伤寒、甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒及其应用

摘要

本发明适用于生物技术和医学领域，提供了一种伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包含第一反应液、第二反应液及石蜡，该第一反应液包含：反应缓冲液，针对伤寒沙门菌的引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和特异性探针SEQ ID NO：3，以及针对甲型副伤寒沙门菌的引物对SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5和特异性探针SEQ ID NO：6；该第二反应液包含DNA聚合酶O。本发明还提供了该试剂盒在伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌检测中的应用。本发明的检测试剂盒缩短了检测时间，避免样本间交叉污染，结果准确可靠。

权利要求

1.一种伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，包含第一反应液、第二反应液及石蜡，所述第一反应液包含：反应缓冲液；针对伤寒沙门菌的引物对和特异性探针，所述针对伤寒沙门菌的引物对序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，所述针对伤寒沙门菌的特异性探针序列为SEQ ID NO：3；以及针对甲型副伤寒沙门菌的引物对和特异性探针，所述针对甲型副伤寒沙门菌的引物对序列为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，所述针对甲型副伤寒沙门菌的特异性探针序列为SEQ ID NO：6，所述第二反应液包含DNA聚合酶O，所述第一反应液和所述第二反应液被所述石蜡隔开。

2.如权利要求1所述的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述针对伤寒沙门菌的特异性探针SEQ ID NO：3和针对甲型副伤寒沙门菌的特异性探针SEQ ID NO：6的5’端连接有FAM或HEX，3’端连接有DABCYL或BHQ。

3.如权利要求1所述的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液含有25mM的MgCl2、不含镁离子的10×buffer和dNTPs。

4.如权利要求1所述的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述第二反应液还包含显色液。

5.如权利要求1所述的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述针对伤寒沙门菌的引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，所述针对伤寒沙门菌的特异性探针序列SEQ ID NO：3，以及针对甲型副伤寒沙门菌的引物对SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，所述针对甲型副伤寒沙门菌的特异性探针序列SEQ ID NO：6在与所述第一反应液中其他组分混合前浓度为45-55μM。

6.如权利要求1所述的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶O在与所述第二反应液的其他组分混合前的浓度为40-44U/μL。

7.如权利要求1至6中任一项所述的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒在伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌检测中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌检测包括PCR反应，所述PCR反应条件为：

50-55℃：2-5min；

94-95℃：2-3min；

94-95℃：5-10s，55-60℃：40-80s；40个循环。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌检测包括利用全血直接进行PCR反应的步骤。

说明书

伤寒、甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒及其应

用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术和医学领域，尤其涉及一种伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。

背景技术

[0002] 伤寒（typhoid fever）是由伤寒杆菌引起的急性传染病，以持续菌血症，网状内皮系统受累，回肠远端微小脓肿及溃疡形成为基本病理特征。副伤寒是甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起的急性消化道传染病。可因水源和食物污染发生爆发流行。伤寒病与副伤寒均是我国法定乙类传染病，也是世界性的主要公共卫生问题之一。它们的病原伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌是肠杆菌科沙门菌属，革兰染色阴性，呈短杆状，长1～3.5μm，宽0.5～0.8μm，周有鞭毛，能活动，不产生芽胞，无荚膜。兼性厌氧，最适的生长温度为35~37℃，Ph6.8~7.8。它们对营养的要求不高，普通培养基即可生长出圆形、光滑、湿润、半透明边缘整齐的菌落，但沙门菌经人工传代后会从光滑型菌落逐步过渡为粗燥型菌落。不发酵乳糖，在SS琼脂平板上形成的菌落中心呈黑色。

[0003] 目前对于伤寒沙门菌引起的伤寒及甲型副伤寒沙门菌引起的副伤寒的诊断方法包括：

[0004] 1.血常规检验：白细胞数一般在（3~5）×109/L，中性粒细胞减少，嗜酸性粒细胞减少或消失。嗜酸性粒细胞计数随病情好转而恢复正常，对伤寒的诊断与病情评估有一定参考价值，但不能检出是否有伤寒杆菌和副伤寒杆菌存在。

[0005] 2.病原菌培养：血培养为最常用的确诊依据。伤寒病程第1~2周的阳性率最高（80%~90%），第3周约为50%，第4周后不易检出。可作为常规检验的依据。

[0006] 3.肥达（Widal）反应通常在病后1周左右出现抗体，第3~4周的阳性率可达70%以上，效价亦较高，并可维持数月。有少数患者抗体阳性较迟出现，或者抗体效价水平较低。约有10%~30%患者肥达反应始终为阴性。“O”抗原为伤寒沙门菌

