转移因子胶囊

摘要

本发明属于医药领域，公开了一种转移因子胶囊及其制备方法。本发明所述转移因子胶囊，由转移因子干粉、甘露醇和淀粉制成，每100重量份含有：转移因子干粉以多肽计1.1-1.6重量份，甘露醇10-40重量份，余量为淀粉，稳定性好，混合后粉末流动性好、吸湿率低，具有较高的生物活性。本发明所述转移因子胶囊的制备方法为按重量配比取转移因子干粉、甘露醇和淀粉，混合均匀，充填胶囊，即得。本发明所述制备方法制得转移因子胶囊杂质减少，产品纯度提高，活性明显较市售的转移因子产品高。

权利要求

1.一种转移因子胶囊，其特征在于，由转移因子干粉、甘露醇和淀粉制成，其中每100重量份含有：转移因子干粉以多肽计 1.1-1.6重量份甘露醇 10-40重量份余量为淀粉；

其中，所述转移因子中含有按重量配比计不得少于0.037份的核糖；所述转移因子干粉的制备方法为取转移因子溶液，通过凝胶色谱层析柱分离纯化，收集活力大于10％峰的洗脱液，浓缩、冷冻干燥即得；所述活性峰的活力采用T细胞活性测定法检测得到。

2.根据权利要求1所述转移因子胶囊，其特征在于，每100重量份含有：转移因子干粉以多肽计 1.4重量份

甘露醇 10-30重量份余量为淀粉。

3.根据权利要求1所述转移因子胶囊，其特征在于，所述胶囊规格为3mg多肽：100μg核糖。

4.根据权利要求1所述转移因子胶囊，其特征在于，所述转移因子溶液的浓度为10mg/mL-20mg/mL。

5.根据权利要求1所述转移因子胶囊，其特征在于，所述凝胶色谱层析柱分离纯化过程为：ⅰ、装柱：将25％乙醇保存的琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质超声波脱气后湿态装柱；

装柱要求无气泡、无裂纹、填料分布均匀；柱的径高比为1:20-5:20，用1-10个柱体积纯水平衡层析柱；

ⅱ、系统连接：将装好的层析柱下端出液口与紫外检测器进口连接；层析柱上端进液口与泵系统连接；

ⅲ、加样：取转移因子溶液小心加于该层析柱的上表面，上样体积为柱床体积的5％～

35％；打开柱下端出口，使转移因子溶液进入凝胶内；

ⅳ、洗脱：在层析柱的上表面上加入水，保持液位高度为3cm-5cm，调节洗脱速度为

20mL/min-40mL/min；

ⅴ、收集：在214nm紫外检测器下在线监测，分段收集活力大于10％峰的洗脱液。

6.根据权利要求5所述转移因子胶囊，其特征在于，所述琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质为没食子酸配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质。

7.一种权利要求1所述转移因子胶囊的制备方法，其特征在于，按重量配比取转移因子干粉、甘露醇和淀粉，将转移因子干粉、甘露醇与淀粉混合均匀，充填胶囊，即得。

8.权利要求1所述转移因子胶囊在制备预防和治疗细胞内感染性疾病和自身免疫性疾病药物中的应用。

说明书

转移因子胶囊

技术领域

[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及一种转移因子胶囊及其制备方法。

背景技术

[0002] 转移因子（Transfer Factor，简称TF）是人或动物致敏白细胞释放的多种因子中的一种能够转移致敏信息的低分子物质。转移因子具可透析性，能与抗原结合而本身却无抗原性。转移因子带有致敏淋巴细胞的特异性免疫信息，能够特异的将供者所具有的抗原性及其敏锐的特异性转移给一个免疫反应阴性的受者，同时受者产生一种迟发型超敏反应能力。转移因子具有传递免疫信息、激发免疫细胞活性、调节免疫机能、增强机体非特异性免疫功能等作用，被誉为T细胞活性的触发剂，细胞免疫的增强剂、细胞免疫调节剂及干扰素产生启动剂。

[0003] 转移因子自20世纪50年代被发现以来，国内外学者对其研究也从基础理论研究深入到临床应用方面。近30多年来广泛用于治疗阴道念珠菌病、球孢子菌病、血吸虫病、水痘、带状疱疹、麻疹、乙型肝炎、多发性硬化症、急性硬化性全脑炎、巨细胞病毒视网膜炎、麻风病、结核病、细菌性疾病等细胞内感染性疾病和Wiskott-Aldrich综合征、共济失调、毛细血管扩张综合征、慢性皮肤念珠菌病、结节病等自身免疫性疾病，转移因子还可用于其他如肾病综合征、类风湿性关节炎、过敏性紫癜、硬皮病、红斑狼疮、溃疡病等，恶性肿瘤、肿瘤病人放化疗后的辅助治疗。

