58
浓度C(ng/mL)为横坐标，进行回归，得 Fe的标准曲线；
Fe在血浆中的浓度分别为0、5、10、20、50、100、200、800、1000ng/mL，涡旋混合30秒，借助三通装置，进行在线加入内标(锗，50ng/mL)，进样测定，以校正后的响应值ICPS为纵坐标，
58
浓度C(ng/mL)为横坐标，进行回归，得 Fe的标准曲线；
[0041] (7)血浆中58Fe的浓度测定：取含有58Fe(例如服用含58Fe的物质)的动物（例如大鼠)血浆样品50μL至Eppendorf管，加入ICP-MS稀释剂950μL，混匀后置冰箱(4°C)58
冷藏，进样测定，用步骤(6)所得标准曲线确定血浆中 Fe的浓度。
冷藏，进样测定，用步骤(6)所得标准曲线确定血浆中 Fe的浓度。
[0042] 根据本发明第一方面的方法，其中所述ICP-MS的工作条件为：离子源为ICP源，采用石英玻璃同心雾化器(0.8mL/m)，整体型石英炬管，1.5mm口径喷射；雾化器氩气的流量为0.6～0.8L/min(优选0.7L/min)；检测模式为CCT模式(使用含7%(v/v)H2的He作为碰撞气)；检测器模拟级电压为1880v，检测器脉冲级电压为3812v，射频功率为1300w，冷却气流量为11.0~15.0L/min(优选冷却气流量为11.0~14.0L/min，优选11.5~13.5L/min，优选12.5L/min)，样品提升量为1mL/min，样品提升时间为40s，重复次数为3次，分别选择铁Fe(54，58)，镍Ni(58)，铬Cr(53)，锗Ge(72)为扫描元素，扫描方式为跳峰扫描。
[0043] 根据本发明第一方曲的方法，其中所述ICP-MS的工作条件中，冷却气流量为11.5~13.5L/min。
[0044] 本发明第一方面的方法具有良好的性能，例如该方法具有良好的定量下限、精密度、绝对回收率试验、样品稳定性、介质效应和质量控制要求，可以作为分析生物样品例如58 58
血浆中稳定性同位素 Fe的含量测定方法。在本发明中稳定性同位素 Fe亦可称为同位素
58 58
Fe或 Fe。
血浆中稳定性同位素 Fe的含量测定方法。在本发明中稳定性同位素 Fe亦可称为同位素
58 58
Fe或 Fe。
[0045] 本发明第二方面提供了制备58Fe标记的氯高铁血红素的方法，该方法包括以下步58 58
骤：使用 Fe和盐酸或氯化氢气体，在无氧条件下制备无水氯化亚铁(为同位素 Fe的氯
58
化亚铁)；以此无水氯化亚铁为原料与酸化的原卟啉钠反应，经过后处理制备出以 Fe标记的氯高铁血红素。
骤：使用 Fe和盐酸或氯化氢气体，在无氧条件下制备无水氯化亚铁(为同位素 Fe的氯
58
化亚铁)；以此无水氯化亚铁为原料与酸化的原卟啉钠反应，经过后处理制备出以 Fe标记的氯高铁血红素。
[0046] 根据本发明第二方面的方法，其中所述无水氯化亚铁(或58Fe)与原卟啉钠的重量比(或者摩尔比)为1:1~1:100，例如1:2~1:50，例如1:5~1:25。在一个实施方案中无水氯58
化亚铁( Fe)与原卟啉钠的摩尔比为1:1~1:100，例如1:2~1:50，例如1:5~1:25。在一个
58
实施方案中无水氯化亚铁( Fe)与原卟啉钠的摩尔比为1:8.5~9.5，例如1:9；本发明人发现当二者投料比为1:8.5~9.5时，不但同位素物质使用量少，而且产物收率大大提高(以同位素铁投料计，产物收率可达92%以上，并且终产物的纯度可以容易地达到91%以上)；但
58
是发明人还发现，当将氯化亚铁( Fe)与原卟啉钠的摩尔比调整为0.125~20：1时，尽管终产物的纯度可达到88%以上，但是产物收率却在83%以下。可见本发明方法使用较少量的人们不易获得的同位素进行反应却可以获得较高的产物收率。
化亚铁( Fe)与原卟啉钠的摩尔比为1:1~1:100，例如1:2~1:50，例如1:5~1:25。在一个
58
实施方案中无水氯化亚铁( Fe)与原卟啉钠的摩尔比为1:8.5~9.5，例如1:9；本发明人发现当二者投料比为1:8.5~9.5时，不但同位素物质使用量少，而且产物收率大大提高(以同位素铁投料计，产物收率可达92%以上，并且终产物的纯度可以容易地达到91%以上)；但
58
是发明人还发现，当将氯化亚铁( Fe)与原卟啉钠的摩尔比调整为0.125~20：1时，尽管终产物的纯度可达到88%以上，但是产物收率却在83%以下。可见本发明方法使用较少量的人们不易获得的同位素进行反应却可以获得较高的产物收率。
[0047] 根据本发明第二方面的方法，该方法包括以下步骤：
[0048] (1)称取铁粉于圆底烧瓶中，加入水(例如无氧水，例如纯净水加热至沸，充入氮气至饱和的无氧水)，确保铁粉完全浸于水中，无附于瓶壁上(在本步骤中，铁粉与水的重量比可以为1：80~120，例如约1：105)；
[0049] (2)在90~120°C(例如约110°C)加热，同时通入HCl气体(例如新生成的HCl气体，例如由浓硫酸和氯化钠新生成的HCl气体)至水中，Fe粉表面有大量微小气泡产生，直至Fe粉完全消失，整个溶液澄清透明，停止通入HCl气体；
[0050] (3)在旋转蒸发仪上旋干水，同时给予氮气保护，得到淡绿色的FeCl2粉末；
[0051] (4)称取原卟啉钠，用约80~120倍量的DMF溶解，加入适量浓盐酸酸化，充分振荡超声，使pH控制呈中性；以甲醇稀释，观察稀释液澄清，呈酒红色，无不溶颗粒；(在本步骤中，原卟啉钠的取用量可以是铁用量的8~10摩尔倍，例如8.5~9.5倍，例如约9倍。在本步骤中，加入适量浓盐酸酸化，使pH＝7±0.3，例如使pH＝7)；
[0052] (5)将酸化的原卟啉钠的DMF溶液转移至盛有FeCl2粉末的圆底烧瓶中(在本步骤58
中，原卟啉钠的取用量可以是同位素 Fe的氯化亚铁用量的8~10摩尔倍，例如8.5~9.5倍，
58
例如约9倍即原卟啉钠与 FeCl2的摩尔比为9：1))；油浴升温至液内温度为130±2°C，隔一段时间取样，甲醇稀释以HPLC分析，监测产物生成及原料减少情况，待产物生成基本达到平衡时，停止反应(反应时间共计12h左右)；
中，原卟啉钠的取用量可以是同位素 Fe的氯化亚铁用量的8~10摩尔倍，例如8.5~9.5倍，
58
例如约9倍即原卟啉钠与 FeCl2的摩尔比为9：1))；油浴升温至液内温度为130±2°C，隔一段时间取样，甲醇稀释以HPLC分析，监测产物生成及原料减少情况，待产物生成基本达到平衡时，停止反应(反应时间共计12h左右)；
[0053] (6)取反应终液，置旋转蒸发仪上85°C加热，旋干DMF至只有5-10mL的DMF剩余，取下反应瓶，冷却，加入大量的蒸馏水洗涤，使产物充分析出；
[0054] (7)向含有产物的混悬液中加入浓盐酸，使其pH＜1；超声振荡30min，静止；采用布氏漏斗和抽滤瓶抽滤，布氏漏斗上垫有两层混合滤膜，抽干后，再以蒸馏水洗涤沉淀至滤液呈中性；刮下滤饼，烘箱80°C烘干，以研钵研磨固体，得到细且均一的粉末，即为产物。
[0055] 根据本发明第二方曲的方法，其还进一步包括以下将所得产物进行重结晶的步骤：
[0056] (8)称取1重量份(例如0.2g)步骤(7)所得产物，置于烧杯中，加入50~100重量份(例如约75重量份)DMF，超声溶解后过滤，以10~20重量份(例如约15重量份)DMF洗涤滤饼，合并滤液；称取10~15重量份(例如约13重量份)表面活性剂氯化苄基十二烷基二甲胺溶于水中(制成浓度4～6%，例如约5.2%的溶液)，在恒温磁力搅拌器上加热至90°C；将滤液倒入表面活性剂溶液中，90°C下搅拌加热10min；以滴液漏斗缓慢向其中滴加18%的盐酸溶液(其使用体积约为表面活性剂溶液体积的40％)；停止加热和搅拌，静置3h，抽滤，刮下滤饼，烘干，即得。
[0057] 本发明第三方面提供了一种58Fe标记的氯高铁血红素的结晶，其基本上具有如图8所示的X射线衍射图。
[0058] 根据本发明第三方面的结晶，其基本上具有如图6a所示的红外光谱。
[0059] 根据本发明第三方面的结晶，其基本上是如本发明第二方面所述方法制备得到的。
[0060] 本发明第四方面提供了一种研究铁络合物在动物体内的药动学行为的方法，其包58
括使用本发明第二方面所制备的 Fe标记的氯高铁血红素给予动物服用，按预定时间采集
58
血液样本，再按本发明第一方面所述方法检测 Fe的含量。
括使用本发明第二方面所制备的 Fe标记的氯高铁血红素给予动物服用，按预定时间采集
58
血液样本，再按本发明第一方面所述方法检测 Fe的含量。
[0061] 类似地，本发明第五方面提供了本发明第二方面所制备的58Fe标记的氯高铁血红素或者本发明第一方面所述方法在研究铁络合物在动物体内的药动学行为中的用途。
[0062] 类似地，本发明第六方面提供了本发明第二方面所制备的58Fe标记的氯高铁血红素或者本发明第一方面所述方法在研究(未标记的)氯高铁血红素吸收机制中的用途。
[0063] 本发明第七方面提供了铁络合物在制备用于测试生物体吸收有机铁的试药中的用途。
[0064] 根据本发明第七方面的的用途，其中铁选自54Fe、55Fe、56Fe、57Fe、58Fe、59Fe，优选58
Fe。
Fe。
[0065] 根据本发明第七方面的的用途，其中铁络合物是氯高铁血红素。
[0066] 本发明第八方面提供了氯高铁血红素在制备用于测试生物体吸收有机铁的试药中的用途。
[0067] 根据本发明第八方面的的用途，其中所述氯高铁血红素中的铁是同位素铁，例如54 55 56 57 58 59 58
选自 Fe、Fe、Fe、Fe、Fe、Fe，优选 Fe。
选自 Fe、Fe、Fe、Fe、Fe、Fe，优选 Fe。
[0068] 根据本发明第八方曲的的用途，其中所述氯高铁血红素中的同位素铁是外源性的。
[0069] 本发明第九方面提供了一种同位素铁标记的氯高铁血红素。
[0070] 根据本发明第九方面的氯高铁血红素，其中所述的同位素铁选自54Fe、55Fe、56Fe、57 58 59 58
Fe、Fe、Fe，优选 Fe。
Fe、Fe、Fe，优选 Fe。
[0071] 根据本发明第九方面的氯高铁血红素，其是58Fe标记的。
[0072] 根据上述任一方面或项目，其中所述测试中使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法。
[0073] 本发明第十方面提供了电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法在含金属药物体内分析与药动学研究测试中的应用。
[0074] 根据本发明第十方面的的应用，其中所述含金属药物是金属络合物。
[0075] 根据本发明第十方面的的应用，其中所述含金属药物是氯高铁血红素。
[0076] 根据本发明第十方面的的应用，其中所述含金属药物是氯高铁血红素，所述铁是58
同位素铁 Fe。
同位素铁 Fe。
附图说明
[0077] 图1：方程式编辑前后浓度和CPS(以秒计)之间的相关性变化(a:方程式编辑前；b:方程式编辑后)。
[0078] 图2：典型的ICP-MS扫描，分别得自：不同的空白大鼠血浆(a)，掺入58Fe溶液的58
标准溶液空白大鼠血浆(5ng/mL)(b)，掺入 Fe溶液的标准溶液空白大鼠血浆(800ng/mL)
58
(c)，和静脉给予用外源性的 Fe标记的氯高铁血红素后2h获得的大鼠血浆样品(2mg/kg)(d)，图中横坐标为质量。
标准溶液空白大鼠血浆(5ng/mL)(b)，掺入 Fe溶液的标准溶液空白大鼠血浆(800ng/mL)
58
(c)，和静脉给予用外源性的 Fe标记的氯高铁血红素后2h获得的大鼠血浆样品(2mg/kg)(d)，图中横坐标为质量。
[0079] 图3：UV200-800nm完整波谱(横坐标为波长，纵坐标为吸光度)。
[0080] 图4：氯高铁血红素的MS全扫描质量谱和碎片离子图(谱谱图中纵坐标为相对丰度)。
[0081] 图5：推断的氯高铁血红素碎裂机制。
[0082] 图6：氯高铁血红素的红外光谱，其中图6a为同位素标记的氯高铁血红素合成品，图6b为氯高铁血红素对照品，横坐标为波数，纵坐标为透光率。
[0083] 图7：标准品的X射线衍射测试报告(未标记的氯高铁血红素)。
[0084] 图8：样品的X射线衍射测试报告(标记的氯高铁血红素)。
[0085] 图9：给大鼠施用外源性标记的氯高铁血红素后大鼠血浆中58Fe的浓度-时间曲58
线。◆：i.g.，40mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)；■：i.g.，80mg/kg(与3.55mg/kg的
58 58
Fe等当)；▲：i.g.，120mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)。
线。◆：i.g.，40mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)；■：i.g.，80mg/kg(与3.55mg/kg的
58 58
Fe等当)；▲：i.g.，120mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)。
[0086] 图10：给大鼠施用外源性标记的氯高铁血红素后大鼠血浆中58Fe的浓度-时间曲58
线。◆:i.g.，40mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)；■:i.g.，80mg/kg(与3.55mg/kg的
58 58
Fe等当)；▲:i.g.，120mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)；●:i.v，2mg/kg(与0.18mg/
58
