靶向肝脏的caspase-1抑制剂及其应用

摘要

本发明公开了一种靶向肝脏的caspase-1抑制剂，由人乙型肝炎病毒Pre-S1肽通过柔性接头与caspase-1抑制剂连接而成，Pre-S1肽由Pre-S1蛋白的第1-50位氨基酸组成，caspase-1抑制剂由YVAD四肽的三分子聚合物通过柔性接头与VAD三肽的三分子聚合物连接而成；该制剂利用特异性靶向肝脏的载体Pre-S1肽将caspase-1抑制剂特异性靶向肝细胞，既有利于通过终止肝细胞内的caspase-1活化来阻断由损伤肝细胞释放的内源性危险信号导致的肝内持续性慢性炎症，进而阻断肝细胞的继发性损伤，也有利于减少caspase-1广泛抑制可能导致的机体不良反应，从而对肝细胞起到特异有效的保护，可用于制备由损伤肝细胞释放的内源性危险信号导致的肝内慢性炎症的治疗药物。

权利要求

1.靶向肝脏的caspase-1抑制剂，其特征在于，由人乙型肝炎病毒Pre-S1肽通过柔性接头与caspase-1抑制剂连接而成，所述Pre-S1肽由Pre-S1蛋白的第1-50位氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID No.1中第1-50位氨基酸所示；所述caspase-1抑制剂由YVAD四肽的三分子聚合物即Tyr-Val-Ala-Asp-Tyr-Val-Ala- Asp-Tyr-Val-Ala-Asp通过柔性接头与VAD三肽的三分子聚合物即Val-Ala-Asp-Val-Ala-Asp-Val-Ala-Asp连接而成。

2.根据权利要求1所述的靶向肝脏的caspase-1抑制剂，其特征在于，所述靶向肝脏的caspase-1抑制剂由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成。

3.权利要求1所述的靶向肝脏的caspase-1抑制剂在制备由损伤肝细胞释放的内源性危险信号导致的肝内慢性炎症的治疗药物中的用途。

说明书

靶向肝脏的caspase-1抑制剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种酶抑制剂及其在医药领域中的用途。

背景技术

[0002] 以慢性肝炎为主要原因导致的慢性肝损伤是我国的重大健康问题，也是当前世界卫生组织公布的人类主要死亡病因之一。慢性肝脏炎症一旦启动，难以终止，进一步造成肝硬化、肝功能衰竭、肝癌的发生，称为“慢性肝病三步曲”；并且，肝细胞的损伤也难以终止，被喻为“永不愈合的创伤”。

[0003] 既往研究认为，病毒在肝内的活动是肝内炎症持续存在的重要原因，所以抗病毒治疗是目前治疗慢性乙肝最常采用的方式。但研究发现，即使是有效抑制了病毒复制，也难以终止慢性乙肝进展到肝硬化/肝功能衰竭的恶性病程，而这恰恰是慢性乙肝的主要危害。目前临床尚无能够阻断慢性肝炎恶性进展的有效治疗策略和治疗药物。

[0004] 炎症体（inflammasome）在炎症应答和免疫调控中具有重要作用，通过感知各种内源性和外源性的危险信号，活化以caspase-1为主的激酶，促进IL-1β的分泌，启动炎症应答，生理状况下，清除感染和死亡细胞，维持机体内环境稳态，也有报道caspase-1的异常活化与多种自身免疫病或自身炎症性疾病相关。

发明内容

[0005] 根据发明人和其他研究人员的最新研究结果，炎症体与慢性肝损伤包括慢性乙肝病毒感染相关的慢性肝炎密切相关。发明人的研究结果显示：慢性乙肝的炎症持续原因并不仅仅包括乙肝病毒的活动，也能由损伤肝细胞特别是凋亡肝细胞释放的内源性危险信号引起；这些内源性危险信号以损伤肝细胞释放的ATP为代表，通过活化炎症体，导致肝内慢性炎症和慢性损伤。同时，发明人在肝细胞等组织细胞中的研究也发现，肝细胞（一种非免疫细胞）中也存在caspase-1的应答机制，肝内微环境中常见的内源性危险信号（如HMGB1、尿酸、ATP等）能够有效启动肝细胞内caspase-1的活化，进而促进炎症应答。因此，阻断肝细胞内caspase-1的活化有可能阻断由损伤肝细胞释放的内源性危险信号导致的肝内慢性炎症，进而阻断肝细胞的继发性损伤和慢性肝炎的恶性进展。

