一种结合FAP的多肽转让专利
申请号 : CN201210525814.8
文献号 : CN102977189B
文献日 : 2014-04-16
发明人 : 刘敏
申请人 : 首都医科大学附属北京朝阳医院
摘要 :
本发明公开了一种结合FAP的多肽，所述的多肽是通过从噬菌体环七肽库中筛选得到的，所述的多肽能特异性的结合成纤维细胞活化蛋白且具有高亲活性，其序列为SCDYNHHWC。得用该多肽可以制备针对肿瘤基质的广谱探针，可以满足在肿瘤分子成像和肿瘤靶向治疗等方面的应用。
权利要求 :
1.一种特异性结合FAP的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为：SCDYNHHWC。
2.权利要求1所述多肽在制备肿瘤分子成像试剂中的应用。
说明书 :
一种结合FAP的多肽
技术领域
[0001] 本发明涉及一种多肽，具体而言涉及一种结合FAP的多肽。
背景技术
[0002] 目前，恶性肿瘤已经逐渐取代心脑血管疾病，成为人类的头号杀手。最近统计资料表明，我国每年新发现癌症患者约2000万人，近150万人死于癌症。癌症的死亡人数占总死亡数的1/5。肿瘤的早期诊断与治疗是提高其治愈率及改善病人生存质量的关键，而如何找到和利用有效的临床手段来实现肿瘤的早期诊断因此成为了基础研究的一个热门领域。
[0003] 分子成像在肿瘤的诊断和治疗中的应用研究越来越受到重视。开发新的高亲和性和特异性分子探针是肿瘤分子成像亟待解决的一个问题。已往在寻找诊断肿瘤的分子探针的研究主要集中在筛选针对肿瘤细胞表达的特异性标志物。然而，各种肿瘤的“异质性”，使得适用于各种病理类型的肿瘤靶向分子研究至今尚未获得突破性进展。肿瘤基质作为所有肿瘤的共有成份，在促进肿瘤持续生长和侵袭等方面发挥着关键的作用。因此以肿瘤基质为靶点设计的分子探针可能成为肿瘤分子显像新的切入点。
[0004] 肿瘤基质主要是由肿瘤相关的成纤维细胞、新生的血管、各种淋巴细胞和巨噬细胞、细胞外基质蛋白及细胞因子等成份组成[Liotta LA，Kohn EC.Themicroenvironment ofthe tumor host interface.Nature，2001，411(6835)：375-379.]。而肿瘤相关的成纤维细胞(Tumor-associated fibroblasts，TAFs)占肿瘤组织的50％～90％，主要分布于肿瘤基质内、靠近肿瘤血管内皮细胞并包绕着癌巢[Loeffler M，Krüger JA，Niethammer AG，Reisfeld RA..R.Targeting tumor-associated fibroblastsimproves cancer chemotherapy by increasing intratumoral drug uptake J.Clin.Invest，2006(7)，116：1955-1962]。TAFs是非转化细胞且基因组非常稳定，与正常组织成纤维细胞差异显著，并且在各种肿瘤中的差异较小。
[0005] 成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast Activation Protein，FAP)是TAFs的核心标志物，属II型膜结合糖蛋白属于丝氨酸蛋白水解酶家族，具有二肽肽酶活性和胶原酶活性，可水解二肽肽酶、明胶和I型胶原，在脊椎动物的进化过程中高度保守。研究证明FAP表达在胚胎，间叶组织来源的肿瘤(如骨肉瘤，软组织肉瘤)、多种恶性上皮肿瘤(如肺癌、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、恶性黑色素瘤，前列腺膀胱癌、胰腺癌、皮肤癌等)的TAF中选择性表达[ParkJE，LenterMC，Zimmermann RN，Garin-Chesa P，Old LJ，Rettig WJ.1.Fibroblast ActivationProtein，a Dual Specificity Serine Protease Expressed in Reactive Human TumorStromal Fibroblasts.J Biological Chemistry，1999，274(51)：36505-36512；Lee J，Fassnacht M，Nair S，Boczkowski D，Gilboa E..Tumor Immunotherapy TargetingFibroblast Activation Protein，a Product Expressed in Tumor-AssociatedFibroblasts Cancer Research，2005，65(23)：11156-11163；Cheng JD，Valianou M，Canutescu AA，Jaffe EK，Lee HO，Wang H，Lai JH，Bachovchin WW，Weiner LM..Abrogation of fibroblast activation protein enzymatic activity attenuates tumorgrowth.，Mol Cancer Ther.2005，4(3)：351-60；Huber MA，Kraut N，Park JE，SchubertRD，Rettig WJ，Peter RU，Garin-Chesa P..Fibroblast activation protein：