[0004] 转移因子应用于细胞内感染性疾病和自身免疫性疾病的治疗具有作用安全、迅速、效果显著、无药物残留、无抗原性、无毒副作用的特点，且来源广、价格便宜，因此具有广阔的前景。

[0005] 从发现转移因子至今，转移因子多采用注射给药，剂型主要是注射液及冻干粉针剂，但以注射给药方式的患者，特别是老人和儿童，顺应性差，使用十分不便。国内外学者的研究证明口服给药能同样达到注射给药的效果，于是自20世纪90年代末开始出现了口服转移因子剂型，即转移因子口服液及转移因子胶囊。但目前市售的转移因子口服剂型大多处方复杂，含有较多辅料，制剂稳定性差，造成患者服药后疗效不显著、服药疗程长、治愈率低的问题。

发明内容

[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种处方简单、稳定性好的转移因子胶囊及其制备方法。

[0007] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 一种转移因子胶囊，由转移因子干粉、甘露醇和淀粉制成，其中每100重量份含有：

[0009] 转移因子干粉以多肽计 1.1-1.6重量份

[0010] 甘露醇 10-40重量份

[0011] 余量为淀粉。

[0012] 转移因子干粉主要是从动物脾脏中分离提取的转移因子溶液，通过分离纯化、浓缩、冷冻干燥得到，具有较高的生物活性，但是较易吸湿。

[0013] 本发明所述转移因子胶囊以转移因子干粉、甘露醇和淀粉为原料制成。甘露醇又称D-甘露醇，分子量182.17，是一种人们熟悉的六元醇，与山梨醇为同分异构体。甘露醇是一种不易吸湿、无臭、白色或无色的结晶粉末，具有令人愉快的甜味，甜度约为蔗糖的0.4倍，具有多元糖醇的通性，同时具有甜度适宜、热量低、无毒副作用等特点，在人体生理代谢中，它与其他功能糖醇一样，与胰岛素无关，不提高血糖值，且不致龋齿。作为辅料，在硬胶囊剂中，甘露醇常作为填充剂，流动性好，尤其适用于易于吸湿的物料。淀粉：无味、无臭，白色粉末，吸湿性不强，不溶于冷水、乙醇和乙醚，溶于55～60℃热水中成淀粉糊。是膳食中主要的碳水化合物，是人类和动物能量的主要来源。在制药工业中用作为药品的赋形剂、增稠剂、稀释剂、崩解剂等。通过实验研究证实，本发明所述转移因子胶囊中甘露醇、淀粉与转移因子干粉不发生相互作用，稳定性好，混合后粉末流动性好、吸湿率低，具有较高的生物活性。

[0014] 进一步的，所述转移因子胶囊，每100重量份含有：

[0015] 转移因子干粉以多肽计 1.4重量份

[0016] 甘露醇 10-30重量份

[0017] 余量为淀粉。

[0018] 进一步的，所述转移因子中含有按重量配比计不得少于0.037份的核糖。

[0019] 进一步的，所述胶囊规格为3mg多肽：100μg核糖。

[0020] 进一步的，本发明所述转移因子干粉的制备方法为取转移因子溶液，通过凝胶色谱层析柱分离纯化，收集活力大于10%峰的洗脱液，浓缩、冷冻干燥即得。

[0021] 其中，所述转移因子溶液是从猪、牛或鸡脾脏中分离提取的。

[0022] 由于经过粗提的转移因子溶液含有多种多肽、核苷酸、氨基酸等物质，为确保药品的安全性，本发明采用凝胶色谱层析法分离纯化提取的转移因子溶液。

[0023] 转移因子溶液的浓度对凝胶色谱层析的分离效果影响较大，如果转移因子溶液的浓度太低，柱层析分析效果好，但是耗时太多，生产周期拉长，成本升高；如果转移因子溶液的浓度太高，柱子过载，分离效果下降。因此，本发明所述转移因子浓度优选为10mg/mL-20mg/mL。

