少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a及其基因和应用

摘要

本发明涉及一种少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a及其基因和应用，属于生物医学技术领域。少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a，由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。编码少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a的基因，由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成。少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a是一种钠通道抑制剂，在制备镇痛药物中的应用。本发明的少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a，对大鼠背根神经节上的钠离子通道电流有非常显著的抑制作用，是一种钠通道抑制剂；该毒素能够选择性的作用钠离子通道亚型Nav1.7，小鼠的镇痛模型表明该多肽具有良好的镇痛效果，能够在制备镇痛药物中应用。

权利要求

1.少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a，其成熟肽氨基酸序列组成为ADNKCENSLRREIACGQCRDKVKTDGYFYECCTSDSTFKKCQDLLH。

2.权利要求1所说的少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a在制备镇痛药物中的应用。

说明书

少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a及其基因和应用

技术领域：

[0001] 本发明涉及一种少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a及其基因和应用，属于生物医学技术领域。背景技术：

[0002] 电压门控钠通道广泛分布于肌肉、神经元、腺体、心肌的可兴奋性组织中，是一种重要的跨膜结构蛋白，其活动与细胞的兴奋、收缩、分泌和突触传递等特异性功能密切相关。钠通道亚型一个引人注目的重要功能就是与伤害性感受传递、神经性疼痛的过程有关。除河豚毒素不敏感型钠通道Nav1.8和1.9是这一过程重要参与者外，Nav1.7也是其中关键因素之一。在小直径外周感觉神经元上，Nav1.7能设定Nav1.8和Nav1.9激活开放的阈值。在致炎疼痛模式动物中，发现Nav1.7表达水平被明显上调。与红斑狼疮相关的Nav1.7突变体激活被易化，与阵发性极端疼痛障碍相关的Nav1.7突变体的失活时间被延长。特别是，当Nav1.7不能产生功能时，患者会失去感受痛觉的能力，但对温觉、压觉等其它功能表现正常。因此，针对钠通道的特异阻断剂具有十分重要的镇痛药物的应用前景。

[0003] 蜈蚣是一种传统中药，性温，味辛，有毒。具有息风镇痉、攻毒散结、通络止痛之功能。蜈蚣毒腺中含有丰富的多肽成分，目前已经证实了这些多肽成分多为神经毒素。多肽能够选择性的抑制钠通道，钾通道或是钙离子通道，因此蜈蚣毒液中的成分具有广泛的应用前途，如开发成为镇痛药物、及治疗自身免疫疾病药物。发明内容：

[0004] 本发明的目的在于提供一种少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a及其基因和应用。

[0005] 本发明提供的少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a，是从少棘蜈蚣粗毒中通过分子筛和反向高效液相色谱分离纯化得到，其氨基酸序列(SEQ ID NO:1)为ADNKCENSLRREIACGQCRDKVKTDGYFYECCTSDSTFKKCQDLLH，该多肽包括46个氨基酸残基分子量为5318.97，等电点为6.76，分子内含有三对二硫键排列方式为C1-C5、C2-C6和C3-C4。

[0006] 少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a的基因克隆包括：

[0007] 少棘蜈蚣毒腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选少棘蜈蚣钙离子通道激活剂多肽基因。扩增引物长度为17个核苷酸，其序列为5’-GCGAAAAATGGAAATCT-3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMART TM cDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列为5＇ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG3＇。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。

[0008] 基因测序结果表明编码少棘蜈蚣钙离子通道激活剂的基因(SEQ ID NO:2)由426个核苷酸组成，自5’端至3’端序列基因序列包括了信号肽、前体肽和成熟肽，其中下划线部分为成熟肽。

[0009] tacattatgagaatttggtcgttaaccagaatccttacttttatcgtaatttttaatttt 60[0010] M R I W S L T R I L T F I V I F N F 18[0011] gctgaagcgggtggagagtgcatgaaaaaatgtgacagtccagatatgatacgcgaaata 120[0012] A E A G G E C M K K C D S P D M I R E I 38[0013] tttacgcgctgcacaatggttaaacgtgatacacagttctctgagaattcaggacatctt 180[0014] F T R C T M V K R D T Q F S E N S G H L 58[0015] atacctaaacgctccgttgttgctgataataaatgtaattcattacgtcgtgaaatagct 240[0016] I P K R S V V↓A D N K C N S L R R E I A 78[0017] tgcggacaatgccgtgataaagtgaaaactgatgggtatttttacgaatgttgcacatct 300[0018] C G Q C R D K V K T D G Y F Y E C C T S 98[0019] gattctacatttaaaaagtgtcaggatttgctgcacaaatgaccttcatggtgttctatg 360[0020] D S T F K K C Q D L L H↓K- 118[0021] ctataaaaccagtgaaatgtgatttaattttctaaaattttcatgctgttttattttatt 420[0022] gacactaaacaactattgtttcataaactaactattgtgaatattgctgataaccttttg 480[0023] tttactactaaaggattaggctgtgatttttattcaaaataaattactttcaataactaa 540[0024] aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 567[0025] 本发明的少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a在制备镇痛药物中应用。