[0006] 有鉴于此，本发明的目的之一在于研制一种靶向肝脏的caspase-1抑制剂，并考察其是否可以通过终止肝细胞内的caspase-1活化来阻断由损伤肝细胞释放的内源性危险信号导致的肝内慢性炎症，进而阻断肝细胞的继发性损伤，同时避免caspase-1广泛抑制可能引起的机体不良反应，最终实现对肝细胞特异有效的保护；目的之二在于提供所述靶向肝脏的caspase-1抑制剂在制药领域中的用途。

[0007] 经过研究，本发明提供如下技术方案：

[0008] 1．靶向肝脏的caspase-1抑制剂，由人乙型肝炎病毒Pre-S1肽通过柔性接头与caspase-1抑制剂连接而成，所述Pre-S1肽由Pre-S1蛋白的第1-50位氨基酸组成，所述caspase-1抑制剂由YVAD（Tyr-Val-Ala-Asp）四肽的三分子聚合物即Tyr-Val-Ala-Asp-Tyr-Val-Ala-Asp-Tyr- Val-Ala-Asp通过柔性接头与VAD（Val-Ala-Asp）三肽的三分子聚合物即Val-Ala-Asp-Val-Ala- Asp-Val-Ala-Asp连接而成。

[0009] 进一步，所述靶向肝脏的caspase-1抑制剂由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成，即所述Pre-S1肽与caspase-1抑制剂之间的柔性接头以及YVAD肽三分子聚合物与VAD肽三分子聚合物之间的柔性接头均由3个甘氨酸组成。

[0010] 2．所述靶向肝脏的caspase-1抑制剂在制备由损伤肝细胞释放的内源性危险信号导致的肝内慢性炎症的治疗药物中的用途。

[0011] 本发明的有益效果在于：本发明利用特异性靶向肝脏的载体Pre-S1肽与caspase-1抑制剂连接，制得了一种靶向肝脏的caspase-1抑制剂，并对其药理活性进行了实验研究。研究结果显示，该靶向肝脏的caspase-1抑制剂能够特异有效地被原代肝细胞摄取，能够有效抑制由内源性危险信号ATP启动的原代肝细胞内caspase-1的活化，减少促炎症细胞因子IL-1β的产生，并能够有效阻断由内源性危险信号ATP启动的原代肝细胞的死亡，从而初步证实了可以通过阻断肝细胞内caspase-1的活化来阻断由损伤肝细胞释放的内源性危险信号导致的肝内持续性慢性炎症，进而阻断肝细胞的继发性损伤，这是治疗慢性肝炎的一种创新性策略，可能阻断慢性肝炎的恶性进展，将是目前常规临床治疗方式的重要且必要的补充。将caspase-1抑制剂特异性靶向肝脏，不仅有利于终止肝细胞内的caspase-1活化，而且有利于减少全身系统性的caspase-1抑制可能导致的严重的内环境紊乱和免疫缺陷等不良反应，从而实现对肝细胞特异有效的保护。因此，本发明的靶向肝脏的caspase-1抑制剂可用于制备由损伤肝细胞释放的内源性危险信号导致的肝内慢性炎症的治疗药物，在终止包括慢性乙肝在内的各种慢性肝炎病程进展方面具有潜在、良好的应用前景。

附图说明

[0012] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步描述，其中：

[0013] 图1为流式细胞仪检测原代肝细胞对靶向肝脏的caspase-1抑制剂的摄取比例，其中a表示阴性对照（荧光标记的无关七肽），b表示荧光标记的靶向肝脏的caspase-1抑制剂，c表示荧光标记的caspase-1抑制剂。

