一种用于通便减肥的药物组合物及其制备方法和用途

摘要

本发明提供了一种用于通便减肥的药物组合物，它是由生大黄、厚朴、枳实、芒硝为原料药制备而成的外用药剂。本发明还提供了该药物组合物的制备方法和用途。本发明药物贴剂是根据祖国医学六腑以通为用的理论，集数十年临床经验潜心研制而成，通过药物和穴位的双重作用清除宿便，增加肠蠕动，便于肠壁上脂肪转化，收紧松弛的腹部肌肉，并增加其弹性，达到理想的通便、减肥康复保健的目的。本发明药物贴剂避免了大黄等泻下药口服所致的腹痛等副作用，使用方便，可随时停药，中病即止。

权利要求

1.一种用于通便减肥的药物组合物的制备方法，其特征在于：它是由生大黄、厚朴、枳实、芒硝为原料药制备而成的，包括如下步骤：a、称取原料药；

b、按3:1.5:1的比例分别称取生大黄、厚朴、枳实，粉碎成粗粉，加75%乙醇浸渍6小时，进行常压渗漉，渗漉液自然沉降，取上清液于40℃减压浓缩至无醇味，用25%乙醇配制成1g/ml的药液，加药液重量10～25%的芒硝使其溶解，再加药液重量2%氮酮，即得浓度为原生药材计1g/ml的药液；

c、按1∶1的比例再称取生大黄、芒硝，粉碎成最细粉，混合均匀，灭菌，即得药粉；

d、将药粉封存于透气性胶贴中，药液灌装，制备成贴剂；使用时揭去盖衬，将药液滴在药粉上，贴于肚脐。

说明书

一种用于通便减肥的药物组合物及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于通便减肥的药物组合物，属药物领域。

背景技术

[0002] 据调查，世界上大约有28～30%的人被程度不同的便秘所困扰，这部分人群中不乏小孩、老人等体弱之人，大便秘结肥胖的人群越来越多。目前国内超重和肥胖人群数量分别为2亿和9000万，而由于大便不通而导致的肥胖也急剧增加，大便排泄是体内毒素和废品排除的主要途径，如果长期便秘还可导致痔疮甚至肠癌等一系列病症。对于便秘的治疗，目前市场上多是以生大黄为君药的口服制剂，由于生大黄泻下剧烈，较多人服用不能承受腹痛等副作用，而外用制剂可以避免上述情况，而且市场上结合传统中医穴位疗法的外用贴剂开发上市很少。

[0003] 脐疗法是我国传统的、独具特色的治疗方法之一,它有着悠久的历史和丰富的内容。我国现存最早的医学文献——帛书《五十二病方》中已有肚脐填药、涂药等记载。汉代医家张仲景《金匮要略》中描述温脐疗病的方法。晋代葛洪在《肘后备急方》中有肚脐隔盐实灸治疗霍乱的记载。中医经络学说阐述神阙穴居脐中,归属于任脉,任、督、冲三脉具有“一源三歧”关系,故脐与三脉经气相通。由于奇经八脉纵中横贯穿于十二经脉之间,联系全身经脉,因此对神阙穴施治能影响五脏六腑、四肢百骸、五官九窍、皮肉筋骨等功能,而达到条理阴阳、行气和血、祛除病邪、康复机体的作用。现代医学研究提示:脐在胚胎发育过程中为腹腔最后闭合处,和全身皮肤比较无皮下脂肪,表皮角质层薄,屏障功能最弱,药物易于穿透弥散,脐下有腹腔上下静脉,并有丰富的血管网,对药物的敏感度最强,吸收迅速。

[0004] 透皮给药系统(Transdermal Drug Delievry Sys tems,TDDS)是近年发展起来的一种新给药系统，它使药物以一定的速率通过皮肤毛细血管吸收进入体循环产生药效的一类制剂,是控制释放药物通过完整皮肤的一种剂型,利用皮肤作为输入体循环的门户,发挥药物的治疗作用,是对传统皮肤用药观念的重大突破。TDS避免了肝脏首过效应、药物在胃肠道的破坏等。

[0005] 申请号：200510021359.8，发明名称：通便降脂减肥的纯中药脐贴；本发明公开了一种在肚脐神即厥穴采用粘贴治疗大便秘结、肥胖、高血脂等病症的外用中药帖剂，其组分为茯苓、厚朴、枳实、火麻仁、大黄、荷叶、山楂、决明子；本发明具有行气通便、清热燥温、降脂减肥之功效，一药多效，复方效果好，充分利用药物与穴位的双重作用对大便秘结、肥胖、高血脂等病症疗效显著，外用无毒副作用、无伤阴损正之虑，使用方便。申请号：200810071234.X，发明名称：贴脐通便散，本发明涉及含有来源于植物材料反应产物的医用配制品，尤其是属于一种治疗便秘病症的贴脐通便散。本发明所采取的技术方案是：它是由下列重量比的成分配成药剂：太子参、麦冬、生地黄、熟大黄、厚朴、枳实、火麻仁、杏仁、皂荚、肉苁蓉、当归、玄明粉、槟榔、芒硝、番泻叶。本发明的有益效果在于：本发明基于传统医学“内病外治”的理论基础，以脐穴给药，避免了对肝、肾、胃的刺激作用，不但解决了口服用药病气与药性相格拒，药入胃即吐，不能纳药等弊端。同时避免脏器官对内服药物的分解，还有效的克服了患者不易服药的问题，且无任何毒副作用，值得推广使用。

发明内容

[0006] 本发明的技术方案是提供了一种用于通便减肥的药物组合物及其制备方法和用途。

[0007] 本发明提供了一种用于通便减肥的药物组合物，它是由生大黄、厚朴、枳实、芒硝为原料药制备而成的外用药剂。

[0008] 进一步优选地，所述的原料药的重量配比为：

[0009] 生大黄100-500份、厚朴50-300份、枳实50-150份、芒硝5-40份。

[0010] 进一步优选地，所述的原料药的重量配比为：

[0011] 生大黄300份、厚朴150份、枳实100份、芒硝10-25份。

[0012] 它是由生大黄、厚朴、枳实、芒硝的原生药粉或有机溶剂提取物为活性成分，加入药学常用的外用制剂辅料或辅助性成分制备而成的药剂。

[0013] 其中，所述的外用药剂为酊剂、膏剂、洗剂、搽剂、巴布剂、贴剂。

[0014] 其中，所述的贴剂中包括封存于透气性胶贴的药粉和灌装的药液；其中，药液的载药量为1-3ml，浓度以原生药材计为1-2g/ml，药粉载药量为1-3g。

[0015] 其中，所述的药液中番泻苷A含量不低于4.490mg/g；药液中和厚朴酚含量不低于37.340mg/g，厚朴酚含量不低于41.830mg/g。

[0016] 本发明还提供了一种制备所述的药物组合物的方法，它包括下述步骤：

[0017] a、称取原料药；

[0018] b、称取生大黄、厚朴、枳实，粉碎成粗粉，加65-85%乙醇浸渍6-12小时，进行常压渗漉，渗漉液自然沉降，取上清液于30℃-40℃减压浓缩至无醇味，用20-30%乙醇配制成1-2g/ml的药液，加药液重量10～25%的芒硝使其溶解，再加药液重量1-6%氮酮，即得浓度为原生药材计1-2g/ml的药液；