[0026] 本发明的少棘蜈蚣多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a，对大鼠背根神经节上的钠离子通道电流有非常显著的抑制作用，是一种钠通道抑制剂；该毒素能够选择性的作用钠离子通道亚型Nav1.7，小鼠的镇痛模型表明该多肽具有良好的镇痛效果，能够在制备镇痛药物中的应用。附图说明：

[0027] 图1A至图1C为多肽毒素mu-SLPTX-Ssm6a的分离纯化。其中：图1A:毒素经过G50分子筛后采用C18反向HPLC分离纯化，其中箭头所示为目的峰。图1B：目的多肽进一步采用反向HPLC分离。图1C：目的分子的质谱鉴定图。

[0028] 图2A至图2C为mu-SLPTX-Ssm6a对大鼠DRG神经元的作用。其中：图2A：1μM mu-SLPTX-Ssm6a全部抑制大鼠DRG神经元上TTX-S钠电流。图2B:mu-SLPTX-Ssm6a抑制大鼠DRG神经元上TTX-S钠电流浓效曲线，其IC50值为23nM.图2C:1μM mu-SLPTX-Ssm6a能快速的抑制TTX-S钠电流，细胞外液也能洗脱mu-SLPTX-Ssm6a对TTX-S钠通道的抑制作用。图2D：mu-SLPTX-Ssm6a使TTX-S钠通道I-V曲线往右漂移但是不改变激活电压和反转电压。图2E:mu-SLPTX-Ssm6a使TTX-S钠通道的电导曲线往右漂移。图2F：mu-SLPTX-Ssm6a不改变TTX-S钠通道的稳态失活曲线。

[0029] 图3A至图3C为mu-SLPTX-Ssm6a选择性的作用于Nav1.7。其中：图3A：2μM mu-SLPTX-Ssm6a抑制Nav1.1电流25％。图3B:1μM mu-SLPTX-Ssm6a抑制Nav1.2电流约31％。图3C：1μM mu-SLPTX-Ssm6a抑制Nav1.6电流约25％。图3D：50nM mu-SLPTX-Ssm6a抑制Nav1.7电流约63％。图3E:mu-SLPTX-Ssm6a对钠离子不同亚型作用的浓效曲线。

[0030] 图4A至图4C为mu-SLPTX-Ssm6a对钠离子不同亚型动力学作用。其中：图4A:mu-SLPTX-Ssm6a使Nav1.1的电导曲线往去极化方向漂移约10.7mV,但不改变稳态失活曲线。图4B:mu-SLPTX-Ssm6a使Nav1.2的电导曲线往去极化方向漂移约+12.9,但不改变稳态失活曲线。图4C:mu-SLPTX-Ssm6a使Nav1.6的电导曲线往去极化方向漂移约9.55mV,但不改变稳态失活曲线。图4D:mu-SLPTX-Ssm6a使Nav1.7的电导曲线往去极化方向漂移约13.5mV,但不改变稳态失活曲线。

[0031] 图5A至图5C为mu-SLPTX-Ssm6对不同疼痛模型的镇痛效果。其中：图5A：1nM，10nM以及100nM的mu-SLPTX-Ssm6明显减少福尔马林导致神经性疼痛。图5B：1nM，10nM以及100nM的mu-SLPTX-Ssm6明显减少福尔马林导致炎性疼痛。图5C：1nM，10nM以及100nM的mu-SLPTX-Ssm6明显减少醋酸导致的疼痛。图5D:1nM，10nM以及100nM的mu-SLPTX-Ssm6明显降低热导致的疼痛。