[0007] 4.和副伤寒甲、乙、丙杆菌的共同抗原，血清中检出高效价“O”抗体不能区别四种不同的病原菌感染，但四者的鞭毛抗原（“H”、“A”、“B”、“C”）不同，可从四者的特异性抗体效价上升来判断感染的菌种。对未经免疫者，“O”抗体的凝集效价在1:80及“H”、“A”、“B”、“C”抗体在1:160或以上时，可确定为阳性，有辅助诊断价值。通过每5~7日复检1次，若效价逐渐上升，价值较大。若只有“O”抗体上升，而“H”、“A”、“B”、“C”抗体不上升，可能是发病早期；若相反，只有“H”、“A”、“B”、“C”抗体上升而“O”抗体不增高可能是因其他发热性疾患所致的非特异性回忆反应。沙门菌D群与A群有部分的共同抗原，后者的感染可产生“O”与“H”抗体的交叉反应。

[0008] 5.其它检查：一些新的免疫学诊断方法，包括PCR检测技术。常规PCR检测相对于传统的培养法具有快速、灵敏的优点，但临床常规应用中还有效果不稳定，容易出现交叉污染等问题。

发明内容

[0009] 本发明实施例的目的在于提供一种伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，旨在解决现有技术中对于伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌检测的周期长、操作繁琐、灵敏度低的问题。

[0010] 本发明实施例是这样实现的，一种伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，包含第一反应液、第二反应液及石蜡，该第一反应液包含：反应缓冲液；针对伤寒沙门菌的引物对和特异性探针，该引物对序列为SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2，该特异性探针序列为SEQ ID NO：3，针对甲型副伤寒沙门菌的引物对和特异性探针，该引物对序列为SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5，该特异性探针序列为SEQ ID NO：6，该第二反应液包含DNA聚合酶O。

[0011] 本发明实施例的另一目的在于提供本发明的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒在伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌检测中的应用。

[0012] 本发明的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒利用荧光定量PCR技术，避免了传统培养法中操作周期长、步骤繁琐等不足，具有快速准确灵敏度高等优点。而且本发明的试剂盒在用于伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌的应用过程中可直接利用血液样本进行检测，不需要DNA提取，缩短了检测时间，避免样本间交叉污染，结果准确可靠。

附图说明

[0013] 图1是现有技术中荧光定量PCR检测结果示意图；

[0014] 图2是本发明实施例的试剂盒的PCR检测阳性结果判定示意图；

[0015] 图3是本发明实施例的试剂盒的PCR检测阴性结果判定示意图；

[0016] 图4为本发明实施例3的PCR检测阳性结果；

[0017] 图5为本发明实施例3的PCR检测阴性结果。

具体实施方式

[0018] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0019] 本发明实施例提供一种伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，包含第一反应液、第二反应液及石蜡，该第一反应液包含：反应缓冲液；针对伤寒沙门菌的引物对和特异性探针，该引物对序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，该特异性探针序列为SEQ ID NO：3；针对甲型副伤寒沙门菌的引物对和特异性探针，该引物对序列为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，该特异性探针序列为SEQ ID NO：6；该第二反应液包含DNA聚合酶O。

[0020] 本发明实施例利用荧光定量PCR技术，其基本原理为：在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，如图1所示，Ct值为每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，而在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可据此进行定量分析。

[0021] 具体地，本发明实施例的试剂盒中，第一反应液中包含的反应缓冲液含有25mM的MgCl2、不含 镁离 子的10×buffer、dNTPs。 其中dNTP为 deoxy-ribonucleoside triphosphate（脱氧核糖核苷三磷酸）的缩写，在本发明实施例中dNTP包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP，用于作为PCR反应的原料。

[0022] 具体地，本发明实施例的试剂盒中，第一反应液中针对伤寒沙门菌的引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和特异性探针SEQ ID NO：3，以及针对甲型副伤寒沙门菌的引物对SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5和特异性探针SEQ IDNO：6序列如表1所示：

[0023] 表1针对伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌的引物对和特异性探针序列

[0024]

