缀合的凝血因子VIIa

摘要

本发明提供了一种生物相容性聚合物，该生物相容性聚合物通过一个或多个半胱氨酸残基与FVIIa缀合，适当地通过FVIIa中还原的二硫键间的连接基与FVIIa缀合，本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有这种缀合形式的FVIIa。

权利要求

1.一种因子VIIa-聚乙二醇缀合物，其中，一个或多个聚乙二醇基团通过连接基团与因子VIIa缀合，所述聚乙二醇基团具有10-30kDa的分子量，所述连接基团桥接在所述因子VIIa中形成二硫键的两个半胱氨酸残基的硫原子，其中，所述缀合物具有如下结构：

1

其中R 为取代基，该取代基为直接的键、亚烷基、或可任选取代的芳基或杂芳基；其中所述芳基为苯基、苯甲酰基或萘基；其中所述杂芳基基团为吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、哒嗪、嘧啶或嘌呤；其中与聚合物的连接为通过水解不稳定的键的连接或通过稳定的键的连接。

2.根据权利要求1所述的因子VIIa-聚乙二醇缀合物，其中，所述亚烷基为C1-10亚烷基。

3.一种药物组合物，该药物组合物含有前述权利要求任意一项所述的因子VIIa-聚乙二醇缀合物。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，所述药物组合物含有药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。

5.根据权利要求3或4所述的药物组合物，所述药物组合物还含有其他药物活性剂。

6.根据权利要求3或4所述的药物组合物，所述药物组合物适于肠外给药。

7.根据权利要求3或4所述的药物组合物，所述药物组合物适于皮内注射、皮下注射、肌肉注射以及静脉输注或骨内输注。

8.根据权利要求3或4所述的药物组合物，所述药物组合物以药水、悬浮液或乳液的形式存在。

9.根据权利要求3或4所述的药物组合物，其中，与未经修饰的因子VIIa相比，因子VIIa缀合物具有更长的半衰期。

10.根据权利要求3或4所述的药物组合物，其中，与未经修饰的因子VIIa相比，因子VIIa缀合物具有更高的AUC。

11.根据权利要求3或4所述的药物组合物，其中，与未经修饰的因子VIIa相比，因子VIIa缀合物具有更高的生物利用率。

12.根据权利要求3或4所述的药物组合物，其中，与未经修饰的因子VIIa相比，因子VIIa缀合物具有更低的免疫原性。

13.权利要求3-12中任意一项所述的药物组合物在制备用于治疗凝血病或创伤的药物中的用途。

14.根据权利要求13所述的用途，其中，所述凝血病是血友病A或血友病B。

15.权利要求3-12中任意一项所述的药物组合物在制备用于降低患有血友病A、血友病B或创伤的哺乳动物的关节积血、出血和经血过多的风险的药物中的用途。

16.根据权利要求15所述的用途，其中，所述出血为胃肠道出血。

17.根据权利要求15或16所述的用途，其中，所述组合物通过皮下途径给药。

18.根据权利要求15或16所述的用途，其中，所述组合物通过静脉途径给药。

19.根据权利要求15或16所述的用途，其中，每一至十四天用所述组合物进行给药一次。

20.权利要求1或2所述的因子VIIa-聚乙二醇缀合物在制备用于治疗以因子VIIa功能丧失为特征的凝血病或治疗创伤的药物中的用途。

21.一种制备以下因子VIIa-聚乙二醇缀合物的方法，1

其中R 为取代基，该取代基为直接的键、亚烷基或可任选取代的芳基或杂芳基；其中所述芳基为苯基、苯甲酰基或萘基；其中所述杂芳基为吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、哒嗪、嘧啶或嘌呤；其中与聚合物的连接为通过水解不稳定的键的连接或通过稳定的键的连接，其中所述聚乙二醇基团具有10-30kDa的分子量，并且其中，所述方法包括以下步骤：

(a)还原因子VIIa的两个半胱氨酸残基之间的天然二硫键，以产生两个游离的硫醇基；

(b)含有缀合双键和离去基团的缀合反应物间发生第一次硫醇盐加成反应；

(c)消去离去基团，产生缀合双键；以及

(d)第二次硫醇盐加成反应，在两个硫原子之间形成3-碳桥。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述缀合反应物具有以下分子式，其中R1是取代基，该取代基为直接的键、亚烷基或可任选取代的芳基或杂芳基；其中所述芳基为苯基、苯甲酰基或萘基；其中所述杂芳基为吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、哒嗪、嘧啶或嘌呤；其中与聚合物的连接为通过水解不稳定的键的连接或通过稳定的键的连接，且L是离去基团。

23.根据权利要求21或22所述的方法，其中，所述亚烷基为C1-10亚烷基。

说明书

缀合的凝血因子VIIa

技术领域

[0001] 本发明涉及一种缀合形式的人凝血因子VIIa。

背景技术

[0002] 凝血因子VII（本文中称作FVII）是一种分子量为53000道尔顿（Da）、被糖基化的维生素K依赖性的单链酶原，凝血因子VII含有12个天然的二硫键（O’Hara et al.,Proc.Nat’lAcad.Sci.美国，84:5158-5162(1987))）。蛋白质主要是在肝脏中产生。FVII参与
外源性凝血级联反应（图1）。所述蛋白质由四个离散的结构域组成：一个N-末端γ-羧基
谷氨酸（Gla）结构域，两个类表皮生长因子（EGF）结构域和一个C-末端丝氨酸蛋白酶结构域。当缺乏存在于血管内皮下膜中的FVII的辅因子组织因子（TF）时，血液循环中的酶原
仅表现出很低的蛋白酶活性。血管损伤后，FVII以高亲和力与TF结合，并通过精氨酸152
和异亮氨酸153之间肽键的特异性裂解，变成有活性的双链酶FVIIa。FVIIa轻链由N-末
端Gla结构域和类EGF结构域构成，重链由丝氨酸蛋白酶结构域构成。重链和轻链通过半
胱氨酸135和半胱氨酸262之间的单一二硫键连接在一起。一旦被活化，FVIIa会快速地
催化FX转化为FXa并催化FIX转化为FIXa。然后，FXa与FVa形成一种复合物，以使凝血
酶原裂解，这会产生少量的凝血酶(Aitken,M.G.EMA,16:446-455(2004))。这种凝血酶的产生会使血小板和血小板表面上的辅因子V，VIII和XI活化。这样的活化会导致凝血酶的大
量形成，所述凝血酶的大量形成能够引起纤维蛋白聚合反应和止血栓塞的形成。

[0003] 诺和诺德公司已经研发出了人重组FVIIa并已将其商品化，其商品名为(活化形式的eptacog alfa，ATC编码B02BD08)。 被批准用
于治疗血友病A或B患者的出血发作（bleeding episodes），所述患者分别能够产生FVIII
或IX的抑制性抗体(Jurlander et al.,Seminars inThrombosis and Hemostasis,27:37
3-383(2001);Roberts et al.,Blood,15:3858-3864(2004))。自1996年开始使用时起，已
经证明这样的治疗是安全和有效的。然而，由于蛋白质在体内半衰期相对较短（2.3小时；
以批准的 为基础的概要，FDA的序列号为96-0597），为了达到止血的目的，在
-1
一次出血发作过程中随着时间的推移，需要多次输入高剂量的产品(90μg kg )。所述产
品较短的半衰期和达到理想的治疗效果所需要的高剂量阻碍了 与抑制剂共
同使用在预防性治疗血友病患者中的用途。因此，很明显需要开发一种半衰期更长的FVIIa分子，以便在药物动力学（PK）和药效动力学（PD）方面都有所改进。

[0004] 以前，人们就已经成功的将生物药品与生物相容性聚合物相缀合以用于提高产品的物理化学特性。通过缀合被改进的治疗性蛋白的特性包括PK、PD和免疫原性。化学基
团与蛋白质的连接能够显著地增加蛋白质的循环半衰期(Jevsevar et al.,Biotechnol.
J.,5:113-128(2010))。对于分子量低于肾小球过滤限制的分子种类来说，大分子量基团的缀合阻碍了产品的肾清除。而且，在药剂制品上附加化学基团能够通过空间位阻来阻碍受
体介导的分子清除。