[0024] 作为优选，本发明所述凝胶色谱层析柱分离纯化过程为：

[0025] ⅰ、装柱：将25%乙醇保存的琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质超声波脱气后湿态装柱；装柱要求无气泡、无裂纹、填料分布均匀；柱的径高比为1:20-5:20，用1-10个柱体积纯水平衡层析柱；

[0026] ⅱ、系统连接：将装好的层析柱下端出液口与紫外检测器进口连接；层析柱上端进液口与泵系统连接；

[0027] ⅲ、加样：取转移因子溶液小心加于该层析柱的上表面，上样体积为柱床体积的5%～35%；打开柱下端出口，使转移因子溶液进入凝胶内；

[0028] ⅳ、洗脱：在层析柱的上表面上加入水，保持液位高度为3cm-5cm，调节洗脱速度为20mL/min-40mL/min；

[0029] ⅴ、收集：在214nm紫外检测器下在线监测，分段收集活力大于10%峰的洗脱液。

[0030] 本发明所述凝胶色谱层析柱分离纯化采用琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质根据以氢键相互作用为特征的氢键吸附色谱原理，从生物组织提取物、多肽混合物中一步分离纯化得到高纯度的多肽、氨基酸、核苷酸等物质，克服了传统纯化方法步骤复杂、介质重复利用度低、样品载量低、生物相容性差、难于规模化等缺点，具有纯化工艺简单、选择性高、样品载量高、介质重复利用度高等优点。

[0031] 本发明所述琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质可以为没食子酸配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质、槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质、β-环糊精配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质。

[0032] 作为优选，本发明所述琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质为没食子酸配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质。

[0033] 进一步的，所述没食子酸配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质为以没食子酸为配基，以10μm-30μm粒径、12%浓度的高交联度琼脂糖凝胶为基质的分离介质。本发明所述没食子酸配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质可以通过商业渠道购买得到，或者按照文献或专利公开的制备方法制备得到。

[0034] 进一步的，步骤ⅳ中，在转移因子溶液恰好流至与凝胶上表面平齐时，关闭层析柱的下端出口；用水清洗加样区，共洗涤三次；待上次清洗液应完全进入凝胶柱内后，再进行下一次洗涤。

[0035] 经过凝胶色谱层析法处理前后的转移因子溶液，通过紫外检测器进行检测发现，处理后的产品中杂质减少，如附图中的图1（处理前产品检测）和图2（处理后的产品检测）所示，图2中杂质峰明显减少，因此转移因子溶液纯度提高。

[0036] 本发明还提供了所述转移因子胶囊的制备方法，为按重量配比取转移因子干粉、甘露醇和淀粉，将转移因子干粉、甘露醇与淀粉混合均匀，充填胶囊，即得。本发明采用T细胞活性测定法即脱E受体法对得到的转移因子胶囊进行活性检测，测定结果显示本发明所述制备方法制备得到的转移因子胶囊的活性明显较市售的转移因子产品高，转移因子胶囊得率为85%，杂质含量低，生物活性稳定在15.0%以上，均高于国家标准规定。

[0037] 本发明还提供了所述转移因子胶囊在制备预防和治疗细胞内感染性疾病和自身免疫性疾病药物中的应用。

[0038] 本发明提供了一种转移因子胶囊及其制备方法，本发明所述转移因子胶囊，由转移因子干粉、甘露醇和淀粉制成，其中每100重量份含有：转移因子干粉以多肽计1.1-1.6重量份，甘露醇10-40重量份，余量为淀粉。本发明所述转移因子胶囊中甘露醇、淀粉与转移因子干粉不发生相互作用，稳定性好，混合后粉末流动性好、吸湿率低，具有较高的生物活性。本发明所述转移因子胶囊的制备方法为按重量配比取转移因子干粉、甘露醇和淀粉，将转移因子干粉、甘露醇与淀粉混合均匀，充填胶囊，即得。本发明所述制备方法制得转移因子胶囊杂质减少，产品纯度提高，活性明显较市售的转移因子产品高。

附图说明

[0039] 图1示常规转移因子溶液的紫外光谱图；

[0040] 图2示经过凝胶色谱层析柱处理后的转移因子溶液的紫外光谱图。

具体实施方式

[0041] 本发明实施例公开了一种转移因子胶囊及其制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0042] 实施例1：

[0043] 从新鲜猪脾脏分离提取转移因子溶液，配置成10mg/mL-20mg/mL备用。

[0044] 装柱：将25%乙醇保存的没食子酸配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质超声波脱气后湿态装柱；装柱要求无气泡、无裂纹、填料分布均匀；柱的径高比为1:20-5:20，用1-10个柱体积纯水平衡层析柱；