具体实施方式

[0032] 1、mu-SLPTX-Ssm6a的分离纯化

[0033] ω-SLPTX-Ssm1a的分离纯化分为三个步骤：(1)分子筛；4mL的少棘蜈蚣毒液(在280nm下的吸收值为200OD)采用自装柱(填料为Sephadex G-50，2.6100cm)分离。采用
0.1M PBS(PH＝6.0)洗脱,流速为0.3mL/min，每十分钟更换收集管。收集后的溶液用紫外分光光度计检测每管溶液在280nm的吸收值，绘制洗脱曲线。(2)找出目的多肽所在的洗脱峰，进一步采用反向HPLC分离纯化。将分子筛的洗脱峰冻干后重新溶解在2ml的去离子水中，采用Phenomenex C18(250x4.6mm)色谱柱分离。洗脱溶液为乙腈(含0.1％TFA),流速为3ml/min,检测波长为280/215nm。(3)将第二步中目的样品的洗脱峰冻干后再采用反向HPLC分离纯化。采用Phenomenex C18(250x4.6mm)色谱柱分离。洗脱溶液为乙腈(含
0.1％TFA),流速为0.7ml/min,检测波长为280/215nm。

[0034] 如图1A至图1C所示，少棘蜈蚣粗毒经过分子筛分离后经反向HPLC分离，其中(箭头标示为目的峰，该峰经过第二次反向HPLC第二次反向HPLC分离产生一个单一的主峰。

[0035] 毒素分子质量的鉴定均使用美国Bruker公司生产ProFLEXTMIII型质谱仪，采用MALDI-TOF进行检测：反射模式检测毒素分子量；激光重复率5.00Hz；N2激光波长337nm；离子源加速电压1(IS/1)20Kv；仪器的控制和数据的处理由Brucker公司开发的控制软件和Sun工作站完成。用0.1％TFA-50％乙腈-49.9％去离子水混合液制备基质CCA(α-cyano-4-hydroxyc-innamic acid)的饱和液，然后取1μl样品与1μl CCA的饱和液混合，再取0.5μl混合液点样于质谱的样品盘上，室温干燥后检测分子量。用外标法或内标法进行校正。

[0036] 结果如图1C，少棘蜈蚣毒素mu-SLPTX-Ssm6a的分子量为5318.4Da分子内有含有三对二硫键。

[0037] 2、mu-SLPTX-Ssm6a氨基酸序列以及基因序列

[0038] 2.1经质谱鉴定纯度达到99.9％的mu-SLPTX-Ssm6a采用Edman降解原理，利用全自动氨基酸测序仪测得部分序列，再根据mu-SLPTX-Ssm6a的基因序列最终确定完整的氨基酸序列。

[0039] 2.2少棘蜈蚣毒腺mRNA的纯化：

[0040] 少棘蜈蚣毒腺mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的 mRNAIsolation Systems试剂盒。

[0041] A.取少棘蜈蚣毒腺总RNA500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加人3μl的Oligo(dT)探针和13μl20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。

[0042] B.磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml0.5×SSC悬浮，称之为B液。

[0043] C.将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的华南雨蛙皮肤mRNA。

[0044] D.加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。

[0045] 3.3少棘蜈蚣毒腺cDNA文库构建

[0046] 采用CLONTECH公司CreatorTM SMART TM cDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。

[0047] A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

[0048] 1.在0.5ml无菌的离心管加入1μl少棘蜈蚣毒腺mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。

[0049] 2.混匀离心管中的试剂并短暂离心，72℃保温2分钟。

[0050] 3.将离心管在冰上孵育2分钟。

[0051] 4.在离心管中加入以下试剂2.0μl5×第一链缓冲、1.0μl20mM二硫苏糖醇、1.0μl10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反转录酶。

[0052] 5.混合离心管中试剂并短暂离心，在42℃保温1小时。

[0053] 6.将离心管置于冰上中止第一链的合成。

[0054] 7.从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

[0055] B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链

[0056] 1.95℃预热PCR仪。

[0057] 2. 将 2μl cDNA 第 一 链 (mRNA 反 转 录 )、80μl 去 离 子 水、10μl10×Advantage2PCR 缓 冲、2μl50×dNTP 混 合 物、2μl5’PCR 引 物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。

[0058] 3.在PCR仪中按以下程序扩增：

[0059] (1)95℃ 20秒钟

[0060] (2)22个循环：

[0061] 95℃ 5秒钟

[0062] 68℃ 6分钟

[0063] 4.循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。

[0064] C.PCR产物用PROMEGA公司的 SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

[0065] 1.将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

[0066] 2.加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

[0067] 3.重复步骤2。

[0068] 4.16,000g离心5分钟。

[0069] 5.将离心纯化柱置于新的离心管中。

[0070] 6.加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。

[0071] 7.16,000g离心1分钟，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。

[0072] D.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

[0073] 1.挑取单个DH5α菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50ml LB培养液中，37℃振荡2小时。当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。