[0005] 已在许多市售的生物药品制品中使用的生物相容性聚合物的实例是聚乙二醇（本文中称作PEG）。将PEG分子共价附着到另一个分子的过程称作聚乙二醇化。迄今为
止，有九种聚乙二醇化的制品已经获得FDA的上市许可，其中有四种是非常畅销的药品：
(Schering-Plough)、 (Hoffman-La Roche)、 (Amgen)和
(Hoffman-LaRoche)。已经有许多不同的化学方法用于将蛋白治疗剂与活化的
PEG分子相缀合。随机的聚乙二醇化已经成功地被用于通过蛋白质上的氨基将PEG基团与
蛋白共价连接。这种连接位点通常是但不仅仅限于赖氨酸残基侧链上的ε-氨基。这种随
机的反应可能产生非常复杂的缀合物的混合物，其中的PEG部分附着位点和数目都不尽相
同。即使在随机缀合反应后进行纯化，也还会存在位置异构体，而这些异构体均具有不同的物理化学性质和药物学性质。目前已经研发了多种位点特异性的聚乙二醇化技术，并且现
在已经试图将这些技术用于生产成分更确定的生物药品。进行位点特异性聚乙二醇化所采
取的方法包括靶标于N-末端、半胱氨酸、聚糖、二硫化物和聚组氨酸的聚乙二醇化。

[0006] 重组FVIIa的聚乙二醇化的现有技术在不同的专利和专利申请中均有记载：

[0007] WO 98/32466文献提到FVII可以被聚乙二醇化，但是没有给出更多关于这方面的信息。

[0008] US 2008/0200651提到在野生型FVII多肽上通过人为引入的半胱氨酸残基而缀合PEG分子，能够表现出延长的体内半衰期或者具有增强的活性。

[0009] US 2008/0221032记载了FVIIa-聚唾液酸缀合物，所得的分子具有显著延长的体内半衰期。

[0010] US 2009/0176967教导：可以使用酶在FVII多肽的C-末端引入特定的官能团，FVII多肽可以在该处与生物相容性聚合物如PEG偶联。

[0011] US2009/0227504记载了FVIIa（或类FVIIa分子）的制备，其中一个或多个天冬酰胺连接的和/或丝氨酸连接的低聚糖链被至少一个表现出改进的血清半衰期的聚合基团
共价修饰。

[0012] US 2010/0028939记载了如何采用半乳糖氧化酶修饰天然的糖蛋白，从而在聚糖末端产生具有反应活性的醛官能团。然后，所述具有反应活性的醛基可以用来将聚合部分
与蛋白缀合，以产生具有改善的药理学的产品。

[0013] US 2010/0056428提到通过聚合部分例如PEG的肟在糖蛋白的糖基位置进行衍生化，可以实现FVIIa药学动力学特性的改进。

[0014] US 2010/0093934教导：聚合基团与凝血因子的靶向缀合可以通过首先将凝血因子与单克隆抗体或抗体结合，在与活化的聚合物反应前，所述单克隆抗体或抗体对蛋白有
亲和力。

[0015] US 2010/0099616记载了如何制备缀合有少量（1-9个）水溶性聚合物的血液因子（包括FVIIa）。然而，作者并没有用实例说明通过这种方法制得的聚乙二醇化的FVIIa的药理学特性。

[0016] 另一种蛋白质聚乙二醇化的方法已由PolyTherics公司开发，并被称为TM
TheraPEG ，其中，通过蛋白质中的一对半胱氨酸残基的还原型二硫键，PEG聚合物与目的蛋白相连接(WO 2005/007197)。这一技术已被用于制备无因子FIXa污染的经聚乙二醇化的
因子IX变体(WO 2009/130602)。

[0017] 然而，对于使用同样的技术制备聚乙二醇化的FVIIa而言，则被认为是重要的或者非常规的。

[0018] 虽然在止血方面，血凝系统中的各种蛋白可能有共同的目标，但是它们发挥作用TM
的机理不同，因此，断言TheraPEG 技术能够为改进所有凝血蛋白的半衰期和免疫原性提
供显而易见的方法是不合理的。区别总结如下：

[0019] 从活性角度来看，FVIIa与FIX存在某些关键的区别，这就意味着这种蛋白质和生物相容性聚合物的缀合并不是一个简单的步骤。。

[0020] 例如，FIX和FIXa参与内源性凝血级联反应，而FVIIa主要参与外源性级联反应。FIX在被活化后仅需要与它的辅因子FVIII结合而参与凝血级联反应。相反地，在组织因
子（Tf）存在时，FVIIa仅仅是启动凝血，因此，对于在凝血中被活化的FVIIa而言，它必须TM
有能力结合Tf，还需要有可用的活性位点来进行肽的裂解。使用TheraPEG 进行的FVIIa
的理论上的聚乙二醇化被认为可能会影响蛋白质结合Tf的能力以及从空间上阻碍活性位
点。在生物活性方面的其他不同点是FIXa具有内源性免疫原性，但FVIIa没有。

[0021] FVIIa也可以通过直接与活化的血小板相互作用来启动凝血。这一特殊的过程并未被完全了解，但是可能涉及更多的受体位点结合。为了达到这一效果，FVIIa在原理上可能需要三个与它的靶标配体相互作用的位点，而这三个位点都有可能被聚乙二醇化破坏。
因此，因子VIIa的聚乙二醇化具有一些独特且不同的困难，这与FIX有明显的不同。

[0022] 但是不管怎样，仍然需要一种改进的FVIIa分子，所述FVIIa分子含有以位点特异性方式与多肽缀合的生物相容性聚合物，以延长FVIIa的体内半衰期，同时，与未修饰的FVIIa或现有技术中已知的其他经修饰的FVIIa治疗剂相比，仍保留了功能性活性。

[0023] 已经发现，重组FVIIa的药理性质可以通过将FVIIa与一个或者多个生物相容性聚合物缀合而得到增强。增强的药理性质包括与未缀合的FVIIa相比，体内循环半衰期的
延长。

发明内容

[0024] 根据本发明的第一方面，提供了通过一个或多个半胱氨酸残基与FVIIa缀合的生物相容性聚合物。

[0025] 生物相容性聚合物可选自由：聚乙二醇(PEG)、聚磷脂酰胆碱(PC)、聚丙二醇(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚环氧乙烷(PEO)、聚氧乙烯醇
（polyoxyethylated polyol）、聚 烯 醇（polyolefinic alcohol）、聚 羟 烷 基 丙 烯 酸甲酯（polyhydroxyalkylmethacrylate）、多糖、聚α-羟基酸、聚乙烯醇、聚磷 腈
(polyphosphosphasphazene)、聚N-丙烯酰吗啉、聚烯烃氧化物聚合物（polyalkyene oxide polymers）、聚马来酸、聚DL-丙氨酸、羧甲基纤维素、右旋糖酐、淀粉或淀粉衍生物、透明质酸甲壳素（hyaluronic acid chitin）、聚甲基丙烯酸酯、聚唾液酸(PSA)、聚羟基羧酸钠（polyhydroxy alkanoates）、聚氨基酸以及它们的组合组成的组中。所述生物相容性聚合物可以具有线性或分支状结构。

[0026] 在另一个实施方式中，所述生物相容性聚合物为蛋白质，选自但不限于由：FVII、白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白（包括单克隆抗体）、抗体片段如单结构域抗体、VL、VH、Fab、F(ab’)2、Fab’、Fab3、scFv、di-scFv、sdAb、Fc以及它们的组合组成的组中。

[0027] 如果需要，每个FVIIa分子可以通过一个或多个半胱氨酸残基与一种或多种生物相容性聚合物缀合。游离的半胱氨酸残基是还原胱氨酸二硫键的产物。本发明的生物相容
性聚合物可以通过一个或多个还原的半胱氨酸二硫键与FVIIa缀合。所述缀合可以是通过
将FVIIa中形成二硫键的两个半胱氨酸残基的硫残基桥接的连接基团的方式。因而，二硫
键可以是天然二硫键或者是重组引入的二硫键。

[0028] 当所述生物相容性聚合物为PEG分子时，它可以具有任何适当的分子量，例如5-100kDa，10-500kDa。适当地为5-30kDa或者10-30kDa。某些适当的分子量包括10、20或
者30kDa。

[0029] 存在几种能够和FVIIa形成缀合物的不同类型的聚乙二醇聚合物。有包括单聚乙二醇链的线性PEG聚合物，也有分枝的或多臂的PEG聚合物。分枝的聚乙二醇包括2个以上
通过统一的基团连接在一起的单独的线性PEG链。例如，两个PEG聚合物可以通过赖氨酸
残基连接在一起。一个线性PEG链与α-氨基连接，而另一个PEG链与ε-氨基连接。剩
下的赖氨酸核心的羧基可用于与蛋白质共价连接。各种分子量的线性和分枝的聚乙二醇聚
合物都是市售可得的。