[0014] 图2为蛋白免疫印迹检测靶向肝脏的caspase-1抑制剂对内源性危险信号ATP启动的原代肝细胞内caspase-1活化的影响，其中1表示未干预的正常肝细胞，显示有大量的caspase-1活化后产生的p10亚单位，2、3、4分别表示靶向肝脏的caspase-1抑制剂5μM、20μM、40μM处理组。

[0015] 图3为ELISA实验检测靶向肝脏的caspase-1抑制剂对内源性危险信号ATP启动原代肝细胞内Caspase-1活化后产生IL-1β能力的影响。

[0016] 图4为乳酸脱氢酶释放实验检测靶向肝脏的caspase-1抑制剂对内源性危险信号ATP启动的原代肝细胞死亡的影响。

[0017] 图3和图4中“block”表示靶向肝脏的caspase-1抑制剂。

具体实施方式

[0018] 以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0019] 一、靶向肝脏的caspase-1抑制剂的制备

[0020] 设计并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的靶向肝脏的caspase-1抑制剂。在SEQ ID No.1所示序列中，第1-50位氨基酸为来源于乙型肝炎病毒株FMC#97的Pre-S1蛋白的第1-50位氨基酸序列，第51-53位氨基酸为柔性接头，第54-65位氨基酸为YVAD（Tyr-Val-Ala-Asp）四肽的三分子聚合物，第66-68位氨基酸为柔性接头，第69-77位氨基酸为VAD（Val-Ala-Asp）三肽的三分子聚合物。

[0021] 同时，合成缺少靶向载体的caspase-1抑制剂作为对照，即从SEQ ID No.1所示序列中去除第1-53位氨基酸。

[0022] 二、靶向肝脏的caspase-1抑制剂的活性检测

[0023] 1、人原代肝细胞的培养

[0024] 取非HBV相关的肝癌患者外科手术肿瘤切除的无相邻的正常组织，按文献方法（Methods for preparation of adult and fetal hepatocytes. Isolated and cultured hepatocytes. A.Guillouzo and C.Guguen-Guillouzo. Les E’ ditions INSERM Paris, -6John Libbey and Co.,Ltd. 1986, 1-12）分离原代肝细胞，用含有3.5×10 M氢化可的松琥珀酸单酯、2%(v/v)二甲基亚砜、5%(v/v)人血清和5%(v/v)胎牛血清的H培养基培养。

[0025] 2、流式细胞仪检测原代肝细胞对靶向肝脏的caspase-1抑制剂的摄取率[0026] 将人原代肝细胞接种至12孔板中培养，每孔约106个细胞，与FITC标记的靶向肝脏的caspase-1抑制剂共孵育60分钟，弃去培养上清，细胞用PBS漂洗2次，用4%(v/v)多聚甲醛溶液固定后，于流式细胞仪488nm激发光下检测细胞对靶向肝脏的caspase-1抑制剂的摄取比例，以FITC标记的缺少靶向载体的caspase-1抑制剂作为对照。结果如图1所示，可见原代肝细胞能够特异有效地摄取靶向肝脏的caspase-1抑制剂，而对缺少靶向载体的caspase-1抑制剂的摄取率与阴性对照相差无几。

[0027] 3、蛋白免疫印迹检测靶向肝脏的caspase-1抑制剂对内源性危险信号ATP启动的原代肝细胞内caspase-1活化的影响

[0028] Caspase-1活化需要双信号，通常有一个预激信号用以上调pro-caspase-1以及pro-IL-1β等分子的表达，可以是LPS、CpG等各种病原体携带的毒性分子；另一个信号是危险信号，直接激活在细胞中的炎症体（inflammasome），使pro-caspase-1被切割成为有活性的caspase-1，再切割pro-IL-1β产生有活性的IL-1β。在正常生理状态下，肝细胞就处于含有生理活性浓度的LPS的血液中。因此，在蛋白免疫印迹实验和后续的ELISA实验和乳酸脱氢酶释放实验中，均采用LPS作为caspase-1活化的预激信号，并采用ATP作为内源性危险信号。

