非酒精性脂肪肝小鼠模型的造模加工方法

摘要

本发明公开了一种非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法，其特征在于：包含以下步骤：（1）取健康小鼠，先在动物房内进行适应性饲养3-7天，每天更换鼠笼垫料和清水，在此期间饲喂基础饲料；（2）适应性饲养后，每日饲喂复合高脂饲料；（3）两周后给小鼠进行腹腔注射浓度5%CCl4液，用去离子水将液体四氯化碳稀释至浓度为5%的乳浊液，每次腹腔注射均需新鲜配制方可；腹腔注射状态持续至第28天，同时饲喂复合高脂饲料；即得。此造模方法历时短、造模成功率高、死亡率极低、成本低。

权利要求

1.一种非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法，其特征在于：包含以下步骤：（1）取健康小鼠，先在动物房内进行适应性饲养3-7天，每天更换鼠笼垫料和清水，在此期间饲喂基础饲料；

（2）适应性饲养后，每日饲喂复合高脂饲料，复合高脂饲料，其配方为:2%胆固醇+0.5%胆酸钠+0.2%丙基硫氧嘧啶+5%焦糖+10%猪油+82.3%基础饲料；

（3）两周后给小鼠进行腹腔注射浓度5% CCl4液，用去离子水将液体四氯化碳稀释至浓度为5%的乳浊液，每次腹腔注射均需新鲜配制方可；腹腔注射状态持续至第28天，同时饲喂复合高脂饲料；即得。

2.根据权利要求1所述的一种非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法，其特征在于：按小鼠的重量计，四氯化碳的注射剂量为0.1ml/10g。

3.根据权利要求1所述的一种非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法，其特征在于：在动物房内饲养，室内温度保持在18℃～29℃，相对湿度在40～70%，保证环境清洁空气流通。

说明书

非酒精性脂肪肝小鼠模型的造模加工方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种动物模型的造模工艺，特别涉及一种非酒精性脂肪肝小鼠模型新型工艺。

背景技术

[0002] 随着人们生活水平的提高，饮食结构有了明显的改变，被称为“富贵病”的脂肪性肝病(也称脂肪肝)发病率明显提高，尤其是在亚洲。已成为仅次于病毒性肝炎的第二大高发性肝病。脂肪肝由多种诱因引起，病变主体在肝小叶，是常见的弥漫性肝病之一，以肝细胞内甘油三酯（TG）蓄积过多和弥漫性肝细胞脂肪变性为主要病理特性。临床上根据是否有过量酒精摄入，将脂肪肝分为酒精性脂肪肝病(alcoholic fatty liver disease, AFLD)和非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)。非酒精性脂肪肝病较为复杂化，如若不及时加以控制，从而会导致炎症反应和肝纤维化发生。它是一种无过量饮酒史，以肝细胞脂肪变性等特征的病理综合征，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性纤维化和脂肪性肝硬化4个病理过程。针对该病理过程，各医疗医学研究机构都在研究治疗非酒精性脂肪肝病的特效药，在此背景下无论是新药的安全性评价还是疗效都需要有动物模型进行检测。非酒精性脂肪肝小鼠模型的高效造模方法就显得格外重要了。

[0003] 目前市场没有出售具有稳定遗传性的非酒精性脂肪肝模型小鼠，都是需要后天培养改造的。针对于不同的造模方法，得出模型小鼠的时间也就长短不一。一般造非酒精性脂肪肝模型的方法原理主要从两方面同时进行。即四氯化碳的腹腔注射可以导致肝脏的急性损伤，再配合着复合高脂饲料导致肝脏的病变，主要表现在肝细胞膜被四氯化碳破损，高脂饲料中的高热量以脂肪滴的形式进入。

[0004] 在上述研究中，全部是以高脂饲料及四氯化碳的量和时间的堆积而成。只求结果而不顾成本和效率，导致造模成功率低下，死亡率上升并且造模的整个过程时间冗长。且传统的造模方式为提高高脂饲料的热量将猪油成分比值提高，加蔗糖少量，再配合其他药物与基础饲料混合压制成条。刚开始小鼠食欲还是比较大的，但是由于猪油含量太高容易产生饱腹感及油腻感导致小鼠食欲不振食量明显下降，从而拉长的造模的时间。传统造模方法还有一弊端，即四氯化碳每次注射剂量为10%，每次0.2ml。四氯化碳浓度高了可以有效导致肝细胞的损坏，但是小鼠体质较弱或状态不好该剂量的腹腔注射很容易导致模型动物的猝死。

发明内容

[0005] 本发明的目的是：提供一种非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法及应用，它在制备获得动物模型的同时，能有效缩短造模时间节约造模成本。

[0006] 本发明的技术方案：一种非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法，包含以下步骤：