[0019] c、称取生大黄、芒硝，粉碎成最细粉、细粉、中粉，或粗粉，混合均匀，灭菌，即得药粉；

[0020] d、将药粉封存于透气性胶贴中，药液灌装，制备成贴剂。

[0021] 进一步优选地，它包括如下步骤：

[0022] a、称取原料药；

[0023] b、按3:1.5:1的比例分别称取生大黄、厚朴、枳实、芒硝，粉碎成粗粉，加75%乙醇浸渍6小时，进行常压渗漉，渗漉液自然沉降，取上清液于40℃减压浓缩至无醇味，用25%乙醇配制成1g/ml的药液，加10～25%的芒硝使其溶解，加2%氮酮，即得浓度为原生药材计1g/ml的药液；

[0024] c、按1∶1的比例称取适量生大黄、芒硝，粉碎成最细粉，混合均匀，灭菌，即得药粉；

[0025] d、将药粉封存于透气性胶贴中，药液灌装，制备成贴剂。

[0026] 本发明还提供了所述的药物组合物在制备通便减肥的外用药物中的用途。

[0027] 大黄入药的历史悠久，《神龙本草经》列为下品，谓“下瘀血，血闭，寒热，破癥瘕积聚，留饮宿食，荡涤肠胃，推陈致新，通利水谷，调中化食，安和五脏。”《本草经疏》亦认为：“大黄气味大苦大寒，性禀直遂，长于下通，故为泻伤寒温病、热病、湿热、热结中下二焦，二便不能，及湿热胶痰于中下二焦之要药”。本处方中，大黄苦寒通降，泻热通便，荡涤胃肠实热积滞，以治热、实，为君药。实热内结，腑气阻滞，故以厚朴下气除满，使胃肠气机通降下行以助泻下通便，为佐药。本发明药物原料泻下与行气并重，泻下则畅行胃肠气机，行气则有助于泻下，是故泻下力峻。

[0028] 本发明药物贴剂是根据祖国医学六腑以通为用的理论，集数十年临床经验潜心研制而成，通过药物和穴位的双重作用清除宿便，增加肠蠕动，便于肠壁上脂肪转化，收紧松弛的腹部肌肉，并增加其弹性，达到理想的通便、减肥康复保健的目的。本发明药物贴剂避免了大黄等泻下药口服所致的腹痛等副作用，使用方便，可随时停药，中病即止。

附图说明

[0029] 图1波长扫描结果图

[0030] 图2大鼠离体皮肤图

[0031] 图3改良Franz扩散池图

[0032] 图4硫酸钠的溶解度曲线图

[0033] 图5番泻苷A对照品HPLC谱图

[0034] 图6对照品阴性HPLC谱图

[0035] 图7供试品阴性HPLC谱图

[0036] 图8供试品溶液HPLC谱图

[0037] 图9厚朴酚、和厚朴酚对照品HPLC谱图

[0038] 图10对照品阴性HPLC谱图

[0039] 图11供试品阴性HPLC谱图

[0040] 图12厚朴供试品HPLC谱图

具体实施方式

[0041] 实施例1本发明外用贴剂的制备

[0042] 1.本发明药物贴剂制备工艺

[0043] 本发明药物贴剂分为固体药物和药液两部分，固体药物封存于透气性胶贴中，给药时去掉胶贴背衬层，在药粉上滴加药液，贴于肚脐即可。

[0044] 1.1药材、仪器及试药

[0045] 1.1.1药材大黄、厚朴等药材均购于成都市新荷花饮片公司，经鉴别及含量测定符[1]合药典标准 。

[0046] 1.1.2仪器岛津LC-20A高效液相色谱仪，赛多利斯Bp211DAG电子天平（德国Sartorius），UV-1100紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司），超声波清洗器CX-100（北京医疗设备二厂），SHD-Ⅲ型循环水式多用真空泵（保定高新区阳光科教仪器厂），旋转蒸发器RE-52A（上海亚荣生化仪器厂），打粉机（上海久品工贸有限公司）。

[0047] 1.1.3药品与试剂

[0048] 药品大黄素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110756-200110）、番泻苷A对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：A0182，纯度≥98%）、厚朴酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110729-200309）、和厚朴酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0730-200206）。

[0049] 试剂乙酸镁由北京化工厂生产，碳酸氢钠由成都市科龙化工试剂厂生产，95%乙醇、冰乙酸、甲醇、石油醚（60～90）等由成都市科龙化工试剂厂生产，甲醇为色谱甲醇，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

[0050] 1.2固体药粉的制备

[0051] 取生大黄、芒硝粉碎成最细粉，按1:1的比例混合均匀，即得。

[0052] 1.3药液的制备

[0053] 药液为生大黄、厚朴、枳实、芒硝的提取液。

[0054] 1.3.1评价指标

[0055] 大黄中结合状态的蒽苷是泻下的有效成分，主要包括蒽醌苷和双蒽酮苷，以双蒽[1]酮苷居多，双蒽酮苷中有番泻苷A、B、C、D、E、F，其中番泻苷A含量最高 ，故以结合型蒽醌、番泻苷A作为工艺评价指标。

[0056] 大便排泄靠“气”的推动，方中厚朴的行气作用不可忽略，故选取厚朴酚、和厚朴酚两个指标性成分来评价工艺。

[0057] 1.3.2含量测定方法

[0058] 1.3.2.1紫外分光光度法测定大黄中结合型蒽醌的含量[2-3]

[0059] 结合型蒽醌含量＝总蒽醌含量-游离型蒽醌含量。

[0060] 大黄素对照品溶液的配制

[0061] 取大黄素对照品约1mg，精密称定，置10ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

[0062] 测定波长的确定

[0063] 精密吸取大黄素对照品溶液0.5ml置蒸发皿中，挥去甲醇，加1.0%醋酸镁甲醇溶液溶解残渣，并定容置10ml容量瓶中，摇匀，以1.0%醋酸镁甲醇溶液作参比，在300～900nm波段内扫描大黄素对照品溶液，结果显示在504nm处吸收峰良好，结果见图1。而空白溶剂在504nm处几乎无吸收，不干扰测定结果，故选用504nm作为测定波长。

[0064] 标准曲线的绘制

[0065] 分别精密吸取中大黄素对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml置蒸发皿中，挥干溶剂，加1.0%醋酸镁甲醇溶液溶解残渣，并定容置10ml容量瓶。以甲醇为空白溶剂，采用分光光度测定法，在504nm处测定其吸光度（A），结果见表1。

[0066] 表1大黄素对照品溶液不同浓度的吸光度

[0067]

[0068] 以大黄素对照品溶液浓度C(mg/ml)为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标，得回归方程为Y=40.821X+0.0094，R2=0.9996，实验结果表明大黄素对照品含量在0.022～0.224mg范围内呈良好线性关系。

