极暗黄链霉菌

摘要

一种极暗黄链霉菌（Streptomyces fulvissimus）CZB40，2012年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2012519。本菌株对农作物病具有广谱拮抗作用，对辣椒疫霉病菌、桃树褐腐病菌、及水稻稻瘟病菌有较好的抑制作用，对水稻纹枯病菌的抑制效果尤为明显。

权利要求

1.一种极暗黄链霉菌，其特征在于:该菌株为极暗黄链霉菌(Streptomycesfulvissimus)CZB40，2012年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCCNO:M2012519o

2.一种发酵法制备极暗黄链霉菌发酵液的方法，其特征在于:发酵所用菌株为权利要求I所述的极暗黄链霉菌CZB40，发酵培养基为:玉米粉10-30g、酵母粉3-7g、MgS040.2_lg、NaCl0.2-lg、K2HP O40.2_lg、及水 1000ml，pH5_9 ;发酵条件为:接种量 1_10%、温度26_30°C、摇瓶转速150-250r/min、发酵培养时间为48_96h。

3.如权利要求2所述的发酵法制备极暗黄链霉菌发酵液的方法，其特征在于:所述培养基为:1000ml 培养基中 25g 玉米粉、5g 酵母粉、0.2g MgS04、0.8gNaCl 及 0.4gK2HP04pH6 ；发酵条件为:接种量5%、温度29°C、转速200r/min、发酵时间72h。

4.如权利要求2或3所.述方法得到的发酵液。

说明书

极暗黄链霉菌

技术领域

[0001] 本发明涉及一种微生物技术领域，具体指一种对农作物病具有广谱拮抗作用，尤其对水稻纹枯病具有明显抑制作用的极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus) CZB40。

背景技术

[0002] 水稻纹枯病是由立枯丝核菌(Rhzioeotniasoalni)引起的导致水稻减产的重要病害，可造成10%_30%的产量损失，发病严重时减产可达50%。近几年，随着高产杂交稻品种的推广，施氮水平的提高，水稻复种指数的上升，水稻纹枯病的危害越来越严重。目前我国水稻纹枯病的防治主要以井R霉素与一些化学药剂为主，长期单一使用井R霉素易导致立枯丝核菌产生抗药性，近年井R霉素每季用药次数已从20年前2次增加到现在的3-5次，用药量也从1.5 kg/hm2上升到4.5-6.0kg/hm，而化学药剂存在毒性、残留、环境污染等缺点，且由于立枯丝核菌腐生能力强和寄主范围广的特点，国内外至今尚未发现对该病的高抗品种。·

[0003] 且，随着化学杀菌剂对生态环境、有益生物及人体所引致负作用的加大，以及植物病原菌日益增加的抗药性，利用一些生物防治菌作为生物杀菌剂来防治植物病害，以减轻化学农药对环境污染的研究引起各界的密切关注。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是:针对上述现有技术的不足，提供一种对农作物病具有广谱拮抗作用的极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus) CZB40,尤其对水稻纹枯病菌具有良好的抑制效果。

[0005] 本发明所述的极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus)CZB40,已于2012年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC NO:M2012519，保藏地址:中国武汉武汉大学。

[0006] 本发明菌株CZB40具有以下性质:

[0007] 形态特征:使用插片法在高氏I号培养基上28°C培养7d后，分别用光学显微镜和电子显微镜观察发现，本菌株具有典型的链霉菌属特征，菌落紧密、表面皱折，皮壳状，青褐色。气生菌丝和基内菌丝均很丰富，在扫描电镜下观察发现，气生菌丝体形成孢子链时，孢子丝呈螺旋状，孢子呈短圆柱形，见图1。

[0008] 生理生化特性:本发明菌株CZB40在高氏一号固体培养基中生长产生暗黄色色素。本菌株能分解利用纤维素，使明胶液化，使淀粉水解，能使牛奶胨化，但不能使牛奶凝固，也不能产生硫化氢。

[0009] 利用参照1.M.Kauffmann等及Jasmina Nikodinovic等的方法提取本发明菌株的基因组DNA，根据放线菌16SrDNA的结构特点及其保守区设计特异引物(引物由上海生工生物工程公司合成):

[0010]正向引物 16sF:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (见 SEQ ID N0.1)；[0011]反向引物 16sR:AAGGAGGTGATCCAGCCGCA (见 SEQ ID N0.2)。

[0012] 以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增(50 μ L反应体系):94°C预变性5min，94°C变性Imin，56°C复性Imin，72°C延伸2min，25个循环，72°C延伸8min。扩增产物经上海生工生物工程技术有限公司测序,序列经BLAST分析并构建系统发育树(见图2)表明，本发明菌株CZB40与极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus)的相似性达99%。结合形态和生理生化特征分析，将其鉴定为极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus)的一个新种，命名为极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus) CZB40。