kg的 Fe等当)；(均值±S.D,n=6)。
线。◆:i.g.，40mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)；■:i.g.，80mg/kg(与3.55mg/kg的
58 58
Fe等当)；▲:i.g.，120mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)；●:i.v，2mg/kg(与0.18mg/
58
kg的 Fe等当)；(均值±S.D,n=6)。
[0087] 图11：大鼠的剂量和生物利用度的相关性。低：40mg/kg(与3.55mg/kg的58Fe等58 58
当)；中：80mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)；高：120mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)。
*P<0.05，与低组比较
当)；中：80mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)；高：120mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)。
*P<0.05，与低组比较
[0088] 图12：经胃给予氯高铁血红素剂量为80mg/kg之后大鼠胆汁中58Fe的平均累积排58
泄量(与3.55mg/kg的 Fe等当).(均值±S.D,n=3)。
泄量(与3.55mg/kg的 Fe等当).(均值±S.D,n=3)。
[0089] 图13：经胃给予氯高铁血红素剂量为80mg/kg之后大鼠尿中58Fe的平均累积排泄58
量(与3.55mg/kg的 Fe等当).(均值±S.D,n=3)。
量(与3.55mg/kg的 Fe等当).(均值±S.D,n=3)。
[0090] 图14：氯高铁血红素在孵育系统中的稳定性。
[0091] 图15：氯高铁血红素和总铁在不同肠中的表观渗透系数(Papp)，其中*P<0.05，与结肠比较；#P<0.05与十二指肠比较。
[0092] 图16：氯高铁血红素在不同的S9温孵体系中的代谢速率，其中*P<0.05，与十二指肠相比。
[0093] 图17：钙离子对氯高铁血红素在培养的Caco-2细胞中的吸收的影响(n=3)。
具体实施方式
[0094] 下面通过具体的实施例/实验例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例和实验例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
[0095] 本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
[0096] 试验例1：稳定性同位素铁58ICP-MS方法的建立与确证
[0097] 自从1983年，ICP-MS商业化以来，大量的试验已经表明其高灵敏度和选择性非常适合用于含金属药物的测定中。最近大量研究都报道了ICP-MS在测定铁元素比例方面的应用。但是在Whittaker的方法中样品的分析非常耗时，同位素的比例变化而不是浓度作为了铁吸收研究的信息，另外该方法也没有得到系统的认证。同时我们发现，尚未有人通过58
ICP-MS法对生物样本中的 Fe进行绝对定量。
ICP-MS法对生物样本中的 Fe进行绝对定量。
[0098] 本文在第一部分实验中，成功采用了公认经典的ICP-MS方法研究铂类药物体内药动学。认为该方法可以拓展到含铁药物的药动学研究中。本章节试验将根据铁的自身特58
点建立并确证稳定性同位素 Fe的ICP-MS定量方法。
点建立并确证稳定性同位素 Fe的ICP-MS定量方法。
[0099] 1.材料
[0100] 1.1仪器与色谱条件
[0101] 1.1.1仪器
[0102] 本发明使用到电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS，型号X SERIES2，Thermo SCIENTIFIC)。
[0103] 1.1.2质谱条件
[0104] ICP-MS的工作条件：离子源为ICP源，采用石英玻璃同心雾化器(0.8mL/m)，整体型石英炬管，1.5mm口径喷射。雾化器氩气的流量为0.7L/min(发明人在诸多初步的试验中58
发现，当雾化器氩气的流量为0.6~0.8L/min时，Fe的定量下限在3~10ng/mL的可接受的范
58
围内，特别是当雾化器氩气的流量为0.7L/min时，Fe的定量下限可达3.2ng/mL，这是非常
58
令人期待的分析条件；然而发明人发现，当雾化器氩气的流量大于0.85L/min时，Fe的定量下限迅速增加，例如0.86L/min和0.95L/min的流量时定量下限分别达34ng/mL和63ng/mL)。检测模式为CCT模式(使用含7%(v/v)H2的He作为碰撞气)。检测器模拟级电压为
1880v，检测器脉冲级电压为3812v，射频功率为1300w，冷却气流量为12.5L/min，样品提升量为1mL/min，样品提升时间为40s，重复次数为3次，分别选择铁Fe(54，58)，镍Ni(58)，铬Cr(53)，锗Ge(72)为扫描元素，扫描方式为跳峰扫描。发明人发现，以上冷却气流量为
12.5L/min可获得最佳的效果，如果该冷却气流量低于11.0L/min或者高于14.0L/min，则
58
会明显影响本发明方法测定 Fe的定量下限，使定量下限大大增加到40ng/mL以上，例如冷
58
却气流量为11.0L/min、14.0L/min或14.3L/min时，Fe的定量下限分别为45ng/mL、43ng/
58
mL和68ng/mL，而冷却气流量为11.5～13.5L/min时 Fe的定量下限在5~10ng/mL之间，
58
例如冷却气流量为12.5L/min时 Fe的定量下限为5.13ng/mL，这是非常令人期待的分析条件。
发现，当雾化器氩气的流量为0.6~0.8L/min时，Fe的定量下限在3~10ng/mL的可接受的范
58
围内，特别是当雾化器氩气的流量为0.7L/min时，Fe的定量下限可达3.2ng/mL，这是非常
58
令人期待的分析条件；然而发明人发现，当雾化器氩气的流量大于0.85L/min时，Fe的定量下限迅速增加，例如0.86L/min和0.95L/min的流量时定量下限分别达34ng/mL和63ng/mL)。检测模式为CCT模式(使用含7%(v/v)H2的He作为碰撞气)。检测器模拟级电压为
1880v，检测器脉冲级电压为3812v，射频功率为1300w，冷却气流量为12.5L/min，样品提升量为1mL/min，样品提升时间为40s，重复次数为3次，分别选择铁Fe(54，58)，镍Ni(58)，铬Cr(53)，锗Ge(72)为扫描元素，扫描方式为跳峰扫描。发明人发现，以上冷却气流量为
12.5L/min可获得最佳的效果，如果该冷却气流量低于11.0L/min或者高于14.0L/min，则
58
会明显影响本发明方法测定 Fe的定量下限，使定量下限大大增加到40ng/mL以上，例如冷
58
却气流量为11.0L/min、14.0L/min或14.3L/min时，Fe的定量下限分别为45ng/mL、43ng/
58
mL和68ng/mL，而冷却气流量为11.5～13.5L/min时 Fe的定量下限在5~10ng/mL之间，
58
例如冷却气流量为12.5L/min时 Fe的定量下限为5.13ng/mL，这是非常令人期待的分析条件。
[0105] 通过编辑公式进行校正，公式编辑如下：
[0106] (1)58Fe实际＝总响应-0.05593＊(54Fe-0.24921＊53Cr)-2.59021＊60Ni[0107] (2)ICPS校正后＝ICPS58Fe实际＊(ICPS空白内标/ICPS样品内标）
[0108] 1.2药品与试剂
[0109] 稳定性同位素58Fe金属粉末(标准品)，由ISOFLEX公司(San Francisco，CA94129，USA)提供，纯度＞99.86%；标记后的氯高铁血红素(实验用药)，中国药科大学药代中心提供；锗元素由上海安谱科学仪器有限公司提供，纯度＞99.999%，本试验中作内标使用。
[0110] 曲拉通(Triton X-100)，化学纯，批号：T20100423，国药集团化学试剂有限公司。
[0111] 2.方法与结果
[0112] 2.1标准溶液的配制：精密称取2mg的58Fe，溶于2%的硝酸中，得浓度为2mg/mL的储备液。同样，精密称取10mg锗溶于10mL的2%硝酸中，得浓度为1mg/mL的内标溶液。58
本发明人发现，如果所用溶剂硝酸溶液的浓度变化超过15%，则下面建立标准曲线时 Fe在
2
5-1000ng/mL范围内线性大大变差，R 不到2个9，例如当使用浓度低于1.7%硝酸溶液或者
2
浓度大于2.3%的硝酸溶液时，R 分别仅为0.988和0.987；但当所用溶剂硝酸溶液的浓度
2
在1.8%~2.2%之间时R 分至少有2个9。
本发明人发现，如果所用溶剂硝酸溶液的浓度变化超过15%，则下面建立标准曲线时 Fe在
2
5-1000ng/mL范围内线性大大变差，R 不到2个9，例如当使用浓度低于1.7%硝酸溶液或者
2
浓度大于2.3%的硝酸溶液时，R 分别仅为0.988和0.987；但当所用溶剂硝酸溶液的浓度
2
在1.8%~2.2%之间时R 分至少有2个9。
[0113] 2.2样品处理与测定方法：ICP-MS稀释剂的配制：按照1:5:200的比例，配制ICP-MS稀释剂，使得去离子水中曲拉通、硝酸和丁醇的比例分别0.01%、0.05%和2%。本发明人发现，如果ICP-MS稀释剂的这三种组分任一成分用量变化(增加或减少)10%以上时58
均会影响本发明方法测定 Fe的定量下限，使定量下限大大增加到45ng/mL以上，例如曲拉
58
通、硝酸和丁醇三者比率为1：5.6：200时，Fe的定量下限为56ng/mL。
均会影响本发明方法测定 Fe的定量下限，使定量下限大大增加到45ng/mL以上，例如曲拉
58
通、硝酸和丁醇三者比率为1：5.6：200时，Fe的定量下限为56ng/mL。
[0114] 取大鼠血浆样品50μL至Eppendorf管，加入ICP-MS稀释剂950μL，混匀后置冰箱(4°C)冷藏，进样测定。
[0115] 2.3标准曲线的建立：取Eppendorf管9个，加入58Fe对照品溶液50μL，于37°C恒温水浴挥干后，分别加入大鼠空白血浆50μL，混匀后加入所配制的ICP-MS稀释剂，使得58
Fe在血浆中的浓度分别为0，5，10，20，50，100，200，800，1000ng/mL，涡旋混合30秒，借助三通装置，进行在线加入内标(锗，50ng/mL)，进样测定。以校正后的响应值ICPS为纵坐标，
58 58
浓度C(ng/mL)为横坐标，进行回归，得 Fe的标准曲线。结果表明 Fe在5-1000ng/mL范围内线性良好（γ＝0.9999)。预期可满足氯高铁血红素在大鼠体内的药代动力学研究。
Fe在血浆中的浓度分别为0，5，10，20，50，100，200，800，1000ng/mL，涡旋混合30秒，借助三通装置，进行在线加入内标(锗，50ng/mL)，进样测定。以校正后的响应值ICPS为纵坐标，
58 58
浓度C(ng/mL)为横坐标，进行回归，得 Fe的标准曲线。结果表明 Fe在5-1000ng/mL范围内线性良好（γ＝0.9999)。预期可满足氯高铁血红素在大鼠体内的药代动力学研究。
[0116] 2.4定量下限试验：取Eppendorf管5个，加入58Fe对照品溶液50μL，于37°C恒温水浴挥干后，分别加入大鼠空白血浆50μL，按“2.2样品处理与测定”项下操作，使血58
浆中 Fe浓度为5ng/mL。将满足测定3～5个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测
58
出Cmax的1/10～1/20时的药物浓度作为本测定方法的定量下限，经测定本方法 Fe的定量下限为5ng/mL。
浆中 Fe浓度为5ng/mL。将满足测定3～5个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测
58
出Cmax的1/10～1/20时的药物浓度作为本测定方法的定量下限，经测定本方法 Fe的定量下限为5ng/mL。
[0117] 2.5精密度试验：取Eppendorf管15个，加入58Fe对照品溶液50μL，于37°C恒温水浴挥干后，分别加入大鼠空白血浆50μL，按“2.2样品处理与测定”项下操作，使血浆58
中 Fe浓度分别为10，100，800ng/ml，测定批内变异和批间(连续考察三天)变异。结果表明，批内和批间变异均在15%以内，符合生物样品分析要求；同时将测定结果带入标准曲
58
线算出测定浓度，将测定浓度与加入浓度相比，算得 Fe的相对回收率。结果表明，各浓度的相对回收率均符合生物样品分析要求。
中 Fe浓度分别为10，100，800ng/ml，测定批内变异和批间(连续考察三天)变异。结果表明，批内和批间变异均在15%以内，符合生物样品分析要求；同时将测定结果带入标准曲
58
线算出测定浓度，将测定浓度与加入浓度相比，算得 Fe的相对回收率。结果表明，各浓度的相对回收率均符合生物样品分析要求。
[0118] 2.6绝对回收率试验：取Eppendorf管15个，加入58Fe对照品溶液50μL，于37°C恒温水浴挥干后，分别加入大鼠空白血浆50μL，按“2.2样品处理与测定”项下操作，使血58
浆中 Fe浓度分别为10，100，800ng/ml，将测定结果的峰面积与相同浓度对照品溶液直接
58