[0069] 总蒽醌含量测定

[0070] 精密吸取提取液1ml，定容置50ml容量瓶中，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，减压挥干溶剂，加冰乙酸-25%盐酸（5:1）10ml，加热回流2h,冷却，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取2次，每次10ml，合并三氯甲烷层，并用大量水洗涤，回收溶剂至干，残渣加1.0%乙酸镁甲醇溶液溶解，定容置50ml量瓶中，摇匀，以1.0%乙酸镁甲醇溶液为空白溶液，于504nm处测定其吸光度，计算总蒽醌的含量。

[0071] 游离型蒽醌含量测定

[0072] 精密吸取上述续滤液5ml置蒸发皿中，挥干溶剂，残渣加少量水洗涤，并转移置分液漏斗中，其余操作同总蒽醌含量测定项下相关操作，于504nm处测定其吸光度，计算游离型蒽醌含量。

[0073] 1.3.2.2HPLC法测定番泻苷A的含量[4-6]

[0074] 色谱条件

[0075] 色谱柱：Comatex-C18柱(5μm，250mm×4.6mm)；

[0076] 检测波长：340nm；

[0077] 流动相：甲醇：水（50:50）；

[0078] 流速：0.5ml/min；

[0079] 柱温：30℃。

[0080] 番泻苷A对照品溶液的制备

[0081] 取番泻苷A对照品适量，精密称定，加甲醇配制成每1ml含50ug番泻苷A的对照品溶液，即得。

[0082] 供试品溶液的制备

[0083] 精密吸取提取液1ml，加甲醇定容置10ml容量瓶中，即得。

[0084] 含量测定

[0085] 分别精密取对照品溶液、供试品溶液各10μl进样，测定，计算番泻苷A含量。

[0086] 1.3.2.3HPLC法测定厚朴酚、和厚朴酚含量

[0087] 色谱条件[7]

[0088] 色谱柱：Comatex-C18柱(5μm，250mm×4.6mm)；

[0089] 流动相：甲醇-水（78:22）；

[0090] 检测波长：294nm；

[0091] 流速：1ml/min；

[0092] 柱温为：35℃。

[0093] 对照品溶液的制备

[0094] 取厚朴酚、和厚朴酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含厚朴酚28ug、和厚朴酚30ug的溶液，即得。

[0095] 供试品溶液的制备

[0096] 精密吸取提取液1ml，挥干溶剂，加甲醇溶解并定容置25ml容量瓶中，即得。

[0097] 含量测定

[0098] 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl进样，测定，计算和厚朴酚、厚朴酚含量。

[0099] 1.3.3提取工艺筛选

[0100] 1.3.3.1正交试验因素水平选择

[0101] 根据预试验得知，影响本渗漉法提取工艺的主要因素为:乙醇浓度、乙醇用量和4
浸渍时间，故按3因素3水平讲行L9（3）试验。因素水平见表2。

[0102] 表2渗漉法因素水平

[0103]

[0104] 1.3.3.2正交试验样品的制备

[0105] 分别称取生大黄150g，厚朴75g,枳实50g，按正交试验表各项所列条件进行提取,所得药液适当浓缩,最后定容至500ml,备用。

[0106] 1.3.3.3指标成分的含量测定

[0107] 参照1.3.2项下相关操作，分别测定结合型蒽醌、番泻苷A、和厚朴酚、厚朴酚的含量，结果见表3。

[0108] 1.3.3.4试验结果

[0109] 正交试验含量测定结果见表3。

[0110] 表3正交试验含量测定结果

[0111]

[0112] 采用综合加权评分法，结合型蒽醌、番泻苷A、和厚朴酚、厚朴酚的含量都以较高为好，故分别把对应的最高值定为100分，宜用公式y=Y/最高含量值。

[0113] 根据实验研究的目的，各成分含量权重系数分别为：结合型蒽醌含量（Y1）为0.3,番泻苷A含量(Y2)为0.4,和厚朴酚含量（Y3）、厚朴酚含量（Y4）均为0.15,将四个单项相加，用式Y=0.3y1+0.4y2+0.15y3+0.15y4,求出各实验综合评分的值，结果见表4。

[0114] 表4正交试验安排表及结果

[0115]

[0116] 1.3.3.5数据分析

[0117] 方差分析结果见表5。

[0118] 表5综合评分方差分析

[0119]

[0120] 由方差分析结果可知，乙醇浓度（A）对结果有显著性影响，乙醇用量（B）及浸渍时间（C）影响不显著，为了使操作简便，适合大生产，故选用B1、C1，最终确定的提取工艺为A2B1C1，即6倍量75%的乙醇浸渍6小时进行常压渗漉。

[0121] 1.3.3.6验证实验

[0122] 为了验证上述结果的准确性，保证提取工艺的合理可行，按照上述确定的最佳提取工艺条件进行验证试验，结果见表6。

[0123] 表6验证试验结果

[0124]

[0125] 验证实验结果表明:此提取工艺科学、合理、可行。

[0126] 1.3.4药液的纯化

[0127] 渗漉液需要进一步的纯化，考虑的实际的可行性，本部分拟采用离心法（不同离心时间）及自然沉降法进行除杂考察，并以结合型蒽醌、番泻苷A、和厚朴酚及厚朴酚为评价指标，以确定最佳除杂工艺，实验结果见表7。

[0128] 表7纯化实验结果

[0129]

[0130] 由以上结果可以看出，离心法和自然沉降法对上述各指标的损失差异并不显著，但从大生产的角度考虑，自然沉降法成本最低且更易操作，故最终确定的纯化工艺为自然沉降24h。

[0131] 1.3.5药液的浓缩实验

[0132] 渗漉液经自然沉降24h后，上清液采用减压浓缩的方式进行浓缩，因为主要有效成分结合型蒽醌及厚朴酚等易受温度的影响[8]，故对减压浓缩的温度进行考察，实验结果见表8。

[0133] 表8减压浓缩温度考察结果

[0134]

[0135] 由上述实验结果可以看出，温度对结合型蒽醌、厚朴酚等都有影响，温度越高，损失的越多。当浓缩温度为30℃时，达到药液的要求浓度所需的时间较长，即受热时间增长，所以与40℃相比损失的更多，故实验最终确定的浓缩温度为40℃。

[0136] 1.3.6小结与讨论

[0137] 通过上述实验研究，最终确定的药液提取工艺为：生大黄、厚朴、枳实粉碎成粗粉，加6倍量75%的乙醇浸渍6小时，常压渗漉，渗漉液自然沉降24h,于40℃减压浓缩。

[0138] 2.成型工艺考查

[0139] 透皮贴剂由膜聚合物、骨架材料，压敏胶等物质组成，分为膜控释型、黏胶分散型、骨架扩散型等，各种类型透皮贴剂的药库中又含有不同的基质，在目前的研究报告中,还没有公认的成型工艺衡量指标,基质处方也各不相同。本实验研究的本发明药物贴剂由固体药粉及药液两部分共同发挥作用，故药粉及药液的载药量、药液的浓度、药液的含醇量、药粉的粉碎粒度对药物的透过率显得尤为重要，所以需要进一步通过离体透皮试验进行考察，具体方法如下：