differentialexpression and serine protease activity in reactive stromal fibroblasts of melanocyticskin tumors..J Invest Dermatol，2003，120(2)：182-188；
Cheng JD，Dunbrack RL Jr，Valianou M，Rogatko A，Alpaugh RK，Weiner LM.Promotion of tumor growth bymurine fibroblast activation protein，a serine protease，in an animal model.CancerRes，2005，62(16)：4767-4772；enry LR，Lee HO，Lee JS，Klein-Szanto A，Watts P，Ross EA，Chen WT，Cheng JD..Clinical implications of fibroblast activation proteinin patients with colon cancer.Clin Cancer Res，
2007，13(6)：1736-1741.]。因此，构建以FAP为靶点的分子影像探针，将在肿瘤的早期诊断、早期治疗和监测治疗效果方面发挥巨大的作用。
differentialexpression and serine protease activity in reactive stromal fibroblasts of melanocyticskin tumors..J Invest Dermatol，2003，120(2)：182-188；
Cheng JD，Dunbrack RL Jr，Valianou M，Rogatko A，Alpaugh RK，Weiner LM.Promotion of tumor growth bymurine fibroblast activation protein，a serine protease，in an animal model.CancerRes，2005，62(16)：4767-4772；enry LR，Lee HO，Lee JS，Klein-Szanto A，Watts P，Ross EA，Chen WT，Cheng JD..Clinical implications of fibroblast activation proteinin patients with colon cancer.Clin Cancer Res，
2007，13(6)：1736-1741.]。因此，构建以FAP为靶点的分子影像探针，将在肿瘤的早期诊断、早期治疗和监测治疗效果方面发挥巨大的作用。
[0006] 分子探针可以分为小分子化合物，多肽，蛋白以及抗体等。多肽类分子具有高亲和力、高特异性、血液清除快和组织穿透能力强等特点而受到广泛关注。另外其制备与修饰也相对容易，在较短时间内能获得高对比度的肿瘤影像，并几乎不存在人体免疫反应。
发明内容
[0007] 本发明 旨在 利用噬 菌体 展示环 七肽 库(Ph.D.-C7CTM Phage display peptidelibrary)，筛选对FAP具有高特异性和高亲和力的多肽序列。该多肽将有望有效解决具有广谱适用性的肿瘤靶向分子成像技术难题，为肿瘤的早期诊断提供重要手段，另外该多肽序列还有可能进一步用于肿瘤靶向治疗药物的开发。
[0008] 本发明采用逐步增加筛选压力的方法来进行特异性噬菌体的富集。具体筛选方法如下：
[0009] 以FAP包被免疫试管并于4℃度封闭过夜，TBST洗涤6次后加入噬菌体肽库，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次去除非特异结合的噬菌体，加0.2mol/LGlycine-HCl(pH2.2)1mL振 荡 10min洗 脱 特 异 结 合 的 噬 菌 体，加 150μL1mol/LTris-HCl(pH9.1)中和，取10μL洗脱产物计数噬菌体的滴度，其余洗脱产物感染大肠杆菌ER2738扩增并纯化噬菌体，得到次级库。逐步降低FAP包被浓度，再进行两轮筛选。从第三轮计数平板上随机挑到100个菌落，培养、纯化得到噬菌体后，通过噬菌体ELISA测定各株噬菌体对FAP的特异结合活性。
[0010] 噬菌体ELISA显示，其中有25株噬菌体表现出对FAP的结合活性。送这25株噬菌体测序后得到7株不同序列，分别为命名P1-P7。呈现频率最高的三种多肽共有SCD(xx)H(xx)WC序列；其中序列P3的出现频率最高(5/25)，其序列为SCDYNHHWC。