[0074] 2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培养物冷却至0℃。

[0075] 3.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。

[0076] 4.倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。

[0077] 5.每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mmol/L MgCl2,20mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。

[0078] 6.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。

[0079] 7.倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。

[0080] 8.每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀，分装后备用。

[0081] 2.4.酶切、连接以及连接产物的转化：

[0082] 1.在微量离心管中加入1μl Takara pMD19-T载体、4μl少棘蜈蚣毒腺cDNA双链溶液，全量为5μl。

[0083] 2.加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。

[0084] 3.16℃反应2小时。

[0085] 4.全量(10μl)加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。

[0086] 5.42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。

[0087] 6.加入37℃温浴过的LB培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。

[0088] 7.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。

[0089] 8.每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA6
大约含1×10 个单独克隆。

[0090] 2.5、少棘蜈蚣毒素mu-SLPTX-Ssm6a基因克隆筛选：

[0091] 扩增引物长度为17个核苷酸其序列为5’-GCGAAAAATGGAAATCT-3’，PCR另一扩增TM引物为CLONTECH公司SMART cDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列为5＇ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG3＇。

[0092] PCR反应在如下条件下进行：94℃30秒钟，56℃30秒钟和72℃45秒钟，30个循环。

[0093] 将扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的条带，用DNA纯化试剂盒进行纯化。将纯化的目的片段连接到pMD19-T载体中，即得连接产物。将连接产物转化预先制备好的大肠杆菌DH5α感受态细胞。最后，取适量转化产物涂布至含Amp的LB平板上，经37℃培养16h形成的单菌落即为含目的片段的阳性克隆。

[0094] 挑取单菌落用M13引物检测插入片段的大小。挑选含目的片段的阳性克隆送DNA测序公司测序。

[0095] 少棘蜈蚣毒素mu-SLPTX-Ssm6a的氨基酸序列和基因序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

[0096] 3.少棘蜈蚣毒素mu-SLPTX-Ssm6a对DRG神经元上钙通道的活性

[0097] 挑选出生±4周、体重约为140～200g的SD大鼠，麻醉后断颈处死，迅速挑出脊椎并将其剪成2～4段，将椎管沿与肋骨垂直的方向剪开，然后在盛有少量培养液的烧杯中浸泡椎管；仔细撕破附在椎管内壁上的无色黏膜，暴露椎管和肋骨交汇处的背根神经纤维。在胸椎和腰椎部分，挑选10～15个较好的背根神经节放入装有2mL临时培养液的培养皿中。分离出神经节以及神经纤维后，用维娜斯剪切除神经节外的絮状物和轴索，放入盛有约0.5mL临时培养液的培养皿中。倒去临时培养液，用维娜斯剪将分离的神经节剪碎。然后将剪碎后神经细胞转入含有15mL消化液的指管中,在34℃下、110rpm的环境中用消化液酶解20～30min。酶解期间每隔8～10min取出指管吹打细胞以防止细胞成团；酶解终止后向消化液中加入胰蛋白酶抑制剂，终止酶解反应。将酶解后的溶液转入离心管中离心(1000rpm、2-5min)，去除上清。用含10％小牛血清的培养液重悬细胞，重悬后的细胞分成
3～4皿，每皿加入2mL培养液，放入37℃恒温培养箱(5％CO2、95％空气)中，培养3～4小时后用于记录电流。

[0098] 实验前必须将细胞外液置于室温下平衡后再更换培养皿内的培养液，以防止溶液温度的剧烈变化。更换溶液时要防止细胞从培养皿底部脱落。倒置显微镜下选择细胞膜较为光滑、细胞质均匀的细胞，在室温20～25℃条件下进行膜片钳实验。选用100μl硼硅酸盐玻璃毛细管为玻璃电极材料，玻璃电极在拉制仪(PC-10，Narishige)上经两步拉制而成，玻璃电极热抛光后电极尖端口径为1.5～3.0μm，拉制完成后在玻璃电极内灌细胞内液。玻璃电极初始电阻为1.5～2.5MΩ比较好。待电极与细胞膜之间形成高阻抗的京欧(GΩ)封接后，补电极快电容。然后将细胞钳制在-60mV，给予一短而有力的负压，将钳制在电极中的细胞膜迅速打破，再补偿细胞慢电容。形成全细胞记录模式后将细胞钳制为-80mV，细胞稳定4～6min开始记录电流。系统电阻(Rs)在实验过程中始终保持在5～10MΩ的范围之内最好能维持不变，系统串联电阻补偿一般在30～60％之间。