[0030] 在本发明的一个方面，FVIIa-PEG缀合物包括一个或多个与FVIIa连接的线性聚乙二醇聚合物，其中每个PEG具有大约2kDa至大约100kDa的分子量。在本发明的另一个
方面，FVIIa-PEG缀合物包括一个或多个与FVIIa连接的线性聚乙二醇聚合物，其中每个线
性PEG具有大约5kDa至大约40kDa之间的分子量。在某些实施方式中，每个线性PEG具有
大约10kDa至大约30kDa之间的分子量。在某些实施方式中，每个线性PEG具有大约20kDa
的分子量。在某些实施方式中，每个线性PEG具有大约小于10kDa的分子量。在特定的实
施方式中，其中FVIIa-PEG缀合物包括一个以上的与FVIIa连接的线性PEG聚合物，例如两
个、三个、或多达八个的与FVIIa连接的线性PEG聚合物。在一些实施方式中，FVIIa-PEG缀合物包括多种线性PEG聚合物，其中每一线性PEG具有大约10-30kDa的分子量。

[0031] 本发明的FVIIa-PEG缀合物可疑包括一个或多个与FVIIa连接的分枝PEG聚合物，其中每个分枝PEG具有大约2kDa至大约100kDa的分子量。在本发明的另一个方面，
FVIIa-PEG缀合物包括一个或多个与FVIIa连接的分枝聚乙二醇聚合物，其中每个分枝PEG
具有大约5kDa至大约40kDa的分子量。在某些实施方式中，每个分枝PEG具有大约5kDa
至大约30kDa的分子量。在某些实施方式中，每个分枝PEG具有大约20kDa的分子量。在
某些实施方式中，每个分枝PEG具有大约小于10kDa的分子量。在特定的实施方式中，其中
FVIIa-PEG缀合物包括一个以上的与FVIIa连接的分枝PEG聚合物，例如两个、三个、或多达八个的与FVIIa连接的分枝PEG聚合物。在一些实施方式中，FVIIa-PEG缀合物包括多达
八个的分枝PEG聚合物，其中每个分枝PEG具有大约10-30kDa的分子量。

[0032] 可以通过本领域已知的色谱方法纯化FVIIa-PEG缀合物，所述色谱方法包括但不限于离子交换色谱法和尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、沉淀和膜分离法（membrane-based separations）。

[0033] 适当地，FVIIa缀合物的生物相容性聚合物部分可以与两个半胱氨酸残基结合，从而在FVIIa中形成二硫键。这样，含有PEG的连接物桥接了所述二硫键。WO 2005/007197、WO 2009/047500和WO 2010/010324描述了这种缀合过程。

[0034] 在本发明的一个实施方式中，可以根据图2中所示的方案将生物相容性聚合物与FVIIa缀合。在图2中，显示了生物相容性聚合物和连接基团之间的基团R1，所述连接基团
跨越（spanning）了FVIIa分子上二硫键的硫原子。

[0035] R1代表是取代基，所述取代基可以是直接的键（direct bond）、亚烷基(优选C1-10亚烷基)或可任选取代的芳基或杂芳基（heteroaryl groups）；其中所述芳基包括苯基、苯甲酰基和萘基；其中适当的杂芳基包括吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、哒嗪、嘧啶和嘌呤；其中与聚合物的连接可为通过水解不稳定的键的方式的连接或通过稳定的键的连接。

[0036] 在可任选取代的芳基或者杂芳基上存在的具体取代基包括例如选自-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR’CO2R、+ + + +
-NO、-NHOH、-NR’OH、-C=N-NHCOR、-C=N-NR’COR、-NR3、-NH3、-NHR2、-NH2R、卤素例如氟或
13
氯、-C≡CR、-C=CR2和 C=CHR中的一种或多种相同或不同的取代基，其中每个R或R’独
立地代表氢原子或者烷基(优选C1-6)或者芳基(优选苯基)。特别优选地存在吸电子取代
基。在一个实施方式中，R1中可任选取代的芳基或杂芳基包括被酰胺基(NHCO)取代的芳
基或杂芳基，所述酰胺基将R1单元与生物相容性聚合物连接。

[0037] 因此，在FVIIa半胱氨酸残基之间的原始二硫键的两个硫原子之间的连接基团可以含有3-碳桥。在一个实施方式中，在FVIIa半胱氨酸残基之间的原始二硫键的两个硫原
子之间的连接基团是(CH2)2CHC(O)-。

[0038] 在本发明的一个实施方式中，生物相容性聚合物如上所述的进行缀合，其中包括与生物相容性聚合物相缀合的FVIIa的组合物具有以下结构：

[0039]

[0040] 从本发明最广泛的意义上讲，反应物可表示为：

[0041]

[0042] 其中R1如上述定义所述，L是离去基团。+ + +

[0043] L可以是-SR、-SO2R、-OSO2R、-NR3、-NHR2、-NH2R、卤素(例如氟或氯)或者-OW，其中每个R独立地代表氢原子或者烷基(例如C1-6的烷基)或者芳基(例如苯基)基团，且W代表包括至少一个吸电子取代基的被取代的芳基(例如苯基)，例如选自：-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR'CO2R、-+ + + +
NO、-NHOH、-NR'OH、-C=N-NHCOR、-C=N--NR'COR、-NR3、-NH3、-NHR2、-NH2R、卤原子例如氟原
13
子或氯原子、-C≡CR、-C=CR2和 C=CHR中的一个或多个相同或不同的取代基，其中每个R
或R’均独立地代表氢原子或烷基(优选C1-6)。
2

[0044] 在一个实施方式中，离去基团L是SO2R，其中R2独立地代表氢原子或者烷基(例如C1-6的烷基)或者芳基(例如苯基)，R1如上述定义所述，缀合反应物可以具有以下分子
式：

[0045]

[0046] 在一个实施方式中，生物相容性聚合物可以是PEG，且离去基团可以是-SO2R2，R1和R2如上述定义所述，所述反应物如下所示：

[0047]

[0048] 在本发明的另一个实施方式中，所述缀合反应物可以由通过酰胺部分(CONH)与生物相容性聚合物连接的专门的结构形成，其中L是如上所定义的离去基团。也就是说，R1是R3-CONH且反应物具有以下分子式：

[0049]

[0050] R3代表取代基，所述取代基可以为：直接的键、亚烷基(优选C1-10亚烷基)或者可任选取代的芳基或杂芳基；其中所述芳基包括苯基、苯甲酰基和萘基；其中适当的杂芳基包括吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、哒嗪、嘧啶和嘌呤；其中与所述聚合物的连接可为通过水解不稳定的键的方式的连接或通过稳定的键的方式的连接。

[0051] 在可任选取代的芳基或者杂芳基上存在的具体取代基包括例如选自-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR’CO2R、-NO、-NHOH、-NR’OH、-C=N-NHCOR、-C=N--NR’COR、-N+R3、-N+H3、-N+HR2、-N+H2R、卤素例如氟或氯、-C≡CR、-C=CR2和13C=CHR中的一种或多种相同或不同的取代基，其中每个R或R’独
立地代表氢原子或者烷基(优选C1-6)或者芳基(优选苯基)。特别优选地存在吸电子取代
基。

[0052] 在存在CONH部分，R2和R3如上定义所述，并且离去基团L是-SO2R2的实施方式中，所述反应物如下所示：

[0053]

[0054] 在这样的实施方式中，当缀合反应物的如上定义所述的R1中可任选取代的芳基或杂芳基包括由酰胺(NHCO)基团取代的芳基或杂芳基时，R3如上述定义所述时，缀合蛋白
的结构如下所示：

[0055]

[0056] 当生物相容性聚合物是PEG，而PEG是聚乙烯部分，且L是如上定义的离去基团时，本发明这一实施方式的缀合反应物如下所示：

[0057]

[0058] 当反应条件是中性或弱碱性时，可以使用下述反应物：

[0059]

[0060] 在较酸性的条件下，上述反应物可以形成如下所示的分子，PEG单砜（mono-sulfone），它也适合在本文所述的缀合反应中使用。

[0061]

[0062] 本文中使用的术语“因子VIIa缀合物”或“FVIIa缀合物”指的是经修饰后包括生物相容性聚合物部分的因子VIIa，与未经修饰的因子VIIa相比，缀合物具有改进的药物动力学特性。从下面一种或多种参数的改进可以观察到改进的药物动力学特性：活性、稳定
性、曲线下面积和循环半衰期。

[0063] 除非上下文中明确指出，术语因子VIIa(FVIIa)和因子VII(FVII)也可以互换使用。此外，本发明还特别地包括生物相容性聚合物与FVII的缀合，以及随后FVII被活化为
FVIIa。

[0064] 因子VIIa可以来自任何适当的来源。可以使用DNA重组技术制备因子VIIa，或从血浆中纯化获得。它包括任何活性片段或它的突变蛋白质。

[0065] 本文中使用的术语“突变蛋白质”指的是FVIIa蛋白质的类似物，其中FVIIa的天然存在的组件中的一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代，或缺失，或者一个或
多个氨基酸残基被插入到FVIIa的原始序列上，并且所得的产物与原始FVIIa相比活性并
未发生显著变化。因此这些突变蛋白质由已知的合成技术和/或定点诱变技术或任何其它
已知的适当的技术制备。