进样的峰面积相比，算得血浆中 Fe的绝对回收率。结果表明，各浓度的绝对回收率均符合生物样品分析要求，RSD(％)均小于10%。
浆中 Fe浓度分别为10，100，800ng/ml，将测定结果的峰面积与相同浓度对照品溶液直接
58
进样的峰面积相比，算得血浆中 Fe的绝对回收率。结果表明，各浓度的绝对回收率均符合生物样品分析要求，RSD(％)均小于10%。
[0119] 2.7样品的稳定性试验：取Eppendorf管15个，加入58Fe对照品溶液50μL，于58
37°C恒温水浴挥干后，分别加入大鼠空白血浆50μL，使血浆中 Fe浓度分别为10，100，
800ng/ml。将配制好的样品，分别进行处理前室温稳定性试验(20°C放置4h)、处理后稳定性(4°C放置24h)、冷冻稳定性实验(-70°C放置15天)和冻融稳定性试验(在一周内反复冻融处理3次)，然后按“2.2样品处理与测定”项下操作，将测定结果的峰曲积比代入血浆标准曲线计算实测值，评估样品的室温、处理后、冷冻、反复冻融稳定性。结果表明实
58
测值与加入量基本一致，说明 Fe在大鼠血浆中于各条件下放置响应可保持稳定，见下面4个表。
37°C恒温水浴挥干后，分别加入大鼠空白血浆50μL，使血浆中 Fe浓度分别为10，100，
800ng/ml。将配制好的样品，分别进行处理前室温稳定性试验(20°C放置4h)、处理后稳定性(4°C放置24h)、冷冻稳定性实验(-70°C放置15天)和冻融稳定性试验(在一周内反复冻融处理3次)，然后按“2.2样品处理与测定”项下操作，将测定结果的峰曲积比代入血浆标准曲线计算实测值，评估样品的室温、处理后、冷冻、反复冻融稳定性。结果表明实
58
测值与加入量基本一致，说明 Fe在大鼠血浆中于各条件下放置响应可保持稳定，见下面4个表。
[0120] 表：在室温下4h大鼠血浆中58Fe制备前的稳定性(n=5)
[0121]
[0122]
[0123] 表：在4°C下24h大鼠血浆中58Fe制备后的稳定性(n=5)
[0124]
[0125] 表：在-70°C下15天大鼠血浆中58Fe冷冻稳定性(n=5)
[0126]
[0127] 表：大鼠血浆中58Fe三个循环(冷冻(-70°C)和冻融(室温))的冻融稳定性(n=5)
[0128]
[0129] 2.8介质效应试验：取大鼠空白血浆若干，按照1:19的比例加入稀释剂，涡旋混匀，得到空白基质。取Eppendorf管若干，加入58Fe对照品溶液50μL后，分别加入空白基质950μL，配成58Fe浓度分别为10，100，800ng/mL的样品，混匀后进样测定。计算测得的血浆58Fe元素及内标锗(Ge)和其相同操作条件下标准品的响应(ICPS)比，评价血浆对58Fe和锗(Ge)测定的影响。结果不存在明显的介质效应，见下面2个表。
[0130] 表：大鼠血浆中58Fe的介质效应的测定(n＝6)
[0131]
[0132] 表：大鼠血浆中Ge的介质效应的测定(n＝6)
[0133]
[0134] 2.9质量控制：质控样品由分析测试负责人配制，方法为在Eppendorf管中分别加58
入 Fe对照品溶液50μL，于37°C恒温水浴挥干后，分别加入空白血浆50μL，使每组58Fe浓度分别为10，100，800ng/mL。血浆样品、质控和随行标准曲线按“2.2样品处理与测定”项下操作。结果符合生物样品分析要求。见下表。
58
入 Fe对照品溶液50μL，于37°C恒温水浴挥干后，分别加入空白血浆50μL，使每组58Fe浓度分别为10，100，800ng/mL。血浆样品、质控和随行标准曲线按“2.2样品处理与测定”项下操作。结果符合生物样品分析要求。见下表。
58
[0135] 表：测定大鼠血浆中 Fe的质量控制样品(n＝3)
[0136]
[0137] 3.小结：本试验建立了ICP-MS测定大鼠血浆中58Fe浓度的方法。其中大鼠血浆2
中最低定量浓度为5ng/mL，线性范围为5-1000ng/mL，线性关系良好(R ＞0.99)。批内、批间精密度变异系数均小于10.86%；绝对回收率在87.3%-111.3%之间；经过条件优化和公式编辑校正后，不存在明显基质效应(88.8％)；稳定性试验考察结果表明，在室温放置4h，处理后4°C放置24h，冷冻15天和冷冻-冻融循环3次的条件下，样品均可以保持稳定性。
表明该方法符合本试验中生物样品分析的要求。
中最低定量浓度为5ng/mL，线性范围为5-1000ng/mL，线性关系良好(R ＞0.99)。批内、批间精密度变异系数均小于10.86%；绝对回收率在87.3%-111.3%之间；经过条件优化和公式编辑校正后，不存在明显基质效应(88.8％)；稳定性试验考察结果表明，在室温放置4h，处理后4°C放置24h，冷冻15天和冷冻-冻融循环3次的条件下，样品均可以保持稳定性。
表明该方法符合本试验中生物样品分析的要求。
[0138] 4.讨论
[0139] 4.1干扰的校正
[0140] 作为自然界存在的铁的同位素之一，58Fe(0.28％)可以用于铁的吸收与代谢研究58
中。但是 Fe并不是真正的示踪剂，因为它虽然在自然界含量最低，但是在各种基质中仍存在一定的背景干扰。同时，ICP-MS的原理是检测质量数，那么相同质量数元素的存在势必
58 58
会对 Fe的测定造成干扰。比如 Ni。这种相同质量数的干扰即为“同质异序素”干扰，具体见下表。
中。但是 Fe并不是真正的示踪剂，因为它虽然在自然界含量最低，但是在各种基质中仍存在一定的背景干扰。同时，ICP-MS的原理是检测质量数，那么相同质量数元素的存在势必
58 58
会对 Fe的测定造成干扰。比如 Ni。这种相同质量数的干扰即为“同质异序素”干扰，具体见下表。
[0141] 表：通过ICP-MS分析58Fe中的光谱干扰
[0142]58 58
[0143] 如表中所示，在对 Fe进行测定时，除了同质异序素 Ni以外，仍存在许多多原子+ 54 + + 53 + + 58 + + 58 +离子的干扰，比如：ArN/ Fe，ArC/ Cr，ArO/ Fe 和CTi/ Fe。实验中选用了CCT模式代替标准模式拟解决这个问题，在CCT模式中，除了使用氩气外，还使用了含7%H2的He作为碰撞气体，这样可以极大的改善多原子离子的干扰。
[0144] 为了扣除同质异序素和本底干扰，实验中根据每种元素在自然界存在恒定的比例，尝试了不同的公式编辑法。最终确定的公式如下：58 58 58 58
[0145] Fe测量＝ Fe实际- Fe背景+ Ni58 58 58 58
[0146] Fe实际＝ Fe测量- Fe背景- Ni58 54 60
[0147] ＝ Fe测量-x Fe-y Ni54 54 60
[0148] ＝58Fe测量-x( Fe- Cr)-y Ni58 54 53 60
[0149] ＝ Fe测量-x( Fe-z Cr)-y Ni58 54 53 60
[0150] ＝ Fe测量-0.05593＊( Fe-0.24921＊ Cr)-2.59021＊ Ni58 54 58 60 54 53
[0151] Fe/ Fe、Ni/ Ni和 Cr/ Cr 的 丰 度 比 分 别 为x=0.05593、y=2.59021 和z=0.24921。
[0152] 在上述公式编辑的条件下，如图1所示，根据图1所示方程式编辑前后浓度和CPS(以秒计)之间的相关性变化(a:方程式编辑前；b:方程式编辑后)，显示干扰效应得到了极大地改善。图2还显示了典型的ICP-MS扫描，分别得自：不同的空白大鼠血浆(a)，58 58
掺入 Fe溶液的标准溶液空白大鼠血浆(5ng/mL)(b)，掺入 Fe溶液的标准溶液空白大鼠
58
血浆(800ng/mL)(c)，和静脉给予用外源性的 Fe标记的氯高铁血红素后2h获得的大鼠血浆样品(2mg/kg)(d)，图中横坐标为质量。
掺入 Fe溶液的标准溶液空白大鼠血浆(5ng/mL)(b)，掺入 Fe溶液的标准溶液空白大鼠
58
血浆(800ng/mL)(c)，和静脉给予用外源性的 Fe标记的氯高铁血红素后2h获得的大鼠血浆样品(2mg/kg)(d)，图中横坐标为质量。
[0153] 4.2内标的选择：对于ICP-MS法而言，内标的选择需要符合两个要求。一是内标元素的质量数需要在被测元素附近，这样才可以起到校正作用；二是内标元素应该是稀有72
元素，使得其在被测样品中浓度足够低可以忽略。本实验中选择了 Ge作为内标，符合上述要求。
元素，使得其在被测样品中浓度足够低可以忽略。本实验中选择了 Ge作为内标，符合上述要求。
[0154] 4.3后遗效应：为了减小后遗效应，试验考察了定量上限样品进样结束后，空白水的响应。发现使用2%HNO3洗脱40s后，可以很好的避免过高浓度带来的记忆效应。58
[0155] 实施例2：大鼠体内 Fe标记氯高铁血红素药动学研究
[0156] 标记性铁化合物的获得方法主要有两种：内源性和外源性标记。内源性标记指的是将同位素加入饲料中或者细胞培养液中，生物体自身合成带有标记的目的化合物。这种方法之前常以放射性标记为主，在儿童和孕妇体内开展类似的实验不符合伦理学的要求。同时内源性标记化合物获得的方法存在有一定的缺点。首先，得到的标记物丰度比较低。在
58
Paz Etcheverry的研究中，虽然制备的含有 Fe的血红蛋白是自然界样品中含量的30-40倍，但是其丰度也仅占了9.5%；另外，铁在体内存在的化学形式是多种多样的，血红蛋白、铁蛋白、转铁蛋白等，所以研究对象真正的存在形式并没有经过系统的确证；最后以内源性方法获得标记性化合物的方法代价相当昂贵。
58
Paz Etcheverry的研究中，虽然制备的含有 Fe的血红蛋白是自然界样品中含量的30-40倍，但是其丰度也仅占了9.5%；另外，铁在体内存在的化学形式是多种多样的，血红蛋白、铁蛋白、转铁蛋白等，所以研究对象真正的存在形式并没有经过系统的确证；最后以内源性方法获得标记性化合物的方法代价相当昂贵。
[0157] 外源性标记指的是通过化学合成的方法得到标记性铁化合物后加入食物中服用进行研究。由于焦磷酸铁等的合成方法较为容易，目前这种主要存在于非血红素铁研究中。57
比如Lena Davidsson等人就利用化学合成的方法得到了用 Fe标记的焦磷酸铁和延胡索酸铁。将二者强化在谷类食物中后在幼儿体内展开了生物利用度研究。
比如Lena Davidsson等人就利用化学合成的方法得到了用 Fe标记的焦磷酸铁和延胡索酸铁。将二者强化在谷类食物中后在幼儿体内展开了生物利用度研究。
[0158] 本部分实验尝试设计氯高铁血红素的化学合成路线，拟实现并借助其外源性58Fe标记，开展氯高铁血红索在大鼠体内的铁吸收研究。
[0159] 第一节氯高铁血红素的稳定性同位素标记
[0160] 1.材料
[0161] 1.1仪器
[0162] TSQ QuantμM Access三重四极杆串联质谱仪配备电喷雾离子源(ESI)源及Xcalibur2.0.7数据处理系统(美国Thermo Scientific公司)；电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS,型号XS ERIES2，Thermo SCIENTIFIC)；岛津LC-10高效液相色谱仪；岛津10A紫外检测器(日本岛津公司产品)；粉末X光衍射计(型号D8Advance，德国布鲁克公司)；电子显微镜(上海测微维光电技术有限公司，LWD200-37T)。
[0163] 1.2试剂
[0164] 原卟啉钠，色谱纯，纯度：≥98％，LOT：GG01，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；稳定性同位素铁58金属粉末(标准品)，由ISOFLEX公司(San Francisco，CA94129，USA)提供，纯度＞99.86%；未标记氯高铁血红素，由新疆科丽公司提供，纯度≥98%。
[0165] 浓硫酸，纯度95-98%，南京化学试剂有限公司；氯化钠，批号：080460260，分析纯，纯度≥99.5％，南京化学试剂有限公司；二甲基甲酰胺，纯度≥99.5%，国药集团化学试剂有限公司；氯化苄基十二烷基二甲胺，纯度≥98%，阿拉丁化学试剂有限公司。
[0166] 2.合成
[0167] 2.1反应
[0168] (a)称取240mg的58Fe粉于500mL圆底烧瓶中，加入25mL无氧水(纯净水加热至沸，充入氮气至饱和)，确保铁粉完全浸于水中，无附于瓶壁上。在油浴上外温110°C加热(本发明人发现，在本制备方法中，当温度低于90°C时反应基本停滞，而当温度高于120°C时产物纯度大大降低，低达95%以下)，同时通入新生成的HCl气体(由浓硫酸和氯化钠生成)至无氧水中，注意控制HCl气体生成的速率，防止生成过快。可观察到Fe粉表面有大量微小气泡产生，直至Fe粉完全消失，整个溶液澄清透明，停止通入HCl气体。在旋
58
转蒸发仪上旋干水，同时给予氮气保护，得到淡绿色的FeCl2粉末。以上制备同位素 FeCl2
58
粉末的工艺规模放大非常容易，并且批间差异小(0.2g~20g范围内不同量的 Fe投料得到的批间产率相差小于3个百分点。
58
转蒸发仪上旋干水，同时给予氮气保护，得到淡绿色的FeCl2粉末。以上制备同位素 FeCl2
58
粉末的工艺规模放大非常容易，并且批间差异小(0.2g~20g范围内不同量的 Fe投料得到的批间产率相差小于3个百分点。
[0169] (b)称取2.1665g原卟啉钠(3.57mmol)，以约200mL DMF溶解，加入750μL浓盐酸，充分振荡超声。取样，测得pH＝7(本发明人发现，在本制备方法中，当pH低于6.5或者高于7.5时，重结晶产物纯度降至95%下)；以甲醇稀释，观察稀释液澄清，呈酒红色，无58