[0007] （1）取健康小鼠，先在动物房内进行适应性饲养3-7天，每天更换鼠笼垫料和清水，在此期间饲喂基础饲料；

[0008] （2）适应性饲养后，每日饲喂复合高脂饲料；

[0009] （3）两周后给小鼠进行腹腔注射浓度5% CCl4液，用去离子水将液体四氯化碳稀释至浓度为5%的乳浊液，每次腹腔注射均需新鲜配制方可；腹腔注射状态持续至第28天，同时饲喂复合高脂饲料；即得。

[0010] 所述的复合高脂饲料，其配方为:2%胆固醇+0.5%胆酸钠+0.2%丙基硫氧嘧啶+5%焦糖+10%猪油+82.3%基础饲料。

[0011] 所述的按小鼠的重量计，四氯化碳的注射剂量为0.1ml/10g。

[0012] 所述的在动物房内饲养，室内温度保持在18℃～29℃，相对湿度在40～70%，保证环境清洁空气流通。

[0013] 本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明采用蔗糖高温化为焦糖后代替了传统高脂饲料中的蔗糖，此法提高了复合高脂饲料特有的香气，从而刺激模型小鼠的食欲，解决了传统高脂饲料降低模型小鼠食欲的问题，并且焦糖香味掩盖了猪油冷却后的油腻味道。焦糖还可以增长链脂肪酸的合成，从而使甘油三酯的合成增加。本发明把传统腹腔注射的10%CCl4液换5% CCl4液并分为两次注射，大大降低了造模的死亡率，并且达到造模死亡率为0%的理想状态。本发明方法简单，容易实施，成本低廉，使用效果好，具有较大的应用推广前景。

附图说明

[0014] 图1为非酒精性脂肪肝模型小鼠肝匀浆检测结果；

[0015] 图2为非酒精性脂肪肝模型小鼠血清检测结果。具体实施例

[0016] 为了证明该种非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法的有效性，因此进行了以下实验:

[0017] 模型小鼠与正常小鼠的血清TC、TG含量比对：

[0018] 1、购买具有动物号的昆明种清洁级的小鼠24只，雌雄各半，体重在18g左右的。购买到实验室后先进行适应性饲养3天到一周左右，看小鼠情况而定。状况良好适应3天即可，否则要延长7天。7天时状况还不佳（指不够活泼好动的）则废弃不投入实验，因为昆明种小鼠比较活泼好斗，尤其是雄性小鼠。每天更换鼠笼垫料和清水，在此期间饲喂基础饲料。动物适应环境后随机分为两组，一组为正常对照组一组为模型组。每组12只雌雄各6只，每组雌雄小鼠分开饲养，每个鼠笼里6只小鼠。

[0019] 2、在动物房内饲养，室内温度保持在18℃～29℃，相对湿度在40～70%，保证环境清洁空气流通。

[0020] 3、空白对照组每日饲喂基础鼠饲料，模型组每日饲喂复合高脂饲料，其配方为:2%胆固醇+0.5%胆酸钠+0.2%丙基硫氧嘧啶+5%蔗糖（高温下转化为焦糖后使用）+10%猪油+82.3%基础饲料。按此方法饲喂两周。

[0021] 4、两周后给模型组小鼠进行腹腔注射浓度5% CCl4液，用去离子水将液体四氯化碳稀释至浓度为5%的乳浊液（因为四氯化碳不溶于水）。每次腹腔注射均需新鲜配制方可。将模型小鼠精确称量后以其质量多少按照每10g腹腔注射0.1ml的原则换算注射每只模型小鼠的腹腔注射剂量。腹腔注射状态持续至第28天，同时饲喂复合高脂饲料。

[0022] 5、28天后，停止所有操作将两组实验小鼠停食不停水24h，24h后对两组小鼠精确称重并记录，采血。小鼠称重后放入小鼠尾静脉注射固定器，从其尾部采血。75%的酒精擦拭尾部后，注射器针头扁平刺进血管，每只小鼠抽取0.2ml～0.3ml，抗凝血剂用0.9%的生理盐水即可。若有浑浊则冷冻离心（3500r/min，10min），取上清液待用。

[0023] 6、取血后将小鼠移出固定器，提起其尾部旋转七八圈，放其至摩擦力大的平面上。由于小鼠被转有晕眩感而趴在桌面上不能动，此时拉其尾部和头部以颈椎脱臼法处死。待其不动立即解剖，此时小鼠的心脏还在搏动，取新鲜肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸去表面的水分，立即称重记录。

[0024] 7、取肝脏中叶，剪取100mg加9倍体积的异丙醇，在冰上研磨成10%肝匀浆，4℃提取24h，离心（3000r/min），提取上清液待用。

[0025] 用甘油三酯试剂盒、胆固醇试剂盒分别检测两组实验小鼠的血清和肝匀浆。两者均在检测波长500nm处测定光吸收值（OD值）。统计分析处理数据如下图1和图2所示。

[0026] 根据图1可以得知，模型组的小鼠在第29天时，肝系数、甘油三酯含量以及胆固醇含量较正常对照组小鼠均严重超标。整个造模时间只用了28天即成，其中无一小鼠死亡。