[0140] 2.1药材、仪器、试药及动物

[0141] 药材大黄、厚朴等药材均购于成都市新荷花饮片公司，经鉴定及含量测定都符合[7]药典标准 。

[0142] 仪器岛津高效液相色谱仪（LC-20A成都安恒达科技有限公司），TK-12B型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司），赛多利斯电子天（Bp211DAG德国Sartorius），超声波清洗器（CX-100北京医疗设备二厂），打粉机（上海久品工贸有限公司）。

[0143] 药品与试剂

[0144] 药品番泻苷A对照品（批号：A0182，纯度≥98%成都曼思特生物科技有限公司）。

[0145] 试剂氮酮（化学纯CP）、硫化钠、水合氯醛、生理盐水由成都市科龙化工试剂厂生产；苯扎溴铵溶液由南昌白云药业有限公司生产。

[0146] 95%乙醇、冰乙酸、甲醇、石油醚（60～90）等由成都市科龙化工试剂厂生产。

[0147] 甲醇为色谱甲醇，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

[0148] 动物SD大鼠，♀♂兼有，体重（150±10）g，成都达硕生物科技有限公司提供，合格证号：SCXK（川）2008-24。

[0149] 2.2离体透皮试验方法

[0150] 2.2.1离体皮肤的制备

[0151] 大鼠经腹腔注射10%水合氯醛（生理盐水配制）麻醉，以8%硫化钠溶液涂于腹部皮肤，1min后用蒸馏水洗净，饲养24h,麻醉后活体剥取腹部皮肤。将皮肤平铺与洁净玻璃板上，角质层朝下，小心除去皮下脂肪和粘连物，用生理盐水洗净，经0.1%新洁而灭溶液浸泡0.5h，再用生理盐水洗净，置于培养皿中，加少量生理盐水，于4℃冰箱密封保存，7天内[9、10]用完 （见附图2）。

[0152] 2.2.2透皮试验

[0153] 将鼠皮取出，用滤纸吸干表面的生理盐水，常温下放置备用，将皮肤固定于改良[11]Franz扩散池上 （见附图3），使角质层面向上，将药粉、药液加于鼠皮上，接受室加满扩散介质，夹层以37℃水浴保温，磁力搅拌子以200r/min的速度搅拌，分别于2h、4h、6h、8h、
10h、12h取出1ml接收液（同时补加等量生理盐水），进样测定番泻苷A的含量。再按下列公式计算累积渗透量:

[0154] Q=Cn V/A Cn＝C1+C2+C3+…………+Cj

[0155] 式中Q为累积渗透量,A为接收池面积,V为接收池容积,j=2,4,6,8,10,12。在本2
实验中,V=13.5mL,A=3.142cm。

[0156] 2.2.3含量测定

[0157] 供试品溶液的制备将取出的接收液置于蒸发皿中，于60℃水浴挥干，残渣加甲醇溶解，并转移置10ml容量瓶中，定容，混匀，即得。

[0158] 按照1.3.3项下HPLC法测定番泻苷A含量的方法进行测定，计算番泻苷A的含量。

[0159] 本节所有离体试验都按上述方法进行操作，具体考察内容如下：

[0160] 2.3载药量实验

[0161] 要保证贴剂的疗效，载药量显得尤为重要，故需对本贴剂的载药量进行考察。由于离体透皮试验每次的样品取样量很少，很难准确的测定结合型蒽醌及番泻苷A、和厚朴酚、厚朴酚的含量，故以主要有效成分的代表物质番泻苷A为评价指标，用正交试验进行载药量的考察。

[0162] 分别以提取液浓度、药液载药量、药粉载药量为考察因素，进行L9(34)试验，各因素水平见表9。

[0163] 表9正交实验因素水平

[0164]

[0165] 正交试验结果见表10。

[0166] 表10正交实验安排结果（n=3）

[0167]

[0168] 方差分析结果见表11。

[0169] 表11方差分析结果

[0170]

[0171] 由方差分析结果知，主要的影响因素为提取液的浓度（A），药液载药量（B）及药粉载药量（C）影响不显著，考虑到药粉和药液的接触性及实际的可操作性，最终确定为A1B2C1，即药液浓度为1g/ml,药液载药量为2ml,药粉载药量为1g。

[0172] 2.4药液乙醇浓度考察

[0173] 乙醇浓度对药物的透皮吸收影响较大[12、13]，且一般药液存储过程中易发生霉变等现象，而适量的乙醇既有利于透皮吸收，又可达到防腐的目的，所以需要对本药液的乙醇浓度进行考察。

[0174] 查阅文献知乙醇的防腐浓度为20%以上，但是浓度过高的乙醇药液会对患者造成过敏性或刺激性，故我们的乙醇浓度考察范围为20～30%。

[0175] 不同浓度乙醇药液的制备参考1.3.3项下供试药液的制备方法，用不同浓度的乙醇进行配制，即得。

[0176] 以番泻苷A为评价指标，采用离体透皮实验进行考察，其中药液浓度为1g/ml,药液载药量为2ml,药粉载药量为1g，实验结果见表12。

[0177] 表12药液乙醇浓度考察结果(n=3)

[0178]

[0179] 由上述实验结果可知，含25%乙醇的药液渗透效果较好，故药液的乙醇浓度定为25%。

[0180] 2.5药粉的粒度考察

[0181] 本制剂由药粉和药液两部分组成，药粉需要药液的溶解才能发挥药效，故药粉的粒度也是影响透皮吸收效果的主要因素，需对其进行考察。

[0182] 以番泻苷A为评价指标，采用离体透皮实验进行考察，其中含25%乙醇药液的浓度为1g/ml,药液载药量为2ml,药粉载药量为1g，实验结果见表13。

[0183] 表13药粉粒度考察结果

[0184]

[0185] 由上述实验结果可知：药粉粉碎为最细粉时，透皮吸收效果较好，故药粉粒度定为最细粉。

[0186] 2.6芒硝的溶解研究

[0187] 本品为硫酸盐类矿物芒硝族芒硝，经加工精制而成的结晶体[14]，本实验选用直接溶解芒硝法，将芒硝溶解于药液中，故芒硝的加入量成为实验考察的因素。

[0188] 硫酸钠的溶解度曲线见附图4。由图可见，芒硝溶解度与温度呈正相关，但芒硝在乙醇中的溶解度远小于在水中的溶解度，本贴剂中药液含有25%的乙醇，故对芒硝的溶解量进行考查。

[0189] 经实验证明在10℃～30℃之间，芒硝在提取液中的溶解度差异不大，其溶解量为10g/100ml～25g/100ml，故大生产中可根据实际情况在药液中加入10～25%的芒硝即可。

[0190] 2.7促透剂氮酮的浓度考察

[0191] 常用的透皮吸收促进剂主要有天然促透剂（萜类、精油及内酯等）；合成促透剂（二甲基亚砜、二甲基亚酰胺、吡咯烷酮类、磷脂及磷酸盐类、有机酸及酯类、酞胺类等）,其中最具代表性的是月桂氮酮(氮酮,Azone)[15-17]。氮酮不仅能够促进多数亲水性和疏水性化合物的透皮吸收,而且适用于化学成分比较复杂的中药贴剂，故本研究选择氮酮作为透皮吸收促进剂，并通过透皮试验确定氮酮的最佳用量[18]。