不溶颗粒。将酸化的原卟啉钠的DMF溶液转移至盛有0.397mmol的 FeCl2粉末的500mL圆底烧瓶中。油浴升温，至内温为130±2°C(本发明人发现，在本制备方法中，当此处温度低于125或者高于135°C时，重结晶产物纯度降至95%下，并且总收率低于75％)，隔一段时间取样，甲醇稀释以HPLC分析，监测产物生成及原料减少情况。待产物生成基本达到平衡时，停止反应；反应时间共计12h左右。
不溶颗粒。将酸化的原卟啉钠的DMF溶液转移至盛有0.397mmol的 FeCl2粉末的500mL圆底烧瓶中。油浴升温，至内温为130±2°C(本发明人发现，在本制备方法中，当此处温度低于125或者高于135°C时，重结晶产物纯度降至95%下，并且总收率低于75％)，隔一段时间取样，甲醇稀释以HPLC分析，监测产物生成及原料减少情况。待产物生成基本达到平衡时，停止反应；反应时间共计12h左右。
[0170] (c)取反应终液，旋转蒸发仪上85°C加热，旋干DMF至只有5-10mLDMF剩余。取下反应瓶，冷却，加入大量的蒸馏水洗涤(1200mL)，使产物充分析出。向含有产物的混悬液中加入12mL浓盐酸，测其pH＜1。超声振荡30min，静止。采用100mm直径布氏漏斗和1000mL抽滤瓶抽滤，布氏漏斗上垫有两层混合滤膜(直径100mm)。抽干后，再以蒸馏水洗涤沉淀至滤液呈中性。刮下滤饼，烘箱80°C烘干，以研钵研磨固体，得到颗粒很细，较为均一的粉末即为产物，在步骤(b)和(c)中，以投料的同位素铁量计，收率可达96%，并且终产物的纯度达到95%。
[0171] 在以上步骤(b)和(c)中，原卟啉钠与FeCl2以投料比(摩尔比)为9:1的收率，以投料的同位素铁量计，收率可达96%，并且终产物的纯度达到95%。当原卟啉钠投料量是FeCl2投料量的8.5~9.5倍(摩尔倍数)时，产物收率可达92~96%，终产物纯度可达91~95%。另外发现，当在以上步骤(b)中当原卟啉钠投料量是FeCl2投料量的0.05~8倍(摩尔倍数)时，收率在47~83%之间(原卟啉钠相对投料量越高显示收率越高；例如原卟啉钠加入量是铁加入量的8倍时收率降到了83%；例如原卟啉钠加入量是铁加入量的0.8倍时收率已经降到了56%；而当原卟啉钠加入量是铁加入量的0.05倍时，采用CN102617581A实施例2的方法，收率降到了47%)，尽管终产物纯度仍可达88~95%；而当在以上步骤(b)中当原卟啉钠投料量是FeCl2投料量的10~20倍(摩尔倍数)时，虽然可以努力确保收率在89-93%之间，但终产物纯度却降低到71-86%(原卟啉钠相对投料量越高显示纯度越低，例如原卟啉钠加入量是铁加入量的10.5倍时产物纯度降到了85％)；可见原卟啉钠投料量是FeCl2投料量的8.5~9.5倍(摩尔倍数)时具有特别适宜的收率/纯度平衡点。
[0172] 2.2重结晶
[0173] 称取0.2g产品，置于25mL烧杯中，加入15mL DMF，超声溶解后过滤，以3mL DMF洗涤滤饼，合并滤液。称取2.6g表面活性剂氯化苄基十二烷基二甲胺(本发明人发现，在本制备方法中，当此处表面活性剂用量低于2克时，后面的总收率低于80%，而用量高于3克时结晶产物的纯度低于96%)溶于50mL水中，在恒温磁力搅拌器(85-2型，上海司乐仪器有限公司)上加热至90°C。将滤液倒入表面活性剂溶液中(速度较快)。90°C下搅拌加热10min，注意控制搅拌速度，不要太快。以滴液漏斗缓慢向其中滴加18%的盐酸溶液20mL，滴速1滴/4秒。滴加约5mL盐酸时，监测pH值已经达到1-2，继续滴加至20mL盐酸全部滴完。停止加热和搅拌，静置3h。抽滤，刮下滤饼，烘干，在显微镜下观察晶型，总收率92%(以铁计)。
[0174] 3.结构确证
[0175] 3.1UV200-800nm波段范围内的全扫结果，见图3。如图3所示：标准品和样品的最大吸收峰均在398nm。这和文献所报道的氯高铁血红素最大吸收波长为399nm基本是一致的。
[0176] 3.2HPLC-MS/MS鉴定结果，见图4。
[0177] 分别称取标准品和合成品，溶于甲醇中，进行二级离子碎片扫描。如图4所示：左侧为标准品的MS全扫描质谱图，右侧为合成品的MS全扫描质谱图。
[0178] MS全扫描碎片离子推断：
[0179] (1)母离子脱去一个氯，碎片离子约为616，标记物应约为618。
[0180] (2)脱掉一个乙酸基，碎片离子约为556，标记物应约为559。
[0181] (3)再脱掉一个乙酸基，碎片离子约为498，标记物应为500。
[0182] 碎片离子推断如图5所示，对比MS全扫描质谱图和碎片离子推断图，可以发现二级碎片与氯高铁血红素结构相一致，而氯高铁血红素标准品和合成品相一致，从结构上证明了二者的一致性。
[0183] 3.3红外光谱鉴定结果，见图6。
[0184] 对所得红外谱图进行解析，发现：
[0185] a．合成品在3400-2500处出现宽峰，推断含有羧基“-COOH”，和氯高铁血红素结构相一致，同时和标准品图谱相一致；
[0186] b．合成品在3086，1650出现的弱吸收峰，说明结构中应该含有“C=C”但无苯环，和氯高铁血红素的结构相一致。同时标准品在1412.3、1380.2、1335.2、1000~600处的峰——δ=CH，也说明有C=C但无苯环(因为没有1500、1600、1580、1450的特征峰)；
[0187] c.合成品在1250-1000处的中等弱峰，说明结构中应该含有“-N-H”，和氯高铁血红素结构相一致，同时和标准品图谱相一致。
[0188] d．合成品在3000，1439.2，1380.3处的峰说明结构中应该含有烃基，和氯高铁血红素结构相一致，同时和标准品图谱基本一致。
[0189] 上述分析表明，合成品和标准品从红外图谱结果来看，主要官能团应该是一致的。
[0190] 3.4显微镜下观察
[0191] 在显微镜放大400倍下观察，发现合成氯高铁血红素与原料药均为晶体(可见呈规则的平行四边形)。
[0192] 3.5粉末-X光衍射结果：图7是标准品的X射线衍射测试报告(未标记的氯高铁血红素)，图8是样品的X射线衍射测试报告(标记的氯高铁血红素)。
[0193] X射线衍射测试报告表明，在合成品所检测到的17个衍射角里有13个与标准品相同，说明经过重结晶以后，二者晶型基本可以保持一致。
[0194] 4.纯度分析：制备获得的稳定性同位素57Fe标记的氯高铁血红素结晶的HPLC-UV纯度分析，结果显示达98.66%(曲积归一化法)
[0195] 5.小结
[0196] 5.1合成：实验中，以58Fe和盐酸，在无氧条件下制备无水氯化亚铁；并以此为原料58
和酸化的原卟啉钠反应，经过后处理制备出以 Fe标记的氯高铁血红素，在投料比为1:10的情况下，所得产物经HPLC-UV鉴定，纯度为98.66%。
和酸化的原卟啉钠反应，经过后处理制备出以 Fe标记的氯高铁血红素，在投料比为1:10的情况下，所得产物经HPLC-UV鉴定，纯度为98.66%。
[0197] 5.2鉴定：UV200-800波段范围内的全扫结果表明，标准品和样品的最大吸收峰均在398nm。这和文献所报道的氯高铁血红素最大吸收波长为399nm基本是一致的；对比MS全扫描质谱图和碎片离子推断图，可以发现二级碎片与氯高铁血红素结构相一致，而氯高铁血红素标准品和合成品相一致，从结构上证明了二者的一致性；合成品和标准品从红外图谱结果来看，主要官能团应该是一致的；在显微镜放大400倍下观察，发现合成氯高铁血红素与原料药均为晶体(可见呈规则的平行四边形)；X射线衍射测试报告表明，在合成品所检测到的17个衍射角里有13个与标准品相同，说明经过重结晶以后，二者晶型基本可以保持一致。
[0198] 第二节药动学研究
[0199] 1.材料
[0200] 1.1仪器
[0201] 同“稳定性同位素铁58ICP-MS方法的建立与确证”。
[0202] 1.2药品与试剂
[0203] 1.2.1试验药品
[0204] 稳定性同位素58Fe金属粉末(标准品)，由ISOFLEX公司(San Francisco，CA94129，USA)提供，纯度＞99.86%；标记后的氯高铁血红素(实验用药)，中国药科大学提供；锗元素由上海安谱科学仪器有限公司提供，纯度＞99.999%，本试验中作内标使用。
[0205] 1.2.2试验材料与试剂
[0206] 曲拉通(TritonX-100)，化学纯，批号：T20100423，国药集团化学试剂有限公司。
[0207] 1.3试验动物
[0208] 清洁级SD大鼠，雌雄各半，体重200±20g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物合格证号SCXK(沪)2008-0016。
[0209] 1.4试验品剂量的选择依据
[0210] 给药剂量是根据氯高铁血红素的长期毒性试验剂量和药效学剂量确定的。
[0211] 2.方法与结果
[0212] 2.1血浆药动学动物试验
[0213] 2.1.1灌胃给药
[0214] SD大鼠18只，♀、各半，体重180-220g，随机分为三组，分别按照40,80,120mg/kg(采用冷热药配比法，其中标记药物剂量为40mg/kg)灌胃给药。给药前取空白血，给药后于30min、1h、1.5h、2h、4h、8h、15h、24h和36h眼底静脉取血200μL，迅速于12000rpm离心2min，取血浆100μL,-70°C保存供测试。
[0215] 2.1.2静脉注射给药
[0216] SD大鼠6只，♀、各半，体重180-220g，按2mg/kg(标记药物剂量为2mg/kg)静注，给药前取空白血，给药后于10min、30min、1h、2h、4h、8h、15h、24h和36h眼底静脉取血200μL，迅速于12000rpm离心2min，取血浆100μL,-70°C保存供测试。
[0217] 2.2排泄试验
[0218] 2.2.1胆排泄
[0219] SD大鼠3只，雄性，实验前禁食不禁水12h。大鼠腹腔注射20%乌拉坦(1mg.kg-1)麻醉后，沿腹白线打开腹腔，分离出胆管，插入聚乙烯管(内径0.4mm，外径0.8mm)，做胆管插管手术。收集空白胆汁待大鼠状态稳定后，按80mg/kg剂量(冷热药配比1:1)灌胃给药后开始计时，分别收集给药后0-2，2-4，4-6，6-8，8-12h的胆汁，并记录重量，置-70°C保存供测试。
[0220] 2.2.2尿排泄
[0221] SD大鼠3只，雄性，实验前禁食不禁水12h。将大鼠分别单独置于代谢笼内，收集空白尿液。按80mg/kg剂量(冷热药配比1∶1)灌胃给药后开始计时。分别收0-2，2-4，4-6，6-8，8-12，12-24，24-36，36-48，48-72h的尿液，记录各时间点尿液的体积，将上述所得样品于-70°C保存供测试。
[0222] 2.3样品处理与测定
[0223] 同“第一章稳定性同位素58Fe的ICP-MS方法建立与确证”。对于尿液和胆汁样本，使用0.22μm的滤膜，进行过滤处理后，按上述方法处理进样。
[0224] 2.3数据处理
[0225] 2.3.1药动学参数计算方法
[0226] 将血药浓度-时问数据以DAS2.1.1程序拟合，并利用统计距法计算药动学参数。其中Cmax和Tmax为实测值，C-t曲线尾段相消除速率常数k为LnC-t直线回归所得，AUC0-t值为梯形面积法计算所得，0-∞时间的曲线下面积AUC＝AUC0-t+Ct/k。绝对生物利用度的计算方法为：
[0227] F＝(AUCig/Doseig)/(AUCiv/Doseiv)。
[0228] 2.3.2累计排泄百分率计算方法
[0229] 大鼠尿和胆汁中累计排泄百分率(％)的计算方法如下：
[0230] 累计排泄百分率(％)＝(累计排泄量/给药量)×100％
[0231] 2.3.3统计方法
[0232] 使用SPSS15.0对低、中、高三组的生物利用度进行统计分析。分析方法选用单因素方差分析中的Dunnett方法，其中*P＜0.05，可认为低剂量组与之相比存在显著性差异。
[0233] 2.4试验结果
[0234] 2.4.1大鼠体内的药代动力学
[0235] 图9显示了给大鼠施用外源性标记的氯高铁血红素后大鼠血浆中58Fe的浓度-时58
间曲线。◆：i.g.，40mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)；■：i.g.，80mg/kg(与3.55mg/kg
58 58
的 Fe等当)；▲：i.g.，120mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)。
间曲线。◆：i.g.，40mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)；■：i.g.，80mg/kg(与3.55mg/kg
58 58
的 Fe等当)；▲：i.g.，120mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)。
[0236] 图10显示了给大鼠施用外源性标记的氯高铁血红素后大鼠血浆中58Fe的浓58
度-时间曲线。◆：i.g.，40mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)；■：i.g.，80mg/kg(与
58 58
3.55mg/kg的 Fe等当)；▲：i.g.，120mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)；·：i.V.，2mg/
58
kg(与0.18mg/kg的 Fe等当)；(均值±S.D，n＝6)。
度-时间曲线。◆：i.g.，40mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)；■：i.g.，80mg/kg(与