[0025] 具体地，针对伤寒沙门菌的特异性探针SEQ ID NO：3和针对甲型副伤寒沙门菌的特异性探针SEQ ID NO：6的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团。荧光基团可发出荧光信号，淬灭基团可以抑制荧光基团发出的荧光信号，而在荧光定量PCR反应过程中，淬灭基团与荧光基团分离，荧光基团可以发出荧光信号，通过检测荧光信号的积累可以对未知模板进行定量分析。其中，连接于5’端的荧光基团可以为FAM或HEX，其中FAM为Carboxyfluorescein，中文名称为羧基荧光素，HEX为hexachloro-fluorescein,中文名称为六氯荧光素，该淬灭基团可以为DABCYL或BHQ，DABCYL为4,4-Dimethylamino-azobenzene-4'-carboxylic acid，中文名称为4-二甲胺偶氮苯-4’-羧酸，BHQ为Black Hole Quencher，中文名称为黑洞淬灭剂。

[0026] 具体地，本发明实施例的试剂盒中，针对伤寒沙门菌的引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和特异性探针SEQ ID NO：3，以及针对甲型副伤寒沙门菌的引物对SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5和特异性探针SEQ ID NO：6在储存液中的浓度为45-55μM。优选地，所述浓度为50μM。在使用时，将该储存液与第一反应液中其他组分混合制得第一反应液。

[0027] 具体地，本发明实施例的试剂盒中，第一反应液中还含有灭菌超纯水，用于在使用本发明实施例的试剂盒进行PCR反应时补足反应体系的体积，使PCR反应有效地进行。

[0028] 具体地，本发明实施例的试剂盒中，第二反应液中含有的DNA聚合酶O，即Omni Klentaq，该DNA聚合酶是经工程改造过的Taq酶，其缺乏5’→3’外切酶活性，能够耐受全血、土壤样本中存在的抑制剂，能够直接扩增全血样品中的DNA而无需事先提纯，因此使用DNA聚合酶O能提高血液样品PCR检测的效率。该DNA聚合酶O在储存液中的浓度为40-44U/μL，优选浓度为42U/μL。在使用本发明实施例的试剂盒时使该储存液与其他组分混合制得第二反应液。

[0029] 优选地，本发明实施例的试剂盒的第二反应液中还包含显色液，该显色液优选为溴酚蓝，显色液可以在加样时起到指示的作用。

[0030] 本发明实施例的试剂盒中石蜡起到隔离的作用，使第一反应液与第二反应液分开，在PCR仪中加热后混合到一起，以提高反应效率，且该石蜡不会影响检测结果。

[0031] 具体地，在本发明实施例的试剂盒中，每个反应体系不包含待测样品的体积为20μL，对于本领域技术人员，可以按照比例扩大，例如扩大至50μL，该反应体系不包括起到隔离作用的石蜡，石蜡的体积为20μL。

[0032] 优选地，反应器中的每个反应体系按表2进行配制。

[0033] 表2反应液组分

[0034]

[0035] 优选地，制备本发明实施例的试剂盒时，在PCR反应管中先加入第一反应液，混匀，加入液态石蜡，待其凝固后加入第二反应液，由此石蜡将第一反应液和第二反应液隔离开。

[0036] 本发明实施例还提供本发明试剂盒在伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌检测中的应用。具体地，在伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌检测时，取人体静脉血，向本发明实施例的试剂盒每个反应体系中加入5μL静脉血，进行PCR反应，具体反应条件为：

[0037] 50-55℃：2-5min；

[0038] 94-95℃：2-3min；

[0039] 94-95℃：5-10s，55-60℃：40-80s；40个循环

[0040] 反应结束后根据扩增图谱判定结果，参见图2、图3，其中

[0041] 阳性结果：扩增曲线图Ct值≤35，如图2所示；

[0042] 阴性结果：扩增曲线图Ct值＞35或无Ct值(图3)。

[0043] 以下结合具体实施例对本发明伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒及其应用进行进一步描述。

[0044] 实施例1

[0045] 伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒的制备。

[0046] 在PCR反应管中按如下组分配制本发明的第一反应液：

[0047]

[0048] 加入灭菌超纯水使总体积达到18.0微升

[0049] 其中，上述探针117A(SEQ ID NO:3)的5’端连接有FAM，3’端连接有DABCYL；上述探针118H(SEQ ID NO:6)的5’端连接有HEX，3’端连接有DABCYL。

[0050] 将第一反应液混合均匀，然后向液面上加入融化的石蜡20微升，待其凝固后，该石蜡封住下面的第一反应液，然后按如下组分配比加入第二反应液：

[0051] DNA聚合酶O（42U/μL) 0.2微升

[0052] 溴酚兰 0.01微升

[0053] 然后加入灭菌超纯水补足至2.0微升，混合均匀。

[0054] 实施例2

[0055] 伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒的制备。

[0056] 在PCR反应管中按如下组分配制本发明的第一反应液：

[0057]