[0192] 以番泻苷A为评价指标，采用离体透皮实验进行考察，其中含25%乙醇药液的浓度为1g/ml,药液载药量为2ml,药粉为最细粉，药粉载药量为1g，实验结果见表14。

[0193] 含氮酮药液的制备参照1.4.3项下相关方法制备，用25%乙醇配制成1g/ml的药液，加入氮酮分别配制成0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%的含氮酮药液。

[0194] 表14氮酮浓度考察结果（n=3）

[0195]

[0196] 以时间为横坐标，番泻苷A累积渗透量为纵坐标作图，得番泻苷A渗透方程及渗透曲线，结果见表15。

[0197] 表15番泻苷A渗透方程

[0198]

[0199] 由表15知，当氮酮含量为2%时透皮效果较好，故药液中促透剂氮酮的含量定为2%。

[0200] 2.8验证实验

[0201] 通过上述正交实验，单因素实验确定了载药量、药液乙醇浓度、氮酮含量等，为了验证实验结果的正确性、合理性，进行验证实验。

[0202] 以番泻苷A为评价指标，进行离体透皮实验，其中含25%乙醇药液的浓度为1g/ml,其中氮酮浓度为2%，药液载药量为2ml；药粉为最细粉，药粉载药量为1g，实验结果见表16。

[0203] 表16验证实验结果

[0204]

[0205] 验证实验结果表明以上实验结果科学，合理可行。

[0206] 2.9药粉的制备

[0207] 2.9.1粉碎

[0208] 按1∶1的比例取生大黄、芒硝适量，粉碎成最细粉，混合均匀。

[0209] 2.9.2灭菌处理

[0210] 对混合均匀的药粉进行0.5h紫外照射，进行灭菌处理。

[0211] 2.9.3分装

[0212] 将灭菌后的药粉封装于药贴中，每贴装1g。

[0213] 2.10小结与讨论

[0214] 通过本部分实验研究最终确定的本发明药物贴剂制备工艺为：

[0215] 按3∶1.5∶1的比例分别称取生大黄、厚朴、枳实适量，粉碎成粗粉，加6倍量75%的乙醇浸渍6h，进行常压渗漉，渗漉液自然沉降24h，取上清液于40℃减压浓缩至无醇味，用25%乙醇配制成1g/ml的药液，加10～25%的芒硝使其溶解，加2%氮酮，即得药液。
按1∶1的比例称取适量生大黄、芒硝，粉碎成最细粉，混合均匀，灭菌，封存于胶贴中即可。

[0216] 本发明为均匀一致的棕黄色贴剂，气清香；药液为棕褐色，气微香。

[0217] 功能主治：清除宿便，用于便秘及便秘引起的肥胖。

[0218] 用法用量：每日一贴。揭去盖衬，将药液滴在药粉上，贴于肚脐。

[0219] 实施例2本发明药物贴剂的含量测定

[0220] 1番泻苷A含量测定

[0221] (1)仪器与试药

[0222] 岛津LC-20A高效液相色谱仪，超声波清洗器CX-100（北京医疗设备二厂），赛多利斯Bp211DAG电子天平（德国Sartorius），SHD-Ⅲ型循环水式多用真空泵（保定高新区阳光科教仪器厂）。

[0223] 乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

[0224] 番泻苷A对照品(批号：A0182，纯度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司)。

[0225] (2)色谱条件

[0226] 色谱柱：Comatex-C18柱(5μm，250mm×4.6mm)

[0227] 流动相:预试验中比较了不同流动相，不同比例的乙腈-水、甲醇-水（80：20）、甲醇-水（70：30）、甲醇-水（60：40）、甲醇-水（50：50）的分离效果，最后选择了甲醇-水（50：50）为流动相。

[0228] 流速:0.5ml/min；

[0229] 检测波长：340nm；

[0230] 柱温：30℃。

[0231] (3)对照品溶液的制备

[0232] 取番泻苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml约含50ug番泻苷A对照品，即得。

[0233] (4)供试品溶液的制备

[0234] 精密吸取药液0.5ml，挥干溶剂，残渣加甲醇溶解并定容置10ml量瓶中，即得。

[0235] (5)阴性样品溶液的制备

[0236] 取大黄阴性样品，照供试品制备方法制备，即得。

[0237] 对照品、对照品阴性、供试品阴性及供试品的高效液相色谱图见附图5～图8。

[0238] （6）线性关系考察

[0239] 精密吸取番泻苷A对照品溶液（0.058mg/ml）分别进样0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5ul测定峰面积，结果见表17。

[0240] 表17线性范围考察结果

[0241]

[0242] 以番泻苷A对照品进样量为横坐标，对应的峰面积值为纵坐标绘制曲线，得曲线2
回归方程为Y=1E+06X-1518.2,R=0.9996,表明番泻苷A在0.0116～0.0870ug间具有良好的线性关系。

[0243] （7）精密度试验

[0244] 精密吸取番泻苷A对照品溶液10ul，重复进样6次，记录峰面积，结果见表18。

[0245] 表18精密度试验结果

[0246]

[0247] 试验结果表明：RSD为0.13%，小于2%，所以仪器精密度良好。

[0248] （8）稳定性试验

[0249] 分别取同一对照品溶液及同一供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h进样10μl，记录峰面积，结果见表19、20。

[0250] 表19对照品稳定性试验结果

[0251]

[0252] 表20样品稳定性试验结果

[0253]

[0254] 试验结果表明:对照品RSD为0.16%，样品RSD为0.65%，且都小于2%，所以对照品溶液和样品溶液在12小时内稳定。

[0255] （9）重复性试验

[0256] 取同一批样品6份，按供试品溶液制备方法制备，分别进样10μl，记录峰面积值，计算含量，结果见表21。

[0257] 表21样品重复性试验结果

[0258]

[0259] 试验结果表明：样品RSD为0.77%，小于2%，所以重复性良好。

[0260] （10）加样回收率试验

[0261] 取9份已知含量的样品粉末约1.5g，精密称定，按照药液制备方法制备成药液，并按上述供试品溶液的制备方法制备成供试品，分别加入番泻苷A对照品溶液三种不同剂量（0.058mg/ml,12ml、15ml、18ml），平行三份，进样10μl，测定峰面积，计算回收率，结果见表22。

[0262] 表22加样回收率试验结果

[0263]

[0264] 试验结果表明：9次实验的加样回收率测定结果均在90～96%之间，其平均回收率为91.99%，RSD为1.92%,小于2%，所以加样回收良好。

[0265] (11)样品含量测定

[0266] 分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20ul，按照上述色谱条件进行测定，记录谱峰面积值并计算含量，结果见表23。

[0267] 表23含量测定结果

[0268]

[0269] 由含量测定结果可知:三批样品的番泻苷A平均含量为5.614mg/g，暂定本品药液番泻苷A含量不低于4.490mg/g。

[0270] 2厚朴酚、和厚朴酚含量测定

[0271] (1)仪器与试药

[0272] 岛津LC-20A高效液相色谱仪，赛多利斯电子天平（Bp211DAG德国Sartorius），SHD-Ⅲ型循环水式多用真空泵（保定高新区阳光科教仪器厂），超声波清洗器CX-100（北京医疗设备二厂）。