58 58
3.55mg/kg的 Fe等当)；▲：i.g.，120mg/kg(与3.55mg/kg的 Fe等当)；·：i.V.，2mg/
58
kg(与0.18mg/kg的 Fe等当)；(均值±S.D，n＝6)。
[0237] 大鼠分别按40、80、120mg/kg剂量灌胃给药(采用冷热药配比法，其中标记药物剂量为40mg/kg)及2mg/kgf标记药物剂量为2mg/kg)剂量尾静脉注射给药后，经时过程的血药浓度见图9至10所示，经时过程的血药浓度数据和通过统计距所计算出得药动学参数见下面8个表，表中“ND”表示未检测。注：对于静脉注射给药组，根据预试验结果，药物浓度高于定量上限的，使用空白血浆稀释后进行测定，稀释比例(v∶v)为1∶4＝血浆样品：空白血浆。
[0238] 表：经胃给予40mg/kg氯高铁血红素之后大鼠血浆中来自氯高铁血红素的58Fe血浆浓度(标记药物：40mg/kg氯高铁血红素)(ng/mL)
[0239]T(min) No1 No2 No3 No4 No5 No6 均值 SD
[0240]0.5 51.1 55.4 44.5 43.7 37.8 29.2 43.62 9.36
1 169.5 130.0 158.8 103.6 120.5 62.8 124.20 38.71
1.5 218.8 183.1 242.9 131.6 144.1 134.1 175.77 47.12
2 219.5 216.8 275.7 139.3 177.8 136.2 194.22 53.74
4 207.0 185.1 194.6 122.3 165.6 155.8 171.73 30.60
8 67.0 72.8 68.0 43.7 41.5 101.5 65.74 21.96
15 47.5 40.7 48.5 39.4 17.4 57.2 41.77 13.53
24 16.1 19.4 13.5 20.5 11.0 ND 16.09 3.98
36 7.5 7.6 ND 5.5 ND 10.0 7.67 1.83
1 169.5 130.0 158.8 103.6 120.5 62.8 124.20 38.71
1.5 218.8 183.1 242.9 131.6 144.1 134.1 175.77 47.12
2 219.5 216.8 275.7 139.3 177.8 136.2 194.22 53.74
4 207.0 185.1 194.6 122.3 165.6 155.8 171.73 30.60
8 67.0 72.8 68.0 43.7 41.5 101.5 65.74 21.96
15 47.5 40.7 48.5 39.4 17.4 57.2 41.77 13.53
24 16.1 19.4 13.5 20.5 11.0 ND 16.09 3.98
36 7.5 7.6 ND 5.5 ND 10.0 7.67 1.83
[0241] 表：经胃给予80mg/kg氯高铁血红素之后大鼠血浆中来自氯高铁血红素的58Fe血浆浓度(标记药物：40mg/kg氯高铁血红素)(ng/mL)
[0242]T(min) No1 No2 No3 No4 No5 No6 均值 SD
0.5 45.27 46.61 67.14 52.42 41.94 57.28 51.78 9.30
1 94.3 127.9 138.1 85.4 102.4 111.1 109.87 20.09
1.5 102.0 157.4 177.7 114.6 121.8 125.8 133.22 28.53
2 98.5 154.3 198.1 117.8 143.3 129.7 140.29 34.38
4 62.2 78.0 173.3 54.1 114.2 79.8 93.61 44.17
8 22.4 21.3 65.8 24.0 30.0 18.0 30.26 17.88
15 19.5 19.4 47.8 12.7 17.6 16.8 22.32 12.72
24 8.8 ND 9.2 16.1 5.3 11.5 10.20 3.98
36 10.9 ND ND 7.9 ND 5.2 8.01 2.84
0.5 45.27 46.61 67.14 52.42 41.94 57.28 51.78 9.30
1 94.3 127.9 138.1 85.4 102.4 111.1 109.87 20.09
1.5 102.0 157.4 177.7 114.6 121.8 125.8 133.22 28.53
2 98.5 154.3 198.1 117.8 143.3 129.7 140.29 34.38
4 62.2 78.0 173.3 54.1 114.2 79.8 93.61 44.17
8 22.4 21.3 65.8 24.0 30.0 18.0 30.26 17.88
15 19.5 19.4 47.8 12.7 17.6 16.8 22.32 12.72
24 8.8 ND 9.2 16.1 5.3 11.5 10.20 3.98
36 10.9 ND ND 7.9 ND 5.2 8.01 2.84
[0243] 表：经胃给予120mg/kg氯高铁血红素之后大鼠血浆中来自氯高铁血红素的58Fe血浆浓度(标记药物：40mg/kg氯高铁血红素)(ng/mL)
[0244]T(min) No1 No2 No3 No4 No5 No6 均值 SD
0.5 53.67 41.17 5.20 35.93 42.06 12.52 31.76 18.80
1 144.1 99.4 23.5 70.1 100.2 49.8 81.16 42.65
1.5 184.3 135.7 50.2 62.7 96.9 70.3 100.01 51.28
2 189.0 141.6 90.7 53.9 91.0 80.1 107.70 48.97
4 153.4 93.1 81.7 22.3 89.5 56.4 82.72 43.59
8 87.2 32.3 29.7 16.9 34.1 19.0 36.52 25.82
15 51.5 32.5 25.5 11.7 24.7 19.4 27.55 13.63
24 25.6 14.4 5.9 9.7 9.2 11.9 12.77 6.89
36 10.9 6.3 ND ND ND ND 8.59 3.30
0.5 53.67 41.17 5.20 35.93 42.06 12.52 31.76 18.80
1 144.1 99.4 23.5 70.1 100.2 49.8 81.16 42.65
1.5 184.3 135.7 50.2 62.7 96.9 70.3 100.01 51.28
2 189.0 141.6 90.7 53.9 91.0 80.1 107.70 48.97
4 153.4 93.1 81.7 22.3 89.5 56.4 82.72 43.59
8 87.2 32.3 29.7 16.9 34.1 19.0 36.52 25.82
15 51.5 32.5 25.5 11.7 24.7 19.4 27.55 13.63
24 25.6 14.4 5.9 9.7 9.2 11.9 12.77 6.89
36 10.9 6.3 ND ND ND ND 8.59 3.30
[0245] 表：静脉给予2mg/kg氯高铁血红素之后大鼠血浆中58Fe的血浆浓度(标记药物：2mg/kg氯高铁血红素)(ng/mL)
[0246]T(min) No1 No2 No3 No4 No5 No6 均值 SD
0.5 2044.5 2108.5 1791.5 1984.5 2005.0 2078.5 2002.08 112.81
1 1603.5 1511.5 1660.0 1532.5 1591.5 1467.5 1561.08 70.06
1.5 1368.5 1212.0 1477.0 1369.0 1317.3 1314.3 1343.00 87.10
2 1070.5 985.8 1121.0 863.8 1012.5 1079.8 1022.21 91.58
4 690.7 692.0 637.1 530.2 550.9 434.2 589.18 102.12
8 178.4 186.8 154.6 159.3 139.6 122.7 156.90 23.82
15 73.8 82.4 92.8 65.8 77.6 64.6 76.19 10.63
24 45.7 48.0 57.8 54.6 52.4 43.7 50.37 5.44
36 36.0 48.1 46.1 39.4 37.5 38.8 40.98 4.92
58
0.5 2044.5 2108.5 1791.5 1984.5 2005.0 2078.5 2002.08 112.81
1 1603.5 1511.5 1660.0 1532.5 1591.5 1467.5 1561.08 70.06
1.5 1368.5 1212.0 1477.0 1369.0 1317.3 1314.3 1343.00 87.10
2 1070.5 985.8 1121.0 863.8 1012.5 1079.8 1022.21 91.58
4 690.7 692.0 637.1 530.2 550.9 434.2 589.18 102.12
8 178.4 186.8 154.6 159.3 139.6 122.7 156.90 23.82
15 73.8 82.4 92.8 65.8 77.6 64.6 76.19 10.63
24 45.7 48.0 57.8 54.6 52.4 43.7 50.37 5.44
36 36.0 48.1 46.1 39.4 37.5 38.8 40.98 4.92
58
[0247] 表：经胃给予大鼠40mg/kg氯高铁血红素之后血浆中 Fe的平均药动学参数(标记药物：40mg/kg氯高铁血红素).(均值±S.D,n＝6)
[0248]参数 单位 No1 No2 No3 No4 No5 No6 均值 SD
AUC(0-t) μg/L*h 2077.3 1985.2 1974.1 1484.9 1286.9 2214.3 1837.1 365.4AUC(0-∞) μg/L*h 2103.7 2071.6 2074.4 1541.4 1372.0 2335.1 1916.4 373.2MRT(0-t) h 8.5 8.9 6.9 10.1 6.0 10.2 8.4 1.7
MRT(0-∞) h 8.9 10.5 8.1 11.4 7.6 12.2 9.8 1.9
t1/2z h 5.4 8.4 5.1 7.2 5.3 8.4 6.6 1.6
Tmax h 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 4.0 2.3 0.8
CLz L/h/kg 1.4 1.4 1.4 1.9 2.1 1.2 1.6 0.3
Vz L/kg 10.7 16.9 10.2 19.5 16.2 14.9 14.7 3.6
Cmax μg/L 219.5 216.8 275.7 139.3 177.8 155.8 197.5 50.0
AUC(0-t) μg/L*h 2077.3 1985.2 1974.1 1484.9 1286.9 2214.3 1837.1 365.4AUC(0-∞) μg/L*h 2103.7 2071.6 2074.4 1541.4 1372.0 2335.1 1916.4 373.2MRT(0-t) h 8.5 8.9 6.9 10.1 6.0 10.2 8.4 1.7
MRT(0-∞) h 8.9 10.5 8.1 11.4 7.6 12.2 9.8 1.9
t1/2z h 5.4 8.4 5.1 7.2 5.3 8.4 6.6 1.6
Tmax h 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 4.0 2.3 0.8
CLz L/h/kg 1.4 1.4 1.4 1.9 2.1 1.2 1.6 0.3
Vz L/kg 10.7 16.9 10.2 19.5 16.2 14.9 14.7 3.6
Cmax μg/L 219.5 216.8 275.7 139.3 177.8 155.8 197.5 50.0
[0249] 表：经胃给予大鼠80mg/kg氯高铁血红素之后血浆中58Fe的平均药动学参数(标记药物：40mg/kg氯高铁血红素).(均值±S.D,n＝6)
[0250]参数 单位 No1 No2 No3 No4 No5 No6 均值 SD
AUC(0-t) μg/L*h 867.6 777.9 1744.6 886.7 985.2 934.7 1032.8 355.6
AUC(0-∞) μg/L*h 894.5 784.3 1809.5 1018.3 1020.8 989.7 1086.2 365.8MRT(0-t) h 10.4 4.5 7.1 10.7 6.0 8.9 7.9 2.5
MRT(0-∞) h 11.5 4.6 8.0 16.1 6.9 11.0 9.7 4.1
t1/2z h 7.1 2.1 4.9 11.5 4.6 8.0 6.4 3.3
Tmax h 1.5 1.5 2.0 2.0 2.0 2.0 1.8 0.3
CLz L/h/kg 3.2 3.7 1.6 2.8 2.8 2.9 2.9 0.7
Vz L/kg 33.0 11.2 11.2 47.3 18.8 33.8 25.9 14.5
Cmax μg/L 102.0 157.4 198.1 117.8 143.3 129.7 141.4 33.8