[0013] 培养及发酵条件

[0014] 培养基中的营养源并无特殊的规定，培养基中可含有常用于微生物培养的碳源、氮源及其他营养源。其中，碳源可为葡萄糖、麦芽糖、马铃薯淀粉、可溶性淀粉、玉米粉、大米粉、蔗糖等。氮源可为NaN03、(MM)2SO4、酵母粉、蛋白胨、大豆粉等。其他营养源可为含镁、钠、钾之类的金属盐等。对温度、时间等培养条件并无严格的限制，以适于本发明菌株的生长为宜。

[0015] 将本发明菌株C ZB40接种于发酵培养基中，可获得发酵液，发酵培养基为:玉米粉 10-30g、酵母粉 3-7g、MgSO4 0.2_lg、NaCl 0.2_lg、K2HP O4 0.2_lg、1000ml 水，pH 5-9 ；发酵条件为:接种量1-10% (体积)、温度26-30°C、摇瓶转速150-250r/min、发酵培养时间为48-96h。通过单因素试验和均匀设计法对本发明菌株CZB40的发酵培养基和发酵条件进行优化，得到最佳培养基(1000ml水)为:25g玉米粉、5g酵母粉、0.2g MgSO4、0.8gNaCl、0.4gK2HP04 pH 6 ;最佳发酵条件为:接种量5%、温度29°C、转速200r/min、发酵时间72h。

[0016] 本发明菌株对农作物病具有广谱拮抗作用，对辣椒疫霉病菌、桃树褐腐病菌、及水稻稻瘟病菌有较好的抑制作用，尤其对水稻纹枯病菌抑制效果明显。

附图说明

[0017] 图1是本发明菌株CZB40的孢子形态图。

[0018] 图2是本发明菌株的系统发育树。

具体实施方式

[0019] 下面以具体实施例对本发明作进一步说明，本文中提及的各病原菌均由湖南农业大学植物病理系提供。

[0020] 实施例1

[0021] 将从湖南省郴州市采集的土样于室温下风干，称取土样IOg放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡20min，用无菌移液管从中吸取Iml 土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，混匀。从此试管中吸取Iml注入另一支盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制备10 -2、10 -3、10 —4、10 —5、10 —6的土壤稀释液。用无菌移液管吸取10 -2、10 -4、10 -6稀释液0.1mL分别滴加到加有3%的抑菌剂(K2Cr2O7)的培养基平板上，用无菌涂布棒涂匀，静置30min后,将培养皿放在28°C温箱中倒置培养。及时挑单菌落至高氏一号培养基上划线纯化，得到本发明菌株。

[0022] 其中，添加有3%的抑菌剂(K2Cr2O7)的培养基配方为:可溶性淀粉20g、KNO3 lg、K2HPO4 0.5g、MgS04.7H20 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4.7H20 0.0lg、琼月旨 20g、水 lOOOmL、pH7.2，加入的抑菌剂(K2Cr2O7) 3mL。

[0023] 实施例2

[0024] 将本发明菌株CZB40接种5% (体积)于发酵培养基(玉米粉25g、酵母粉5g、MgSO40.2g、NaCl 0.8g, K2HP O4 0.4g、1000ml 水；pH6)，28°C 下以 200r/min 转速摇瓶发酵培养72h，用细菌过滤器(直径=0.22 μ m)过滤，得发酵液。

[0025] 实施例3本发明菌株对水稻纹枯病菌的抑制作用

[0026] 于培养皿中加入3ml本发明菌株发酵液与12mlPDA，混匀制成平板(以3ml无菌水与12mlPDA混匀制成平板做对照)，将培养在PDA上的水稻纹枯病菌的小菌饼(直径=5mm)倒置放到平板中央，重复3次。静置Ih后放入28°C温箱倒置培养l-2d。用十字交叉法测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈透明程度和边缘整齐程度，记录结果并按下式计算抑制率:

[0027] 菌落直径=相垂直的两直径的平均值一菌饼直径

[0028] 抑制率(％)=(对照菌落直径一处理菌落直径)/(对照菌落直径一菌饼直径)X 100%。(这里提及的菌饼直径皆是指水稻纹枯病菌的小菌饼(直径=5mm))

[0029] 结果表明:本发明菌株的抑菌率为89.3%，说明了本发明菌株对水稻纹枯病菌的生长有较强的抑制作用，并能抑制水稻纹枯病菌菌核的形成。

[0030] 实施例4本发明菌株对辣椒疫霉病菌的抑制作用

[0031] 参照实施例3的步骤，只是将病原菌换为辣椒疫霉病菌，结果表明:本发明菌株对辣椒疫霉病菌的抑制率为52.94% ，有较好的抑菌效果。

[0032] 实施例5本发明菌株对桃树褐腐病菌的抑制作用

[0033] 参照实施例3的步骤，只是将病原菌换为桃树褐腐病菌，结果表明:本发明菌株对桃树褐腐病菌的抑制率为80.29%，有较好的抑菌效果。

[0034] 实施例6本发明菌株对水稻稻瘟病菌的抑制作用

[0035] 参照实施例3的步骤，只是将病原菌换为水稻稻瘟病菌，结果表明:本发明菌株对水稻稻瘟病菌的抑制率为52.94%，抑菌效果较好。