[0011] 本发明所用的缓冲液、培养基等说明如下：
[0012] PBS：磷 酸 缓 盐 冲 溶 液 (Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L，NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，pH7.4，Solarbio，China)；
[0013] PBST：(PBS，0.05％Tween20(sigma)，1％BSA(ablum bovine fraction V，WAKO)；
[0014] TBS：Tris缓冲盐溶液(50mmol/L，pH7.5，sigma)；
[0015] TBST：50mmol/L TBS+0.05％Tween20(sigma)；
[0016] 甘氨酸-HCl：0.2mol/L Glycine-HCl(pH2.2，solarbio，China)；
[0017] PEG/NaCl溶液：含20％(W/V)聚乙二醇-8000，2.5mol/L NaCl，sigma；
[0018] 封闭缓冲液：PBS+5mg/mL BSA(WAKO)
[0019] LB液体培养基：10g/L细菌培养用胰化蛋白胨(Oxford)，5g/L细菌培养用酵母提取物(Oxford)，5g/L NaCl(sigma)；
[0020] 顶层琼脂糖培养基：LB培养基+7g/L琼脂糖(sigma)；
[0021] LB/IPTG/Xgal琼脂平板：(0.05g/L isopropyl-β-D-thiogalactoside(IPTG)，0.04g/L5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside(Xgal)，15g/L琼脂粉(agar)，sigma)。
附图说明
[0022] 图1特异性噬菌体富集第一轮至第三轮噬菌体回收率；
[0023] 图2ELISA测定P3与FAP的结合。
具体实施方式
[0024] 通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。
[0025] 本发明(包括以下实施例)中涉及的噬菌体滴度测定均采用下述方法(参见TMPh.D. Phage Display Library操作手册)：
[0026] 接种E.coli ER2738单菌落于5-10ml LB液体培养基中，37℃，250rpm摇床孵育至对数中期(OD600：～0.5)；微波炉加热融化顶层琼脂糖培养基，分成3mL/份分装到灭菌试管中，每个噬菌体稀释度用一管，保存于45℃备用；37℃预温LB/IPTG/Xgal琼脂平板，每个噬菌体稀释梯度取一个平板备用；用LB培养液对噬菌体进行10倍比系列稀释(建议稀释8 11 1 4
范围：扩增的噬菌体培养物上清：10-10 ；未扩增的淘选洗脱物：10-10)；每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染；当大肠杆菌菌液达对数中期时，将菌液分成200μL等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度用一管；每管大肠杆菌菌液中分别加入10μL不同稀释倍数的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min；将噬菌体感染的大肠杆菌菌液加入45℃预温的顶层琼脂糖培养基管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal琼脂平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开：待平板冷却5min后，倒置于37℃孵箱，培养过夜；检查平板，计数约有～102个噬菌斑的平板上的斑数(噬菌体在计数时，其有效的范围是30～300)，然后，用此数目乘以稀释因子即得到每10μL噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。
范围：扩增的噬菌体培养物上清：10-10 ；未扩增的淘选洗脱物：10-10)；每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染；当大肠杆菌菌液达对数中期时，将菌液分成200μL等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度用一管；每管大肠杆菌菌液中分别加入10μL不同稀释倍数的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min；将噬菌体感染的大肠杆菌菌液加入45℃预温的顶层琼脂糖培养基管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal琼脂平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开：待平板冷却5min后，倒置于37℃孵箱，培养过夜；检查平板，计数约有～102个噬菌斑的平板上的斑数(噬菌体在计数时，其有效的范围是30～300)，然后，用此数目乘以稀释因子即得到每10μL噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。