[0273] 甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

[0274] 厚朴酚对照品（批号：110729-200309，中国药品生物制品检定所）、和厚朴酚对照品（批号：0730-200206，中国药品生物制品检定所）。

[0275] (2)色谱条件

[0276] 参照《中国药典》（2010版）一部项下相关规定测定。

[0277] 色谱柱：Comatex-C18柱(5μm，250mm×4.6mm)

[0278] 流动相:甲醇-水（78:22）

[0279] 流速:1ml/min；

[0280] 检测波长：294nm；

[0281] 柱温：35℃。

[0282] (3)对照品溶液的制备

[0283] 取厚朴酚、和厚朴酚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含厚朴酚28ug、和厚朴酚30ug的溶液，即得。

[0284] (4)供试品溶液的制备

[0285] 精密吸取药液0.5ml，挥干，残渣加甲醇溶解并定容置25ml容量瓶中，即得。

[0286] (5)阴性样品溶液的制备

[0287] 取厚朴阴性样品，参照供试品制备方法制备，即得。

[0288] 对照品、对照品阴性、供试品阴性及供试品的高效液相色谱图见附图9～图12。

[0289] （6）线性关系考察

[0290] 精密吸取和厚朴酚对照品溶液（30.512ug/ml）、厚朴酚对照品溶液（28.320ug/ml）进样1ul、2ul、4ul、6ul、8ul，测定峰面积，结果见表24、25。

[0291] 表24和厚朴酚线性范围考察结果

[0292]

[0293] 表25厚朴酚线性范围考察结果

[0294]

[0295] 分别以和厚朴酚、厚朴酚对照品进样量为横坐标，其对应的峰面积值为纵坐标2
绘制曲线，得和厚朴酚回归方程为：Y=3E+06X-1578,R=1,表明和厚朴酚在0.03051～
2
0.24410ug间具有良好的线性关系。厚朴酚的回归方程为：Y=6E+06X-9627,R=0.9998,表明厚朴酚在0.02832～0.22656ug间具有良好的线性关系。

[0296] （7）精密度试验

[0297] 精密吸取上述对照品溶液10ul，重复进样6次，记录峰面积，结果见表26、27。

[0298] 表26和厚朴酚精密度试验结果

[0299]

[0300] 表27厚朴酚精密度试验结果

[0301]

[0302] 试验结果表明：RSD均小于2%，所以仪器精密度良好。

[0303] （8）稳定性试验

[0304] 取同一对照品及同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12小时进样10μl，记录峰面积值，结果见表28、29、30。

[0305] 表28和厚朴酚对照品稳定性试验结果

[0306]

[0307] 表29厚朴酚对照品稳定性试验结果

[0308]

[0309] 表30供试品稳定性试验结果

[0310]

[0311] 试验结果表明:对照品及供试样品RSD均小于2%，所以对照品溶液和供试样品溶液在12小时内稳定。

[0312] （9）重复性试验

[0313] 取同一批样品6份，分别按供试品溶液的制备方法制备，进样10μl，记录峰面积，计算含量，结果见表31。

[0314] 表31供试品重复性试验结果

[0315]

[0316] 试验结果表明：样品RSD小于2%，所以重复性良好。

[0317] （10）加样回收率试验

[0318] 取9份已知含量的样品粉末约1.5g，精密称定，制备成药液，按供试品制备方法制备成供试品，分别加入和厚朴酚对照品溶液（30.512ug/ml）、厚朴酚对照品溶液（28.320ug/ml）三个不同量，平行三份，进样10μl，测定峰面积值，计算回收率，结果见表32、33。

[0319] 表32供试品中和厚朴酚加样回收率试验结果

[0320]

[0321] 表33供试品中厚朴酚加样回收率试验结果

[0322]

[0323] 试验结果表明：和厚朴酚3种不同水平，9次实验的加样回收率测定结果均在90～96%之间，其平均回收率为92.99%，RSD为1.26%,表明加样回收良好；

[0324] 厚朴酚3种不同水平，9次实验的加样回收率测定结果均在87～95%之间，其平均回收率为90.87%，RSD为1.67%，表明加样回收良好。

[0325] (11)样品含量测定

[0326] 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，依上述色谱条件进行测定，记录色谱峰面积值，计算含量，结果见表34。

[0327] 表34含量测定结果

[0328]

[0329] 由测定结果可知:三批样品的和厚朴酚平均含量为46.676mg/g，厚朴酚平均含量为52.290mg/g，所以暂定本品药液和厚朴酚含量不低于37.340mg/g，厚朴酚含量不低于41.830mg/g。

[0330] 实施例3本发明药物贴剂的制备

[0331] 1)按3:1.5:1的比例分别称取生大黄、厚朴、枳实，粉碎成粗粉，加75%乙醇浸渍6小时，进行常压渗漉，渗漉液自然沉降，取上清液于40℃减压浓缩至无醇味，用25%乙醇配制成1g/ml的药液，加药液重量10～25%的芒硝使其溶解，再加药液重量2%氮酮，即得浓度为原生药材计1g/ml的药液；

[0332] 2)按1∶1的比例称取生大黄、芒硝，粉碎成最细粉，混合均匀，灭菌，即得药粉；

[0333] 3)将药粉封存于透气性胶贴中，药液灌装，制备成贴剂。

[0334] 其中，药液的载药量为1-3ml，浓度以原生药材计为1-2g/ml，药粉载药量为1-3g。

[0335] 实施例4本发明药物膏剂的制备

[0336] 取生大黄300g、厚朴150g、枳实100g、芒硝10g，直接打粉，加入基质制备成外用膏剂。

[0337] 实施例5本发明药物贴剂的制备

[0338] 取生大黄100g、厚朴50g、枳实50g、芒硝5g，按实施例3的方法制备成贴剂。

[0339] 实施例6本发明药物贴剂的制备

[0340] 取生大黄500g、厚朴300g、枳实150g、芒硝40g，按实施例3的方法制备成贴剂。

[0341] 以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。

[0342] 试验例1本发明药物泻下实验

[0343] 1.仪器、试药及动物

[0344] 仪器小鼠灌胃器、自制小鼠代谢笼（实用新型专利，专利号：CN201146735）、滤纸、计时手表，电子天平（德国Sartorius公司）。

[0345] 药品复方地芬诺酯（国药准字：H34021501合肥久联制药有限公司）、麻仁丸（湖北诺得胜制药有限公司）。

[0346] 试剂氮酮（化学纯CP）、硫化钠都由成都市科龙化工试剂厂生产，生理盐水由四川科伦药业股份有限公司生产。

[0347] 动物健康昆明种小鼠（清洁级），雌雄各半，体重18～22g，购于四川达硕实验动物中心，动物生产许可证号SCXK(川)2008-24。

[0348] 2.试验场所

[0349] 成都中医药大学中药炮制实验室（国家中医药管理局三级实验室）；成都中医药大学药学院中药药理实验动物观察室，许可证号：川实动管使第15号。

[0350] 3.统计方法

[0351] 实验数据以平均值±标准差 表示，组间差异的显著性检验运用SPSS软件提供的单因素方差分析方法进行分析。

[0352] 4.药物的制备

[0353] 供试药物的制备分别称取生大黄、厚朴、枳实各300g、150g、100g,粉碎成粗粉，按照药液制备工艺制备，分别配制为低、中、高三种浓度（0.5g/ml、1g/ml、2g/ml）的药液适量。称取生大黄、芒硝各50g，粉碎成最细粉，混合均匀，分别制成低、中、高（0.25g、0.5g、1g）三种剂量的胶贴。