AUC(0-t) μg/L*h 867.6 777.9 1744.6 886.7 985.2 934.7 1032.8 355.6
AUC(0-∞) μg/L*h 894.5 784.3 1809.5 1018.3 1020.8 989.7 1086.2 365.8MRT(0-t) h 10.4 4.5 7.1 10.7 6.0 8.9 7.9 2.5
MRT(0-∞) h 11.5 4.6 8.0 16.1 6.9 11.0 9.7 4.1
t1/2z h 7.1 2.1 4.9 11.5 4.6 8.0 6.4 3.3
Tmax h 1.5 1.5 2.0 2.0 2.0 2.0 1.8 0.3
CLz L/h/kg 3.2 3.7 1.6 2.8 2.8 2.9 2.9 0.7
Vz L/kg 33.0 11.2 11.2 47.3 18.8 33.8 25.9 14.5
Cmax μg/L 102.0 157.4 198.1 117.8 143.3 129.7 141.4 33.8
[0251] 表：经胃给予大鼠120mg/kg氯高铁血红素之后血浆中58Fe的平均药动学参数(标记药物：40mg/kg氯高铁血红素).(均值±S.D,n=6)
[0252]参数 单位 No1 No2 No3 No4 No5 No6 均值 SD
AUC(0-t) μg/L*h 2113.3 1221.4 791.4 448.2 927.9 648.7 1025.2 593.5
AUC(0-∞) μg/L*h 2260.4 1271.4 837.7 566.8 1007.4 790.6 1122.4 605.1MRT(0-t) h 10.1 9.8 7.9 8.2 7.4 8.3 8.6 1.1
MRT(0-∞) h 12.7 11.2 9.2 15.1 9.4 13.3 11.8 2.3
t1/2z h 9.4 7.4 5.4 12.0 6.1 8.3 8.1 2.4
Tmax h 2.0 2.0 2.0 1.0 1.0 2.0 1.7 0.5
CLz L/h/kg 1.3 2.3 3.5 5.1 2.9 3.7 3.1 1.3
Vz L/kg 17.3 24.4 27.1 88.0 25.2 44.0 37.7 26.2
Cmax μg/L 189.0 141.6 90.7 70.1 100.2 80.1 111.9 45.1
AUC(0-t) μg/L*h 2113.3 1221.4 791.4 448.2 927.9 648.7 1025.2 593.5
AUC(0-∞) μg/L*h 2260.4 1271.4 837.7 566.8 1007.4 790.6 1122.4 605.1MRT(0-t) h 10.1 9.8 7.9 8.2 7.4 8.3 8.6 1.1
MRT(0-∞) h 12.7 11.2 9.2 15.1 9.4 13.3 11.8 2.3
t1/2z h 9.4 7.4 5.4 12.0 6.1 8.3 8.1 2.4
Tmax h 2.0 2.0 2.0 1.0 1.0 2.0 1.7 0.5
CLz L/h/kg 1.3 2.3 3.5 5.1 2.9 3.7 3.1 1.3
Vz L/kg 17.3 24.4 27.1 88.0 25.2 44.0 37.7 26.2
Cmax μg/L 189.0 141.6 90.7 70.1 100.2 80.1 111.9 45.1
[0253] 表：静脉给予氯高铁血红素2mg/kg之后血浆中58Fe的平均药动学参数(标记药物：2mg/kg氯高铁血红素).(均值±S.D,n=6)
[0254]参数 单位 No1 No2 No3 No4 No5 No6 均值 SD
AUC(0-t) μg/L*h 8802.5 8885.4 8749.3 7908.7 8153.4 7594.4 8348.9 539.5AUC(0-∞) μg/L*h 8987.1 9081.6 9192.7 9528.8 9219.1 7898.6 8984.7 562.7MRT(0-t) h 5.6 6.0 6.3 6.1 5.9 5.6 5.9 0.3
MRT(0-∞) h 6.5 6.9 8.5 18.1 12.8 7.4 10.0 4.6
t1/2z h 8.3 8.3 11.3 28.2 20.2 10.9 14.5 8.0
CLz/F L/h/kg 0.016 0.015 0.015 0.015 0.015 0.018 0.02 0.00
Vz/F L/kg 0.2 0.2 0.3 0.6 0.4 0.3 0.3 0.2
Cmax μg/L 2044.5 2108.5 1791.5 1984.5 2005.0 2078.5 2002.1 112.8
AUC(0-t) μg/L*h 8802.5 8885.4 8749.3 7908.7 8153.4 7594.4 8348.9 539.5AUC(0-∞) μg/L*h 8987.1 9081.6 9192.7 9528.8 9219.1 7898.6 8984.7 562.7MRT(0-t) h 5.6 6.0 6.3 6.1 5.9 5.6 5.9 0.3
MRT(0-∞) h 6.5 6.9 8.5 18.1 12.8 7.4 10.0 4.6
t1/2z h 8.3 8.3 11.3 28.2 20.2 10.9 14.5 8.0
CLz/F L/h/kg 0.016 0.015 0.015 0.015 0.015 0.018 0.02 0.00
Vz/F L/kg 0.2 0.2 0.3 0.6 0.4 0.3 0.3 0.2
Cmax μg/L 2044.5 2108.5 1791.5 1984.5 2005.0 2078.5 2002.1 112.8
[0255] 大鼠的剂量和生物利用度的相关性见图11。从图11可见，大鼠灌胃给予氯高铁血红素后，随着剂量增加标记药物绝对生物利用度有下降的趋势。经过SPSS分析，低剂量组分别和中剂量、高剂量组之间存在显著性的差异。说明在剂量40-120mg/kg的剂量范围内该药在大鼠体内过程基本呈现出非线性药动学特征。
[0256] 2.4.2体内排泄试验
[0257] 灌胃给药后，如图12所示，源于氯高铁血红素中的58Fe几乎不通过胆汁进行排泄，给药后12小时，累积排泄率仅为0.005%。如图13所示，给药72小时后，源于氯高铁血红素58
中的 铁有0.391%通过尿液进行了排泄。
中的 铁有0.391%通过尿液进行了排泄。
[0258] 3小结
[0259] 大鼠按剂量40、80、120mg/kg灌胃给药(采用冷热药配比法，其中标记药物剂量为40mg/kg)后，氯高铁血红素在大鼠体内的处置过程为非线性动力学，其血药浓度的变化特征符合二房室模型，其中Cmax分别为197.48±49.97、141.38±33.83、111.94±45.12μg/mL。其中，以低剂量组进行计算，绝对生物利用度为1.07%±0.21%。排泄试验表明灌胃给药
58
后，摄取进入血液循环的 Fe几乎不通过胆汁排泄，大部分由尿液排泄。
58
后，摄取进入血液循环的 Fe几乎不通过胆汁排泄，大部分由尿液排泄。
[0260] 上述结果说明试验所提出的采用外源性标记法通过ICP-MS研究氯高铁血红素的铁吸收是可行的。
[0261] 目前关于铁吸收率的定量方法主要有以下三种：
[0262] 第一种是服铁约14天后，采集血样，测定同位素铁整合入红细胞的比例。这种方法不仅可以反映出铁的吸收情况，还可以看出其和骨髓之间的循环以及在红细胞形成中的利用情况。在开展的补铁面包中的抗坏血酸棕榈酸脂能否提高铁的生物利用度研究中，Femando Pizarro等人就采用了这种方法，虽然后来的研究使用差速离心法对该方法进行了优化，但是这种方法不能获得实时定量曲线。同时由于实验周期比较长、计算方法复杂等原因，常常出现较大的个体差异，且实验成本比较高。不过这种方法是目前铁吸收研究中最常采用的方法。
[0263] 第二种是根据铁在人体内没有特定的排泄途径的特点，通过收集并测定受试者在试验期间排泄物中同位素的量，利用同位素摄入量与排泄量的差值，研究铁的吸收情况。霍军生等利用该方法研究了NaFeEDTA强化酱油中铁在人体的吸收率，发现其吸收率要明显优于硫酸亚铁。不过，该方法存在与上述方法相类似的不足。
[0264] 第三种方法是采用常规的药物代谢动力学研究方法通过生物利用度进行评价。Michael B Zimmermann在其文章中讲到，标记铁同位素的吸收曲线可以被用来描述并定量吸收进入循环中的铁，甚至是在较低的剂量下在缺铁的患者中。根据铁在机体内没有特定排泄途径的特点，可以这样认为：进入血液循环的铁可以直接评价铁的吸收率。从这个观点出发，在拥有较好的灵敏度与精密度的情况下，第三种方法将成为误差较小同时成本较低的研究铁吸收率的方法。同时该方法还可以开展含铁药物在体内的分布、代谢和排泄研究。
[0265] 本实验采用了常规药动学的方法对氯高铁血红素在大鼠体内的铁吸收进行了研究，实验中所用的氯高铁血红素是采用外源性标记法，经过化学合成法得到的：以稳定性同58
位素 Fe和原卟啉为原料合成所得合成产物。试验发现灌胃给予氯高铁血红素后铁吸收率比较低，在1.07%左右，同时可以看到试验结果稳定性好，变异较小。这就证实了之前的假设是可行的，说明可以采用外源性标记法，结合药动学知识，开展铁吸收研究。
位素 Fe和原卟啉为原料合成所得合成产物。试验发现灌胃给予氯高铁血红素后铁吸收率比较低，在1.07%左右，同时可以看到试验结果稳定性好，变异较小。这就证实了之前的假设是可行的，说明可以采用外源性标记法，结合药动学知识，开展铁吸收研究。
[0266] 总之，本实验在采用ICP-MS技术的基础上，进行稳定性同位素标记，解决了体内微量铁元素造成的内源性干扰问题，对源于氯高铁血红素的铁吸收情况进行了合理评价。该方法的建立将有利于深入研究铁的吸收和代谢，同时对于体内钙、锌等微量元素研究工作的开展也具有普遍意义。为含金属药物的体内药物分析和药物代谢动力学研究提供新的技术手段。这一工作还将进一步推广电感耦合等离子体质谱技术在含金属药物体内分析与药动学研究中的应用。
[0267] 实施例3：未标记的氯高铁血红素吸收机制
[0268] 初步研究
[0269] 通常认为血红素铁的吸收比较稳定，不容易受外界因素的影响。与之相比，非血红素铁的吸收很容易受外界因素的影响。Diego Moretti等就发现铁的状态和食物基质会严重影响焦磷酸铁在人体的相对生物利用度。
[0270] 1、强化铁的载体
[0271] 对于血红素铁，文献普遍报道影响其吸收的因素比较少。不过有文献认为肉食会在一定程度上促进铁的吸收；有研究发现锌也会促进铁的吸收。Qianyi Ma等人利用放射55
性 Fe在Caco-2细胞水平上研究了常规饮食中具有生物活性的酚酸类物质是否会影响铁的利用。发现表没食子儿茶素和葡萄籽提取物均会降低血红素铁的转运。
性 Fe在Caco-2细胞水平上研究了常规饮食中具有生物活性的酚酸类物质是否会影响铁的利用。发现表没食子儿茶素和葡萄籽提取物均会降低血红素铁的转运。
[0272] 常规的铁吸收研究试验一般以无机铁为研究对象，将强化铁加入不同食物中，比如玉米面、黑豆糊、面包、鸡肉等等。试验发现不同的基质会对铁的吸收产生很大的影响。这也说明了非血红素铁的吸收很容易受饮食的影响。
[0273] 2、吸收促进剂
[0274] 针对非血红素铁容易受基质影响的特点。许多试验开展了铁吸收促进剂的研究，发现抗坏血酸棕榈酸酯、异抗坏血酸、乙二胺四乙酸等都会在一定程度上促进铁的吸收。
[0275] 3、机体的状态
[0276] 研究还发现在不同的机体状态下，铁的吸收情况也会存在差异。尤其是在缺铁状态下，机体对铁的吸收率会增大。
[0277] 但是，氯高铁血红素是血红素脱蛋白后的稳定形态。与血红素铁相比，从结构上讲，前者是无机铁，后者是有机铁；从铁的价态上讲，前者是三价态，后者是二价态。那么其和血红素铁的吸收机制是否一样呢？
[0278] 本部分试验在大鼠水平研究了氯高铁血红素的肠吸收与代谢，同时在Caco-2细胞水平初步研究了氯高铁血红素的吸收特性以及常见的饮食因素对氯高铁血红素铁吸收的影响。
[0279] 第一节大鼠肠吸收与代谢
[0280] 1.材料
[0281] 1.1仪器：岛津LC-20AD液相泵，岛津CBM-20A系统控制器，岛津CTO-20A柱温箱，SIL-20AC自动进样器，岛津SPD-10Avp紫外-可见光检测器；酶标仪，Thermo(Multiskan SpectrμM1500-320，version1.2)，美国。其余同前“第一章稳定性同位素58Fe的ICP-MS方法建立与确证”。
[0282] 1.2色谱条件：色谱柱为Hanbon@Tech，HederaODS-2，Media：10nm5μm，Size：2.1×150mm，Pro.No：H1810205.15；Ser.No：C9805113；柱温40°C；流动相A为甲醇乙腈混合液(v/v=50∶50)，流动相B为水相(水：冰醋酸：吡啶=19∶1∶0.6)，A相与B相比例为80∶20，等度洗脱。流速为0.3mL/min。
[0283] 1.3药品与试剂：氯高铁血红素，含量>98％，新疆科丽公司提供；山奈酚，含量>98％，本试验中作内标使用；菲洛嗪，纯度>98％，阿拉丁化学试剂有限公司；新铜试剂，分析纯，阿拉丁化学试剂有限公司；抗坏血酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。缓冲液Krebs-Hanks中各成分及浓度如下：NaHCO3，25mM；NaCl，118mM；KCl，4.7mM；MgSO4，1.2mM；NaH2PO4，1.2mM；CaCl2，1.2mM；Glucose，10mM。pH值调至7.2-7.4。