[0045] 系统连接：将装好的层析柱下端出液口与紫外检测器进口连接；层析柱上端进液口与泵系统连接；

[0046] 加样：取上述转移因子溶液小心加于该层析柱的上表面，上样体积为柱床体积的5%～35%；打开柱下端出口，使转移因子溶液进入凝胶内；

[0047] 洗脱：在层析柱的上表面上加入水，保持液位高度为3cm-5cm，调节洗脱速度为20mL/min-40mL/min；

[0048] 收集：在214nm紫外检测器下在线监测，分段收集不同活性峰的洗脱液。

[0049] 用T细胞活性测定法—脱E受体法检测不同活性峰的活力，结果见表1。

[0050] 表1不同活性峰的活力

[0051]名称 活力 多肽含量（%）
峰1 5.3 3
峰2 13.7 4
峰3 18.2 10
峰4 25.7 16
峰5 23.9 20
峰6 28.4 23
峰7 26.5 22
峰8 7.2 2

[0052] 收集活力大于10%峰的洗脱液，将收集的洗脱液浓缩、冷冻干燥即得转移因子干粉。

[0053] 采用上述方法得到的转移因子干粉高分子量物质被控制在1.0%以内，远远低于原转移因子溶液国家标准规定的不得过5.0%；同时转移因子溶液生物活性指标达到15.0%以上，高于原国家标准（不小于10.0%）50.0%以上。

[0054] 实施例2：

[0055] 实施例1制得的转移因子干粉：含多肽12.0％，活力：23.2%

[0056] 混合后用于充填胶囊的充填粉多肽含量：1.4%，充填量约为220mg/粒。

[0057] 分别按照甘露醇用量为5%、10%、20%、30%、40%进行处方筛选，考察粉体的流动性（休止角）。统计结果见表2。

[0058] 休止角（α）测定方法：固定漏斗法。将漏斗固定于水平放置的绘图纸上，漏斗出口距绘图纸的距离为H，把粉体倒入漏斗直到漏斗的出口与圆锥尖端接触，量取圆锥体底部直径（2R）及圆锥体的高，按下式计算休止角：

[0059] α=arctg（H/R）

[0060] 其中，α为休止角，R为底盘半径。

[0061] 表2不同处方休止角测定结果（转移因子干粉多肽含量12.0%）

[0062]处方 转移因子干粉g 甘露醇g 淀粉g 活力% 流动性（休止角°）
1 11.6 0.0 88.4 23.2 46
2 11.6 5.1 83.3 23.1 44
3 11.6 10.0 78.4 23.2 40
4 11.6 20.0 68.4 23.3 38
5 11.6 30.0 58.4 23.2 37
6 11.6 40.0 48.4 23.2 36

[0063] 由表2结果可见，处方3-6的流动性均较好，适合充填胶囊。但甘露醇价格较淀粉贵，从节约社会资源和成本的角度出发，选择3、4、5三个处方。

[0064] 进一步对3、4、5三个处方进行吸湿性考察，统计结果见表3。

[0065] 吸湿性检测方法：取按上表所列处方配制的粉体2g，置具塞玻璃瓶中，敞口置于相对湿度55%(54.38%±0.23%，25℃硝酸镁饱和溶液)、60%(57.57%±0.4%，25℃溴化钠饱和溶液)、70%(恒温箱)的干燥器中，分别于0、2、4、8、24、48h取出，精密称定，计算吸湿增重百分率。

[0066] 表3不同处方在不同湿度环境中的吸湿增重百分比

[0067]

[0068] 由表3结果可见，处方3-5在相对湿度55%、60%条件下吸湿率较低，稳定性好，符合胶囊制备的工艺要求。

[0069] 实施例3：

[0070] 取实施例1制得的转移因子干粉，按实施例2中3-5处方，将转移因子干粉（以多肽计）、甘露醇和淀粉混合均匀，充填胶囊，制成转移因子胶囊。

[0071] 将本发明制成的转移因子胶囊与已上市转移因子胶囊和转移因子口服液的活性进行比较，结果如表4。

[0072] 表4活性进行比较

[0073]产品名称 活性% 高分子量物质%
本发明所述转移因子胶囊（处方3） 25% 0.1
本发明所述转移因子胶囊（处方4） 26% 0.1
本发明所述转移因子胶囊（处方5） 25% 0.1
上市转移因子胶囊1 13% 2.9
上市转移因子胶囊2 14% 3.3
上市转移因子胶囊3 11% 4.6
上市转移因子胶囊4 12% 2.7
转移因子口服液 15% 3.2