[0066] 根据本发明的突变蛋白质包括由核酸（例如根据本发明，在严格条件下与编码FVIIa的DNA或RNA杂交的DNA或RNA）编码的蛋白质。术语“严格条件”是指杂
交条件和随后的洗涤条件，也就是本领域普通技术人员所指的“严格”(Ausubel et
al.,Current Protocols in Molecular Biology,Interscience,N.Y.,sections 63and
6.4(1987,1992);Sambrook et al.,Molecular Cloning：ALaboratory Manual,Cold
Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y(1989))。

[0067] 严格条件的例子包括但不限于洗涤条件为比计算出的所研究的杂合体的Tm低12-20℃，在例如2xSSC和0.5%SDS中洗涤5分钟，在2xSSC和0.1%SDS中洗涤15分钟；在
0.1倍的SSC和0.5%SDS中在37℃下洗涤30-60分钟，然后0.1xSSC和0.5%SDS中在68℃
下洗涤30-60分钟。本领域普通技术人员能够理解的是：严格条件也取决于DNA序列、寡核
苷酸探针(如10-40个碱基)或者混合的寡核苷酸探针的长度。如果使用混合探针，优选
使用四甲基氯化铵(TMAC)代替SSC。

[0068] 优选地，任何这种突变蛋白质都具有充分复制的FVIIa的氨基酸序列，因而与FVIIa具有大体相似的活性或者更好的活性。

[0069] FVIIa的一个特征活性是参与凝血级联反应的能力，且本文中描述了检测FVIIa活性的分析方法。只要突变蛋白质具有基本的FVIIa活性，就可认为它具有与FVIIa活性
大体上相似的活性。因此，可以通过常规的实验手段(包括用本文所述的分析方法分析这
样的突变蛋白质)来测定任何给定的突变蛋白质是否与FVIIa具有至少大体相同的活性。

[0070] 在优选的实施方式中，任何这种突变蛋白质与FVIIa的氨基酸序列相比具有至少40%的同一性或同源性。更优选地具有至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，或者最优选地具有至少90%、95%或者99%的同一性或同源性。

[0071] 同一性反映了两种或多种多肽序列之间或者两种或多种多核苷酸序列之间的关系，通过比较序列来测定。通常，同一性涉及在被比较的序列的长度上，分别准确地比较两种多核苷酸序列的核苷酸与核苷酸之间的对应或者多肽序列的氨基酸与氨基酸之间的对
应。

[0072] 对于没有准确对应的序列，则可以用“百分比同一性”测定。通常，将待比较的两个序列进行比对以给出序列间的相关性最大值。这可以包括在一个序列或者两个序列间插入“空位(gap)”来提高对齐的程度。百分比同一性可以在所比较的每个序列的全长上进行测定(所谓的总体比对)，这种比对尤其适合具有相同或非常相似长度的序列；百分比同一
性也可以在限定的较短长度上进行测定(所谓的局部比对)，这种比对更适合于不等长的
序列。

[0073] 比较两个或多个序列的同一性和同源性的方法在本领域是公知的。例如，可以使用Wisconsin序列分析包9.1版 的软件(Devereux,et al.,Nucleicacids
Research,12:387(1984))，例如可以使用BESTFIT和GAP软件来测定两个多核苷
酸之间的百分比同一性，和测定两个多肽序列之间的百分比同一性和百分比同源
性。BESTFIT使用Smith和Waterman的“局部同源性”算法(Advances in Applied
Mathematics,2:482-489(1981))，并找出两个序列之间的最佳相似性单一区域。其
它用来测定序列之间的同一性和/或相似性的软件在本领域是已知的，如BLAST家
族 的 软 件(Atschul et al.,J.Molec.Biol.215:403(1990)，通 过 进 入 NCBI的 主
页 www.ncbi.nlm.nih.gov 就 能 使 用 ) 和 FASTA 软 件 (Pearson W R,Methods in
Enzymology,183:63-98(1990))。

[0074] 根据本发明，可以使用的FVIIa突变蛋白质包括置换多肽形式的有限的一组基本相对应的序列，基于本发明的教导和指导，本领域普通技术人员无需经过过多的试验就能
够得到这些突变蛋白质。

[0075] 优选地，根据本发明的突变蛋白质中的改变是已知的“保守”置换。FVIIa的保守氨基酸置换可以包括在具有足够相似的物理化学性能的组内的同义氨基酸，组内成员间的置换能够保留分子的生物功能。很明显，也可以在上述限定的序列中进行氨基酸的插入和
缺失，而不改变它们的功能，尤其是当插入或缺失仅仅涉及少许的氨基酸，如30个以内，优选10个以内，并且没有移除或取代对功能构象很重要的氨基酸，如半胱氨酸残基时。由这
种缺失和/或插入制得的蛋白质和突变蛋白质都属于本发明的保护范围。

[0076] 因此，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸经常能够互相置换(它们都是具有脂肪族侧链的氨基酸)。这些可能的置换中，优选使用甘氨酸和丙氨酸互相置换(因为它们具有相对短的侧链)，使用缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸互相置换(因为它们具
有较大的疏水脂肪族侧链)。其它通常能够互相置换的氨基酸包括：苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；
天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨
基酸)；半胱氨酸和蛋氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。这种性质的置换通常被称为是“保
守的”或“半保守的”氨基酸置换。

[0077] 可以利用任何适当的技术例如使用定点诱变技术来实现相对于本发明的融合蛋白序列的氨基酸改变。

[0078] 能够理解的是，可以通过使用天然存在或非天然存在的氨基酸，来实现本发明范围内的氨基酸置换和插入。无论使用的是天然的还是合成的氨基酸，优选仅存在L-氨基
酸。

[0079] 另外，也可以使用包括FVIIa和其他肽或蛋白片段的融合蛋白，只要所述融合蛋白保留了FVIIa的活性。一般而言，本文中的术语“融合蛋白”是指通过包括氢键或盐桥的化学方法、或通过由蛋白质合成的肽键、或是通过上述两种方法连接在一起的一种或多种
蛋白质。

[0080] 本文所使用的术语“功能衍生物”涵盖了FVIIa的衍生物和它们的突变蛋白质，可以通过本领域已知的手段，由在残基上以侧链的形式存在的功能基团或附加于N-或C-端基团的功能基团制得，只要它们保持药学上可接受的性质，也就是它们没有破坏蛋白质大
体上与FVIIa相似的活性，也没有将毒性赋予含有它的组合物的毒性，就都属于本发明的
内容。

[0081] 例如，这些衍生物可以包括羧基的脂肪族酯、羧基通过与氨或伯胺或仲胺反应生成的酰胺、氨基酸残基中的游离氨基与酰基部分（例如烷酰基或羧基芳酰基（carboxylic aroyl groups））形成的N-酰基衍生物、或由游离羟基（例如丝氨酰残基或苏氨酰残基的游离羟基）与酰基部分形成的O-酰基衍生物，包括例如可利用羟基残基的糖基化。

[0082] 根据本发明的“FVIIa的活性片段”可以是本文定义的FVIIa或突变蛋白质的片段。术语片段是指分子的任何亚基（subset），也就是保持所需生物活性的较短的肽。可以很容易地通过从FVIIa分子的任何一端消除氨基酸而得到片段并通过本文所述的方法测
定所得片段的性质。用于从多肽的N-端或C-端消除一个氨基酸的蛋白酶是已知的，并且
测定保持所需生物活性的片段仅涉及常规实验。

[0083] 在本发明中，FVIIa的活性部分、它的突变蛋白质和活性片段涵盖了任何单独的或与相关分子或残基(例如糖或磷酸盐残基)连接的蛋白质分子多肽链的片段或前体，或蛋白质分子的聚集物或它们的糖残基，只要所述部分与FVIIa具有大体相似的活性。

[0084] 本文中的术语“盐”指的是羧基盐和FVIIa分子或其类似物的氨基的酸加成盐（acid addition salts）。羧基盐可用本领域已知的方法制备，羧基盐包括无机盐和有机盐，无机盐例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐等等，有机盐可用胺类制备，如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等。酸加成盐包括例如与矿物酸(例如盐酸或硫酸)形成的盐
和与有机酸(例如醋酸或草酸)形成的盐。当然，这些盐必须保留如上所述的FVIIa的生
物活性。

[0085] 例如，与非缀合FVIIa相比，FVIIa缀合物具有疗效。这种疗效包括但不限于增加循环半衰期、降低免疫原性、提高活性、提高稳定性、增加曲线下面积、降低剂量需求和允许通过其他途径(例如皮下)进行给药。