[0354] 模型药的配制复方地芬诺酯，每片含盐酸地芬诺酯2.5mg，用时取适量配制成[19、20]0.5mg/ml备用 。

[0355] 阳性药的配制麻仁丸，使用时取30g，配制成0.5g/ml备用。

[0356] 墨汁的制备阿拉伯树胶10g加水80ml，煮沸至溶液透明，取活性炭5g，加入上述溶液煮沸3次，待溶液凉后，加水定容至100ml，4℃冰箱保存，临用前摇匀。

[0357] 5.试验过程

[0358] 5.1分组

[0359] 取健康昆明小鼠50只，雌雄各半，按体重随机分成5组，即模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组及阳性组，每组10只。

[0360] 5.2脱毛

[0361] 实验前对小鼠进行脱毛处理，将8%硫化钠涂于小鼠腹部，1min后，用干净的蒸馏水清洗皮肤，正常饲养24h。

[0362] 5.3实验方法

[0363] 实验前禁食不禁水12h，各组分别灌胃给予复方地芬诺酯50mg/kg，1h后，各组迅速灌胃给予墨汁并各自给药且分笼饲养，模型组给予空白贴剂，低、中、高剂量组给予相应[21]药物，阳性组灌胃麻仁丸药液5g/kg 。

[0364] 5.4观察指标

[0365] 从给药开始计时，连续观察10h，记录各动物首次排黑便时间及10h累积排便数。

[0366] 6.试验结果

[0367] 统计小鼠首次排黑便时间及10小时累积排便数，结果见表35。

[0368] 表35泻下实验结果表

[0369]

[0370] 注：与模型组比较，P<0.05﹡，P<0.01★

[0371] （1）由方差分析结果知，正常对照组与模型组对比，首次排黑便时间P>0.05，10h累积排便数P<0.01，即对于首次排黑便实验来说，造模不成功，但对于累积排便数来说造模成功。

[0372] （2）分别将低、中、高剂量组及阳性组与模型组进行了比较，由方差分析结果知：对首次排黑便时间来说，低、中、高剂量组都有显著性差异，P<0.01，阳性组也有显著性差异P<0.01。

[0373] 对于10h累积排便数来说，低剂量组与模型组对比没有统计学意义，中剂量组有统计学差异，P<0.05，高剂量组及阳性组有显著性差异P<0.01。

[0374] （3）分别将各给药组与正常对照组进行比较，由方差分析知，对于首次排黑便来说，低剂量组P=0.437>0.05，没有统计学意义，中剂量组、高剂量组及阳性组都有显著性差异，P<0.01。

[0375] 试验例2本发明药物肠推进实验

[0376] 1.仪器、试药及动物

[0377] 仪器小鼠灌胃器、手术剪、眼科镊、直尺，电子天平（德国Sartorius公司）。

[0378] 药品复方地芬诺酯（国药准字：H34021501合肥久联制药有限公司）、麻仁丸（湖北诺得胜制药有限公司）。

[0379] 试剂氮酮（化学纯CP）、硫化钠由成都市科龙化工试剂厂生产，生理盐水由四川科伦药业股份有限公司生产。

[0380] 动物健康昆明种小鼠（清洁级），雌雄各半，体重18～22g，购于四川达硕实验动物中心。动物生产许可证号SCXK(川)2008-24。

[0381] 2.试验场所

[0382] 成都中医药大学中药炮制实验室（国家中医药管理局三级实验室）；成都中医药大学药学院中药药理实验动物观察室，许可证号：川实动管使第15号。

[0383] 3.统计方法

[0384] 实验数据以平均值±标准差 表示，组间差异的显著性检验运用SPSS软件提供的单因素方差分析方法。

[0385] 4.供试药物的制备

[0386] 供试药物的制备同上一节中第4项下操作。

[0387] 5.试验过程

[0388] 5.1分组

[0389] 取健康昆明小鼠50只，雌雄各半，按体重随机分成6组，即模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组及阳性组，每组10只。

[0390] 5.2脱毛

[0391] 实验前对小鼠进行脱毛处理，将8%硫化钠涂于小鼠腹部，1min后，用蒸馏水清洗皮肤，正常饲养24h。

[0392] 5.3实验方法

[0393] 实验前禁食不禁水12h，各组灌胃给予复方地芬诺酯5mg/kg，30min后，各组迅速灌胃给予墨汁并各自给药，模型组给予空白贴剂，低、中、高剂量组给予相应的药物，阳性组[22-24]灌胃麻仁丸药液5g/kg 。

[0394] 5.4观察指标

[0395] 给药25min后立即处死，剖腹取出从幽门回部至回盲部的全部小肠，剪去肠系膜，将小肠轻轻拉直，平铺于白纸上，测量并记录墨汁推进长度，计算墨汁推进百分率。

[0396]

[0397] 6.试验结果

[0398] 统计小鼠的小肠总长度、墨汁在肠内推进长度和推进率，结果见表36。

[0399] 表36肠推进结果表

[0400]

[0401] 注：与模型组对比，P<0.05﹡，P<0.01★

[0402] （1）由方差分析结果知，正常对照组与模型组对比，P=0.033<0.05，所以造模成功。

[0403] （2）分别将低、中、高剂量组及阳性组与模型组进行了比较，由方差分析结果知：低剂量组P=0.096>0.05，没有统计学意义，中剂量组P=0.024<0.05，有统计学差异，高剂量组及阳性组有显著性差异P<0.01。

[0404] （3）分别将各给药组与正常对照组进行比较，由方差分析知，各给药组均没有统计学意义。

[0405] 本发明药物贴剂确实能缩短便秘小鼠的首次排便时间，且效果优于麻仁丸组，中、高剂量组亦可缩短正常小鼠首次排便时间；本发明药物贴剂亦可增加便秘小鼠的累积排便数及小肠推荐率，经药效试验证明本贴剂对便秘小鼠泻下作用确切。

[0406] 以下通过皮肤刺激性及过敏性试验证明本发明的安全性。

[0407] 试验例3本发明药物皮肤刺激性实验

[0408] 1.仪器、试药及动物

[0409] 仪器手术剪，电子天平（德国Sartorius公司）。

[0410] 试剂硫化钠（成都市科龙化工试剂厂生产）。

[0411] 动物家兔，雌雄各半，雌性无孕，体重1800±100g，动物生产许可证号SCXK(川)2008-24，购于四川达硕实验动物中心。

[0412] 2.试验场所

[0413] 成都中医药大学中药炮制实验室（国家中医药管理局三级实验室）；成都中医药大学药学院中药药理实验动物观察室，许可证号：川实动管使第15号。

[0414] 3.统计方法

[0415] 组间比较采用SPSS软件的χ2检验。

[0416] 4.供试药物

[0417] 用中试产品进行试验。

[0418] 5.单次给药皮肤刺激性实验方法

[0419] 取8只家兔，雌雄各半，分为完整皮肤组，破损皮肤组，每组4只，采用同体自身左右对比进行实验。给家兔背部脊柱两侧去毛，脱毛面积约为7cm×7cm。去毛后24h检查去毛皮肤是否受伤，受伤家兔不宜做完好皮肤的毒性试验。