[0099] 4、少棘蜈蚣毒素mu-SLPTX-Ssm6a对钠通道亚型的作用。

[0100] 细胞转染：

[0101] (1)转染前一天，用不含抗生素的培养液培养更换培养皿中含抗生素培养液。

[0102] (2)当细胞密度达到80-90％，弃培养液，PBS漂洗一次，加2mL无血清培养液(Opti-MEM)。

[0103] (3)配置A液：240ul无血清培养基+10ul lipofectamine2000per well(总体积250ul)室温下静置5min。

[0104] (4)配置溶液B：250μL无血清培养液中加入4ngDNA，室温静置5min。

[0105] (5)将A液与B液混匀，室温下静置20min。

[0106] (6)将DNA-脂质体混后匀，轻轻滴加入细胞中。

[0107] (7)6小时后，更换含有血清的全培养基。

[0108] 活性检测：

[0109] 实验前必须将细胞外液置于室温下平衡后再更换培养皿内的培养液，以防止溶液温度的剧烈变化。更换溶液时要防止细胞从培养皿底部脱落。倒置显微镜下选择细胞膜较为光滑、细胞质均匀的细胞，在室温20～25℃条件下进行膜片钳实验。选用100μl硼硅酸盐玻璃毛细管为玻璃电极材料，玻璃电极在拉制仪(PC-10，Narishige)上经两步拉制而成，玻璃电极热抛光后电极尖端口径为1.5～3.0μm，拉制完成后在玻璃电极内灌细胞内液。玻璃电极初始电阻为1.5～2.5MΩ比较好。待电极与细胞膜之间形成高阻抗的京欧(GΩ)封接后，补电极快电容。然后将细胞钳制在-60mV，给予一短而有力的负压，将钳制在电极中的细胞膜迅速打破，再补偿细胞慢电容。形成全细胞记录模式后将细胞钳制为-80mV，细胞稳定4～6min开始记录电流。系统电阻(Rs)在实验过程中始终保持在5～10MΩ的范围之内最好能维持不变，系统串联电阻(Rseries compensation)补偿一般在
30～60％之间。

[0110] 5、少棘蜈蚣毒素mu-SLPTX-Ssm6a的镇痛效果

[0111] 福尔马林镇痛实验：

[0112] 雌性昆明小鼠(18～22g)，分为四组(n＝10)。mu-SLPTX-Ssm6a冻干粉溶解于无菌生理盐水，在实验开始前30分钟腹腔注射方式给药，对照组注射相同体积的生理盐水。在小鼠的脚掌处注射20mL浓度为0.92％福尔马林，采用摄像记录小鼠总舔脚时间。

[0113] 扭体法镇痛实验：

[0114] 昆明小鼠(18～22g)，分为四组(n＝10)。mu-SLPTX-Ssm6a冻干粉溶解于无菌生理盐水，采用腹腔注射方式给药，在少棘蜈蚣毒素mu-SLPTX-Ssm6a注射30min后，采用腹腔注射方式给小鼠注射0.6％的乙酸(10ml/kg体重)，计数小鼠注射乙酸后30min的扭体次数。

[0115] 甩尾法镇痛实验：

[0116] 昆明小鼠(18～22g)，分为四组(n＝10)。用鼠尾测痛仪筛选出基础痛阈在3～7s的小鼠来用于试验，鼠尾测痛仪的红外光束照在距离小鼠尾巴根部的1/3处，痛阈时间是指从小鼠接受红外光束照射到小鼠发生摆尾动作之间的时间间隔，在注射少棘蜈蚣毒素mu-SLPTX-Ssm6a之前测试出小鼠的基础痛阈。少棘蜈蚣毒素mu-SLPTX-Ssm6a冻干粉溶解于无菌生理盐水，采用腹腔注射方式给药，分别在少棘蜈蚣毒素mu-SLPTX-Ssm6a注射后
10min、30min、60min、180min、360min测定小鼠的痛阈值。为了避免造成小鼠的组织伤害，如果小鼠给药后痛阈值大于10s，该小鼠的痛阈值就记为10s。对照组给予同样体积的无菌生理盐水。