[0058] 加入灭菌超纯水使总体积达到18.0微升。

[0059] 其中，上述探针117A(SEQ ID NO:3)的5’端连接有HEX，3’端连接有BHQ；上述探针118H(SEQ ID NO:6)的5’端连接有FAM，3’端连接有BHQ。

[0060] 将第一反应液混合均匀，然后向液面上加入融化的石蜡20微升，待其凝固后，该石蜡封住下面的第一反应液，然后按如下组分配比加入第二反应液：

[0061] DNA聚合酶O（42U/μL) 0.5微升

[0062] 溴酚兰 0.02微升

[0063] 然后加入灭菌超纯水补足至2.0微升，混合均匀。

[0064] 实施例3

[0065] 伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒的应用。

[0066] 1.血液标本采集

[0067] 对于20例伤寒患者在病程的第一周无菌采集静脉血5mL/人。

[0068] 2.实时荧光定量PCR检测

[0069] 将步骤1采集的静脉血取5μL直接加入至实施例1制备的PCR检测试剂盒的PCR反应管中，该反应管含有第一反应液和第二反应液，它们用石蜡隔开，然后盖上盖，将该PCR反应管放入荧光定量PCR仪中进行PCR反应。其中PCR反应条件为：

[0070] 50℃：2min；

[0071] 94℃：2min；

[0072] 94℃：5s，55℃：40s；40个循环。

[0073] 反应结束后得到反应结果。

[0074] 3.结果判断

[0075] 根据扩增图谱判定结果，其中：

[0076] 阳性结果：扩增曲线图Ct值≤35，并有明显指数增长，参见图2。

[0077] 阴性结果：扩增曲线图Ct值＞35（未图示）或无Ct值（见图3）。

[0078] 具体检测结果见表3、图4和图5，其中图4为PCR检测阳性结果曲线图，图5为PCR检测阴性结果曲线图。

[0079] 对比实施例

[0080] 以传统的培养法作为对比实施例，以作为本发明试剂盒检测效果的参考。

[0081] 1.血液标本采集

[0082] 对于20例伤寒患者在病程的第一周无菌采集静脉血10mL/人。

[0083] 2.增菌培养

[0084] 按1:10的体积比将血液样品加入至血液增菌培养基，置于36℃±1℃孵育，分别于1天、2天、7天转钟血琼脂平板或营养琼脂平板，置36℃±1℃培养24小时～48小时。

[0085] 3.生化鉴定

[0086] 从上述平板上挑选不少于3个可疑菌落，分别转种到以下培养基：双糖铁斜面（KI）或三糖铁斜面（TSI）和动力-靛基质-尿素半固体各一支，36℃±1℃培养18小时，观察生化反应。用多价O血清做玻片凝集试验，如呈现强凝集反应，即为试验阳性，即含有待检测样品。

[0087] 结果分析

[0088] 将实施例3（参见图4和图5）与其对比实施例的检测结果进行比较，得到如表3所示的检测结果。

[0089] 表3检测结果

[0090]

[0091] 实施例4

[0092] 伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒的应用。

[0093] 1.血液标本采集

[0094] 对于15例伤寒患者在病程的第一周无菌采集静脉血5mL/人。

[0095] 2.实时荧光PCR检测

[0096] 将步骤1采集的静脉血取5μL直接加入至实施例2制备的PCR检测试剂盒的PCR反应管中，盖上盖，将该PCR反应管放入荧光定量PCR仪中进行PCR反应。其中PCR反应条件为：

[0097] 55℃：5min；

[0098] 95℃：3min；

[0099] 95℃：10s，60℃：80s；40个循环。

[0100] 3.结果判断

[0101] 根据扩增图谱判定结果，见图2、图3。

[0102] 阳性结果：扩增曲线图Ct值≤35，并有明显指数增长。

[0103] 阴性结果：扩增曲线图Ct值＞35或无Ct值。

[0104] 具体检测结果见表4。

[0105] 对比实施例

[0106] 1.血液标本采集

[0107] 对于15例伤寒患者在病程的第一周无菌采集静脉血5mL/人。

[0108] 其余操作步骤同实施例3的对比实施例。

[0109] 实施例4及其对比实施例的结果分析，见表4

[0110] 表4检测结果

[0111]

[0112] 根据表3及表4可知，传统培养法检测结果与采用本发明试剂盒的荧光定量PCR检测法结果一致，而实时荧光PCR法检出只需要约5小时，培养法则需要66小时以上。

[0113] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。