[0074] 采用本发明所述制备方法制备得到的转移因子胶囊，高分子量物质被控制在0.5%以内，明显低于其他上市产品，并且远远低于国家标准规定的不得过5.0%。同时生物活性均达到20%以上，明显高于其他上市产品，高于国家标准50%以上，且更加稳定。

[0075] 附：T细胞活性测定法—脱E受体法

[0076] 根据转移因子可使脱E受体后的胸腺T细胞恢复其E受体功能，从而反映转移因子的生物活性。

[0077] 试剂的配制：

[0078] （1）Hank’s液取0.3％磷酸二氢钾溶液，0.76％磷酸氢二钠溶液，2％氯化钾溶液及20％氯化钠溶液依次按20：20：20：40比例混合，加葡萄糖1g，溶解混匀，用水稀释至1000ml，并用4％碳酸氢钠溶液调节pH值至7.2～7.3（临用时配制）。

[0079] （2）阿氏液取氯化钠0.420g，枸缘酸0.055g，枸缘酸钠0.766g，葡萄糖2.05g，加水溶解并稀释至100ml，灭菌。

[0080] （3）分离液为淋巴细胞分离液。

[0081] （4）羊血取绵羊静脉血5ml，加入5ml阿氏液中，冰箱保存。

[0082] （5）固定液取25%戊二醛溶液，3.5％碳酸氢钠溶液及Hank’s液依次按1：1：38比例混合。

[0083] （6）姬姆萨染色液原液取姬姆萨染料0.5g，加甘油33ml，55～60℃加热至姬姆萨染料溶解，冷至室温，加入33ml甲醇，室温放置24小时后，用滤纸过滤，滤液即为原液，密封室温保存。

[0084] （7）染色液取姬姆萨染色液原液2ml，加Hank’s液6ml，摇匀，以每分钟1500转离心10分钟，取上清液待用。

[0085] 操作法：

[0086] （1）脱E受体胸腺T细胞悬液的制备取新鲜猪胸腺，去脂肪并剪碎，加适量Hank’s液使成细胞悬液，经100目筛过滤，每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，加入少量Hank’s液打匀，将此溶液加入已加有1/3滤液量的分离液的离心管中，以每分钟2000转离心20分钟，小心吸出中间层的胸腺细胞，放入另一离心管中，加适量Hank’s液洗涤，摇匀，以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，洗涤一次后，在沉淀物中加入适量Hank’s液，混匀，45℃恒温水浴保温30分钟（每隔5分钟振摇一次）。以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，再加入适量Hank’s液，混匀后，置45℃恒温水浴保温30分钟，取出后以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液。用Hank’s液洗涤三次（操作同前），最后用6 6
Hank’s液适当稀释并计数，使最终浓度为每1ml中（3×10）～（5×10）个细胞。

[0087] （2）绵羊红血球悬液的制备取适量羊血，用适量Hank’s液洗三次（同前）。弃去上清液，加适量Hank’s液稀释并计数，使最终浓度为脱E受体胸腺T细胞悬液浓度的8～10倍。

[0088] （3）供试品溶液的制备取供试品，用Hank’s液配制成每1ml中含1mg的溶液。

[0089] （4）测定取小试管6支，其中3支各加Hank’s液0.1ml作对照管，另3支各加供试品溶液0.1ml作测定管，每管中各加脱E受体胸腺T细胞悬液0.2ml，37℃保温1小时后，加入绵羊红血球悬液0.2ml，摇匀，以每分钟500转离心3分钟，放入4℃冰箱过夜，次日取出，弃去上清液，每管中各加入固定液一滴，轻轻摇匀，静置10分钟，加入染色液2滴并摇匀，静置15分钟后开始计数，显微镜视野中淡蓝色的较大的细胞为淋巴细胞，共数计数板16个大方格上所有淋巴细胞的个数（不少于200个），统计其中的E玫瑰花结形成的细胞数（结合3个以上绵羊红细胞的淋巴细胞），求得结花百分率，取平均值。即为供试品管或对照管的平均值。计算公式入下：

[0090] 样品活力＝供试品管E玫瑰花结百分率—对照管E玫瑰花结百分率

[0091] 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。