[0029] 将人原代肝细胞接种至12孔板中培养，每孔约106个细胞，分设4组：①组与200ng/ml LPS共孵育24小时，移除LPS，再加入5μM ATP继续刺激6小时；②组在加入LPS前，先用5μM 靶向肝脏的caspase-1抑制剂预处理1小时，其余与①组相同；③组在加入LPS前，先用20μM 靶向肝脏的caspase-1抑制剂预处理1小时，其余与①组相同；④组在加入LPS前，先用40μM 靶向肝脏的caspase-1抑制剂预处理1小时，其余与①组相同；最后收集细胞，用RIPA裂解液裂解后，收集总蛋白并测定浓度。将收集的总蛋白进行SDS-PAGE，电泳完毕后转膜，用WB洗涤液漂洗，再加入WB封闭液，室温封闭60分钟，去除封闭液，再加入按体积比1:200稀释的caspase-1一抗（Santa Cruze公司）和GAPDH抗体，4℃过夜孵育，去除一抗，用WB洗涤液漂洗，再加入二抗，室温孵育1小时，去除二抗，再用WB洗涤液漂洗，最后采用化学发光法检测caspase-1活化片段p10亚单位。结果如图2所示，可见靶向肝脏的caspase-1抑制剂有效地阻断了原代肝细胞中caspase-1的活化。

[0030] 4、ELISA实验检测靶向肝脏的caspase-1抑制剂对内源性危险信号ATP启动原代肝细胞caspase-1活化后产生IL-1β能力的影响

[0031] 将人原代肝细胞接种至12孔板中培养，每孔约106个细胞，分设5组：①组不加入任何试剂；②组与200ng/ml LPS共孵育12小时或24小时，移除LPS，再加入5μM ATP继续刺激6小时；③组在加入LPS前，先用5μM 靶向肝脏的caspase-1抑制剂预处理1小时，其余与②组相同；④组在加入LPS前，先用20μM 靶向肝脏的caspase-1抑制剂预处理1小时，其余与②组相同；⑤组在加入LPS前，先用40μM 靶向肝脏的caspase-1抑制剂预处理1小时，其余与②组相同；最后收集培养上清，用IL-1β的ELISA检测试剂盒（Abcam 公司）检测培养上清中IL-1β的分泌情况。结果如图3所示，可见原代肝细胞中caspase-1活化后产生IL-1β的能力被靶向肝脏的caspase-1抑制剂有效抑制，且该抑制作用呈现剂量依赖性。

[0032] 5、乳酸脱氢酶释放实验检测靶向肝脏的caspase-1抑制剂对内源性危险信号ATP启动的原代肝细胞死亡的影响

[0033] 将人原代肝细胞接种至12孔板中培养，每孔约104个细胞，分设6组：①组不加入任何试剂，为样品对照组；②组与200ng/ml LPS共孵育24小时，移除LPS，再加入5μM ATP继续刺激6小时；③组在加入LPS前，先用5μM 靶向肝脏的caspase-1抑制剂预处理1小时，其余与②组相同；④组在加入LPS前，先用20μM 靶向肝脏的caspase-1抑制剂预处理1小时，其余与②组相同；⑤组在加入LPS前，先用40μM 靶向肝脏的caspase-1抑制剂预处理1小时，其余与②组相同；⑥不加任何处理，收集细胞后用1%NP-40处理，为最大酶活性组；另设无血清培养基为空白对照；最后收集培养上清，加入60μl LDH检测工作液，混匀，室温避光孵育30分钟，于490nm处测定吸光度，并使用600nm作为参考波长进行双波长测定，各组吸光度以测得吸光度减去空白对照吸光度的差值表示，按以下公式计算细胞死亡率：细胞死亡率(%)=[(样品处理组吸光度-样品对照组吸光度)/(最大酶活性组吸光度-样品对照组吸光度)]×100。结果如图4所示，可见靶向肝脏的caspase-1抑制剂有效地抑制了由内源性危险信号ATP启动的原代肝细胞的死亡。

[0034] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。