[0086] 与未经修饰的FVIIa相比，本发明的FVIIa缀合物可以在药物动力学特性的一种或多种参数上显示出改进，包括曲线下面积(AUC)、峰值浓度、清除率(CL)、半衰期、血浆停留时间和生物利用率。

[0087] 在用多肽药物对患者进行给药的情况下，本文中使用的术语“曲线下面积”或“AUC”的定义为：把患者体循环内的药物浓度作为从零到无限大的时间的函数，所得到的曲线下方的总面积。本文中使用的术语“清除率”或“肾清除率”的定义为每分钟排出的含有一定量药物的血浆的体积。

[0088] 在用多肽药物对患者进行给药的情况下，本文中使用的术语“半衰期”或“t1/2”的定义为：患者体内的药物血浆浓度减少至一半所需要的时间。根据多种清除机理、重新分配和其它本领域已知的机理，与肽药物相关的半衰期可以多于一种。通常，α和β半衰期定义为α相和重新分配有关，且β相与清除率有关。然而，对大部分情况而言，蛋白质药物局限于血流中，就可能有至少两种清除率半衰期。如本领域所熟知的，聚乙二醇化对α相和
β相半衰期的精确影响会随着分子大小和其它参数而变化。对“半衰期”的更多解释可参见《Pharmaceutical Biotechnology》(1997,DFA Crommelin and RD Sindelar,eds.,Harwood Publishers,Amsterdam,pp 101-120)。

[0089] 在用多肽药物对患者进行给药的情况下，本文使用的术语“停留时间”的定义为：从给药后算起药物在患者体内停留的平均时间。

[0090] 在用多肽药物对患者进行给药的情况下，本文使用的术语“免疫原性”的定义为：对患者给药后或重复给药后在患者体内药物引发免疫反应的倾向。

[0091] 根据本发明，FVIIa和生物相容性聚合物的缀合增强了FVIIa在药物组合物中的效用。而且，生物相容性部分可以保护FVIIa免受降解和抗体反应。FVIIa缀合物可具有延
长的循环半衰期，节省了剂量和降低了给药频率。

[0092] 如上所述，PolyTherics已经开发了被称为TheraPEGTM的技术，这种技术能够利用在蛋白质中天然存在的硫原子的选择性化学来进行位点特异性的聚乙二醇化。这种技术也能够应用于通过重组或其它方法引入了新的含硫基团的蛋白质和多肽。PolyTherics表明
了通过增加PEG-连接的碳桥能够制备更稳定的二硫键，并且可以对蛋白质中的二硫键进
行这种修饰，同时保留三级结构和维持蛋白质的功能。这是人们首次能够利用形成二硫键
的两个硫原子的缀合硫醇选择性，从而在天然蛋白质或选择性工程蛋白中位点特异性地使
生物相容性聚合物与目的蛋白缀合。这种方法的一个实例是使用这种技术将PEG部分附加
至FVIIa蛋白质(或“聚乙二醇化的”FVIIa蛋白质)上。

[0093] 二硫化物桥接的缀合反应物是潜在的能够经历交互式Michael反应和逆-Michael反应的交叉缀合系统。这使得通过还原天然二硫基生成的两个游离的硫醇能
够再退火连接一个3碳桥，所述3碳桥将原始二硫键的两个硫基连接在一起(例如参见图
2，图2示出了增加PEG部分的缀合反应的原理图)。当包括的PEG作为生物相容性聚合物
用作聚乙二醇化FVIIa蛋白质时，缀合反应物可以描述为“聚乙二醇化”反应物。

[0094] 从原理上讲，需要缀合反应物中的缀合双键以启动一系列的加成反应。硫醇盐的加成一旦发生，就可能消去剩余的硫磺酸（sulphinic acid）部分。这就生成了另一个缀合双键，以用于第二硫醇阴离子的加成和两个硫原子之间的3-碳桥的形成。最终结果是在碳
桥的两侧形成两个非常稳定的硫醚键（thiol-ether bonds）。

[0095] 使用TheraPEGTM技术对FIX进行聚乙二醇化获得成功的事实，对于使用同样的方法能够成功制备聚乙二醇化的FVIIa而言并没有指导意义，因为FVIIa是结构和功能上都
TM
不相同的蛋白质。因此，在体内试验中利用TheraPEG 技术制备聚乙二醇化的FVIIa能够
取得如此好的效果是非常出人意料的。

[0096] 此外，最初进行的体外终点凝血分析表明，发现上文所述的关于FVIIa需要多重结合的顾虑是很有必要的，因为活性很低。但是出人意料的是，只通过使用基于不同速率的测试时，本发明的发明人才确认了“标准”FVIIa活性分析低测了活性，因此才继续进行了体内试验的研究。

[0097] 根据本发明的第二方面，提供了含有与FVIIa缀合的生物相容性聚合物的药物组合物，如本发明第一方面所述，所述生物相容性聚合物通过一个或多个半胱氨酸残基与
FVIIa缀合。

[0098] 本发明的药物组合物还可以含有药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。

[0099] 适于口服的药物组合物可以以独立的单元存在，如胶囊、汤剂、糖浆剂或悬浮液(在水性液体或非水性液体中；或作为可食用泡沫状物（foams）或搅拌泡沫状物（whips）；
或作为乳剂)。用于片剂或硬胶质胶囊（hard gelatinecapsules）的适当赋形剂包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或它的盐。与软胶质胶囊（soft gelatine capsules）一起使用的适当赋形剂包括例如植物油、蜡、油脂、半固体或液体多元醇等。为了制备汤剂和糖浆剂，可以使用的赋形剂包括例如水、多元醇和糖。为了制备悬浮液，可以使用油(例如植物油)来提供水包油或油包水悬浮液。

[0100] 适于鼻腔给药且载体是固体的药物组合物包括例如具有粒度在20-500微米范围内的粗粉剂（coarse powder），使用鼻吸的方式给药，也就是将容器靠近鼻子并将容器内的粉剂迅速吸入鼻腔内。通过喷鼻剂或滴鼻剂给药且载体是液体的药物组合物包括活性成
分的水性或油性溶液。适于吸入给药的药物组合物包括由各种压力定量气溶胶（metered
dose pressurised aerosols）、喷雾器或吹药器产生的微粒粉剂或雾剂。

[0101] 适于注射给药的药物组合物包括水性或非水性的无菌注射液，注射液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使剂型大体上与目标受体的血液等渗的溶质；可以包括分散剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。可以用于可注射的药水的赋形剂包括例如水、醇、多元醇、丙三醇和植物油。所述组合物可以置于单位剂量或多剂量的容器内，例如密封的安瓿和小瓶中，并可以储藏于冷冻干燥(冻干的)的条件下，仅需添加无菌液体载体，例如注射用
水，就可以立即使用。可以用无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备即时的注射药水和悬浮液。

[0102] 通常，药物组合物可以含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、香味剂（odourants）、盐(本发明的物质本身就可以以可药用盐的形式提供)、缓冲剂、包被剂或抗氧化剂。所述药物组合物还可以含有除本发明物质之外的有治疗活性的试剂。本发明的药物组合物可以和药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体一起使用。这类赋形剂可
以包括但不限于生理盐水、缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、脂质体、水、丙三醇、乙醇以及上述物质的组合。

[0103] 药物组合物可以以任何有效便捷的方式给药，以治疗患者的疾病，所述给药方式包括例如：口服给药途径、静脉给药途径、皮下给药途径、肌肉给药途径、骨内给药途径、鼻内给药途径或其它常规的给药方式。在治疗或预防应用中，活性剂可以以可注射组合物的
形式对个体进行给药，例如以无菌水性分散液的形式，优选等渗分散液。

[0104] 对于哺乳动物特别是人类的给药而言，预计的活性成分的日剂量是0.01mg/kg体重，通常大约为1mg/kg。在任何情况下都可由临床医生决定最适合于个体的实际剂量，这取决于包括年龄、体重、性别和个体反应在内的因素。上述剂量是平均情况的示例性剂量。当然，也可能有需要更高或更低的剂量的情况，这些情况也属于本发明的范围。

[0105] 本发明物质的剂量可在较宽范围内变化，这要取决于待治疗的疾病或病变，待治疗个体的年龄和身体状况等。临床医生最终能够决定所使用的合适剂量。

[0106] 可以按照适当的频率重复剂量。根据正常临床实践，如果产生副作用，可以减少剂量的总量和/或频率。在一个实施方式中，每一至十四天用所述药物组合物进行给药一次。