[0420] 破损皮肤的制作：采用一次性注射器针头在脱毛区消毒皮肤上划出“＃”形切口，[25]长、宽各约5cm，深度为2～3mm，以不损伤皮下组织并有渗血为度 。

[0421] 动物左侧去毛区贴本发明药物贴剂,右侧去毛区贴空白贴剂。给药8h后,用温水去除残留受试物,去除受试物后1h、24h、48h、72h肉眼观察并记录施药处有无红斑、水肿[26、27］等情况,按《皮肤刺激性反应评分标准》 进行评分，计算各组动物反应平均分值。根据[26、27］
《皮肤刺激性强度评价标准》 对皮肤刺激性强度进行评价。《皮肤刺激性反应评分标准》见表37，《皮肤刺激性强度评价标准》见表38，实验结果见表39。

[0422] 反应平均分值=（红斑形成总分+水肿形成总分）/动物数

[0423] 表37皮肤刺激反应评分标准

[0424]

[0425] 表38皮肤刺激性强度评价标准

[0426]

[0427] 6.多次给药皮肤刺激性实验方法

[0428] 方法同一次给药试验,但是每天给药1次,连续给药1周。去除受试物后1、24、48、72h肉眼观察,记录各组受试物和基质的平均反应分值,按《皮肤刺激性反应评分标准》进行评分，计算各组动物反应平均分值。根据《皮肤刺激性强度评价标准》对皮肤刺激性强[28]
度进行评价 ，实验结果见表39。

[0429] 7.试验结果

[0430] （1）单次给药皮肤刺激性试验结果

[0431] 表39本发明药物贴剂单次用药对皮肤刺激的平均反应分值

[0432]

[0433] ①本发明药物贴剂与空白贴剂一次给药的平均反应分值差异无统计学意义(P>0.05)。

[0434] ②对完整皮肤组动物,本发明药物贴剂与空白贴剂的平均反应分值均<0.5分,表明两者对正常皮肤无刺激性；

[0435] ③对破损皮肤组动物,本发明药物贴剂的平均反应分值在用药后1h和24h均≥0.5分,但<2.99分,表明本发明药物贴剂对破损皮肤有轻度刺激性，给药72h后,刺激性消失，空白贴剂的平均反应分值在用药后1h时≥0.5分，但<2.99分,表明空白贴剂对破损皮肤有轻度刺激性，给药48h后,刺激性消失。

[0436] （2）多次给药皮肤刺激性试验结果

[0437] 表40本发明药物贴剂多次给药对皮肤刺激性的平均反应分值

[0438]

[0439] ①本发明药物贴剂与空白贴剂多次给药的平均反应分值差异无统计学意义(P>0.05)。

[0440] ②对完整皮肤组动物,本发明药物贴剂与空白贴剂用药1h后的平均反应分值均≥0.5分,表明两者对正常皮肤有轻度刺激性，用药24h后刺激性消失；

[0441] ③对破损皮肤组动物,本发明药物贴剂的平均反应分值在用药后1h和24h均≥0.5分,但<2.99分,表明本发明药物贴剂对破损皮肤有轻度刺激性，给药72h后,这种刺激性消失；空白贴剂的平均反应分值在用药后1h时>0.5分，但<2.99分,表明空白贴剂对破损皮肤有轻度刺激性，给药48h后,这种刺激性消失。

[0442] 试验例4本发明药物皮肤过敏性实验

[0443] 1.仪器、试药及动物

[0444] 仪器手术剪，电子天平（德国Sartorius公司）。

[0445] 药品2,4-二硝基氯苯

[0446] 试剂硫化钠由成都市科龙化工试剂厂生产。

[0447] 动物家兔，雌雄各半，雌性无孕，体重1800±100g，购于四川达硕实验动物中心。动物生产许可证号SCXK(川)2008-24。

[0448] 2.试验场所

[0449] 成都中医药大学中药炮制实验室（国家中医药管理局三级实验室）；成都中医药大学药学院中药药理实验动物观察室，许可证号：川实动管使第15号。

[0450] 3.统计方法2

[0451] 组间比较采用SPSS软件，采用χ 检验。

[0452] 4.供试药物

[0453] 用中试产品进行试验。

[0454] 5.试验方法

[0455] （1）分组及皮肤制备取家兔18只，随机分为3组（空白组、本发明药物贴剂组、阳性组），每组6只，雌雄各半。于给药前24h将家兔背部脊柱两侧去毛，脱毛面积为7cm×7cm。

[0456] （2）致敏接触取受试物给予动物左侧脱毛区，本发明药物贴剂组给予本发明药物贴剂,空白组给予空白贴剂,阳性对照组给予1%2,4-二硝基氯苯0.1m,持续8h,第7天[29、30]和第14天以同样方法重复1次,共给药3次 。

[0457] （3）激发接触于末次给受试物致敏后14d,将受试物分别施于相应动物的右侧脱毛区,8h后去掉受试物,即刻观察,并于24h、48h、72h再次观察皮肤过敏反应情况,按[26、27］《皮肤过敏反应程度的评分标准》 进行评分，计算各组动物反应平均分值（见表41）。注意观察动物是否有哮喘、休克或站立不稳等严重的全身变态反应。根据《皮肤过敏性评价标[26、27］
准》 按致敏发生率推断致敏性（见表42）

[0458] 反应平均分值=（红斑形成总分+水肿形成总分）/动物数

[0459] 致敏反应发生率=有过敏反应动物数/动物总数×100%

[0460] 表41皮肤过敏反应程度的评分标准

[0461]

[0462] 表42皮肤致敏性评价标准

[0463]

[0464] 6.试验结果

[0465] 本发明药物贴剂对家兔皮肤过敏性试验结果见表43、表44。

[0466] 表43本发明药物贴剂对家兔皮肤致敏反应平均分值

[0467]

[0468] 表44本发明药物贴剂对家兔皮肤致敏率的影响（%）

[0469]

[0470] ①空白组未见红斑、水肿等皮肤变态反应情况；

[0471] ②本发明药物贴剂组仅有个别动物即刻有中度红斑反应，致敏率为30%，48h后反应消退；

[0472] ③阳性对照组出现明显的红斑、水肿等皮肤变态反应情况，致敏率达到100%。

[0473] 3组家兔均未出现哮喘、站立不稳或休克等严重的全身变态反应。

[0474] 从皮肤刺激性和过敏性实验结果可知：本药物对完整皮肤无刺激性，对破损皮肤有轻度刺激性，但可自行消失；对皮肤有轻度致敏性，但可自行消失，证明了本发明贴剂的安全性较高。

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