[0284] 1.4试 验 动 物：清 洁 级 SD大 鼠，雄 性，体 重200±20g，许 可 证 号SCXK(浙)2008-0033。
[0285] 2方法
[0286] 2.1体外实验样本中氯高铁血红素的测定方法
[0287] 2.1.1标准溶液的配制
[0288] 精密称取13.04mg的氯高铁血红素，溶于1.86mL的碳酸钠溶液(1％)中，加入3.6%盐酸溶液140μL，得浓度为10mM，pH为7.4的氯高铁血红素溶液。精密称取10mg山奈酚，溶于10mL的甲醇中，得浓度为1mg/ml的内标溶液。
[0289] 2.1.2样品处理与测定方法
[0290] 取空白细胞裂解液50μL至Eppendorf管，加入内标山奈酚(20ng/mL)20μL，混匀后加入150μL甲醇，涡旋振荡30s，12000r/min离心10min，取上清液10μL进样测定。
[0291] 2.1.3专属性试验
[0292] 在本试验条件下，氯高铁血红素的保留时间约为3.1min，内标山奈酚的保留时间约为1.8min。通过比较空白细胞裂解液，空白细胞裂解液含药样本中的内源性杂质不干扰样品测定。
[0293] 2.1.4标准曲线的建立
[0294] 取Eppendorf管8个，加入氯高铁血红素对照品溶液20μL，于37°C恒温水浴挥干后，分别加入空白细胞裂解液50μL，使氯高铁血红素浓度分别为0，0.08，0.2，0.4，0.8，2，4，8μM，立即加入150μL甲醇，涡旋混合30秒，12000r/min离心10min，取上清液10μL进样测定。以样品和内标峰面积比As/Ais为纵坐标，浓度C(ng/mL)为横坐标，得氯高铁血红素的标准曲线。结果表明氯高铁血红素在0.08-8μM范围内线性良好。回归方程为：As/
2
Ais=0.625C-0.085，R=0.992。预期可满足氯高铁血红素在Caco-2细胞水平的摄取研究。
2
Ais=0.625C-0.085，R=0.992。预期可满足氯高铁血红素在Caco-2细胞水平的摄取研究。
[0295] 2.1.5精密度试验
[0296] 取Eppendorf管5个，加入氯高铁血红素对照品溶液20μL，于37°C恒温水浴挥干后，分别加入空白细胞裂解液50μL，使氯高铁血红素浓度分别为0.2，2.0，6.4μM。按“2.1.2样品处理与测定”项下操作，测定批内变异。结果表明，批内变异均在15%以内，符合生物样品分析要求，RSD(％)均小于5.5%。
[0297] 2.1.6准确度试验
[0298] 取Eppendorf管5个，加入氯高铁血红素对照品溶液20μL，于37°C恒温水浴挥干后，分别加入大鼠空白血浆50μL，使氯高铁血红素浓度分别为0.2，20，6.4μM。按“2.1.2样品处理与测定”项下操作，测定结果带入血浆标准曲线算出测定浓度，将测定浓度与加入浓度相比，算得血浆中氯高铁血红素的相对回收率。结果表明，各浓度的相对回收率均符合生物样品分析要求，RSD(％)均小于5.5%。
[0299] 2.2生物样品中铁元素的ferrozine测定法
[0300] 2.2.1铁离子释放剂的配制
[0301] 铁离子释放剂由A液和B液混合而成，A液为1.4MHCl，B液为4.5%(w/v)的KMnO4水溶液。因为KMnO4具有强氧化性，所以该释放剂需要现配现用。
[0302] 2.2.2铁离子检测剂的配制
[0303] 铁离子检测剂的配制方法分为两个步骤：
[0304] 步骤一：
[0305] 称取27.04mg新铜试剂于30mL的广口瓶中，加入甲醇1mL振荡使之溶解，加入菲洛嗪63.96mg，醋酸铵3850mg，用水使之溶解。终体积为20mL。所得溶液分别含菲洛嗪(6.5mM)，新亚铜试剂(6.5mM)，醋酸铵(2.5M)。
[0306] 步骤二：
[0307] 因为抗坏血酸溶液的热不稳定，光不稳定性，要求最终的铁离子检测剂必须现配现用。
[0308] 临用前，取步骤一所得的铁离子检测剂初始溶液，按照17.6%(w/v)的比例，加入抗坏血酸，即得铁离子检测剂的终液。所含成分及浓度分别如下：
[0309] 菲洛嗪(6.5mM)，新亚铜试剂(6.5mM)，醋酸铵(2.5M)，抗坏血酸(1M)
[0310] 2.2.3铁离子标准溶液的制备
[0311] 精密称取FeSO4.7H2O27.8mg置10mL的容量瓶中，用10mM的HCl溶液溶解并定容，得终浓度为10mM的铁离子标准溶液。
[0312] 2.2.4样品的处理与测定
[0313] 分别 取 肠 囊内 容 液 或细 胞 裂 解液 100μL至Eppendorf管 中，加入100μLHCl(10mM)，混匀后加入铁离子释放剂100μL，振荡30s，混合均匀。将混合物置通风橱，避光，在水浴锅中(60度)温孵2个小时。温孵时间到后，将混合物冷却至室温。加入已配制好的铁离子检测剂30μL，避光混匀30分钟，取出280μL溶液至96孔板。使用酶标仪进行测定，吸收波长为550nm。
[0314] 2.2.5标准曲线的制备
[0315] 取浓度为10mM的铁离子储备液逐级稀释为20，10，5，2，1，0.5μM的标准溶液。各取100μL如上“2.2.4样品的处理与测定”法操作。即得铁离子溶液的标准曲线，Y＝
2
0.023x+0.037，R=0.997。
2
0.023x+0.037，R=0.997。
[0316] 2.3氯高铁血红素在大鼠肠道的吸收
[0317] 2.3.1氯高铁血红素在Krebs-Ringer缓冲液中的稳定性考察
[0318] 将装有20mL Krebs液的广口瓶置37°C恒温水浴，同时持续向广口瓶中通入混合氧气。氯高铁血红素浓度为(20μM)。分别于30min，1h，1.5h后，取样测量试验前后溶液含量的变化。
[0319] 2.3.2氯高铁血红素外翻肠管离体通透性试验
[0320] SD大鼠隔夜禁食，腹腔注射乌拉坦(1mg/kg，20%)麻醉后，沿腹白线剖开腹腔。从胃幽门下1cm开始向下取10cm为十二指肠；胃幽门下15cm开始向下取10cm为空肠；从回盲瓣上5cm开始向上取10cm为回肠；回盲瓣向下取10cm为结肠。将取出的各肠段迅即用冰生理盐水灌流冲洗，至流出液不再浑浊，基本无肠内容物为止。将小肠移至通入混合氧气(5%CO2，95%O2)的4°C人工肠液中，小心剥离肠表面的脂肪及血管。用玻棒小心将肠腔面向外翻出，将一端封口，另一端插管注入约1mLKrebs液。
[0321] 将处理好的肠管放入盛有37°C恒温Krebs液(含氯高铁血红素20μM)的广口瓶中，通入混合氧气，平衡2min后开始计时。1.5h后将肠管取出，以吸水纸将表面液体吸干，将肠腔内Krebs液取出，置于Eppendorf管中待处理。小心将肠管置于表面皿上，沿纵轴剪开肠管后平铺，测量其宽度和长度。依“2.1体外实验样本中氯高铁血红素的测定方法；和“2.2生物样品中铁元素的ferrozine测定法”处理后进行测定。
[0322] 2.4氯高铁血红素在大鼠肠道的代谢转化
[0323] 2.4.1氯高铁血红素在PBS缓冲液中的稳定性
[0324] 将氯高铁血红素标准溶液使用PBS(pH，7.4)缓冲液稀释至100μM，移取100μL至Eppdorf管中，置于37°C水浴锅中温孵，分别于30min，1h，1.5h后，取样测量试验前后溶液含量的变化(n=2)。
[0325] 2.4.2肠S9制备的操作
[0326] 大鼠禁食12h，用乙醚麻醉后股动脉放血处死，取出小肠，从胃幽门下1cm开始向下取10cm为十二指肠；胃幽门下15cm开始向下取10cm为空肠；从回盲瓣上5cm开始向上取10cm为回肠；回盲瓣向下取10cm为结肠。取出的各肠段迅即用PBS缓冲液灌流冲洗，至流出液不再浑浊，基本无肠内容物为止。然后在冰板上纵向剖开小肠，用玻片刮下肠腔侧的黏膜层，力度要轻，防止刮下其肌肉层，收集刮下的肠黏膜细胞，按质量体积比1：3加入PBS缓冲液，将匀浆管浸入碎冰中尽量保持低温制备匀浆，制备好的匀浆转移至离心管中，4°C下9000g离心20分钟，弃去脂肪层和沉淀物，上清液即为S9，分装后-80°C下保存。
[0327] 2.4.3肠S9蛋白含量的测定
[0328] 用考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定肠S9中的蛋白含量，蛋白质分子中有-NH3+基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋3+
白-NH 结合，使溶液变为蓝色，通过测定吸光度可计算出蛋白含量。
白-NH 结合，使溶液变为蓝色，通过测定吸光度可计算出蛋白含量。
[0329] 取制备好的肠S9混悬液，3000rpm离心10min后取上清液，用生理盐水稀释一定倍数。考马斯亮兰储备液临用时用蒸馏水稀释5倍。按照说明书的添加量混匀，静置10分钟，将溶液转移到96孔板，使用酶标仪进行测定，吸收波长设为595nm，测各管OD值。
[0330] 计算公式为：
[0331]
[0332] 经测定各肠段的蛋白含量(g/l)如下：十二指肠10.7、空肠11.08、回肠12.0、结肠11.0。
[0333] 2.4.4肠S9温孵试验操作
[0334] 取各肠段肠S9溶液100μL，加入PBS10μL和50mM氯化镁溶液各20μL，再加入氯高铁血红素标准品溶液(200μM)20μl混匀，置37°C水浴锅中预温孵5min后加入4mM的NADPH溶液50μL起始反应。终蛋白浓度约为5mg/ml，继续温孵90min后加入600μL冰甲醇终止反应。依“2.1.2”项下操作并进行HPLC测定。
[0335] 2.5数据处理与统计分析
[0336] 2.5.1数据处理
[0337] 2.5.1.1表观通透系数的计算
[0338] 药物在上皮细胞的转运能力通常可以用药物的表观通透系数(Papp)来表示，Papp的计算方法如下：
[0339] Papp=(dQ/dt)/(A×Co)
[0340] 其中dQ／dt表示药物的通透速率(ng/s)，A是通透膜的曲积(cm2)，C0指供应侧药3
物的初始浓度(ng/cm)。本实验中，药物通透量dQ是样品测定浓度和测量体积乘积；dt为取样时间；A为肠管粘膜面测量面积；C0为肠囊外药液氯高铁血红素的初始浓度(20μM)。
物的初始浓度(ng/cm)。本实验中，药物通透量dQ是样品测定浓度和测量体积乘积；dt为取样时间；A为肠管粘膜面测量面积；C0为肠囊外药液氯高铁血红素的初始浓度(20μM)。
[0341] 2.5.1.2吸收率的计算
[0342] 肠腔中药物吸收程度可以用吸收率计算，计算方法如下：
[0343] 吸收率＝(Ct*V1)/(C0*V2)*100%
[0344] 其中Ct为t时间点时，肠囊内的药物浓度；C0为肠囊外药液氯高铁血红素的初始浓度(20μM)；V1为肠囊内实际充液体积；V2为肠囊外液体积。
[0345] 2.5.1.3代谢速率的计算
[0346]
[0347] 其中：温孵体系体积为200μL；温孵时间为90min，蛋白量为各肠段测定的蛋白浓度与加入体积20μL的乘积。
[0348] 2.5.2统计分析
[0349] 使用SPSS15.0对数据进行统计分析。分析方法选用T-test，其中*P<0.05，可认为存在显著性差异。
[0350] 3.结果
[0351] 3.1温孵体系中稳定性考察：图14显示民氯高铁血红素在孵育系统中的稳定性。如图14所示，氯高铁血红素在本实验的溶解方式下，在pH约为7.2-7.4的Krebs和PBS缓冲体系中温孵90min均可以保持稳定。
[0352] 3.2氯高铁血红素在大鼠不同肠段吸收率的比较：在外翻肠囊的粘膜侧Krebs液中加入20μM的氯高铁血红素，温孵1.5h后，测定不同肠段的浆膜侧Krebs液中的氯高铁血红素和总铁含量。同时计算在各肠段的通透系数和吸收率。由图15可知，氯高铁血红素在各个肠段的通透系数由高到低分别为结肠＞回肠＞空肠＞十二指肠，而总铁在各个肠段的通透系数由高到低分别为十二指肠＞结肠＞回肠＞空肠。说明总铁吸收最强的部位在十二指肠，氯高铁血红素吸收最强的部位在结肠。而氯高铁血红素本身在十二指肠吸收时存在较为严重的代谢作用。各肠段吸收率的计算结果与上述结果相一致。结果如下表所示：
[0353] 表：氯高铁血红素和总铁在不同肠中的吸收分数(％)
[0354]
[0355] 3.3氯高铁血红素在大鼠不同肠段代谢转化的比较
[0356] 为验证各肠段对氯高铁血红素的代谢作用，在不同肠段S9所组成的Ⅰ相温孵体系中温孵1.5h后，测定氯高铁血红素的代谢转化率。由图16可知，氯高铁血红素在各个肠段S9温孵体系中的代谢转化率最高的是十二指肠，与其他三组相比较，存在显著性的差异，本部分试验结果与
[0357] 4.小结
[0358] 肠外翻试验结果发现：氯高铁血红素在各个肠段的通透系数由高到低分别为结肠＞回肠＞空肠＞十二指肠，而总铁在各个肠段的通透系数由高到低分别为十二指肠＞结肠＞回肠＞空肠。说明总铁吸收最强的部位在十二指肠，氯高铁血红素吸收最强的部位在结肠。而氯高铁血红素本身在十二指肠吸收时存在较为严重的代谢作用。各肠段吸收率的计算结果与上述结果相一致。大鼠肠S9温孵试验结果与上述肠外翻试验结果一致：氯高铁血红素在各个肠段S9温孵体系中的代谢转化率最高的是十二指肠。
[0359] 第二节Caco-2细胞模型的吸收
[0360] 1.材料与方法
[0361] 1.1药品与试剂
[0362] DMEM高糖培养基(高糖，含1%谷氨酰胺，不含丙酮酸钠)，Hyclone，美国；胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)，Hyclone，美国；青霉素，链霉素，Bioshape，中国；胰蛋白酶消化液(0.25%-0.02％)；考马斯亮蓝试剂盒，南京生兴生物技术有限公司；MTT，噻唑蓝；氯高铁血红素，含量＞96%，由新疆科丽有限公司提供；绿茶提取物、葡萄柚提取物购自南京泽朗医药科技有限公司提供(纯度大于95%)；Caco-2细胞购自上海中科院细胞库，代数在20-30代之间。