[0107] 根据本发明的第三方面，提供了第二方面和其他药物活性剂的药物组合物。所述其他药物活性剂可以促进或提高FVIIa的活性，例如其他凝血因子。

[0108] 本发明的药物组合物可以单独使用或与其它化合物一起使用，所述其他化合物例如治疗化合物或分子，如消炎药、止痛剂或抗生素。和其它化合物一起使用时的给药可以是同时给药、分别给药或连续给药。组分可以以包括适当的说明书的药盒（kit）的形式制备。

[0109] 优选地，用本发明的药物组合物和其它的治疗化合物直接对有需要的患者进行给药。

[0110] 本发明还提供了套装药盒（kit of parts），所述套装药盒包括本发明的药物组合物和给药工具，所述给药工具包括但不局限于用于口服给药的胶囊、用于肺部给药的吸入器和用于静脉内给药的可注射药水。

[0111] 根据本发明的第四方面，提供了治疗凝血病或创伤的方法，其中，所述方法包括用本发明的组合物对有需要的患者进行给药。因此本发明的这个方面也包括所述组合物在所述方法中的用途。

[0112] 凝血病的特征是凝血因子的功能丧失或自身抗体的产生。凝血病的实例包括血友病A和血友病B。

[0113] 本文中使用的术语“治疗”包括任何有益于人类或非人类动物的方式。“非人类动物”的治疗可以延伸至家养动物的治疗，所述家养动物包括马和宠物(例如猫和狗)，农场/农用动物（包括绵羊、山羊、猪、牛和马科的成员）。治疗可以是针对任何已存在疾病和病变，或可以是预防(预防性治疗)。可以治疗遗传性或获得性疾病。可以治疗急性或慢性疾病。

[0114] 根据本发明的第五方面，提供了制备以下如上所述的生物相容性聚合物和FVIIa的缀合物的方法，

[0115]

[0116] 其中所述方法包括：

[0117] (a)还原FVIIa的两个半胱氨酸残基之间的天然二硫键，以产生两个游离的硫醇基；

[0118] (b)含有缀合双键和离去基团的缀合反应物间发生第一次硫醇盐加成反应；

[0119] (c)消去离去基团，产生缀合双键；以及

[0120] (d)第二次硫醇盐加成反应，在两个硫原子之间形成3-碳桥

[0121] 其中，R1的定义如上所述。

[0122] 在所述方法中，所述缀合反应物可以具有如上所述的分子式，即：

[0123]

[0124] 其中R1如上所述，且L是如上所述的离去基团。

[0125] 本发明这一实施方式的另一方面如以上涉及缀合反应物的各种结构所述。

[0126] 可以使用的缀合反应物的一个实例如下所示，具有如上所述的取代基R1和R2，即：

[0127]

[0128] 其中离去基团是如上所述的亚磺酰基，由SO2R2表示。

[0129] 当所述生物相容性聚合物是PEG时，所述缀合反应物如下（如上所述）：

[0130]

[0131] 本发明第二方面和后几方面中的优选特征适应于第一方面中所述。

[0132] 下面将参照下述实施例对本发明进行进一步的描述，本发明所包括的实施例是用于参照目的的，而不应被理解为是对要保护的发明的限制。

附图说明

[0133] 本说明书和实施例中还涉及一些附图，其中：

[0134] 图1显示了凝血级联反应。缩写词：HMWK-高分子量激肽原；PK-激肽释放酶；PL-磷脂。

[0135] 图2显示了使用聚乙二醇化反应物作为缀合反应物的实例，进行二硫化物特异性的生物聚合物缀合化学过程中涉及的步骤（取自Shaunak et al.inNat Chem
Biol.2006;2(6):312-313)）。

[0136] 图3显示了SDS-PAGE，显示了用DTT(图A)或TCEP/SeCys（图B）还原后的FVIIa。

[0137] 图4显示了考马斯染色的SDS-PAGE，显示了纯化的10kDa、20kDa、30kDa的聚乙二醇化反应混合物（泳道3-5）。FVIIa显示于泳道1中，还原的FVIIa显示于泳道2中。

[0138] 图5显示了银染色的SDS-PAGE，显示了纯化的10kDa、20kDa、30kDa的单聚乙二醇化的FVIIa。

[0139] 图6显示了PT凝血试验中所涉及的步骤的示意图。箭头表示凝血酶介导的扩增事件。缩写词：HMWK-高分子量激肽原；PK-激肽释放酶；PL-磷脂。

[0140] 图7显示了浓度依赖性的聚乙二醇化的FVIIa的凝血时间的缩短（小规模）。113秒时缓冲液（试剂盒）凝结。

[0141] 图8显示了浓度依赖性的聚乙二醇化的FVIIa的凝血时间的缩短（大规模）。115秒时缓冲液（试剂盒）凝结。

[0142] 图9显示了浓度依赖性的聚乙二醇化的FVIIa的缩短（大规模，冻干的样品）。114秒时缓冲液（试剂盒）凝结。

[0143] 图10显示了显色试验所涉及的步骤的示意图。箭头表示凝血酶介导的扩增事件并显示了抑制效果。

[0144] 图11显示了显示在含有20mM苄脒的HEPES缓冲液中的FVIIa的剂量依赖性活性的代表性结果。

[0145] 图12显示了FVIIa反应混合物的TheraPEGTM聚乙二醇化的SDS-PAGE分析结果。泳道1： 分子量标记；泳道2-5：PEG(20kDa)-FVIIa样品的反应混合物，分别为2mg
FVIIa、3mg FVIIa、2mg FVIIa&3mg FVIIa。

[0146] 图13显示了在大鼠PK研究中得到的聚乙二醇化的FVIIa凝血时间的浓度依赖性的缩短（4个样品a-d）。

[0147] 图14显示了根据相对于时间（小时）测量的人FVIIa的浓度（μg/ml），通过ELISA而离体测量的FVIIa和PEGFVIIa的药物动力学特性。

[0148] 图15显示了FVIIa和聚乙二醇化的FVIIa的凝血反应速率的比较。

[0149] 图16显示了本发明缀合物的两种可选择的示意性结构，其中FVIIa用黑色曲线表示，（C）表示FVIIa的半胱氨酸残基，其中显示的FVIIa通过本文所述的连接物与生物相容性聚合物缀合。

具体实施方式

[0150] 现在参照以下实施例来进一步描述本发明，这些实施例的存在仅以说明为目的。

[0151] 实施例1：FVIIa的二硫化物聚乙二醇化

[0152] 根 据 Shaunak等 人 在 Nat Chem Biol.2006;2(6):312-313和 Brocchini 等人在Nature Protocols,2006;1(5):2241-2252中所述步骤的改进版本进行重组人
FVIIa 的二硫化物聚乙二醇化。

[0153] 实施例2：二硫键还原

[0154] TheraPEGTM的聚乙二醇化过程需要还原二硫键。由于FVIIa是由单个二硫键连接的重链和轻链形成的异二聚体，因此，对还原条件进行了初步研究，以确定在没有链间二硫化物裂解时还能否进行还原。研究发现，DTT浓度范围为0.5-5mM时还原会使链间二硫化
物还原，产生重链和轻链（图3A）。然而，使用稍微摩尔过量的DTT或者使用还原剂三（2-羧乙基）膦（TCEP），在存在或不存在硒代胱胺(selenocystamine，SeCys)的情况下，结果都是链间二硫键仅有轻微裂解或不裂解（图3B）。在这些条件下还原的链间二硫键的存在是通过加入与半胱氨酸硫醇基反应而产生聚乙二醇化产物的PEG反应物来进行确认的。

[0155] 实施例3：FVIIa的聚乙二醇化

[0156] 用小规模反应（10-20μg的FVIIa）中对用于FVIIa的聚乙二醇化的TheraPEGTM的使用进行了初步评估。这能够帮助鉴定可以利用2摩尔当量的PEG反应物重复地制备单
聚乙二醇化的FVIIa的条件。早期实验中研究了加入苄脒防止蛋白水解的效果。研究发
现，基于SDS-PAGE分析的结果显示加入苄脒对聚乙二醇化没有影响，因此在后来所有的反
应中均加入苄脒。

[0157] 将反应扩大规模(0.2-0.3mg的FVIIa)，以生产用于初步体外评价的聚乙二醇化的FVIIa。生产了PEG(20kDa)-FVIIa样品和一个PEG(10kDa)-FVIIa样品用于体外分析（参
见表1）。分析发现，升高聚乙二醇化反应的温度提高了FVIIa到PEG-FVIIa的转化率，这是通过肝素亲和纯化的色谱图的峰积分而近似评估的。然而，初步的体外评价表明，温度的升高可能会对聚乙二醇化的产物的活性产生副作用，因此在较低温度下进行随后的反应（参
见实施例5）。

[0158] 表1 初步聚乙二醇化反应

[0159]