[0027] 实施例FAP特异性多肽的筛选和鉴定
[0028] 1.材料
[0029] 噬菌体环七肽库(Ph.D.-C7CTM Phage display peptide library)：购自NEB公司，13 9
2×10 pfu/mL，多样性2.7×10，于M13噬菌体cpIII蛋白的Kpn-I、Eag-I位点之间插入外源序列，随机七肽两端的半胱氨酸形成二硫键，使呈现的随机七肽形成相对稳定的环状结构；HRP标记鼠抗M13噬菌体抗体：Abcam公司产品；FAP：sigma公司产品；其余试剂库市购。
2×10 pfu/mL，多样性2.7×10，于M13噬菌体cpIII蛋白的Kpn-I、Eag-I位点之间插入外源序列，随机七肽两端的半胱氨酸形成二硫键，使呈现的随机七肽形成相对稳定的环状结构；HRP标记鼠抗M13噬菌体抗体：Abcam公司产品；FAP：sigma公司产品；其余试剂库市购。
[0030] 2.方法和结果
[0031] 受体菌E.coli ER2738的复苏及培养：以无菌技术从E.coli ER2738的甘油冻存物中挑取一接菌环，涂布于LB-Tet平板上，37℃颠倒培养过夜后，挑取单一菌落，置于3ml含有1u g/ml Tet的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，使OD600值达0.6左右。LB-Tet平板及细菌扩增液置于4℃保存，备用。
[0032] FAP特异性噬菌体的富集：以10μg/mL浓度FAP包被免疫试管并于4℃度封闭过夜，TBST洗涤6次后加入噬菌体肽库，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次去除未结合的噬菌体，加0.2mol/L Glycine-HCl(pH2.2)1mL振荡10min洗脱特异结合的噬菌体，加150μL1mol/L Tris-HCl(pH9.1)中和，取10μL洗脱产物计数噬菌体的滴度，其余洗脱产物感染大肠杆菌ER2738扩增并纯化噬菌体，得到次级库，对次级库滴度进行测定并进入下一轮筛选程序。按上述步骤再进行两轮筛选，其中第二轮FAP包被浓度为5μg/mL，第三轮FAP包被浓度为2μg/mL。筛选结果如图所示，随着筛选轮数的增加，FAP包被浓度逐渐降低，而噬菌体依然显现富集趋势。
[0033] FAP特异性噬菌体的鉴定：随机挑取第三轮筛选后滴度测定平板上的分离良好的单菌落100个，经分别培养纯化后，用噬菌体ELISA检测各株对FAP的结合活性。具体步骤如下为：分别以1μg/mL浓度FAP、BSA和IgG1Fc包被酶标板并于4度封闭过夜，TBST洗涤6次后加入纯化后的噬菌体100μL，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次去除未结合的噬菌体，加入HRP标记的鼠抗M13单克隆抗体100μL，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次，加TMB底物室温避光反应5～10min，2mol/L硫酸终止反应，于450nm波长测定OD值，以P/N≥2.1为阳性。检测结果显示，有25株噬菌体表现出对FAP的结合。提取这25株噬菌体ssDNA，送Invitrogen公司测序，得到7株不同序列，分别为命名P1-P7。呈现频率最高的三种多肽共有序列结构：SCD(xx)H(xx)WC；其中出现频率最高的序列为P3(5/25)，其序列为SCDYNHHWC。
[0034] 序列P3的ELISA鉴定：分别以1μg/mL浓度FAP、BSA和IgG1Fc包被酶标板并于4度封闭过夜，TBST洗涤6次，加入展示有P3序列的噬菌体100μL(以相同滴度的无关噬菌体为对照)，TBST洗涤10次去除未结合的噬菌体，加入HRP标记的鼠抗M13单克隆抗体
100μL，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次；加TMB底物室温避光反应5～10min，2mol/L硫酸终止反应，于450m波长测定OD值。结果如图2所示，展示有P3序列的噬菌体表现出对FAP的特异性结合。
100μL，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次；加TMB底物室温避光反应5～10min，2mol/L硫酸终止反应，于450m波长测定OD值。结果如图2所示，展示有P3序列的噬菌体表现出对FAP的特异性结合。