[0363] 细胞培养溶液的配制：
[0364] 完全培养基：高葡萄糖(DMEM)培养基，L-谷氨酰胺，青霉素，链霉素，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，兑入20%胎牛血清和1%非必需氨基酸，置于4°C保存。
[0365] Hank’s平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution,HBSS)：
[0366] a.准确称取以下各成分：
[0367]
[0368] 将CaCl2先溶解在100mL超纯水中。其他成分依次溶解750mL超纯水中(注意应待前一种试剂完全溶解后再溶解下一种成分)，加入溶解好的氯化钙。将配好的溶液移入容量瓶中，补足水充分混匀。过滤灭菌，分装瓶中，4°C保存。
[0369] 胰蛋白酶消化液：0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，置于4°C保存。
[0370] MTT溶液配制：称取MTT0.05g，溶于10mL的PBS(0.01M，pH7.4)中，得浓度为5mg/mL的MTT溶液。用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4°C避光保存，最好临用前一天现配。两周内使用有效。在配制和保存的过程中，容器用铝箔纸包住避光。
[0371] 含药溶液的配制：
[0372] (1)氯高铁血红素：精密称取13.04mg的氯高铁血红素，溶于1.86mL的碳酸钠溶液(1%)中，加入3.6%盐酸溶液140μL，得浓度为10mM，pH为7.4的氯高铁血红素溶液。用空白Hank’s液逐级稀释为1，5，10，20，50，100μM等试验所需的浓度。
[0373] (2)钙离子溶液：精密称取无水氯化钙11.1mg，溶于1mL空白Hank’s液，并逐级稀释为1，10，100μM，待用。
[0374] (3)抗坏血酸：精密称取抗坏血酸17.6mg，溶于1mL空白Hank’s液，并逐级稀释为1，10，100μM，临用现配，注意避光。
[0375] (4)绿茶提取物：精密称取绿茶提取物1mg，溶于1ml空白Hank’s液，并逐级稀释为1，10，100μg/mL，待用。
[0376] (5)葡萄柚提取物：精密称取葡萄柚提取物1mg，溶于1mL空白Hank’s液，并逐级稀释为1，10，100μg/mL，待用。
[0377] 1.2仪器
[0378] 酶标仪，Thermo(Multiskan SpectrμM1500-320，version1.2)，美国；灭菌锅，医用净化工作台，中国，倒置相差显微镜，西域，中国，灭菌式二氧化碳培养箱，Thermo，美国。
[0379] 1.3Caco-2细胞的培养
[0380] 将Caco-2细胞培养在高葡萄糖(4.5g/L)的DMEM培养基(含有1%非必须氨基酸，L-谷氨酰胺，20%胎牛血清)中，长于T-25组织培养曲颈瓶中。通入5%CO2(相对湿度90%)，置37度培养箱中培养。培养液2-3天更换一次，当细胞达到90%融合后，用不含钙，镁离子的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后与胰酶(0.25%)-EDTA(0.02%)于37度一起孵育至分离(约3-5分钟)。吹打细胞使之脱落，置离心管中1000rpm离心5分钟。细胞重新悬浮于完全DMEM液中以1:3的比例分配至新培养瓶中。实验时细胞接种于24孔板，接种密度为
5
1.5*10/mL，接种后隔天换液，培养5天后待用。
5
1.5*10/mL，接种后隔天换液，培养5天后待用。
[0381] 1.4实验内容
[0382] 1.4.1Caco-2细胞生存活力MTT试验
[0383] Caco-2细胞系培养至状态和活力良好后收集对数期细胞，接种于96孔培养板上，4
铺板使待测细胞密度为3×10 每孔，边缘孔用无菌PBS填充。5%CO2，37°C细胞培养箱孵育，细胞贴壁后即可开始试验。
铺板使待测细胞密度为3×10 每孔，边缘孔用无菌PBS填充。5%CO2，37°C细胞培养箱孵育，细胞贴壁后即可开始试验。
[0384] 试验A：共分为9组，分别为空白对照组，阴性对照组，阳性对照组和给药组。其中空白对照组不含细胞，阴性对照组不加药，阳性对照组以SDS(终浓度为0.1％)为阳性对照药，给药组浓度(终浓度)梯度设置为：0.16，0.8，4，20，100和1000μM。每孔加样量100μL，每种给药剂量设6个复孔。
[0385] 试验B：分别分为空白对照组，阴性对照组，阳性对照组和给药组。其中空白对照组，阴性对照组和阳性对照组，如试验A所示。给药组分别为钙离子(1，10，100μM)，抗坏血酸(1，10，100μM)，绿茶提取物(1，10，100μg/mL)，葡萄柚提取物组(1，10，100μg/mL)。其余同上试验A所示。
[0386] 将各种药物用空白Hank’s液溶解配制好后，过滤灭菌，用培养基逐级稀释为相应浓度。5%CO2，37°C细胞培养箱孵育4h后，将孔内的含药培养基吸出，PBS清洗后，加入空白培养基180μL，每孔再分别加入20μL经过滤后无菌的MTT溶液(5mg/mL)，放置细胞培养箱中继续培养4h。终止培养，小心吸去每个孔内的培养液以及MTT溶液。每孔加入150μLDMSO，37°C下置摇床上低速振荡10min，使甲紫结晶物充分溶解。
[0387] 吸光度用酶标仪进行测定，波长设在570nm。用抑制率来评价药物对Caco-2细胞活力的影响。抑制率在15%以内，可以认为药物对Caco-2细胞活力没有抑制作用。抑制率公式如下：
[0388] 抑制率％=(阴性对照组-给药组)/阴性对照组*100%
[0389] 注：MTT的原理是氧化还原反应。而实验中所用的抗坏血酸和硫酸亚铁本身拥有较强的还原性，所以在加入MTT之前需要将含药培养基吸出并用空白PBS清洗。
[0390] 1.4.2氯高铁血红素在Caco-2细胞的摄取试验
[0391] 1.4.2.1氯高铁血红素在Caco-2细胞摄取的时间依赖性
[0392] 取融合成单层的Caco-2细胞，实验前将每孔用37°C的Hank’s液轻轻荡洗三次，第三次加入Hank’s液后，将培养板置于37°C摇床中平衡10min，各孔换为Hank’s溶液配制的氯高铁血红素溶液(20μM)0.5mL(37°C)，置于37°C摇床中温孵，温孵时间为0，15，30，60，120，180min，速度为50rpm。温孵时间到达后，将含有药物的Hank’s溶液吸出，用4°C的冰Hank’s溶液轻轻荡洗三次，以除去吸附在细胞表面的药物。加入0.5mL超纯水，反复冻融三次后，置超声仪中，超声频率设置为99HZ，超声时间设置为10min。超声裂解后，置显微镜下观察细胞裂解情况，可见细胞均裂解，呈现点状均一溶液。处理后进样测定，同时取细胞悬液，用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。最终，药物浓度用蛋白含量进行校正，表示为nmol/μg protein。
[0393] 1.4.2.2氯高铁血红素在Caco-2细胞摄取的浓度依赖性
[0394] 取融合成单层的Caco-2细胞，实验前将每孔用37°C的Hank’s液轻轻荡洗三次，第三次加入Hank’s液后，将培养板置于37°C摇床中平衡10min，各孔换为Hank’s溶液配制的氯高铁血红素溶液0.5mL(37°C)，氯高铁血红素浓度分别设置为0，1，5，10，50，100μM。置于37°C摇床中温孵，温孵时间为180min，速度为50rpm。温孵时间到达后，按照“1.4.2.1氯高铁血红素在Caco-2细胞摄取的时间依赖性”终止温孵并处理细胞。
[0395] 1.4.2.3氯高铁血红素在Caco-2细胞摄取的温度依赖性
[0396] 取融合成单层的Caco-2细胞，实验前将每孔用37°C的Hank’s液轻轻荡洗三次，第三次加入Hank’s液后，将培养板置于37°C摇床中平衡10min，部分孔换为Hank’s溶液配制的氯高铁血红素溶液0.5mL(37°C)，氯高铁血红素浓度分别设置为1和10μM。置于37°C摇床中温孵，温孵时间为180min，速度为50rpm。温孵时间到达后，将含有药物的Hank’s溶液吸出，用4°C的冰Hank’s溶液轻轻荡洗三次，以除去吸附在细胞表面的药物。
[0397] 将剩余孔换为Hank’s溶液配制的氯高铁血红素溶液0.5mL(37°C)，氯高铁血红素浓度分别设置为1和10μM。置于4°C冰箱中温孵，温孵时间为180min，速度为50rpm。温孵时间到达后，同上“1.4.2.1氯高铁血红素在Caco-2细胞摄取的时间依赖性”处理。
[0398] 1.4.2.4氯高铁血红素在Caco-2细胞摄取受饮食因素的影响
[0399] 饮食因素对氯高铁血红素摄取影响实验中，分别考察了钙离子，抗坏血酸，绿茶提取物和葡萄柚提取物四个影响因素。
[0400] 根据参考文献，四种因素的设置水平分别如下：
[0401] 钙离子，抗坏血酸：1，10，100μM
[0402] 绿茶提取物，葡萄柚提取物：1，10，100μg/mL
[0403] 取融合成单层的Caco-2细胞，实验前将每孔用37°C的Hank’s液轻轻荡洗三次，第三次加入Hank’s液后，将培养板置于37°C摇床中平衡10min，平衡时间结束后，各孔换为Hank’s溶液配制的各药物溶液0.45mL(37°C)，置于37°C摇床中温孵，速度为50rpm。
[0404] 温孵时间20min到达后，分别加入Hank’s溶液配制的氯高铁血红素溶液(200μM)0.05mL，设置温孵时间180min。温孵结束后，将含有药物的Hank’s溶液吸出，用4°C的冰Hank’s溶液轻轻荡洗三次，以除去吸附在细胞表面的药物，同上“1.4.2.1氯高铁血红素在Caco-2细胞摄取的时间依赖性”处理。
[0405] 2.结果
[0406] 2.1氯高铁血红素对Caco-2细胞生存活力的影响
[0407] MTT结果如下表所示，给药组和阴性对照组细胞相比，抑制率均在15%以内。因此，我们可以认为本部分Caco-2细胞试验里，所选择的给药浓度包括钙离子、抗坏血酸、绿茶提取物、葡萄柚提取物和氯高铁血红素在内均未对Caco-2细胞造成损伤。这也是准确开展细胞摄取试验的基础。接下来的细胞摄取试验中，各药物给药剂量均在上述所得安全剂量范围内。
[0408] 表：用于细胞活性的物质的作用(均值±Sd,n=6)
[0409]
[0410] 2.2摄取特性的研究
[0411] 2.2.1时间依赖性：结果显示，氯高铁血红素在Caco-2细胞中的摄取呈现了一个时间依赖性的过程，即摄取量随着时间的延长而增加。在60min之前近似呈线性，之后在60min至120min，摄取量逐渐饱和，在120min至180min之间出现了摄取的累积平台。根据氯高铁血红素在Caco-2细胞中摄取的时间依赖性特点，为保证摄取稳态时间的一致性，本实验的给药时间都采用180min的摄取时间。
[0412] 2.2.2浓度依赖性：浓度依赖性试验选用180min作为设点时间点，氯高铁血红素给药浓度范围选择在1-100μM之间。结果显示，随着氯高铁血红素给药浓度的增加，其在Caco-2细胞内的摄取量均显著增加。以摄取量对氯高铁血红素浓度做线性回归，得回归直线方程，y＝0.137x+0.334，相关系数为0.994，这说明在该浓度范围内Caco-2细胞对氯高铁血红素的摄取呈线性，表现为浓度依赖性。根据氯高铁血红索在Caco-2细胞中摄取的浓度依赖性特点，为保证摄取时均在线性范围内，本实验的给药浓度都采用20μM。
[0413] 2.2.3温度依赖性：温度依赖性试验选用180min为设定时间点，20μM为摄取浓度。结果显示，在37度和4度两种条件下，氯高铁血红素在1和10μM浓度水平的摄取量均不存在显著性的差异。
[0414] 2.2.4饮食因素对氯高铁血红素铁吸收的影响
[0415] 为了考察常见的饮食因素是否会对氯高铁血红素的铁吸收产生影响，试验分别在Caco-2水平研究了钙离子(1，10，100μM)、抗坏血酸(1，10，100μM)、绿茶提取物(1，10，100μg/ml)和葡萄柚提取物(1，10，100μg/mL)对氯高铁血红素吸收的影响，其中各影响因素的预温孵时间为20min。氯高铁血红素的浓度水平设为20μM。
[0416] 结果如下图17所示：钙离子可以促进氯高铁血红素铁的吸收，并呈现出剂量相关性。与空白组相比较，中浓度组呈现出显著性的差异，高浓度组呈现出极显著性差异；抗坏血酸组在1-100μM浓度范围内，均可以显著的促进氯高铁血红素的铁吸收；但是高浓度时该作用有一定下降的趋势；绿茶和葡萄柚提取物在高浓度时也可以促进氯高铁血红素铁的吸收。
[0417] 3.小结
[0418] 3.1氯高铁血红素在Caco-2细胞中的摄取呈现了一个时间依赖性的过程，即摄取量随着时间的延长而增加。在60min之前近似呈线性，之后在60min至120min，摄取量逐渐饱和，在120min至180min之间出现了摄取的累积平台。
[0419] 3.2随着给药浓度的增加，氯高铁血红素在Caco-2细胞内的摄取量呈线性增加。说明在1-100μM浓度范围内，氯高铁血红素在Caco-2细胞中的摄取呈现依赖性特点。
[0420] 3.3在37°C和4°C两种条件下，氯高铁血红素在1和10μM三种浓度水平的摄取量不存在显著性的差异。
[0421] 3.4Caco-2实验中，饮食因素包括钙离子、抗坏血酸、绿茶和葡萄柚提取物均可以在一定程度上促进氯高铁血红素的吸收，其中促进作用最显著的是抗坏血酸。