[0160] 研究了分离聚乙二醇化物质的各种纯化条件。PEG(20kDa)-FVIIa的第一个样品是通过肝素亲和来纯化的，第二个样品是在肝素亲和后，进行了DEAE阴离子交换。在纯化
这些样品的缓冲液中不含有苄脒。至于所有其它样品，其纯化是在缓冲液带有苄脒的肝素
亲和后，再通过尺寸排阻色谱法（SEC）而进行的。用于SEC的缓冲液内开始含有苄脒，但是由于在280nm处的吸光度很强，导致对峰的识别变得很困难。因此，从SEC缓冲液除去了苄
脒，但是在洗脱后立即向样品中加入苄脒。

[0161] 为了得到用于体外评价的原料，将反应规模进一步扩大到1mg的FVIIa。采用较小规模反应中确定的条件，制备了分子量为10kDa、20kDa和30kDa的聚乙二醇化的FVIIa变
体（图4）。

[0162] 如上所述，通过肝素亲和色谱及随后进行SEC纯化后，用SDS-PAGE分析聚乙二醇化产物来确定纯度（图5），并用BCA实验进行定量分析。

[0163] 实施例4：通过PT实验评估聚乙二醇化的FVIIa的体外活性

[0164] 采用改进的凝血酶原时间（PT）试验(STACLOT VIIa-rTF,DiagnosticaStago，巴黎，产品目录No.00281)测定了FVIIa和聚乙二醇化的FVIIa的活性。试剂盒中提供的重
组可溶性组织因子(rsTF)是特异性针对FVIIa的。试剂盒中没有提供凝血所需的氯化钙，
因此，购买25mM的氯化钙(DiagnosticaStago，产品目录No.00367)用于试验。图6显示了
凝血级联反应试验所提供的成分和试验所涉及的步骤。

[0165] 所有的试验都是利用人工凝结的方法进行的。将FVIIa或聚乙二醇化的FVIIa吸取到反应器（带塑料盖的玻璃瓶）中。然后将FVII缺陷型血浆（50μL）加入到反应器中，接着加入50μL的rsTF，并随后将磷脂加入到反应管中，并在37℃下温育180秒。之后，将
50μL 25mM的氯化钙（预加热到37℃）加入到反应混合物中，并同时开始计时。将反应管在
37℃的水浴中来回轻轻地摇晃，仔细观察以确定凝块的形成。纤维蛋白凝块形成时，立刻记录凝结时间。

[0166] 本试验中确定了测定FVIIa活性所用的合适浓度范围在0.01-10ng/mL之间，而且确定了聚乙二醇化的FVIIa的浓度范围在0.10-100ng/mL之间。由于观察到未聚乙二醇化
的蛋白的凝固时间很短，因此，试验中使用的聚乙二醇化的FVIIa的初始浓度范围比PT试
验中FVIIa的浓度范围低一个数量级，因为浓度为100ng/mL时会导致立即凝结。

[0167] 实施例5：通过PT试验评估聚乙二醇化的FVIIa的活性

[0168] 使用由0.2-0.3mg的FVIIa进行聚乙二醇化反应所产生的样品进行聚乙二醇化的FVIIa的初步评估。对10kDa聚乙二醇化的FVIIa和20kDa聚乙二醇化的FVIIa的样品进
行了测试。用置于柠檬酸盐缓冲液中的PEG(20kDa)-FVIIa样品进行第一个实验，且表现出
的活性不高。后面的样品置于HEPES缓冲液中。表2中列出了在HEPES缓冲液中的样品的
PT试验结果。在稀释至所测试的FVIIa的最高浓度(100ng/mL)后，这些PEG-FVIIa样品中
的苄脒浓度为4mM。

[0169] 表2聚乙二醇化的FVIIa样品在浓度为100ng/ml时的凝结时间(HEPES缓冲液)

[0170]

[0171] 研究了20kDa和10kDa的聚乙二醇化的FVIIa在浓度范围为0.1-100ng/mL的凝结时间与浓度的依赖性变化（图7）。随着浓度的增加，这些样品在凝结时间上表现出与早期实验相似的变化。由于不同大小的PEG所产生的曲线是平行的，因此，与HEPES缓冲液中的
FVIIa相比，由于进行了聚乙二醇化，凝结时间上的任何变化都是可能的。根据最佳拟合曲线可以得出，分子量为10kDa和20kDa的聚乙二醇化的FVIIa的活性范围为1.3%-2.5%。

[0172] 然后，测试了较大规模(1mg的FVIIa)反应生产的10kDa和20kDa的聚乙二醇化FVIIa样品。这些聚乙二醇化样品的凝结时间彼此差不多，而且比小规模反应的样品所观察到的凝结时间要快（表3）。这些反应中的聚乙二醇化样品浓度较大，因此需要稀释更多倍以达到PT试验中最高的浓度100ng/mL。比较了这些样品与FVIIa的凝结时间与浓度的依赖性
变化（图8）。从最佳拟合曲线得出了这些样品的百分比活性范围，发现该范围为5%-7.5%。

[0173] 将大规模反应中10kDa和20kDa的聚乙二醇化的FVIIa样品的等分试样进行缓冲液置换（buffer exchanged），使其含有发现于 中的赋形剂（蔗糖代替了甘露
醇，因为甘露醇不可用），然后冻干。将所得到的粉末重悬于水中，并用PT试验进行了分析（图9）。同时分析了下述样品：（1）从规模为1mg的反应中制备的PEG(30kDa)-FVIIa样品，（2）经过未加入PEG的聚乙二醇化的方法处理的FVIIa。

[0174] 与在HEPES缓冲液中经过缓冲液置换的FVIIa相比，经过未加入PEG的聚乙二醇化的方法处理的FVIIa在凝结时间上表现出相似的变化（图8）。这表明观察到的活性的降
低是因为连接了PEG，而不是因为该处理方法。用30kDa的PEG进行聚乙二醇化的FVIIa变
体与分子量较小的PEG变体也表现出相似的活性。在较高浓度下，10kDa和20kDa的聚乙二
醇化的FVIIa的冻干好像不会影响活性。在较低浓度下，冻干的10kDa的聚乙二醇化的变
体与未经聚乙二醇化的FVIIa似乎表现出相似的活性。然而，因为这个值是从单次实验中
得到的，因此在解释这个值时需谨慎，需要重复分析才能证实这个结果。从最佳拟合曲线中确定了这些样品的活性百分比范围，并总结在表3中。

[0175] 表3利用较大规模反应中得到的聚乙二醇化样品进行的PT试验的结果

[0176]

[0177] 实施例6：显色试验

[0178] 显色试验（Hyphen Biomed，产品目录No.221304）通过有色底物的形成来测量FVIIa的活性，而且不涉及凝块形成。该过程是在钙和组织促凝血酶原激酶的存在下通过
FVIIa激活FX生成FXa来实现的。FXa切割对于FXa有特异性的显色底物。从而定量测量
FVIIa（图10）。

[0179] 该试验是在96孔的微滴定板中进行的。所有的预热和保温步骤都是在37℃进行的。将样品（30μL）加到微滴定板中，并在37℃下预热2分钟。将预热的R2反应物（30μL）加到各个孔中，然后将预热的R1（60μL）加入到各个孔中，将其混合并温育7分钟。然后
在每个孔中加入60μL的显色底物（R3，预热过）并温育5分钟。通过加入60μL 20%的乙
酸终止该反应，并读出405nm处的吸光度。

[0180] 显色试验的结果显示，HEPES缓冲液中的FVIIa适用于该试验，并且得到与含有20mM苄脒的FVIIa相似的结果。图11显示了该显色试验结果的一个实例。含有20mM苄
脒的HEPES缓冲液中FVIIa的ED50值是307.6±9.0pg/mL(15.4±0.5mU/mL)，而对于含有
20mM苄脒的FVIIa来说，该值为351.4±10.8pg/mL(17.6±0.5mU/mL)。

[0181] 确定了FVIIa的显色试验范围为浓度在0.10pg/mL-100ng/mL之间。而显色试验要求聚乙二醇化的FVIIa的浓度在毫克范围内。这是不可行的，因此并没有对聚乙二醇化
的样品进行显色试验。

[0182] 实施例7：用于大鼠PK研究的20kD的TheraPEGTM-FVIIa的制备

[0183] 聚乙二醇化反应的规模从1mg增加到2-3mg的FVIIa。大鼠PK研究所用的20kDTM
的TheraPEG -FVIIa的制备是通过含有2mg或3mg的FVIIa 的四小批来进
行的。利用先前确定的条件进行聚乙二醇化，并用肝素亲和色谱法进行纯化以除去未反应
的PEG试剂，接着用SEC去除残余的未被聚乙二醇化的FVIIa和被双聚乙二醇化的蛋白质。
将含有单聚乙二醇化的PEG(20kDa)-FVIIa的级分合并，并用 RT缓冲液成分
进行缓冲液置换，然后冻干。

[0184] 每个聚乙二醇化反应中单聚乙二醇化的产物的生成是通过SDS-PAGE分析来确认的（图12）。FVIIa转化为聚乙二醇化的FVIIa的平均转化率百分比为44.5±7.5%，这是通
过肝素亲和纯化的色谱图中的峰积分来近似估测的。聚乙二醇化的FVIIa的最终产量为
1.09mg的PEG(20kDa)-FVIIa，这是通过Bradford总蛋白试验确定的。这一产量表示平均
产率为11.2±3.8%。

[0185] 利用改进的凝血酶原时间（PT）试验确定了PEG(20kDa)-FVIIa的体外活性。早期研究过程中的凝血时间分析是通过在半对数图上绘制数据而进行的，而本次研究改用了
对数-对数图（图13），因为这是试剂盒生产厂商推荐的方法。计算了样品冻干前后保留
活性的百分比。PEG(20kDa)-FVIIa冻干前的平均凝血时间（100ng/ml）和保留活性分别为
33.0±4.5s和0.6±0.4%。PEG(20kDa)-FVIIa冻干后的平均凝血时间（100ng/ml）和保留
活性分别为34.8±4.7s和0.8±0.4%。

[0186] 可以看出，为大鼠研究而制备的样品和在初步可行性研究中制备的样品（实施例3-5）之间的保留活性是有区别的。当回顾初步可行性研究数据时，我们发现在等浓度时
用于初步可行性研究的FVIIa标准品比用于大鼠研究样品的标准品表现出了更长的凝血
时间。用于可行性分析的FVIIa标准样品已经在无硅酮微量离心管中储存了15天。由于
进行了该实验，看起来是在这些条件下存储FVIIa可能会导致一些蛋白粘到管子上。因
此，当使用该标准品时，FVIIa的实际浓度可能会低于预期的浓度，这会导致加入到试验
中的量比计算的量少。这会导致凝血时间更长，并因此使得该标准品的表观活性较低，所
以PEG(20kDa)-FVIIa的保留活性百分比更高。为了进行大鼠PK研究，在重溶以后立即将
FVIIa标准品在Eppendorf 试管中冷却到-80℃，这能够防止储存期间FVIIa粘
到试管上，从而在PT试验中可以得到更精确的结果。

[0187] 实施例8：20kD的TheraPEGTM-FVIIa与 在大鼠体内的药物动力学的比较

[0188] 在雄性SD大鼠体内进行了PEG(20kDa)-FVIIa的药物动力学性质的评价，并将其直接与这种模型中FVIIa 的药物动力学进行比较。每组的九只动物在尾
静脉处通过静脉内快速推注体积为2.5ml/kg、质量为0.3mg/kg的样品。取血样的时间点
为0.033、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、6.0和24小时。制备血浆样品并通过ELISA分析FVIIa的浓度。图14显示了以时间对FVIIa浓度作图的曲线。计算了α、β和整体血浆
半衰期，并列在表4中。结果显示TheraPEGTM(20kDa)-FVIIa的血浆半衰期明显长于FVIIa
的血浆半衰期。

[0189] 表4：大鼠PK研究结果

[0190]

[0191] 实施例9：用于狗PK研究的20kD的TheraPEGTM-FVIIa的制备

[0192] 聚乙二醇化反应的规模通过规模为5mg和10mg的中间反应从3mg增加到25mg的FVIIa。用于狗PK研究的PEG(20kDa)-FVIIa的制备使用了两种来源的FVIIa。

[0193] 使用第一种来源的FVIIa 制备PEG(20kDa)-FVIIa是通过FVIIa的聚乙二醇化分5批进行的，反应规模在10mg-25mg之间。每批的反应条件相同，并且
SDS-PAGE分析显示聚乙二醇化是一致的。FVIIa转化为聚乙二醇化的FVIIa的平均转化率
百分比为41.8±11.7%，这是通过肝素亲和纯化的色谱仪的峰积分进行估测的。聚乙二醇化
的FVIIa的最终总产量为15.3mg的PEG(20kDa)-FVIIa，这是通过Bradford总蛋白试验确
定的。这一产量表示平均产率为14.7±3.6%。

[0194] 计算了样品冻干前后的体外活性。冻干前PEG(20kDa)-FVIIa的对比FVIIa的平均凝血时间(100ng/ml下)和保留活性分别为28.5±3.5s和1.8±0.6%。冻干
后PEG(20kDa)-FVIIa对比FVIIa的平均凝血时间(100ng/ml下)和保留活性分别为
32.2±4.1s和2.2±2.5%。

[0195] 使用第二种来源的FVIIa制备PEG(20kDa)-FVIIa是通过FVIIa的聚乙二醇化分3批进行的，反应规模为25mg。每批的反应条件相同，并且SDS-PAGE分析显示聚乙二醇化是
一致的。FVIIa转化为聚乙二醇化的FVIIa的平均转化率百分比为40.3±2.9%，这是通过
肝素亲和纯化的色谱仪的峰积分进行估测的。聚乙二醇化的FVIIa的最终总产量为13.1mg
的PEG(20kDa)-FVIIa，这是通过Bradford总蛋白试验确定的。这一产量表示平均产率为
17.5±6.9%。

[0196] 计算了样品冻干前后的体外活性。冻干前PEG(20kDa)-FVIIa对比FVIIa的平均凝血时间(100ng/ml下)和保留活性分别为37.0±3.5s和1.5±0.6%。冻干
后PEG(20kDa)-FVIIa对比FVIIa的平均凝血时间(100ng/ml下)和保留活性分别为
35.7±1.1s和1.3±0.3%。

[0197] 实施例10：通过测量凝血反应的速率对PEG(20kDa)-FVIIa进行的体外分析

[0198] 为了确定PEG(20kDa)-FVIIa是否以与FVIIa相同的速率凝结，在SysmexCA50凝血分析仪上进行了改进的PT试验。随着凝块的形成，分析仪记录了散射光从2-80%的变
化。通过将凝血时间对凝血百分比检测结果进行绘图，从曲线的斜率可以计算出凝结速率，并且能够比较样品的凝结速率。重要的是比较相同浓度下的样品，因为这对反应速率有浓
度依赖性的影响。

[0199] 在四种不同浓度下测量了FVIIa和PEG(20kDa)-FVIIa的反应速率，四种浓度为分别为7.5、10、12.5和20ng/ml（图15）。结果发现在所测试的四种浓度条件下，聚乙二醇化的FVIIa的平均反应速率为FVIIa平均反应速率的22%（表5）。

[0200] 表5聚乙二醇化的FVIIa对FVIIa的反应速率

[0201]

[0202] 实施例11：20kD的TheraPEGTM-FVIIa产品在患有血友病A的狗体内的药物动力学和血液凝固

[0203] 该研究的目的在于确定与 和另一种来源的FVIIa相比，这两种不同的PEG(20kDa)-FVIIa产品（实施例9）是否具有有利的药理学特征以及在易于患血友病A的
狗体内的抑制剂是否有效。这两种聚乙二醇化的产品的不同在于它们制备中使用的FVIIa
的来源。

[0204] 对每只狗进行预处理CBC、血清生化分析纤维蛋白原、FDPs、凝血酶时间（TT）和UA，以确认正常的健康状态并用于基线比较。另取血清和血浆等分试样在-70℃下冷冻，用于以后的凝血因子和抑制剂抗体试验。最初每个试验项目使用一只狗，如果生物半衰期和安全性的结果满意的话，则可以计划扩大测试规模。

[0205] 每个测试项目的剂量选为与体外速率反应试验（实施例10）的剂量相等的剂量，并且该剂量通过静脉内输注到头静脉中而实现。

[0206] 在30分钟、1、2、4、8、16、24、36、48、72、96和120小时时收集血浆样品并置于0.109M的柠檬酸三钠抗凝剂中，接着离心并将其在-70℃下冷冻。对血浆样品进行如下
测试：通过ELISA和凝血弹性描记图凝血质量（thromboelastogram clot quality）测
定aPTT、Staclot FVIIa活性、FVIIa抗原水平。在静脉穿刺时，立即进行全血凝固时间
（WBCT）。使用aPTT、Staclot试验和WBCT来评测生物半衰期，而根据蛋白抗原水平，FVIIa ELISA可以用来确定半衰期。

[0207] 通过在用产品进行给药后的第48小时和第5天进行CBC和血清生化试验可以筛选预料之外的毒性。对纤维蛋白原、FDPs和凝血酶时间（TT）进行评估以测试增加血栓的风险。Bethesda试验用来筛选中和抗体的存在。